KR101078821B1 - 페닐 에틸리덴 구조를 갖는 화합물을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1의 화합물의 약제학적 유효량을 포함하는 약제학적 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다:

화학식 1

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단하며, 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단하면서도 내피세포의 세포독성에는 영향을 미치지 않기 때문에, 세포사멸을 유도하지 않으면서 혈관신생 반응(angiogenic responses)을 억제하며, 이는 약물의 안전성을 크게 개선한다.

혈관신생, 억제, 비조절, 내피세포, 페닐 에틸리덴

Description

페닐 에틸리덴 구조를 갖는 화합물을 포함하는 혈관신생 억제용 약제학적 조성물{Pharmaceutical Compositions for Inhibiting Angiogenesis Comprising Phenyl Ethylidene Containing Compounds}

본 발명은 혈관신생 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)은 배아의 발생, 상처치료 및 조직 또는 기관의 재생과 같은 다양한 생리적 과정에서 필수적이다(Iwaguchi, T. 1993. Angiogenesis and its regulation. Gan To Kagaku Ryoho 20:1-9.; Kuwano, M. et al., 2001. Angiogenesis factors. Intern. Med. 40:565-572.; 및 Tobelem G. 1990. Endothelial cell growth: biology and pharmacology in regulation to angiogenesis. Blood Coagul. Fibrinolysis 1:703-705.). 그러나, 지속적인 비조절성 혈관신생은 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 고형 종양, 혈관종 및 건선과 같은 혈관신생성 질병을 유발시킨다(Andre, T., et al., 1998. Tumoral angiogenesis: physiopathology, prognostic value and therapeutic perspectives. Rev. Med. Interne. 19:904-9134; Battegay, E. J. 1995. Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects. J. Mol. Med. 73: 333-346; Carmeliet, P. and R. K. Jain. 2000. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407:249-257; 및 Fidler, I. J. 2000. Angiogenesis and cancer metastasis. Cancer J. Sci. Am. 2:134-141).

다양한 종류의 혈관신생 억제제가 개발이 되었다. 상기 억제제는, 자연적이거나 또는 합성된 물질로서, 단백질 분해효소 억제제, 티로신 인산화 효소의 억제제, 케모카인, 인터루킨 및 기질 단백질의 분해 절편을 포함한다(Abedi, H. and I. Zachary. 1997. Vascular endothelial growth factor stimulates tyrosine phosphorylation and recruitment to new focal adhesions of focal adhesion kinase and paxillin in endothelial cells. J. Biol. Chem. 272: 15442-15451; Cao, Y. 2001. Endogenous angiogenesis inhibitors and their therapeutic implications. Int. J. Biochem. Cell Biol. 33: 357-369; Fong, T. A et al., 1999. SU5416 is a potent and selective inhibitor of the vascular endothelial growth factor receptor (Flk-1/KDR) that inhibits tyrosine kinase catalysis, tumor vascularization, and growth of multiple tumor types. Cancer Res. 59:99-106; Kwon, H. J. et al., 2001.J. Microbiol. Biotechnol. 11:656-662).

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 효과적인 항혈관신생제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단하는 신규한 항혈관신생제 발굴하였으며, 이 항혈관신생제는 세포독성을 갖지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 약제학적 혈관신생 억제용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 하기 화학식 1의 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 혈관신생 억제용 조성물을 제공한다:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁-R₄ 및 R₈은 서로 독립적으로 수소, 할로, 히드록시, 시아노, 아미노, 니트로, 니트로소, 카르복실, C₁-C₁₂ 알킬, C₂-C₆ 알케닐기, C₃-C₈ 사이클로알킬, C₅-C₇ 사이클로알케닐, C₁-C₆ 알킬아미노, C₁-C₆ 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬, 아릴알케닐 또는 알킬아릴이고; R₅는 수소 또는 C₁-C₁₂ 알킬이며; 그리고 R₆ 및 R₇은 서로 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C₁-C₁₂ 알킬이다.

본 발명자들은 효과적인 항혈관신생제를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단하는 신규한 항혈관신생제 발굴하였으며, 이 항혈관신생제는 세포독성을 갖지 않음을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 “약제학적 혈관신생 억제용 조성물”로 표현되며, 이는 “혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물” 또는 “비조절 혈관신생-관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물”로 표현될 수도 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 화학식 1로 표시된다. 본 발명의 화합물은 기본적으로 페닐 에틸리덴(Phenyl Ethylidene) 구조를 갖는다.

본 발명의 화합물을 정의하는 화학식 1에서, 용어 “할로”는 할로겐족 원소를 나타내며, 예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 포함한다. 용어 “ C₁-C₁₂ 알킬”은 탄소수 1-12의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₁-C₈ 직쇄 또는 가지쇄 알킬”이고, 보다 바람직하게는 “C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알킬”이며, 이는 저가 알킬로서 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 이소부틸, n-부틸 및 t-부틸을 포함한다. 용어, “알케닐기”는 지정된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분쇄 불포화 탄화수소기를 나타내며, 바람직하게는 C₂-C₆ 직쇄 또는 가지쇄 알케닐이고, 이는 최소 하나의 이중 결합을 갖는 탄소수 2-6의 탄화수소기로서, 예컨대, 에테닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, t-부테닐, n-펜테닐 및 n-헥세닐을 포함한다.

용어 “사이클로알킬”은 지정된 탄소수를 갖는 사이클릭 탄화수소 라디칼을 의미하며, 바람직하게는 “C₃-C₈ 사이클로알킬”이고, 이는 사이클로프로필, 사이클로부틸 및 사이클로펜틸을 포함한다. 용어 “사이클로알케닐”은 지정된 탄소수를 갖으며 최소 하나의 이중 결합을 갖는 사이클릭 탄화수소기를 의미하며, 바람직하게는 “C₅-C₇ 사이클로알케닐”이고, 이는 사이클로펜텐, 사이클로헥센 및 사이클로헥사디엔을 포함한다. 용어 “알킬아미노”는 아미노 치환체를 갖는 알킬기를 의미한다. 용어, “알콕시”는 -O알킬기를 의미한다.

용어 “아릴”은 전체적으로 또는 부분적으로 불포화된 치환 또는 비치환된 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 탄소 고리를 의미하며, 바람직하게는 모노아릴 또는 비아릴이다. 모노아릴은 탄소수 5-6을 갖는 것이 바람직하며, 비아릴은 탄소수 9-10을 갖는 것이 바람직하다. 가장 바람직하게는 상기 아릴은 치환 또는 비치환된 페닐이다. 모노아릴, 예컨대, 페닐이 치환되는 경우에는, 다양한 위치에서 다양한 치환체에 의해 치환이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는, 할로, 히드록시, 니트로, 시아노, C₁-C₄ 치환 또는 비치환된 직쇄 또는 가지쇄 알킬, C₁-C₄ 직쇄 또는 가지쇄 알콕시, 알킬 치환 설파닐, 페녹시, C₃-C₆ 사이클로헤테로알킬 또는 치환 또는 비치환 아미노기에 의해 치환될 수 있다.

용어, “헤테로아릴”은 헤테로사이클릭 방향족기로서, 헤테로원자로서 N, O 또는 S를 포함하는 것이다. 바람직하게는, 헤테로아릴은 헤테로원자로서 N을 포함하는 헤테로비아릴이다.

용어, “아릴알킬(아랄킬)”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 바람직하게는 벤질기이다. 용어, “알킬아릴”은 하나 또는 그 이상의 아릴기로 이루어진 구조에 결합된 알킬기를 의미한다. 용어, “아릴알케닐”은 하나 또는 그 이상의 알킬기에 의한 구조에 결합된 아릴기를 의미하며, 바람직하게는 페닐 에테닐기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₁-R₄ 및 R₈은 서로 독립적으로 수소, 히드록시, C₁-C₁₂ 알킬 또는 C₁-C₆ 알콕시이고, 보다 바람직하게는 서로 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C₁-C₁₂ 알킬이며, 가장 바람직하게는 수소이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₅는 C₁-C₁₂ 알킬이고, 보다 바람직하게는 C₁-C₈ 알킬이며, 보다 더 바람직하게는 C₃-C₈ 알킬이고, 가장 바람직하게는 펜틸기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₆-R₇은 서로 독립적으로 수소, 히드록시 또는 C₁-C₈ 알킬이고, 보다 바람직하게는 C₁-C₄ 알킬이며, 보다 더 바람직하게는 메틸 또는 에틸기이고, 가장 바람직하게는 메틸기이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 R₁-R₄는 수소이고, R₅는 C₃-C₈ 알킬이며, R₆-R₇은 메틸 또는 에틸기이고, R₈은 수소이다.

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 1의 화합물에서 R₁-R₄는 수소이고, R₅는 펜틸기이며, R₆-R₇은 메틸기이고, R₈은 수소이다. 상기 정의된 화합물은 (3-메틸-5-니트로-3H-이미다졸-4-일설파닐)-아세트산[1-(4-펜틸옥시-페닐)-에틸리덴]-히드라자이드이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질병, 질환 또는 상태는 혈관신생과 관련된 다양한 질환을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은, 암, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망 막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환이다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 자가면역질환은 알로페시아 그레아타(alopecia greata), 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가면역 아디슨 질환, 부신의 자가면역 질환, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 간염, 자가면역 난소염 및 고환염, 자가면역 혈소판감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근병증, 복강 스프루우-피부염(celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역이상 증후군, 만성염증성 탈수초 다발성 신경병증, Churg-Strauss 증후군, 반흔성유천포창, CREST 증후군, 한냉 응집소 질환, 크론씨병, 원판성 낭창, 복태성복합한냉글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스 질환, 귈레인 바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유화증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, IgA 신경염, 연소자성 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합성 연결 조직 질환, 다발성 경화증, 타입 I 또는 면역-매개 당뇨병, 중증근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결정성 다발동맥염, 다발연골염, 자가면역성 다선 증후군, 류마티스 다발성근통, 다발성 근염과 피부근염, 일차성 무감마글로불린혈증, 일차성 담증성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류마티스 관절염, 사르코이드증, 공피증, 강직인간 증후군, 전신성 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 다가야스 동맥염, 일시적 동맥염, 거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 백반증 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 염증성 질환의 예는, 천식, 엔세필리티스(encephilitis), 염증성 장염, 만성 폐쇄성 폐질환, 알러지, 폐혈병성 쇼크증, 폐섬유증, 미분화 척추관절증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골용해 및 만성 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 질환은 암 또는 당뇨병성 망막증이다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상기 화학식 1의 화합물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여, 점막 투여 및 점안 투여 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.0001-100 ㎎/kg(체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 내피세포의 증식, 관 형성(tube formation) 및 침입(invasion)을 억제한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포 의 증식 및 이동을 효과적으로 차단함으로써 효과적으로 그리고 인체에 안전한 방식으로 혈관신생을 억제하여 다양한 혈관신생-관련 질환 또는 질병의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다(참고: 도 1 내지 도 4).

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 혈관신생의 과정에서 중요한 단계인 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단한다.

(ⅱ) 본 발명의 약제학적 조성물은 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다.

(ⅲ) 본 발명의 약제학적 조성물에서 유효성분으로 이용되는 화합물은 내피세포의 증식 및 이동을 효과적으로 차단하면서도 내피세포의 세포독성에는 영향을 미치지 않기 때문에, 세포사멸을 유도하지 않으면서 혈관신생 반응(angiogenic responses)을 억제하며, 이는 약물의 안전성을 크게 개선한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험재료 및 실험방법

1. 세포의 증식에 대한 영향

본 발명의 화합물인 YCG063(즉, 화학식 1에서 R₁-R₄는 수소이고, R₅는 펜틸이며, R₆-R₇은 메틸이고, R₈은 수소인 화합물)은 Autora Screening Library 사에서 구입하였다. 내피세포의 증식은 다수의 단계로 구성된 혈관신생의 과정에서 중요한 단계이다. 이에, 본 발명의 화합물이 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell)과 다른 몇 가지 세포주에서 증식을 억제하여 항혈관신생 활성을 나타내는 지 여부를 다음과 같이 분석 하였다: 우선, 5 × 10³ HUVECs, HCT15, HeLa 세포(한국 세포주 은행)를 96-웰 플레이트에 분주하고, 10% 우태아 혈청(Invitrogen)이 포함된 배지에서 배양하였다. 이어, PBS를 사용하여 세포를 세척한 다음, 다시 신선한 동일배지로 교환하였다. 그런 다음, 각 웰에 다양한 농도로 화합물을 첨가하고, 3일 동안 배양하며, MTT 분석을 실시하였다. MTT 분석은 다음과 같이 실시하였다: 50 ㎕의 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, 2 ㎎/㎖ 스톡용액, Sigma)를 각 웰에 첨가하고, 4시간 동안 방치한 다음, 배지를 제거하고 100 ㎕ DMSO를 각 웰에 첨가하였다. 이어, 유니버셜 마이크로플레이트 리더(universal microplate reader, BIO-TEK INSTRUMENTS, INC.)를 이용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여, 세포의 생존성을 측정하였다(도 1).

2. 내피세포의 세포 독성에 미치는 영향

화합물이 활성 농도에서 세포 독성을 나타내지 않으면서 세포 증식을 저해하는 것이 화합물의 활성 확인에 필요한 단계이다. 이에, 본 발명의 화합물이 HUVECs에서 세포 독성을 나타내는 지 여부를 다음과 같이 분석 하였다: 우선, 1 × 10⁴ HUVECs 세포를 24-웰 플레이트에 분주하고, 10% 우태아 혈청이 포함된 배지에서 배양하였다. 이어, 각 웰에 다양한 농도로 화합물을 첨가하고, 3일 동안 배양하며, 2일과 3일 째에 분석을 수행하였다. 세포 독성 분석은 다음과 같이 실시하였다: 항온 배양한 세포에 트립신을 처리하여 배양기에서 5분간 반응시킨다. 이어, 회수한 세포를 1분간 3000 rpm으로 원심분리하여 세포만 모은다. 회수한 세포를 10 ㎕의 PBS로 풀어준 후, 10 ㎕ 트립판 블루 용액과 섞어 세포 내부의 염색여부를 현미경으로 관찰하였다(도 2).

3. 내피세포의 관 형성(tube formation)에 대한 영향

혈관신생의 주요 특성 중의 하나인 내피세포의 이동에 의해 혈관형태의 모세관 형성이 이루어져야 신생 혈관이 형성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물이 이러한 내피 세포의 모세관 형성에 미치는 영향을 조사하였다.

48-웰 플레이트에 150 ㎕의 마트리겔(10 ㎎/㎖, Collaborative Biomedical Products)을 코팅하고, 37℃에서 2시간 동안 중합시켰다. 이어, HUVECs을 마트리 겔에 접종하고, VEGF(Upstate Biotechnology) 50 ng/㎖를 처리하였다. 그런 다음, 화합물을 첨가하고, 18시간 동안 항온 처리하였다. 세포의 형태학적 변화를 현미경 하에서 관찰하였고, ImagePro Plus 소프트웨어(Media Cybernetics, Inc.)로 40배 사진 촬영하였다. 관 형성 내피 세포에 대한 세포 독성은 트립판 블루 염색으로 평가하였다(도 3).

4. 내피세포의 침입( invasion )에 대한 영향

혈관신생의 주요 특성 중의 하나인 내피세포의 이동에 의해 자신의 기저막(basement membrane)의 파괴 및 관통이 이루어져야 신생 혈관이 형성될 수 있으며, HUVECs은 이러한 내피세포 침입을 촉진할 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물이 이러한 내피세포 침입에 영향을 미치는 지 여부를 조사하였다.

HUVECs의 침입은 폴리카보네이트 필터가 있는 트랜스웰 챔버 시스템(Transwell chamber, Corning Costar)을 이용하여 인 비트로에서 실시하였다. 우선, 상기 필터의 하부를 10 ㎕ 젤라틴(1 ㎍/㎕)으로 코팅하고, 필터의 상부를 10 ㎕의 마트리겔로 코팅하였다. 600 ㎕ EGM에 위치한 하부 웰에 VEGF 50 ng/㎖ 및 화합물을 첨가하였다. 이어, 필터의 상부에 HUVECs (1 × 10⁵ 세포)를 위치시킨 후, 챔버를 37℃에서 18시간 동안 항온 처리하였다. 70% 메탄올로 세포를 고정시키고, 헤마톡실린/에오신으로 염색한 다음, 현미경 하에서 하나의 필터 내의 전체 세포를 계수함으로써 세포 침입 정도를 결정하였고, ImagePro Plus 소프트웨어를 이용하여 40배로 사진 촬영하였다(도 4).

5. 융모요막에서 혈관신생에 대한 영향

상술한 화합물의 인 비트로 혈관신생 억제 활성 결과를 인 비보 수준에서 검증하기 위하여, 융모요막(chorioallantoic membrane: CAM)에서 혈관신생 억제 활성을 나타내는 지 여부를 실험하였다. 수정된 계란을 37℃에서 3일 동안 배양한 다음, 피하침으로 난알부민 약 2 ㎖을 제거하여 CAM과 난황낭을 난막으로부터 제거하였다. 3.5일째에, 난 껍질에 구멍을 뚫고, 난막을 제거하였다. 터마녹스 커버슬립(thermanox coverslip) 위에 화합물을 처리 및 건조시키고, 4.5일령 배자 단계의 CAM 표면 위에 놓았다. 2일 경과 후, 10% 지방 에멀젼 2 ㎖을 CAM에 주입하고, CAM을 현미경으로 관찰하였다. 시료-처리된 CAM이 무혈관 영역을 나타내는 경우, 결과를 포지티브로 정하였고 최종 점수는 포지티브 난 vs. 시험 대상 총 난의 수의 백분율로 나타내었다(도 5).

실험결과

1. 내피세포의 증식 및 세포 독성에 대한 영향

혈관신생(angiogenesis)은 배아의 발생, 상처치료 및 조직 또는 기관의 재생과 같은 무수한 생리적 과정에서 필수적이다(1). 그러나, 지속적인 비조절성 혈관신생은 류마티스 관절염, 당뇨성 망막염, 고형 종양, 혈관종 및 건선과 같은 혈관신생성 질병을 유발시킨다(2). 따라서, 새로운 항혈관신생 화합물은 혈관신생 과 연관된 암 및 다른 인간 질병의 치료제로 개발될 수 있다. 그리하여, 본 발명 화합물인 YCG063이 항혈관신생 활성을 나타내는 지 확인하기 위해, 기본적인 활성 확인 방법인 내피세포의 증식과 세포 독성에 관한 분석을 실시하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, 실험 결과 화합물은 농도-의존적으로 HUVECs과 HCT15, HeLa의 증식을 억제하였다. HUVECs에 대한 IC₅₀은 30 μM, HCT15에 대한 IC₅₀은 40 μM이며, HeLa의 IC₅₀은 50 μM 이상임을 확인할 수 있었다. 도 1에서 대조군은 유효 성분을 처리하지 않은 것을 나타낸다. 본 발명 화합물을 처리한 결과, HCT15와 HeLa에서 보다 HUVECs에서 세포 증식 저해 효과가 더 크게 나타났다. 세포 독성을 관찰한 도 2의 결과에서 확인 가능하듯이, 20 μM 이하에서 화합물을 처리한 세포의 90 % 이상이 세포 생존도를 보였다. 이러한 결과는, 본 발명 화합물이 내피세포에 독성을 보이지 않으며, 증식 저해에 더욱 특이적인 효과를 나타기 때문에 항혈관신생 치료제로 개발될 수 있음을 나타낸다.

2. 혈관신생 저해 활성 분석 결과

본 발명 화합물인 YCG063이 항혈관신생 작용을 나타내는 지 확인하기 위해, 대표적인 인 비트로(in vitro) 혈관신생 측정 방법인 내피세포의 관 형성 및 침입 분석을 실시하였다(3,4). 도 3과 4에서 보는 바와 같이, YCG063은 VEGF에 의해 유도되는 HUVECs의 관 형성 및 침입을 농도-의존적으로 억제하였다. 특히 HUVECs 침입에 대한 억제 효과는 1-5 μM의 낮은 농도에서 발휘되었다. 게다가, 본 발명 화합물에 의해 혈관신생이 억제된 세포들이 트립판 블루에 의해 염색되지 않는 것으로 보아, YCG063의 항혈관신생 활성이 세포 독성으로부터 초래되는 것은 아님을 보여준다. 이러한 결과는 YCG063이 새로운 항혈관신생 치료제로 개발될 수 있음을 나타낸다.

본 발명 화합물인 YCG063이 인 비보(in vivo)에서도 항혈관신생 작용을 나타내는 지 확인하기 위해, 융모요막에서의 혈관신생 저해도를 측정하였다. 실험 결과, 레틴산의 혈관 신생 억제도는 85%(n = 13)이었고, 엠티(empty) 커버슬립은 45%(n = 11)이었다. 그러나, 본 발명 화합물의 1 ㎍/난(egg)은 독성을 나타내지 않으면서도 효과적으로 융모요막의 혈관신생을 억제하였고(57%, n = 14), 2 ㎍/난(egg)에서도 역시 효과적으로 혈관신생을 억제함을 확인할 수 있었다(89%, n = 9). 실험 결과는 하기 표 1에 정리되어 있다.

처리 화합물	억제된 난/생존 난	억제율(%)
엠티	5/11	45
RA(1 ㎍/난)	11/13	85
본 발명 화합물(1 ㎍/난)	8/14	57
본 발명 화합물(2 ㎍/난)	8/9	89

도 5는 본 실험의 현미경 관찰 사진으로서, 본 발명의 화합물이 인 비보에서 혈관신생을 억제함을 보여준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참조 문헌

1. Folkman J and Shing Y 1992. Angiogenesis. J Biol Chem 267(16): 10931-10934.

2. Carmeliet P and Jain RK 2000. Angiogenesis in cancer and other diseases. Nature 407: 249-257.

3. Shim JS, Kim JH, Cho HY, Yum YN, Kim SH, Park HJ, Shim BS, Choi SH, and Kwon HJ. 2003. Irreversible inhibition of CD13/aminopeptidase N by the antiangiogenic agent curcumin. Chemistry & Biology 10(8): 695-704

4. Jung HJ, Lee HB, Lim CH. Kim CJ, and Kwon HJ. 2003. Cochlioquinone A1, a new anti-angiogenic agent from Bipolaris zeicola. Bioorganic and medicinal chemistry 11(22): 4743-4747

도 1은 화합물 72시간 처리 후의 세포 증식 정도를 측정한 실험결과를 나타낸 도면이다. 세포 주에 따른 화합물의 활성을 확인하기 위하여 HUVECs, HCT15 및 HeLa 세 종류의 세포에서 실험을 수행하였다. 무처리군에 비하여 화합물을 1, 5, 10, 20 및 50 μM 처리하였을 때 세포 증식 정도를 MTT로 측정하여 상대비율로 나타낸 결과이다.

도 2는 화합물 처리 24 및 48시간 후의 세포 독성을 확인한 실험결과를 나타낸 도면이다. HUVECs 세포에 5, 10, 20 및 50 μM 처리하였을 때 세포 생존 정도를 트리판 블루(trypan blue)용액의 세포 내 염색 상태로 측정하였다. 세포 내부가 파란색으로 염색된 경우를 화합물에 의한 독성으로 세포가 사멸한 것으로 판단하였으며, 이를 죽은 세포/생존한 세포의 비로 나타낸 결과이다.

도 3은 인 비트로(in vitro) 혈관신생 측정 방법인 내피세포의 관 형성 및 침입 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다. 혈관신생인자인 VEGF 50 ng/㎖로 유도된 내피세포의 관 형성이 화합물 YCG063 을 처리하였을 때에는 저해되는 것을 확인할 수 있다. 화살표는 관 형성을 저해한 부위를 표기한 것이다. 내피세포의 관 형성이 VEGF에 의해 유도되고 화합물에 의해 저해되는 정도를 상대적인 비율로도 나타낸 것이 오른쪽 아래의 표이다. NT는 Not Treated를 나타낸다.

도 4는 인 비트로(in vitro) 혈관신생 측정 방법인 내피세포의 침입에 대한 효과를 보인 결과를 나타낸 도면이다. 혈관신생인자인 VEGF 50 ng/㎖로 유도되는 HUVEC세포의 침입을 화합물이 저해하는 정도를 트랜스웰 하부로 넘어온 세포 수로 측정하였으며 이를 상대비율로 표기하였다.

도 5는 인 비보(in vivo)의 항혈관신생 작용을 평가하기위해, 수정란 융모요막에서의 혈관신생 저해도를 측정한 실험으로 융모요막 중에서 커버슬립이 올려졌던 부위를 사진으로 나타낸 도면이다. 무처리군에 비하여 대조군으로 사용된 레틴산과 본 발명 화합물이 기존의 혈관의 저해를 보이지 않은 채 새로 형성되는 혈관만을 저해함을 확인할 수 있는 사진이다. 화살표는 혈관신생이 저해된 부위를 나타낸다. 정량된 결과는 표 1에 제시하였다.

Claims (8)

1. (a) 하기 화학식 1의 화합물의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 염증 또는 신경퇴행성 질환의 혈관신생-관련 질병 또는 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.

   화학식 1

   

   상기 화학식에서, R₁-R₄ 및 R₈은 수소이고; R₅는 C₃-C₈ 알킬이며; 그리고 R₆ 및 R₇은 서로 독립적으로 메틸 또는 에틸기이다.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 내피세포의 증식, 관 형성 및 침입을 억제하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.

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