MXPA04003044A - Pronostico de cancer colorrectal. - Google Patents

Abstract

Un metodo para dar un pronostico de cancer colorrectal se realiza analizando la expresion de un grupo de genes; se incluyen perfiles de expresion genetica en una variedad de medios tales como micromatrices, y tambien equipos que los contienen.

Description

PRONOSTICO DE CANCER COLORRECTAL ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere al pronóstico del cáncer colorrectal en base a los perfiles de expresión genética de muestras biológicas. El cáncer colorrectal es una enfermedad heterogénea de origen complejo. Una vez que un paciente es tratado por cáncer colorrectal, la probabilidad de recurrencia está relacionada con el grado de penetración de tumor a través de la pared intestinal y la presencia o ausencia de complicación nodal. Estas características son la base del sistema de división actual definido por la clasificación de Duke. La enfermedad A de Duke está confinada a las capas de la submucosa del colon o recto. El tumor B de Duke invade a través de la muscularis propria y puede penetrar la pared del colon o del recto. La enfermedad C de Duke incluye cualquier grado de invasión de la pared intestinal con metástasis regional del ganglio linfático. La resección quirúrgica es muy efectiva en cánceres colorrectales de etapa temprana, suministrando tasas de curación de 95% en los pacientes con enfermedad A de Duke y 75% en los pacientes con enfermedad B de Duke. La presencia de ganglio linfático en la enfermedad C de Duke predice una probabilidad del 60% de recurrencia en el transcurso de cinco años. El tratamiento de pacientes con enfermedad C de Duke con una quimioterapia posquirúrgica reduce la tasa de recurrencia a 40%-50%, y actualmente es el estándar de atención para los pacientes con la enfermedad C de Duke. Debido a la tasa de recurrencia relativamente baja, ha sido más difícil detectar el beneficio de una quimioterapia posquirúrgica en pacientes con enfermedad B de Duke, y sigue en controversia. Sin embargo, la clasificación B de Duke es imperfecta ya que aproximadamente 20% - 30% de estos pacientes parecen tener más bien la enfermedad C de Duke y recaen en el transcurso de 5 años. Claramente existe la necesidad de identificar factores pronósticos mejores que la complicación nodal para orientar la selección de los pacientes con enfermedad B de Duke en pacientes que probablemente tengan recaída y pacientes que probablemente sobrevivan.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La invención es un método para determinar la probabilidad de recurrencia de cáncer colorrectal en un paciente diagnosticado o tratado por cáncer colorrectal. En un aspecto de la invención, el perfil de expresión genética incluye por lo menos tres genes. En otro aspecto de la invención, el perfil de expresión genética incluye por lo menos cuatro genes. Los artículos usados en la práctica de los métodos también son un aspecto de la invención. Estos artículos incluyen perfiles de expresión genética o sus representaciones, que están grabados en medios legibles en máquina tales como medios legibles en computadora. Los artículos usados para identificar perfiles de expresión genética también pueden incluir substratos o superficies, tales como micromatrices, para capturar o indicar la presencia, ausencia, o grado de expresión genética. En otro aspecto de la invención, unos equipos incluyen reactivos para realizar el análisis de expresión genética pronóstico de recurrencia del cáncer colorrectal.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica de la intensidad de medición (eje y) del gen 1 de proteína de unión de ácido graso de Homo sapiens en muestras de paciente (eje x). Una intensidad mayor indica mayor expresión genética, mostrando que estos genes son regulados negativamente en pacientes con recaída. La figura 2 es una gráfica de la intensidad de medición (eje y) del gen transportador asociado con péptido intestinal de humano en muestras de paciente (eje x). Una intensidad mayor indica mayor expresión genética, mostrando que estos genes son regulados negativamente en pacientes con recaída. La figura 3a es una gráfica de la intensidad de medición (eje y) del gen de antígeno de MHC de clase II (HLA-DRB1 ) en muestras de paciente (eje x). Una intensidad mayor indica mayor expresión genética, mostrando que estos genes son regulados negativamente en pacientes con recaída. La figura 3b es una gráfica de la intensidad de medición (eje y) del gen de proteína del transcrito 5 similar a inmunoglobulina en muestras de paciente (eje x). Una intensidad mayor indica mayor expresión genética, mostrando que estos genes son regulados negativamente en pacientes con recaída. La figura 4 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida con los datos de paciente como una serie de entrenamiento como se describe en los ejemplos. La figura 5 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida con los datos de paciente como una serie de prueba como se describe en los ejemplos. La figura 6 es una gráfica estándar de Kaplan-Meier construida con los datos de todos los pacientes como se describe en los ejemplos. La figura 7 es una curva estándar ROC.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Sólo raramente se ha encontrado que la sola presencia o ausencia de una secuencia de ácido nucleico particular en una muestra de tejido tenga un valor diagnóstico o pronóstico. Por otra parte, cada vez se considera más importante la información acerca de la expresión de varias proteínas, péptidos o ARNm. La sola presencia de secuencias de ácido nucleico que tienen el potencial de expresar proteínas, péptidos o ARNm (tales secuencias referidas como "genes") dentro del genoma, por si sola no determina si una proteína, péptido o ARNm es expresado en una célula dada. Una variedad de factores complejos determina si se expresa o no un gen dado capaz de expresar proteínas, péptidos o ARNm, y la magnitud en la que ocurre dicha expresión si esta ocurriera. Sin considerar las dificultades para comprender y determinar estos factores, el análisis de la expresión genética puede proveer información útil acerca de la ocurrencia de eventos importantes tales como génesis de tumor, metástasis, apoptosis y otros fenómenos clínicamente relevantes. En los perfiles de expresión genética se pueden encontrar indicaciones relativas del grado de actividad o inactividad de los genes. Los perfiles de expresión genética de esta invención se usan para dar un pronóstico y un tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal. La preparación de la muestra requiere la recolección de muestras del paciente. Las muestras de paciente usadas en el método de la invención son aquellas sospechosas de contener células enfermas, tales como las células epiteliales tomadas de una muestra de colon o de márgenes quirúrgicos. Una técnica útil para obtener muestras sospechosas es la microdisección de captura de láser (LCM). La tecnología LCM ofrece una forma de seleccionar las células a estudiar minimizando la variabilidad causada por la heterogeneidad del tipo de célula. Consecuentemente, se pueden detectar fácilmente cambios pequeños o moderados en la expresión genética entre células normales y cancerosas. En un método preferido, las muestras comprenden células epiteliales circulantes extraídas de la sangre periférica. Estas se pueden obtener de acuerdo con varios métodos, pero el método más preferido es la técnica de separación magnética descrita en la patente de E.U.A. No. 6,136,182, asignada a Immunivest Corp, que se incorpora aquí como referencia. Una vez obtenida la muestra que contiene las células de interés, se extrae y amplifica el ARN, y se obtiene un perfil de expresión genética de los genes en la cartera apropiada, preferiblemente por medio de una micromatriz. Los métodos preferidos para establecer perfiles de expresión genética incluyen la determinación de la cantidad del ARN producido por un gen que codifica una proteína o péptido. Esto se realiza por medio de PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), RT-PCR competitiva, RT-PCR en tiempo real, RT-PCR de despliegue diferencial, análisis de Northern blot y otras pruebas relacionadas. Aunque es posible realizar estas técnicas usando reacciones de PCR individuales, es mejor amplificar ADN complementario (ADNc) o ARN complementario (ARNc) producido del ARNm, y analizarlo por medio de una micromatriz. Varias configuraciones de matriz diferentes, y los métodos de su producción, son conocidas del experto en la materia y se describen en varias patentes de E.U.A., tales como: Nos: 5,445,934; 5,532,128; 5,556,752; 5,242,974; 5,384,261 ; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,472,672; 5,527,681 ; 5,529,756; 5,545,531 ; 5,554,501 ; 5,561 ,071 ; 5,571 ,639; 5,593,839; 5,599,695; 5,624,711 ; 5,658,734; y 5,700,637; cuyas descripciones se incorporan aquí como referencia. La tecnología de micromatrices permite la medición simultánea del nivel de ARNm de estado constante de miles de genes, presentando así una herramienta poderosa para identificar efectos tales como el inicio, detención, o modulación de la proliferación celular descontrolada. Actualmente están en amplio uso dos técnicas de micromatriz. La primera es de matrices de ADNc y la segunda es de matrices de oligonucleótido. Aunque existen diferencias en la construcción de estas microplacas, esencialmente todo el análisis de datos al final y el resultado son los mismos. El producto de estos análisis, típicamente, consiste de mediciones de la intensidad de la señal recibida de una sonda marcada, para detectar una secuencia de ADNc de la muestra que híbrida con una secuencia de ácido nucleico en un sitio conocido sobre la micromatriz. Típicamente, la intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de ADNc, y por tanto de ARNm, expresado en las células de muestra. Muchas de estas técnicas están disponibles y son de utilidad. Los métodos preferidos para determinar la expresión genética se pueden encontrar en las patentes de E.U.A. Nos. 6,271 ,002, para Linsley y otros; 6,218,122, para Friend y otros; 6,218,1 14, para Peck y otros; y 6,004,755, para Wang y otros; la descripción de las cuales se incorpora aquí como referencia. El análisis de los niveles de expresión se realiza comparando dichas intensidades. Esto se hace mejor generando una matriz de relación de las intensidades de expresión de genes en una muestra de prueba contra las de una muestra de control. Por ejemplo, la intensidad de expresión genética de un tejido enfermo se puede comparar con la intensidad de expresión generada de tejido normal del mismo tipo (por ejemplo muestra de tejido de colon enfermo contra muestra de tejido de colon normal). Una relación de estas intensidades de expresión indica las veces de cambio de la expresión genética entre las muestras de prueba y de control. Los perfiles de expresión genética también se pueden desplegar de varias maneras. El método más común es disponer las intensidades de fluorescencia en bruto o una matriz de relación en un dendograma gráfico en donde las columnas indican las muestras de prueba y las filas indican los genes. Los datos se disponen de tal manera que los genes que tienen perfiles de expresión similares están cercanos entre sí. La relación de expresión para cada gen es visualizada como un color. Por ejemplo, una relación menor de uno (indicando regulación negativa) puede aparecer en la porción azul del espectro, mientras que una relación mayor de uno (indicando regulación positiva) puede aparecer como un color en la porción roja del espectro. Están disponibles comercialmente programas de software de computadora para desplegar dichos datos, incluyendo el software "GENESPRINT" de Silicon Genetics, Inc. y "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc. Los genes modulados usados en los métodos de la invención se describen en los ejemplos. Los genes que son expresados diferencialmente son regulados, ya sea positiva o negativamente, en pacientes con una recurrencia de cáncer de colon con respecto a aquellos con una recurrencia.

La regulación positiva y la regulación negativa son términos relativos que significan que se encuentra una diferencia detectable (más allá de la contribución de la interferencia en el sistema usado para medirla) en la cantidad de expresión de los genes con respecto a alguna linea basal. En este caso, la línea basal es la expresión del gen medida en un paciente sin recaída. Los genes de interés en las células enfermas (de los pacientes en recaída) son así regulados positiva o negativamente con respecto al nivel de línea basal, usando el mismo método de medición. Enfermo, en este contexto, se refiere a una alteración del estado de un cuerpo que interrumpe o perturba, o tiene el potencial de perturbar, el desempeño apropiado de las funciones corporales, como ocurre con la proliferación descontrolada de células. Se diagnostica una enfermedad en una persona cuando algún aspecto del genotipo o fenotipo de esa persona es consistente con la presencia de la enfermedad. Sin embargo, el acto de realizar una diagnosis o un pronóstico incluye la determinación de cuestiones de enfermedad/estado, tales como determinar la probabilidad de recaída y el monitoreo de la terapia. En el monitoreo de la terapia se hacen consideraciones clínicas respecto al efecto de un curso dado de terapia, comparando la expresión de genes con el paso del tiempo para determinar si los perfiles de expresión genética han cambiado o están cambiando a patrones más consistentes con el tejido normal. Preferiblemente, los niveles de regulación positiva y negativa se distinguen en base a las veces que cambian las mediciones de intensidad de sondas de micromatriz hibridadas. Se prefiere una diferencia de 2.0 veces para hacer dichas distinciones, o un valor de p de menos de .05. Esto es, antes de afirmar que un gen se expresa diferencialmente en células enfermas/recurrentes en comparación con células normales/no recurrentes, se encuentra que la célula enferma produce por lo menos 2 veces más, o 2 veces menos, la intensidad de las células normales. A mayor diferencia de veces será más preferido el uso del gen como una herramienta diagnóstica o pronostica. Los genes seleccionados para los perfiles de expresión genética de la presente invención tienen niveles de expresión que resultan en la generación de una señal que es distinguible de los genes normales o no modulados, en una cantidad que rebasa el fondo, usando instrumentación de laboratorio clínico. Se pueden usar valores estadísticos para distinguir confiablemente genes modulados de no modulados e interferencia. Las pruebas estadísticas encuentran los genes significativamente más diferentes entre diversos grupos de muestras. La prueba t de Student es un ejemplo de una prueba estadística robusta que se puede usar para encontrar diferencias significativas entre dos grupos. A menor valor de p será más fuerte la evidencia de que el gen está mostrando una diferencia entre los diferentes grupos. No obstante, puesto que las micromatrices miden más de un gen a la vez, se pueden consultar decenas de miles de pruebas estadísticas a la vez. Debido a esto, es poco probable ver valores de p pequeños solo por azar, y se pueden hacer ajustes de esto usando una corrección de Sidak, así como también un experimento de aleatorización/permutación. Un valor de p menor de .05 en la prueba t es evidencia de que el gen es significativamente diferente. Un valor de p menor de .05 después de factorizar la corrección de Sidak es una evidencia más fuerte. Para un gran número de muestras en cada grupo, un valor de p menor de 0.05 después de la prueba de aleatorización/permutación, es la evidencia más fuerte de una diferencia significativa. Otro parámetro que se puede usar para seleccionar genes que generan una señal que es mayor que la del gen no modulado o la interferencia, es una medición de diferencia de señal absoluta. Preferiblemente, la señal generada por la expresión del gen modulado es por lo menos 20% diferente a la del gen normal o no modulado (en una base absoluta). Es aún más preferido que dichos genes produzcan patrones de expresión que sean por lo menos 30% diferentes de los genes normales o no modulados. Los genes se pueden agrupar de tal manera que la información obtenida sobre la serie de genes en el grupo provea una base firme para hacer un juicio clínicamente relevante, tal como una diagnosis, pronóstico, o elección de tratamiento. Estas series de genes integran la cartera de la invención. En este caso, los juicios apoyados por la cartera incluyen cáncer colorrectal. Como con la mayoría de los marcadores diagnósticos, frecuentemente es deseable usar el menor número posible de marcadores para hacer un juicio médico correcto. Esto previene un retraso en el tratamiento pendiente de análisis posterior, así como el uso inapropiado de tiempo y recursos. Preferiblemente, la cartera es establecida de tal manera que la combinación de genes en la cartera exhiba un mejoramiento de sensibilidad y especificidad con respecto a genes individuales o combinaciones de genes seleccionados aleatoriamente. En el contexto de la presente invención, la sensibilidad de la cartera puede ser reflejada en las veces de diferencia exhibidas por la expresión de un gen en el estado enfermo con respecto al estado normal. La especificidad puede ser reflejada en mediciones estadísticas de la correlación entre la señalización de la expresión genética y la condición de interés. Por ejemplo, se puede usar la desviación estándar como dicha medición. Al considerar un grupo de genes para su inclusión en una cartera, una desviación estándar pequeña de las mediciones de expresión se correlaciona con mayor especificidad. En esta capacidad también se pueden usar otras mediciones de variación, tales como coeficientes de correlación. Un método preferido para establecer carteras de expresión genética es usar algoritmos de optimización tales como el algoritmo de variación media usado ampliamente para establecer carteras de valores. Este método se describe en detalle en la solicitud de patente titulada "Portfolio Selection" de Tim Jatkoe y otros, presentada el 21 de marzo de 2003. Esencialmente, el método requiere el establecimiento de una serie de entradas (valores en aplicaciones financieras, aquí la expresión medida por la intensidad) que optimizarán el retorno (por ejemplo una señal que es generada) que se recibe para usarlo minimizando la variabilidad del retorno. Están disponibles muchos programas de software comerciales para realizar tales operaciones. Se prefiere la "aplicación de optimización de variación media de Wagner Associates", referida en toda esta especificación como "software de Wagner". Este software utiliza funciones de la "colección de optimización de variación media de Wagner Associates" para determinar una frontera eficiente y se prefiere la cartera óptima en el sentido de arkowitz. El uso de este tipo de software requiere que datos de micromatriz sean transformados de tal manera que puedan ser tratados como una entrada en el modo de retorno de valores, y se usan mediciones de riesgo cuando el software se usa para fines de análisis financiero. Por ejemplo, cuando se emplea el software de Wagner en conjunto con mediciones de intensidad de micromatriz, se emplea el siguiente método de transformación de datos. Primero, los genes son preseleccionados para identificar aquellos genes cuya expresión muestre por lo menos cierto nivel mínimo de diferenciación. El proceso de preselección preferido se realiza como sigue. Se selecciona una clase de línea basal. Típicamente, esta comprenderá genes de una población que no tenga la condición de interés. Por ejemplo, si se estuviera interesado en seleccionar una cartera de genes que sean diagnósticos para cáncer de pulmón recurrente, se pueden usar muestras de pacientes sin recurrencias para hacer la clase de línea basal. Una vez seleccionada la clase de línea basal, se calcula la media aritmética y la desviación estándar para el indicador de la expresión genética de cada gen para muestras de clase de línea basal. Este indicador es, típicamente, la intensidad fluorescente de una lectura de micromatriz. Los datos estadísticos calculados se usan entonces para calcular un valor de línea basal de (X*Desviación estándar+Media) para cada gen. Esta es la lectura de línea basal para el gen con el cual serán comparadas todas las otras muestras. X es una variable de severidad seleccionada por la persona que formula la cartera. Los valores más altos de X son más severos que los más bajos. Preferiblemente, X está en la escala de .5 a 3, siendo más preferido 2 a 3, y siendo muy preferido 3. Entonces se calculan las relaciones entre cada muestra experimental (las que exhiben la condición de interés) contra las lecturas de línea basal. Las relaciones se transforman entonces en valores logarítmicos de base 10 para facilitar el manejo de los datos con el software. Esto permite que los genes regulados negativamente exhiban valores negativos necesarios para la optimización de acuerdo con el algoritmo de variación media de Markman usando el software de Wagner. Los datos preprocesados que comprenden estas relaciones transformadas son usados como entradas en lugar de los valores de retorno de activo que son usados normalmente en el software de Wagner cuando se usa para fines de análisis financiero. Una vez formulada una frontera eficiente, se selecciona una cartera optimizada para un nivel de entrada (retorno) o variación dado que corresponde con un punto en la frontera. Estas entradas o variaciones son los estándares predeterminados establecidos por la persona que formula la cartera. Dicho de otra forma, quien busca la cartera óptima determina un nivel de entrada aceptable (indicativo de sensibilidad) o un nivel dado de variación (indicativo de especificidad), y selecciona los genes que están a lo largo de la frontera eficiente que corresponde a ese nivel de entrada o variación. El software de Wagner puede seleccionar tales genes cuando es seleccionado un nivel de entrada o variación. También puede asignar un peso a cada gen en la cartera como si fuera para unos valores en una cartera de valores. Se puede determinar si una muestra tiene la condición para la cual la cartera es diagnóstica comparando la expresión de los genes en la cartera de la muestra del paciente con los valores calculados de genes expresados diferencialmente usados para establecer la cartera. Preferiblemente, primero es generado un valor de cartera sumando los múltiplos del valor de intensidad de cada gen en la cartera por el peso asignado a ese gen en el proceso de selección de cartera. Es calculado entonces un valor límite por medio de (Y*desviación estándar+media del valor de cartera para grupos de línea basal), en donde Y es un valor de severidad que tiene el mismo significado que X anteriormente descrito. Una muestra que tiene un valor de cartera mayor que el valor de cartera de la clase de línea basal, es clasificada entonces como poseedora de la condición. Si se desea, este proceso puede ser realizado iterativamente de acuerdo con métodos estadísticos bien conocidos para mejorar los niveles de confianza. Opcionalmente se puede reiterar este proceso hasta obtener la mejor precisión de predicción. El proceso de selección de cartera y la caracterización de un desconocido se resume de la siguiente manera: 1. Elegir clase de línea basal. 2.- Calcular la media y la desviación estándar de cada gen para muestras de clase de línea basal. 3.- Calcular (X*Desviación estándar+Media) para cada gen. Esta es la lectura de línea basal con la cual serán comparadas todas las otras muestras. X es una variable de severidad siendo los valores más altos de X más severos que los más bajos. 4.- Calcular la relación entre cada muestra experimental y la lectura de línea basal calculada en el paso 3. 5.- Transformar las relaciones para que las relaciones menores de 1 sean negativas (por ejemplo usando logaritmo de base 10; los genes regulados negativamente ahora tienen correctamente los valores negativos necesarios para la optimización MV). 6.- Estas relaciones transformadas son usadas como entradas en lugar de los retornos de activo que son usados normalmente en la aplicación del software. 7.- El software graficará la frontera eficiente y retornará una cartera optimizada en cualquier punto a lo largo de la frontera eficiente. 8. - Elegir un retorno o variación deseado en la frontera eficiente. 9. - Calcular el valor de la cartera para cada muestra sumando los múltiplos de cada valor de intensidad de gen por el peso generado por el algoritmo de selección de cartera. 10. - Calcular un valor límite agregando el valor de cartera medio para grupos de linea basal al múltiplo de Y, y la desviación estándar de los valores de cartera de línea basal. Los valores mayores que este valor límite serían clasificados como la clase experimental. 1 1. - Opcionalmente se puede reiterar este proceso hasta obtener la mejor exactitud de predicción. Alternativamente, los genes se pueden preseleccionar primero identificando aquellos genes cuya expresión muestre cierto nivel mínimo de diferenciación. La preselección en este método alternativo se basa preferiblemente en un umbral dado por 1 = -i en donde µ? es la media del subgrupo que se sabe posee la enfermedad o condición, µ? es la media del subgrupo de muestras normales, y s- +s? representa las desviaciones estándares combinadas. También se puede usar un corte de señal a interferencia preseleccionando los datos de acuerdo con una relación tal como: o 5 < (µ -MAX n )\^ EstQ asegUra que |os genes qüe son (s, + s„ ) preseleccionados en base a su modulación diferencial son diferenciados en una forma clínicamente significativa. Esto es, arriba del nivel de interferencia de la instrumentación apropiada para medir los parámetros diagnósticos. Para cada marcador preseleccionado de acuerdo con estos criterios, se establece una matriz en la cual las columnas representan muestras, las filas representan marcadores y cada elemento es una medición de intensidad normalizada para la expresión de ese marcador, de acuerdo con la relación: — — — ¡ en donde I es la medición de intensidad. /"i También es posible establecer condiciones de límite adicionales para definir la cartera óptima. Por ejemplo, el tamaño de la cartera se puede limitar a una escala o número fijo de marcadores. Esto se puede hacer ya sea haciendo los criterios de preselección de datos más severos (por ejemplo, 0 \ ( ] - MAX„ ) I Cu, - MAX„ ) en lugar de 0 5 - ~ — o usando características (s, + s„ ) y (s, + s„ ) de programación tales como restringiendo el tamaño de la cartera. Por ejemplo, se podría poner la condición límite de que la frontera eficiente sea seleccionada solo de entre los 10 genes más óptimos. También se podrían usar todos los genes preseleccionados para determinar la frontera eficiente y después limitar el número de genes seleccionados (por ejemplo no más de 1 0). El proceso de selección de una cartera también puede incluir la aplicación de reglas heurísticas. Preferiblemente, tales reglas se formulan en base a la biología y a una comprensión de la tecnología usada para producir resultados clínicos. Muy preferiblemente, se aplican al resultado del método de optimización. Por ejemplo, el método de la variación media de selección de cartera se puede aplicar a datos de micromatriz para varios genes expresados diferencialmente en sujetos con cáncer colorrectal. El resultado del método sería una serie optimizada de genes que podría incluir algunos genes que son expresados en sangre periférica y también en tejido enfermo. Si las muestras usadas en el método de prueba se obtienen de sangre periférica y ciertos genes expresados diferencialmente en casos de cáncer de mama también podrían expresarse diferencialmente en sangre periférica, entonces se puede aplicar una regla heurística en la cual se selecciona una cartera de la frontera eficiente que excluya los que son expresados diferencialmente en sangre periférica. Desde luego, la regla se puede aplicar antes de la formación de la frontera eficiente, por ejemplo, aplicando la regla durante la preselección de datos. Se pueden aplicar otras reglas heurísticas que no necesariamente están relacionadas con la biología en cuestión. Por ejemplo, se puede aplicar la regla de que solo un porcentaje dado de la cartera puede ser representado por un gen o genes particulares. El software disponible comercialmente, tal como el software Wagner, acomoda fácilmente este tipo de heurística. Esto puede ser útil por ejemplo cuando otros factores diferentes de exactitud y precisión tienen un impacto sobre la conveniencia de incluir uno o más genes (por ejemplo cargos de autorización anticipada). Un método de la invención incluye comparar perfiles de expresión genética para varios genes (o carteras) para atribuir pronósticos. Los perfiles de expresión genética de cada uno de los genes que comprenden la cartera se graban en un medio, tal como un medio legible en computadora.

Este puede tomar varias formas. Por ejemplo, se puede establecer una tabla en la cual la entrada es la escala de señales (por ejemplo mediciones de intensidad) indicativa de la enfermedad. Los datos reales de paciente se pueden comparar entonces con los valores de la tabla para determinar si las muestras de paciente son normales o enfermas. En una modalidad más sofisticada, los patrones de las señales de expresión (por ejemplo la intensidad fluorescente) se registran digitalmente o gráficamente. Los patrones de expresión genética de las carteras de gen usadas en conjunto con las muestras de paciente, se comparan entonces con los patrones de expresión. Se puede usar entonces software de comparación de patrones para determinar si las muestras de paciente tienen un patrón indicativo de la recurrencia de la enfermedad. Desde luego, estas comparaciones también se pueden usar para determinar si es probable que el paciente experimente recurrencia de la enfermedad. Los perfiles de expresión de las muestras se comparan entonces con la cartera de una célula de control. Si los patrones de expresión de muestra son consistentes con el patrón de expresión para recurrencia de un cáncer colorrectal, entonces (en ausencia de consideraciones médicas contrarrestantes) el paciente es tratado como se trataría a un paciente con recaída. Si los patrones de expresión de muestra son consistentes con el patrón de expresión de la célula normal/de control, entonces se diagnostica al paciente como negativo para cáncer colorrectal. Están disponibles muchos métodos bien conocidos de reconocimiento de patrones. Las siguientes referencias proveen algunos ejemplos: Votación ponderada: Golub, T. R., Slonim, D K., Tamaya, P., Huard, C, Gaasenbeek, M., Mesirov, J P., Coller, H., Loh, L., Downing, J R., Caligiuri, M A., Bloomfield, C D., Lander, E S. "Molecular classification of cáncer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring". Science 286:531 -537, 1999.

Máquinas de vector de soporte: Su, A. I., Welsh, J B., Sapinoso, L M., Kern, S G., Dimitrov, P., Lapp, H., Schultz, P G., Powell, S M., Moskaluk, C A., Frierson, H F. Jr., Hampton, G M. "Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signaturas". Cáncer Research 61 :7388-93, 2001. Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukhejee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C, Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. "Multiclass cáncer diagnosis using tumor gene expression signatures", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154, 2001.

Vecinos más cercanos a K: Ramaswamy, S., Tamayo, P., Rifkin, R., Mukherjee, S., Yeang, C H., Angelo, M., Ladd, C, Reich, M., Latulippe, E., Mesirov, J P., Poggio, T., Gerald, W., Loda, M., Lander, E S., Gould, T R. "Multiclass cáncer diagnosis using tumor gene expression signatures", Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154, 2001.

Coeficientes de correlación: van't Veer L J, Dai H, van de Vijver M J, He Y D, Hart A A, ao M, Peterse H L, van der Kooy K, Marton M J, Witteveen A T, Schreiber G J, Kerkhoven R M, Roberts C, Linsley P S, Bernards R, Friend S H., "Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cáncer", Nature, 31 de enero 31 de 2002 ; 415(6871 ):530-6. Los perfiles de expresión genética de esta invención también se pueden usar en conjunto con otros métodos diagnósticos no genéticos útiles en la diagnosis, pronóstico o monitoreo de tratamiento del cáncer. Por ejemplo, en algunas circunstancias es benéfico combinar el poder diagnóstico de los métodos basados en la expresión genética arriba descritos con datos de marcadores convencionales tales como marcadores de proteína de suero (por ejemplo antígeno carcinoembriónico). Existe una gama de estos marcadores incluyendo análisis como CEA. En uno de estos métodos, se extrae sangre periódicamente de un paciente tratado y después la sangre se somete a un inmunoensayo de enzima para uno de los marcadores de suero arriba descritos. Cuando la concentración del marcador sugiere el regreso de tumores o el fracaso de una terapia, se toma una muestra fuente susceptible de análisis de expresión genética. Cuando existe una masa sospechosa, se toma un aspirado de aguja fina y entonces se analizan los perfiles de expresión genética de las células tomadas de la masa como se describió arriba. Alternativamente se pueden tomar muestras de tejido de áreas adyacentes al tejido del cual se removió previamente un tumor. Este enfoque puede ser particularmente útil cuando otros análisis producen resultados ambiguos. Los artículos de esta invención incluyen representaciones de los perfiles de expresión genética útiles para tratar, diagnosticar, pronosticar y determinar de alguna otra forma enfermedades. Estas representaciones de perfil se reducen a un medio que puede ser leído automáticamente por una máquina, tal como los medios legibles en computadora (magnéticos, ópticos y similares). Los artículos también pueden incluir instrucciones para determinar los perfiles de expresión genética en dichos medios. Por ejemplo, los artículos pueden comprender un CD ROM que tiene instrucciones de computadora para comparar perfiles de expresión genética de las carteras de los genes arriba descritos. Los artículos también pueden tener perfiles de expresión genética registrados digitalmente en los mismos, de tal manera que pueden ser comparados con datos de expresión genética de muestras de paciente. Alternativamente, los perfiles pueden ser registrados en diferente formato de representación. Un registro gráfico es uno de tales formatos. Algoritmos de agrupamiento tales como los incorporados en el software "DISCOVERY" e "INFER" de Partek, Inc., arriba mencionados, pueden ayudar más a la visualización de dichos datos. Diferentes tipos de artículos de fabricación de acuerdo con la invención son medios o pruebas formateadas usadas para revelar perfiles de expresión genética. Estos pueden comprender, por ejemplo, micromatrices en las cuales se fijan complementos o sondas de secuencia a una matriz con la cual se combinan las secuencias indicativas de los genes de interés creando un determinante legible de su presencia. Alternativamente, los artículos de acuerdo con la invención se pueden adaptar en equipos reactivos para realizar hibridación, amplificación y generación de señal indicativa del nivel de expresión de los genes de interés para detectar el cáncer colorrectal. Los equipos hechos de acuerdo con la invención incluyen pruebas formateadas para determinar los perfiles de expresión genética. Estos pueden incluir todos o algunos de los materiales necesarios para realizar las pruebas, tales como reactivos e instrucciones. La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLOS Los genes analizados de acuerdo con esta invención típicamente están relacionados con secuencias de ácido nucleico de longitud completa que codifican una proteína o péptido. El experto en la materia reconocerá que la identificación de secuencias de longitud completa no es necesaria desde un punto de vista analítico. Esto es, porciones de las secuencias o ESTs se pueden seleccionar de acuerdo con principios muy conocidos, para las cuales se pueden diseñar sondas para determinar la expresión genética del gen correspondiente.

EJEMPLO 1 Manejo de muestra y LCM Se tomaron muestras de tejido recién congelado de pacientes sometidos a cirugía por tumores colorrectales. Las muestras que se usaron eran de 63 pacientes clasificados con la enfermedad B de Duke de acuerdo con la diagnosis y patología clínicas estándares. El resultado clínico de los pacientes era conocido. Treinta y seis pacientes habían estado libres de la enfermedad durante más de 3 años mientras que 27 pacientes tuvieron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años. Los tejidos se congelaron repentinamente en nitrógeno líquido dentro de 20-30 minutos del cultivo, y después se guardaron a -80 °C. Para captura de láser, las muestras se cortaron (6 µ) y una sección se montó en un portaobjetos de vidrio, y la segunda sobre una película (P.A.L.M.) que se había fijado sobre un portaobjetos de vidrio (Micro Siides Colorfrost, VWR Scientific, Media, Pennsylvania). La sección montada sobre un portaobjetos de vidrio se fijó después en acetona fría, se marcó con hematoxilina de Mayer (Sigma, St. Louis, Missouri). Un patólogo analizó las muestras para diagnosticar y determinar el grado. La etapa clínica fue estimada de los reportes clínicos y de patología quirúrgica acompañantes para verificar la clasificación de Duke. La sección montada sobre la película se fijó después durante cinco minutos en etanol al 100%, se contramarcó 1 minuto en eosina/etanol 100% (100 pg de eosina en 100 mi de etanol deshidratado), se remojó rápidamente una vez en etanol 100% para remover la marca libre, y se secó al aire durante 10 minutos. Antes de usar en LCM, la membrana (LPC-MEMBRANE PEN FOIL 1.35 µ No 8100, P.A.L.M. GmbH Mikrolaser Technologie, Bernried, Alemania) y los portaobjetos se trataron previamente para anular ARNasas, y para incrementar la unión de la muestra de tejido sobre la película. Brevemente, los portaobjetos se lavaron en H20 DEP y la película se lavó en ARNasa AWAY (Molecular Bioproducts, Inc., San Diego, California) y se enjuagaron en H2O DEP. Después de unir la película sobre los portaobjetos de vidrio, estos se metieron al horno a +120 °C durante 8 horas, se trataron con TI-SAD (Diagnostic Products Corporation, Los Angeles, California, 1 :50 en H2O DEP, filtrado a través de algodón absorbente), y se incubaron a +37 °C durante 30 minutos. Inmediatamente antes de usar, se extendió sobre la película en donde se había montado la muestra de tejido, una alícuota de 10 µ? de solución inhibidora de ARNasa (Inhibidor Rnasin 2500 U = 33 ??/µ? N211A, Promega GmbH, Mannheim, Alemania, 0.5 µ? en 400 µ? de solución congeladora, conteniendo 0.15 moles de NaCI, 10 mmoles de Tris pH 8.0, 0.25 mmoles de ditiotreitol). Las secciones de tejido montadas sobre la película se usaron para LCM. Se capturaron aproximadamente 2000 células epiteliales/muestra usando la tecnología PALM Robot-Microbeam (P.A.L.M. Mikrolaser Technologie, Cari Zeiss, Inc., Thomwood, New York), acoplada en un microscopio Zeiss Axiovert 135 (Cari Zeiss Jena GmbH, Jena, Alemania). Se incluyeron el estroma circundante de la mucosa normal, y los componentes de estroma que intervienen ocasionalmente en muestras de cáncer. Las células capturadas se pusieron en tubos en etanol al 100% y se conservaron a -80 °C.

EJEMPLO 2 Extracción y amplificación de ARN Se usó una columna Zymo-Spin (Zymo Research, Orange, California, 92867) para extraer ARN total de las muestras capturadas en LCM. Se resuspendieron aproximadamente 2 ng de ARN total en 10 µ? de agua y se realizaron 2 rondas de la amplificación basada en ARN polímerasa T7 para producir aproximadamente 50 pg de ARN amplificado.

EJEMPLO 3 Hibridación y cuantificación de micromatriz de ADNc Se usó una serie de micromatrices de ADNc consistentes en aproximadamente 23,000 clonas de ADNc humano para probar las muestras usando la microplaca U133a de humano, obtenida y disponible comercialmente de Affymetrix, Inc. Se obtuvo y preparó ARN total como se describió arriba y se aplicó a las microplacas, y se analizó por medio del Agilent BioAnalyzer de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las 63 muestras pasaron los estándares de control de calidad y los datos se usaron para selección de marcador. Se analizaron los datos de intensidad de la microplaca usando el software MAS versión 5.0, disponible comercialmente de Affymetrix, Inc. ( "MAS 5.0"). Se usó un análisis no supervisado para identificar dos genes que distinguen pacientes que recaerían de los que no recaerían, de la siguiente manera. Los datos de intensidad de la microplaca obtenidos como se describió, fueron la entrada para el software de agrupamiento no supervisado disponible comercialmente como PARTEK, versión 5.1. Este algoritmo de agrupamiento no supervisado identificó un grupo de 20 pacientes con una alta frecuencia de recaída (13 con recaída y 7 supervivientes). De los 23,000 genes originales, el análisis de prueba t seleccionó 276 genes que se expresaron significativamente diferente en estos pacientes. De este grupo, se seleccionaron dos genes que distinguían mejor a los pacientes con recaída de los que no tuvieron recaída: el transportador asociado con péptido intestinal humano (Seq ID No: 3) y la proteína 1 de unión de ácido graso de Homo sapiens (Seq ID No: 1 ). Estos dos genes son regulados negativamente (de hecho, están inactivados o no se expresan) en los pacientes con recaída de este grupo de pacientes. Esto se muestra en la figura 1 y en la figura 2, en las cuales se gráfica la intensidad de señal (eje y) contra el número de muestra de paciente (eje x). Después se realizó análisis supervisado para discriminar más a los pacientes con recaída de los que no tuvieron recaída en los 43 pacientes restantes. Este grupo de datos de paciente se dividió entonces en los siguientes grupos: 27 pacientes fueron asignados como la serie de entrenamiento y 16 pacientes fueron asignados como la serie de prueba. Esto aseguró que los mismos datos no fueran usados para identificar marcadores y luego para validar su utilidad. Se realizó una prueba t de variación desigual en la serie de entrenamiento. De una lista de 28 genes que tienen valores de p corregidos significativos, se eligió MHC ll-DR-B. Estos genes son regulados negativamente en los pacientes con recaída. MHC ll-DR-B (Seq ID No: 2) también tenía el valor de p más pequeño (figura 3a). En una ronda adicional de análisis supervisado, se puso en práctica un procedimiento de selección variable para análisis discriminante lineal, usando el software Partek versión 5.0 arriba descrito para separar pacientes con recaída de pacientes supervivientes en la serie de entrenamiento. El método de búsqueda fue selección hacia delante. La variable seleccionada con el error posterior más bajo fue la proteína de transcrito 5 similar a inmunoglobulina (Seq ID No. 4; figura 3b). Después se usó un modelo de azar proporcional de Cox (usando software "S Plus" de Insightful, Inc.) de selección de gen para confirmar la selección de gen arriba identificado para tiempo de supervivencia. En cada ciclo de 27 ciclos en total, cada uno de los 27 pacientes en la serie de entrenamiento fue mantenido aparte; los 26 pacientes restantes se usaron en la regresión univariada del modelo Cox para determinar la fuerza de asociación entre la expresión genética y el tiempo de supervivencia del paciente. La fuerza de dicha asociación se evaluó por medio del estimado de parámetro estandarizado estimado correspondiente y el valor P retornado de la regresión del modelo de Cox. Se usó un valor de P de 0.01 como el umbral para seleccionar los mejores genes de cada ciclo de selección de genes que deja uno fuera. Los mejores genes seleccionados de cada ciclo se compararon entonces para seleccionar aquellos genes que se mostraron mejores por lo menos 26 veces en el total de 27 ciclos de selección de genes que deja uno fuera. En total se seleccionaron 70 genes y entre ellos se encontraba tanto MHC ll-DR-B como la proteína de transcrito 5 similar a inmunoglobulina (nuevamente, mostrando regulación negativa).

Construcción de un predictor de múltiples genes Se usaron dos genes, MHC ll-DR-B y proteína de transcrito 5 similar a inmunoglobulina, para producir un predictor usando análisis discriminante lineal. La puntuación de votación fue definida como la probabilidad posterior de recaída. Si la puntuación del paciente era mayor de 0.5, el paciente se clasificaba como recurrente. Si la puntuación del paciente era menor de 0.5, el paciente se clasificaba como superviviente. El predictor se probó en la serie de entrenamiento (cuadro 1 ). La curva de Kaplan- eier se construyó sobre los recurrentes y supervivientes predichos (figura 4).

Validación cruzada y evaluación del predictor El desempeño del predictor debe ser determinado en una serie de datos independientes porque la mayoría de los métodos de clasificación funcionan bien en los ejemplos que se usaron en su establecimiento. La serie de prueba de 16 pacientes se usó para determinar la exactitud de la predicción. El corte de la clasificación fue determinado usando la curva ROC (figura 5). Con el corte seleccionado, se determinaron los números de predicción correcta para pacientes recurrentes y sobrevivientes en la serie de prueba, y se resumen en el cuadro 2. La curva de Kaplan-Meier se construyó sobre los recurrentes y supervivientes predichos (figura 6).

Predicción global La determinación del perfil de la expresión genética de 63 pacientes con cáncer de colon B de Duke condujo a la identificación de 4 genes que tienen expresión diferencial (regulación negativa o inactivación) en estos pacientes. Estos genes son Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4. Treinta y seis pacientes habían estado libres de la enfermedad por más de 3 años, mientras que 27 pacientes tuvieron recurrencia de tumor en el transcurso de 3 años. Usando la cartera de 3 genes marcadores de Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4, se identificaron correctamente 22 de los 27 pacientes con recaída y 27 de 36 pacientes libres de enfermedad. Este resultado representa una sensibilidad de 82% y una especificidad de 75%. El valor predictivo positivo es de 71 % y el valor predictivo negativo es de 84% (cuadro 3). La curva de Kaplan-Meier se construyó sobre los pacientes recurrentes y supervivientes predichos (figura 6). A continuación se describen los genes que comprenden los perfiles de esta invención.

Proteina 1 de unión de ácido graso de Homo sapiens (FABP1 ): En primer lugar, Smith LC y otros, en J. Biol. Chem. 260 (5), 2629-2632 (1985), identificaron el gen humano de la proteína de unión de ácido graso de hígado (L-FABP) en una colección de ADNc de hígado. La L-FABP contiene 127 residuos de aminoácido. Las proteínas de unión de ácido graso son una familia de proteínas citoplásmicas pequeñas altamente conservadas que se unen a ácidos grasos de cadena larga y otros ligandos hidrofóbicos. Se piensa que las funciones de las FABPs incluyen incorporación, transporte y metabolismo de ácidos grasos. También pueden ser responsables de la modulación de crecimiento y proliferación celular. La L-FABP comparte homología significativa con l-FABP, que se expresa específicamente en tejido de colon.

ARNm de transportador asociado con péptido intestinal humano HPT-1 : Este gen fue identificado por un grupo de científicos de Eli Lilly and Company. El documento se publicó en Science el 15 de abril de 1994; 264 (5157): 430-3. Este gen codifica una proteína de membrana de aproximadamente 92 kilodaltons, y la secuencia de aminoácidos indicó que esta proteína asociada con transporte comparte varios elementos estructurales conservados con la superfamilia cadherina de proteínas de adhesión célula-célula dependientes de calcio.

ARNm de antíqeno de MHC clase II de Homo sapiens (HLA- DRB1 ): Este gen fue encontrado primero en un niño español en 1997, y se publicó en Tissue Antigens en junio de 1977; 49(6): 658-61. Como su nombre lo indica, pertenece a la superfamilia de antígenos de MHC de clase II. Este gen codifica un producto de proteína de 267 aminoácidos.

ARNm de proteína de transcrito 5 similar a inmunoglobulina de clona 6 de Homo sapiens: Este gen codifica un producto de proteína que es un receptor de MHC de clase I inhibidor, de la superfamilia de inmunoglobulina, expresada no solo por subgrupos de células NK y T, sino también por células B, monocitos, macrófagos y células dendríticas. Esta molécula contiene 194 aminoácidos. La secuencia fue publicada en J. Exp. Med., 1 de diciembre de 1997, 186(1 1 ): 1809-18. Este receptor se une a moléculas de MHC de clase I y libera una señal negativa que inhibe la destrucción realizada por células NK y T, así como también la movilización de Ca2+ en células B y células mielomonocíticas, activada por el receptor de antígeno de células B y por antígenos de leucocito de histocompatibilidad humanos (HLA)-DR, respectivamente.

Hidroximetilbilano sintasa de Homo sapiens (denominada también porfobilinóqeno desaminasa, PBGD): Este gen se usó como el gen de control. Es uno de los genes menos variables entre tumor sólido y tejidos normales. La secuencia fue publicada primero en Nucleic Acids Res. 14(15), 5955-5968 (1986).

CUADRO 1 Exactitud de predicción sobre la serie de entrenamiento usando predictor de 2 genes Estudio Número de muestra Predicción correcta Recurrente 6 5 Superviviente 21 , 21 Sensibilidad 83% Especificidad 100% CUADRO 2 Exactitud de predicción en base a la serie de prueba usando predictor de 2 genes Estudio Número de muestra Predicción correcta Recurrente 8 4 Superviviente 8 7 Sensibilidad 50% Especificidad 88% CUADRO 3 Exactitud de predicción en base a todos los pacientes usando predictor de 3 genes (Seq ID No. 2, Seg ID No. 3 y Seg ID No. 4) Estudio Número de muestra Predicción correcta Recurrente 27 22 Superviviente 36 28 Sensibilidad 82% Especificidad 75% LISTADO DE SECUENCIAS <110> Wang, Yixin <120> Pronóstico de Cáncer Colorrectal <130> CDS5005 <140> tbd <141> 2003-03-31 <160> 5 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 489 <212> ADN <213> humano <400> 1 agagccgcag gtcagtcgtg aagagggagc tctattgcca ccatgagttt ctccggcaag 60 taccaactgc agagccagga aaactttgaa gccttcatga aggcaatcgg 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aatggaatta tagtggaggg tccagtccct 420 atcaccatag aagtgaagga catcaacgac aatcgaccca cgtttctcca gtcaaagtac 480 gaaggctcag taaggcagaa ctctcgccca ggaaagccct tcttgtatgt caatgccaca 540 gacctggatg atccggccac tcccaatggc cagctttatt accagattgt catccagctt 600 cccatgatca acaatgtcat gtactttcag atcaacaaca aaacgggagc catctctctt 660 acccgagagg gatctcagga attgaatcct gctaagaatc cttcctataa tctggtgatc 720 tcagtgaagg acatgggagg ccagagtgag aattccttca gtgataccac atctgtggat 780 atcatagtga cagagaatat ttggaaagca ccaaaacctg tggagatggt ggaaaactca 840 actgatcctc accccatcaa aatcactcag gtgcggtgga atgatcccgg tgcacaatat 900 tccttagttg acaaagagaa gctgccaaga ttcccatttt caattgacca ggaaggagat 960 atttacgtga ctcagccctt ggaccgagaa gaaaaggatg catatgtttt ttatgcagtt 1020 gcaaaggatg agtacggaaa accactttca tatccgctgg aaattcatgt aaaagttaaa 1080 gatattaatg ataatccacc tacatgtccg tcaccagtaa ccgtatttga ggtccaggag 1140 aatgaacgac tgggtaacag tatcgggacc cttactgcac atgacaggga tgaagaaaat 1200 actgccaaca gttttctaaa ctacaggatt gtggagcaaa 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gccaggctgg tcttgaactc 2940 ctgacgtcaa gtgatctgcc tgccttggtc tcccaataca ggcatgaacc actgcaccca 3000 cctacttaga tatttcatgt gctatagaca ttagagagat ttttcatttt tccatgacat 3060 ttttcctctc tgcaaatggc ttagctactt gtgtttttcc cttttggggc aagacagact 3120 cattaaatat tctgtacatt ttttctttat caaggagata tatcagtgtt gtctcataga 3180 actgcctgga ttccatttat gttttttctg attccatcct gtgtcccctt catccttgac 3240 tcctttggta tttcactgaa tttcaaacat ttgtcagaga agaaaaaagt gaggactcag 3300 gaaaaataaa taaataaaag aacagccttt tgcggccgcg aattc 3345 <210> 4 <211> 1924 <212> ADN <213> humano <400> 4 ccatgacgcc cgccctcaca gccctgctct gccttgggct gagtctgggc cccaggaccc 60 gcatgcaggc agggccctto cccaaaccca ccctctgggc tgagccaggc tctgtgatca 120 gctgggggag ccccgtgacc atctggtgtc aggggagcct ggaggcccag gagtaccaac 180 tggataaaga gggaagccca gagccctggg acagaaataa cccactggaa cccaagaaca 240 aggccagatt ctccatccca tccatgacac agcaccatgc agggagatac cgctgccact 300 attacagctc tgcaggctgg tcagagccca gcgaccccct ggagctggtg atgacaggat 360 tctacaacaa acccaccctc 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gctcagatag 1020 catacaagag accatgcagg ctaccatcca tgtccctgcc cagcatgaag atggccctga 1080 ggatgaccca cagttggtag gcatcactgc tcgtaacatt ccacgagggc cccagttggc 1140 tgcccagaac ttgggcatca gcctggccaa cttgttgctg agcaaaggag ccaaaaacat 1200 cctggatgtt gcacggcagc ttaacgatgc ccattaactg gtttgtgggg cacagatgcc 1260 tgggttgctg ctgtccagtg cctacatccc gggcctcagt gccccattct cactgctatc 1320 tggggagtga ttaccccggg agactgaact gcagggttca agccttccag ggatttgcct 1380 caccttgggg ccttgatgac tgccttgcct cctcagtatg tgggggcttc atctctttag 1440 agaagtccaa gcaacagcct ttgaatgtaa ccaatcctac taataaacca gttctgaagg 1500 taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1536

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar el estado de un cáncer colorrectal, que comprende identificar la modulación diferencial de cada gen (con respecto a la expresión del mismo gen en una población normal), en una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la combinación de genes es Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la combinación de genes es Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No.

4. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque hay una diferencia de por lo menos 2 veces en la expresión de los genes modulados.

5. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el valor de p que indica la modulación diferencial es menor de .05.

6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque también comprende una diagnosis colorrectal que no está basada en la genética.

7. - Una cartera de pronóstico que comprende secuencias de ácido nucleico aisladas de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4, sus complementos, o porciones de las mismas.

8. - La cartera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la combinación de genes es Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

9. - La cartera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque la combinación de genes es Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

10. - La cartera de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque está en una matriz adecuada para identificar la expresión diferencial de los genes contenidos en la misma.

11.- La cartera de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha matriz se emplea en una micromatriz.

12. - La cartera de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha micromatriz es una micromatriz de ADNc.

13. - La cartera de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque dicha micromatriz es una micromatriz de oligonucleótido.

14. - Un equipo para determinar el pronóstico de un paciente de cáncer colorrectal, que comprende materiales para detectar secuencias de ácido nucleico aisladas de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4, sus complementos, o porciones de las mismas.

15. - El equipo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque los genes son las Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

16. - El equipo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque los genes son las Seq ID No.1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

17.- El equipo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende reactivos para realizar un análisis de micromatriz.

18. - El equipo de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque también comprende un medio a través del cual se prueban dichas secuencias de ácido nucleico, sus complementos, o porciones de las mismas.

19. - Un método para determinar la respuesta al tratamiento de cáncer colorrectal, que comprende identificar modulación diferencial de cada gen (con respecto a la expresión del mismo gen en una población normal), en una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4.

20. - Artículos para determinar el estado de un cáncer colorrectal, que comprenden materiales para identificar secuencias de ácido nucleico de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4, sus complementos, o porciones de las mismas.

21.- Artículos para determinar el estado de un cáncer colorrectal, que comprenden representaciones de secuencias de ácido nucleico aisladas de una combinación de genes seleccionados del grupo que consiste de Seq ID No. 1 , Seq ID No. 2, Seq ID No. 3 y Seq ID No. 4, sus complementos, o porciones de las mismas.