KR101081333B1 - 단일 염기다형성 대립유전자의 프라이머 또는 프로브를 이용한 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법으로 보다 상세하게는 단일 염기다형성 대립유전자의 프라이머 또는 프로브 세트를 이용하여 진돗개의 모색결정 유전자의 실시간중합효소연쇄반응을 수행한 후 각 시료에서 나타나는 형광의 분포를 통하여 진돗개의 모색을 판별하는 방법으로, 상기 유전형 판별방법은 진돗개의 모색이 다양하게 발현되는 원리를 보다 쉽게 이해할 수 있어 모색의 혈통관리 체계 확립하는데 크게 기여할 것이다.
진돗개, 모색유전자, 유전형, 대립유전자
Description
본 발명은 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법으로 보다 상세하게는 단일 염기다형성 대립유전자의 1개 이상의 염기를 특이적으로 인식하는 프라이머 또는 프로브 세트를 이용한 진돗개 모색유전자의 유전형을 판별하는 방법에 관한 것 관한 것이다.
진돗개는 다양한 모색의 표현형을 보이는 특징이 있다. 특히 백구와 백구사이의 자견이 황구가 나오는 등 부모견과 자견의 모색은 빈번히 다양하고 예측하기 어려울때가 많은 것이 사실이다.
이를 유전학적으로 해석하기 위해 다양한 연구가 수행되어 왔다. 그 결과, 진돗개의 모색결정에 관여하는 유전자인 MC1R 유전자에 6개의 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 대립유전자가 발견되었다. 이들은 각각 G286A, G313A, C470A, G790A, C894T, 그리고 C916T이다. 위 6개의 단일 염기다형성 중에 5번째 C894T는 염기서열의 차이는 있으나 코딩하는 아미노산에는 변화가 없어 서 모색의 변화에는 영향을 주지 못한다. 즉, 모색의 결정에는 G286A, G313A, C470A, G790A, 그리고 C916T가 관여한다.
현재까지 밝혀진 바로는 개체는 각 대립유전자에 한 가지의 염기, 즉 한 개체의 경우 G286A 단일 염기다형성에는 "G"를 갖거나 혹은 “A"를 갖는 것으로 알려져 왔다. 이는 염기서열 분석 및 기타 기존의 방법을 이용할 경우, 각 단일 염기다형성 유전자 위치의 염기서열을 한 개체의 경우 1개만 읽게 되어 있기 때문에 각 개체는 5개의 단일 염기다형성들에 있어 각각 한가지씩의 염기를 보유한 동종접합체(homozygote)로 해석이 되어 왔다.
그러나 본 발명자들은 단일 염기다형성 특이 염기에 상응하는 프로브를 이용하여 진돗개의 모색결정에 관여하는 유전자인 MC1R에 1개 이상의 염기를 보유한 이형접합체(heterozygote)를 선별이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 단일 염기다형성 대립유전자의 프라이머 또는 프로브 세트를 이용하여 2개 이상의 대립유전자 특이-실시간중합효소연쇄반응단계; 및 상기 실시간중합효소연쇄반응 후 형광 분석에 의해 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 진돗개 모색유전자의 유전형을 판별하기 위한 단일 염기다형성 대립유전자의 프라이머 또는 프로브 세트를 제공하고자 한다.
본 발명은 진돗개의 모색결정에 관여하는 유전자인 MC1R에 1개 이상의 염기를 보유한 이형접합체(heterozygote)를 선별할 수 있는 것으로 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 서열목록 1과 2의 염기서열, 서열목록 3과 4의 염기서열, 서열목록 5와 6의 염기서열, 서열목록 7과 8의 염기서열, 서열목록 9와 10의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 방법은 열목록 11과 12의 염기서열, 서열목록 13과 14의 염기서열, 서열목록 15와 16의 염기서열, 서열목록 17과 18의 염기서열, 서열목록 19와 20의 염기서열로 구성되는프로브 세트를 이용하는 것을 특징으로 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
진돗개의 모색유전자에 대해, 진돗개의 모색유전자(GenBank NM001014282)의 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 대립유전자의 프라이머 세 트를 이용하여 2개 이상의 대립유전자 특이-실시간중합효소연쇄반응단계; 및 상기 실시간중합효소연쇄반응 후 형광 분석에 의해 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법을 제공한다.
상기 진돗개의 모색결정에 관여하는 유전자는 MC1R에 6개의 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 대립유전자로 G286A, G313A, C470A, G790A 및 C916T를 포함한다.
본 발명은 진돗개 모색유전자의 유전형을 판별하기 위하여 상기 방법에 사용되는 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열목록 1과 2의 염기서열, 서열목록 3과 4의 염기서열, 서열목록 5와 6의 염기서열, 서열목록 7과 8의 염기서열, 서열목록 9와 10의 염기서열로 구성되는 프라이머 세트를 이용한다.
본 발명에 따른 실시간중합효소연쇄반응은 표지된 상기 프라이머나 형광 물질이 있는 프로브 또는 앰플리콘(amplicon)을 이용하여 실시간으로 증폭된 산물의 축적량을 모니터링 할 수 있어 중합효소연쇄반응 산물의 확인을 위해 겔을 이용할 필요가 없다. 이러한 실시간중합효소연쇄반응은 DNA-결합 형광발색단(fluorophore), 선형 올리고프로브, 5' 뉴클레아제 올리고프로브, 헤어핀 올리고프로브 등을 이용하여 중합효소연쇄반응 산물의 생성을 실시간으로 측정한다. 따라서 중합효소연쇄반응 산물의 분석을 위해 별도로 아가로즈 겔에서의 전기영동 등을 실시할 필요가 없다.
본 발명은 진돗개의 모색결정에 관여하는 유전자인 MC1R에 1개 이상의 염기 를 특이적으로 인식하는 프로브들을 이용하여 진돗개의 모색결정 유전자의 실시간중합효소연쇄반응을 수행한 후 각 시료에서 나타나는 형광의 분포를 통하여 진돗개의 모색을 판별하는 방법을 제공한다.
상기 프로브는 상보적으로 결합할 수 있는 2개의 다른 형광 리포터로 표지된 것으로, 본 발명에 따른 진돗개 모색유전자의 유전형을 판별방법은 형광 리포터로 FAMTM 및 TAMRA을 사용하는 것이 바람직하다. 이는 FAMTM 이 표지된 프로브가 소비되어 FAMTM의 형광이 나타난다는 것은 FAMTM으로 표지된 프로브기 인식하는 염기서열이 있다는 말이 되고 이것을 통해 유전자를 식별할 수 있다. TAMRA가 표지된 프로브 역시 같은 원리이다.
본 발명은 진돗개 모색유전자의 유전형을 판별하기 위하여 상기 방법에 사용되는 형광 리포터로 표지된 프로브 세트를 제공한다.
상기 프로브 세트는 서열목록 11과 12의 염기서열, 서열목록 13과 14의 염기서열, 서열목록 15와 16의 염기서열, 서열목록 17과 18의 염기서열, 서열목록 19와 20의 염기서열로 구성되는프로브 세트를 이용한다.
구체적인 예로 G286A의 경우 서열목록 11의 정방향 프로브는 G에만 반응하는 시퀀스로 합성하여 FAMTM-dye로 표지하고, 서열목록 12의 역방향 프로브는 A에만 반응하도록 합성하여 TAMRA와 같은 dye로 표지하면 MC1R 유전자의 단일염기다형성 부위와 특이적으로 결합하게 되어 두 가지 리포터 형광이 발색되게 된다.
도 2는 본 발명에 따라 제작된 상기 G286A 유전자의 프로브 세트를 이용한 것으로, FAMTM dye에만 형광을 나타내는 동종접합체(homozygote) 개체뿐만 아니라 FAMTM 및 TAMRA dye에 형광을 모두 보이는 이형접합체(heterozygote) 개체도 다수 관찰되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 진돗개의 모색유전자의 유전형 판별방법은 진돗개의 모색이 다양하게 발현되는 원리를 보다 쉽게 이해할 수 있을 뿐만 아니라, 자견의 모색고정 및 예측이 가능하여 모색의 혈통관리 체계 확립하는데 크게 기여할 것이다.
이하, 본 발명을 구체적인 실시 예에 의해 보다 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만, 본 발명은 하기 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다.
[
실시예
]
(1) 공시동물
본 시험은 백구 또는 황구인 진돗개 54두를 공시하였다.
(2)
DNA
의 준비
각 개체는 구강 점막에서 swab을 통해 샘플을 준비하였고 게놈 DNA prep 키트를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA는 시험전까지 -20℃에서 보관하였다.
(3)
MC1R
유전자좌의
증폭
본 실험을 위해 먼저 순수하게 MC1R 유전자만을 증폭하여 다시 시료를 준비하였다. 즉, MC1R 유전자(GenBank #NM_001014282)에 기초하여 MC1R-정방향(5'-ATGGTCTGGCAGGGCCCCCA-3')과 MC1R-역방향(5'-TCACCAGGAACATAGCACTA-3') 2개의 프라이머를 이용하여 각 시료의 MC1R 유전자좌 증폭을 실시하였다. 증폭된 유전자는 1% 아가로스 겔에서 전기영동 후, UV 램프하에서 기대되는 증폭산물(약 0.95 kb)을 확인하고, 상기 중합효소연쇄반응 증폭산물을 AccPrepTM 겔 추출 키트(Bioneer, 한국)를 이용하여 아가로즈 겔에서 정제하였다.
(4) 실시간
중합효소연쇄반응
(
allele
-
specific
real
-
time
PCR
) 실시
상기 (3)에서 정제된 중합효소연쇄반응 증폭산물을 주형으로 하여 대립유전자 특이-실시간 중합효소연쇄반응(allele-specific real-time PCR)을 실시하였다.
DNA 증폭은 전변성(95℃, 3분) 후, 변성 (95℃, 30초)과 어닐링/연장(60℃, 30초)을 40회 수행하였다.
이를 위하여 각 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에 특이적인 프라어머 세트와 상보적으로 결합할 수 있는 2개의 다른 형광 리포터로 표지된 프로브 세트를 합성하였다. 합성한 프라이머 및 프로브 세트는 하기 표 1 및 표 2와 같다.
[실험예]
상기 (3)에서 정제된 중합효소연쇄반응 증폭산물을 주형으로 하여 G286A 염기다형성 대립유전자의 대립유전자 특이-실시간 중합효소연쇄반응(allele-specific real-time PCR)을 실시하였다.
상기 G286A 염기다형성 대립유전자의 경우 하나의 프로브는 G에만 반응하는 시퀀스로 합성하여 FAMTM-dye로 표지하고, 다른 하나의 프로브는 A에만 반응하도록 합성하여 TAMRA와 같은 dye로 표지하였다.
그 결과 도 2에서도 확인 할 수 있듯이, FAMTM dye에만 형광을 나타내는 즉, G286A에서 G 시퀀스의 한 가지 염기만을 가진 동종접합체(homozygote) 개체뿐만 아니라 FAMTM 및 TAMRA dye에 형광을 모두 보이는 즉, G와 A 시퀀스 2개의 염기를 동시에 가지는 이형접합체(heterozygote) 개체도 다수 관찰되는 것을 확인 할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 대립유전자 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 진돗개 모색유전자의 대립유전자별 염기의 분포를 확인 한 결과 하기 표 3과 같았다.
상기 실시간 중합효소연쇄반응 결과에서 확인 할 수 있듯이, 각 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)에서 한가지의 염기만을 보인 동종접합체(homozygote)도 있지만 2개의 염기를 동시에 가진 이형접합체(heterozygote)가 다수 관찰되는 것을 확인 할 수 있어 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 프로브 세트를 이용하면 자견의 모색고정을 예측할 수 있다.
도 1은 진돗개 모색유전자의 PCR 증폭산물을 전기영동에서 확인한 결과이고,
도 2는 본 발명에 따른 단일 염기다형성 대립유전자(G286)의 실시간중합효소연쇄반응의 결과를 그래프로 도식화한 도면이다.
(▲: G 및 A의 염기서열 모두 포함, ●: G의 염기서열만 포함)
<110> Industry Foundation of Chonnam National Universityv
<120> Discrimination of MC1R genotypes of the Jindo using
allele-specific probes and primers
<160> 20
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G286A-forward primer
<400> 1
gagcgtgacg aatgtgctgg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G286A-reverse primer
<400> 2
cccaggaagc agaggatgg 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G313A-forward primer
<400> 3
agcgtgacga atgtgctgga gac 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G313A-reverse primer
<400> 4
tgaaccacag atgagcacgt caatg 25
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C470A-forward primer
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atcgccgtgg accgctacc 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C470A-reverse primer
<400> 6
gcgtgctgga gaggacgcta g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A790G-forward primer
<400> 7
agggcgctgc cacactcact 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A790G-reverse primer
<400> 8
tgaaagacgc agccacagat gg 22
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C916T-forward primer
<400> 9
caacctcttc ctcaccctca tcatc 25
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C916T-reverse primer
<400> 10
aggaacatag cactacctct tggagagtc 29
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G286A-P1G(FAM Labelled)
<400> 11
agacggccgt catgctgctg 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G286A-P1A(TAMRA Labelled)
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acgaccgtca tgctgctggt g 21
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G313A-P2G(FAM Labelled)
<400> 13
tggaggcagg cgccttggc 19
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> G313A-P2A(TAMRA Labelled)
<400> 14
tggaggcagg caccttggc 19
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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accacagcat cgtcacactc ccgc 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C470A-PA(TAMRA Labelled)
<400> 16
accacagcat cgtcaaactc ccgc 24
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<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A790G-PA(FAM Labelled)
<400> 17
ttcttgcacc tctcactcat ggtcctct 28
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> A790G-PG(TAMRA Labelled)
<400> 18
ttcttgcacc tctcactcgt ggtcctct 28
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C916T-PC(FAM Labelled)
<400> 19
ttccgcagcc aggagctccg a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C916T-PT(TAMRA Labelled)
<400> 20
ttccgcagcc aggagctctg a 21
Claims (6)
- 진돗개의 모색유전자에 대해, 진돗개의 모색유전자(GenBank NM001014282)의 G286A, G313A, C470A, G790A 및 C916T인 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 대립유전자의 프라이머 세트 또는 프로브 세트를 이용하여 2개 이상의 대립유전자 특이-실시간중합효소연쇄반응단계; 및 상기 실시간중합효소연쇄반응 후 형광 분석에 의해 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서,상기 프라이머 세트는 서열목록 1과 2의 염기서열, 서열목록 3과 4의 염기서열, 서열목록 5와 6의 염기서열, 서열목록 7과 8의 염기서열, 서열목록 9와 10의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법.
- 제 1항에 있어서,상기 프로브 세트는 서열목록 11과 12의 염기서열, 서열목록 13과 14의 염기서열, 서열목록 15와 16의 염기서열, 서열목록 17과 18의 염기서열, 서열목록 19와 20의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법.
- 제 4항에 있어서,상기 프로브는 상보적으로 결합할 수 있는 2개의 다른 형광 리포터로 표지된 것을 특징으로 하는 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법.
- 제 1항, 제 3항 내지 5항 중 선택되는 어느 한 항에 있어서,상기 유전형 판별방법은 각 단일 염기다형성 대립유전자별로 1개 이상의 염기를 보유한 이형접합체(heterozygote)를 선별할 수 있는 것을 특징으로 하는 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법.
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Publications (2)
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| KR1020090043958A KR101081333B1 (ko) | 2009-05-20 | 2009-05-20 | 단일 염기다형성 대립유전자의 프라이머 또는 프로브를 이용한 진돗개 모색유전자의 유전형 판별방법 |
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| KR101749823B1 (ko) | 2015-11-06 | 2017-06-21 | 영남대학교 산학협력단 | 단일염기다형성 마커를 포함하는 삽살이 단모 견종 판별용 조성물 |
-
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 선상수'Microsatellite를 이용한 진돗개 유전자 Polymorphism 분석'전남대학교(2003) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101749823B1 (ko) | 2015-11-06 | 2017-06-21 | 영남대학교 산학협력단 | 단일염기다형성 마커를 포함하는 삽살이 단모 견종 판별용 조성물 |
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