KR101070964B1

KR101070964B1 - 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101070964B1
Application number: KR1020090000633A
Authority: KR
Inventors: 김광중; 양재하; 장은영; 곽재일
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2011-10-06
Also published as: KR20100081405A

Abstract

본 발명은 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 본 발명의 시호추출물은 반복적인 니코틴투여로 인한 민감화 유발 동물모델에서 약물 중독의 지표로 사용되는 행동적 민감화(Behavioral sensitization) 반응인 보행성 활동량 및 상동적 행동량의 감소효과뿐만 아니라, 뇌의 측핵과 선조체에서의 신경활성 지표인 c-Fos 및 FosB 발현을 급격히 감소시킴을 확인함으로써, 상기 조성물은 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

시호, 행동적 민감화(Behavioral sensitization) 반응, c-Fos, FosB, 보행성 활동량

Description

시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising the extract of Bupleurum falcatum L. for preventing and treating drug intoxication or withdrawal symptoms}

본 발명은 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품에 관한 것이다.

[문헌 1] Di Chiara, Imperato A. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentration in the mesolimbric system of freely moving rat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.5274-5278, 1988

[문헌 2] Einhorn, L.C., et al., Electrophysiological effect of cocaine in the mesoaccumbens dopamine system:studies in the ventral tegmental area, J Neurosci., 8(1), pp 100-112, 1988

[문헌 3] Zhao RJ et al., The essential oil from Angelica gigas NAKAI suppresses nicotine sensitization, Biol. Pharm. Bull., 28(12), pp.2323-2326, 2005

[문헌 4] Kim Sang Eun et al., Effect of Ginseng Saponins on Enhanced Dopaminergic Transmission and Locomotor Hyperactivity Induced by Nicotine, Neuro. psychopharmacology, 31, pp.1714-1721, 2006

[문헌 5] Hurd YL, et al., Cocaine: an in vivo micro dialysise valu at ion of its acute action on dopamine transmission in rats triatum., 3(1), pp.48-54, 1989

[문헌 6] Assunta Imperoto et al., Nicotine preferentially stimulates dopamine release in the limbic system of freely moving rats, European journal of pharmacology, 132, pp.337-338, 1986

[문헌 7] Ksir C et al., Chronic nicotine and locomotor activity: influences of exposure dose and test dose, Psychopharmacology, 92(1), pp.25-29, 1987

[문헌 8] Benwell ME, et al., The effects of acute and repeated nicotine treatment on nucleus accumbens dopamine and locomotor activity, Br. J. Pharmacol., 105(4), pp.849-856, 1992

[문헌 9] Corrigall WA et al., The mesolimbic dopaminergic system is implicated in the reinforcing effects of nicotine, Psychopharmacology, 107(2-3), pp.285-289, 1992

[문헌 10] Clarke PB., Mesolimbic dopamine activation-the key to nicotine reinforcement? Ciba Found Symp., Review, 152, pp.153-168, 1990

[문헌 11] Shim I et al., Role of nitric oxide synthase inhibitors and NMDA receptor antagonist in nicotine-induced behavioral sensitization in the rat., Eur J Pharmacol., 443(1-3), pp.119-124, 2002

[문헌 12] Chae Youn byoung et al., Shim Acupuncture attenuates repeated nicotine-induced behavioral sensitization and c-Fos expression in the nucleus accumbens and striatum of the rat, Neuroscience Letters, 358, pp.87-90, 2004

[문헌 13] 박종희, 한약백과도감(상), 도서출판 신일상사, pp.497-499, 2002.

[문헌 14] Karasinska JM et al., Eur Neurosci., 22(7), pp.1741-1750, 2005

[문헌 15] Jang EY, et al., Eur J Pharmacol., 587(1-3), pp.124-128, 2008

[문헌 16] Marttila K, et al., Neuropharmacology. 51(1), pp.44-51, 2006

[문헌 17] 이형철 외, 동의병리학회지, 15(4), pp.543-547, 2001

과학문명의 발달과 급진하는 경제사회에 따른 현대인들의 잇따른 스트레스로 인해 약물 중독의 확산은 가장 중요한 현대 사회문제 중의 하나이다. 약물이란 질병을 예방, 치료하는데 사용되는 물질을 지칭하며, 신체기능의 변화를 일으키는 물질을 말한다. 이러한 약물의 남용은 부정적인 측면에서 신체적, 정신적, 사회적으로 자기 파괴의 문제를 발생시킨다. 약물 중독은 아편이나 신경안정제 또는 알코올과 같은 약물에 대한 신체적인 반응을 지칭한다. 이러한 약물 중독은 내성, 금단증상 및 습관화의 현상을 가지는데, 약물의 사용으로 인한 통제력 상실을 의미하기도 한다. 최근의 약물남용은 청소년, 여성 약물남용자의 증가로 인한 세계적으로 심각한 정신질환중의 하나로서, 중독성 약물에 대한 치료제의 개발은 시급한 현실이다. 이러한 약물 중독의 해결책으로 여러 가지 사회정책 및 치료, 재활을 위한 프로그램이 이루어지고 있지만, 근본적인 치료대책으로서, 한계점을 가지고 있다.

전 세계적으로 성인의 1/3이 흡연을 하며 대부분의 경우는 청소년 때부터 흡연이 시작된다. 최근에는 여성 흡연자의 수가 증가하고 있는 추세로 흡연으로 인한 심맥관계질환, 뇌혈관계질환, 및 위장관계질환 등의 건강 문제뿐만 아니라 사회문제로까지 대두되고 있다.

이러한 부정적인 영향(negative effect)이 있음에도 사람들이 금연을 하지 못하고 흡연을 계속하는 이유는 담배 속에 들어있는 ‘니코틴’이라는 성분 때문이다. 일반적으로, 니코틴을 포함한 코카인이나 암페타민, 모르핀 등과 같은 모든 중 독성 약물들은 뇌로 전달되어 쾌감(euphoria)을 만들어 내는데, 이는 중독성 약물들이 중추신경계의 주요 도파민계인 중뇌변연계(mesolimbic system)와 흑질선조체(nigrostriaral pathway)를 자극을 하여 나타나며, 이는 중독성 약물의 강화작용(reinforcing property)과 조건화된 행동방식에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Di Chiara, Imperato A. Drugs abused by humans preferentially increase synaptic dopamine concentration in the mesolimbric system of freely moving rat, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, pp.5274-5278, 1988).

또한, 중독성 약물들은 행동방식 중 행동적 민감화 (Behavioral sensitization)현상을 유발하는데 행동적 민감화란 적은 양의 중독성 약물을 반복적 또는 간헐적으로 투여하면 보행성 활동량(locomotor activity)과 상동적 행동(stereotypy)이 점진적으로 증가하는 현상으로, 활동량의 점차적인 증가가 유도발달되는 상태인 발달 단계(Development = induction of sensitization)와 일단 발달된 활동량이 비교적 장기간 유지되는 상태인 발현 단계 (expression of sensitization)로 나타나게 되는데, 이러한 현상을 담당하는 신경적 근저(neural substrate)는 중추 신경계내 중뇌 변연 도파민계(mesolimbic dopamine pathway)로 도파민 신경세포와 그 표적영역인 측좌핵(NAc, nucleus accumbens)과 선조체(striatum)인 것으로 알려져 있다(Einhorn, L.C., et al., Electrophysiological effect of cocaine in the mesoaccumbens dopamine system:studies in the ventral tegmental area, J Neurosci., 8(1), pp 100-112, 1988).

급성 또는 반복적인 니코틴 투여는 복측피개영역(VTA, ventral tegmental area)에서 측좌핵과 선조체로 향하는 도파민 신경을 자극하여 도파민계의 표적 영역인 측좌핵과 선조체에서의 도파민의 유리를 자극하고(Zhao RJ et al., The essential oil from Angelica gigas NAKAI suppresses nicotine sensitization, Biol. Pharm. Bull., 28(12), pp.2323-2326, 2005; Kim Sang Eun et al., Effect of Ginseng Saponins on Enhanced Dopaminergic Transmission and Locomotor Hyperactivity Induced by Nicotine, Neuro. psychopharmacology, 31, pp.1714-1721, 2006; Hurd YL, et al., Cocaine: an in vivo micro dialysise valu at ion of its acute action on dopamine transmission in rats triatum., 3(1), pp.48-54, 1989). 그 결과 보행성 활동량을 증가시키며, 반복적인 니코틴 투여시에는 행동적 민감화(behavior sensitization)를 유발시킨다(Assunta Imperoto et al., Nicotine preferentially stimulates dopamine release in the limbic system of freely moving rats, European journal of pharmacology, 132, pp.337-338, 1986; Ksir C et al., Chronic nicotine and locomotor activity: influences of exposure dose and test dose, Psychopharmacology, 92(1), pp.25-29, 1987; Benwell ME, et al., The effects of acute and repeated nicotine treatment on nucleus accumbens dopamine and locomotor activity, Br. J. Pharmacol., 105(4), pp.849-856, 1992).

또한, 도파민 신경회로를 손상시키면 중독성 약물의 강화능력이 사라지고(Corrigall WA et al., The mesolimbic dopaminergic system is implicated in the reinforcing effects of nicotine, Psychopharmacology, 107(2-3), pp.285- 289, 1992), 니코틴에 의한 보행성 활동이 억제된다(Clarke PB., Mesolimbic dopamine activation-the key to nicotine reinforcement? Ciba Found Symp., Review, 152, pp.153-168, 1990). 이러한 이전의 연구결과들에 의해 메소림빅 시스템(Mesolimbic system)에서의 DA 트랜스미션(transmission)은 니코틴의 강화작용에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 행동적 민감화와 관련하여 최근에는 전시냅스에서 분비된 신경전달물질이 후시냅스의 자기고유의 수용체와 결합함으로써 일어나는 하위 메커니즘에 대한 연구가 보고 되고 있다. 그 중 반복적인 니코틴 투여 시 전사인자 중 Fos family에 속하는 초기유전자인 c-fos와 Delta FosB의 발현을 증가시킨다(Shim I et al., Role of nitric oxide synthase inhibitors and NMDA receptor antagonist in nicotine-induced behavioral sensitization in the rat., Eur J Pharmacol., 443(1-3), pp119-124, 2002; Chae Youn byoung et al., Shim Acupuncture attenuates repeated nicotine-induced behavioral sensitization and c-Fos expression in the nucleus accumbens and striatum of the rat, Neuroscience Letters, 358, pp.87-90, 2004).

따라서 니코틴 중독성에 관여하는 신경기전의 규명이야말로 약물중독치료에 궁극적인 해답을 줄 수 있을 것이다.

시호(Bupleurum falcatum L.)는 미나리과의 여러해살이풀로 산지나 들에서 자라며, 특이한 냄새가 있으며, 맛은 약간 쓰다. 예로부터 뿌리는 오한, 해열, 제암, 늑막염, 해수, 모세혈염, 강심, 사기, 상한, 익기, 열로, 진통, 지해 및 말라리아 등의 약으로 사용하여 왔으며, 성분은 지방유가 약 2%(stearic acid, oleic acid, linolic acid, linolenic acid 등) 함유되어 있고, 당으로서 아도니티올(adonitiol)이 함유되어 있다. 또한 사포닌(saponin)배당체로서 세이코사포닌(saikosaponin) a, 세이코사포닌 b, 세이코사포닌 c, 세이코사포닌 d, 세이코사포닌 e, 세이코사포닌 f(이 중에서 saikosaponin b는 saikosaponin d에서 2차적 생성물이다), 및 그것에 대응하는 사포게닌(sapogenin) E, 사포게닌 F, 사포게닌 G가 알려져 있다. 스테롤(sterol)성분으로서는 α-스피나스테롤(α-spinasterol; 약 70%), 스티그마스테롤(stigmasterol), Δ⁷-스티그마스테놀(Δ⁷-stigmastenol),Δ²²-스티그마스테놀(Δ²²-stigmastenol)이 함유되어 있으나(박종희, 한약백과도감(상), 도서출판 신일상사, pp.497-499, 2002), 상기 문헌 어디에도 시호추출물이 약물 중독 및 금단증상에 효과적이라는 어떠한 개시도 된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 시호(Bupleurum falcaum L.)추출물이 반복적인 니코틴투여로 인한 민감화 유발 동물모델에서 약물 중독의 지표로 사용되는 행동적 민감화(Behavioral sensitization) 반응인 보행성 활동량 및 상동적 행동량의 감소효과뿐만 아니라, 뇌의 측핵과 선조체에서의 신경활성 지표인 c-Fos 및 FosB 발현을 급격히 감소시킴을 확인함으로써, 약물 중독 및 금단증상의 치료 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중 독 및 금단증상의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한 본 발명은, 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 시호추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 용매 또는 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합 용매, 보다 바람직하게는 60 내지 100% 에탄올 혼합용매, 가장 바람직하게는 90 내지 100% 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 약물은 코카인(cocaine), 암페타민(amphetamine),니코틴(nicotine), 모르핀(morphine), 대마초, 알코올(alcohol) 또는 카페인(caffeine) 등이며, 바람직하게는 니코틴임을 특징으로 포함한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 시호추출물은 하기와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 시호를 음건하여 마쇄한 후, 시호 중량의 약 1 내지 25배, 바람직하게는 약 5 내지 20배 분량의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 용매 및 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합 용매, 보다 바람직하게는 60 내지 100% 에탄올 혼합용매로, 실온에서 약 10 내지 96시간, 바람직하게는 60 내지 80시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 냉침 추출한 후 수득한 추출액을 여과, 감압 농축 또는 건조하여 본 발명의 시호추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 수득한 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.02 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 시호추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(Intracerebroventricular) 주사 에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 시호추출물을 유효성분으로 함유하는 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본원에서 정의되는 “건강기능식품”은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 백지추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 시호추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 추출물은 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료를 위한 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 시호추출물은 반복적인 니코틴투여로 인한 민감화 유발 동물모델에서 약물 중독의 지표로 사용되는 행동적 민감화(Behavioral sensitization) 반응인 보행성 활동량 및 상동적 행동량의 감소효과뿐만 아니라, 뇌의 측핵과 선조체에서의 신경활성 지표인 c-Fos 및 FosB 발현을 급격히 감소시키는 효과를 나타내는 바, 약물 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 약학조성물 또는 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 실험동물의 준비

실험동물은 체중 250-260 g의 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)계 수컷 랫트(효창사이언스)를 사용하였고, 대구한의대학교 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 21±2, 명암: 12시간 명암주기)에서, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하며 실험시작 전에 실험동물을 3일 동안 하루에 10분씩 사전취급(Handling)한다.

참고예 2. 통계처리

보행성 활동량은 박스 내에서 수평이동거리(㎝)로 측정하였으며, 자가 투여장치 실험은 랫트의 자발적인 약물 섭취반응수를 측정하여 기록하였다. 통계적 유의성은 SPSS 프로그램(Version 11.01)의 원웨이(one-way) ANOVA로 검정하여 p값이 0.05이하인 경우에 유의한 것으로 인정하였다.

실시예 1. 시호추출물의 제조

대구광역시에 위치한 대원약업사에서 구입한 시호 3kg을 음건하여 세절한 후, 15ℓ의 95% 에탄올을 가하고, 상온(24℃)에서 72시간 동안 추출하여 수득한 추출액을 여과한 후, 감압농축기 (EYELA Co., Japan)로 감압 농축하여 시호추출물 270g을 수득하였다(이하 “BF"라 함).

실험예 1. 약물 투여 후 행동적 민감화 반응에 대한 시호추출물의 효과

약물 투여로 의한 행동적 민감성에 대한 상기 실시예 1의 시호추출물의 효과를 확인하기 위하여 하기와 같이 니코틴 투여 후 랫트의 보행성 활동량 및 상동적 행동량 변화에 대한 실험을 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 방법으로 수행하였다(Karasinska JM et al., Eur Neurosci., 22(7), pp.1741-1750, 2005).

1-1. 측정 방법

실험동물의 보행성 활동량은 비디오트랙킹(videotracking)을 이용하여 에토비젼 프로그램(Ethovision program, Noldus Information Technology BV, Wageningen, Netherlands)으로 측정하였다. 보행성 활동량은 가로, 세로, 높이가 각각 40ⅹ40ⅹ45 cm로 만들어진 검은색의 무광택 아크릴 상자 안에 넣어 실험동물의 움직임을 상자 위에 설치된 디지털 카메라를 사용하여 비디오트랙킹(videotracking) 방법으로 측정하였다. 실험절차는 행동 측정 당일 날, 실험동물의 몸무게를 측정한 후, 9개의 활동량 측정상자에 개별적으로 넣어 1시간 동안의 적응시간을 거친 다음, 그 후 1시간 동안 동물의 안정시의 보행성 활동량을 측정하였다. 그리고 난 후, vehicle 및 시호 추출물 mg/kg를 2 ㎖/kg기준으로 복강주사 하고, 약물이 충분히 몸 안에서 흡수되도록 30분 동안 두었다. vehicle 또는 시호 추출물 투여 30분 후, 니코틴 (0.4 mg/kg)을 피하 주사 한 후, 1시간 동안 보행성 활동량을 측정하였다. Vehicle은 70 % polyethylene glycol, 10% EtOH, 1% Tween 80, 생리식염수로 이루어진 것으로 사용하였다.

1-2. 보행성 활동량 및 상동적 행동량의 측정

상기 참고예 1에서 준비된 실험동물을 하기 표 1에서 나타낸 바와 같이, 7일 (Day 1-7) 동안 하루에 2번 정해진 시간(9:30~10:00, 16:30~17:00)에 니코틴을 피하 주사 하였다. 3일 (Day 8-10) 동안의 철회기간을 거친 후, 11일째 되는 날 추출물을 복강 주사하고 30분 후 니코틴을 처치하였다. 니코틴 처치 후 행동실험과 단백질(protein) 발현 확인을 위한 견본 추출(sampling)을 하였다.

11일째 되는 날, 실험동물을 사육장에서 외부소음이 차단된 실험실로 옮겨 각각 무게를 측정한 후, 9개의 활동량 측정상자에 개별적으로 넣었다. 상자 내에서 60분간 적응시간을 거쳐 60분간 기저활동량(baseline)을 측정한 후, 시호추출물 25, 50, 100 mg/kg을 각각 1회 복강투여 하였으며, 대조군으로 2ml/kg의 vehicle(70% PEG+1% Tween 80+10% EtOH)을 복강주사 하였다. vehicle 또는 시호 추출물 25, 50, 100 mg/kg 복강투여 30분 후 니코틴 0.4 mg/kg를 피하 주사한 후, 추가적으로 60분 동안 보행하여 박스 내에서 수평이동거리(cm), 상하움직임(frequency)로 보행성 활동량 및 상동적 행동량을 측정하였다.

그 실험결과, 표 2 및 도 1에서 나타내는 바와 같이, 7일 동안 생리식염수를 주고 3일 동안의 철회기간을 거쳐 11일째의 생리식염수에 의한 민감화 발현 단계에서의 정상군(S/V/S)의 보행성 활동량은 812.78± 207.55 cm이고, 7일 동안 생리식염수를 주고 3일 동안의 철회기간을 거쳐 11일째의 급성 니코틴투여에 의한 민감화 발현 단계에서의 활동량(S/V/N)은 2170.65± 555.15㎝ 이고, 7일 동안 니코틴을 주고 3일 동안의 철회기간을 거쳐 11일째의 니코틴에 의한 민감화 발현 단계에서의 활동량(N/V/N)은 6240.62± 724.84㎝ 로서 만성 니코틴 투여군는 유의하게 보행성 활동량을 증가하였다 (p<0.001, p<0.01). 시호추출물 25, 50, 100mg/kg 투여군에서 각각 3942.19± 996.76cm, 3800.54± 463.67cm, 3383.74± 390.91cm로 나타나, 시호추출물 투여군 모두 농도 의존적으로 보행성 활동량이 감소하였고, 시호추출물 100mg/kg 투여군에서 유의하게 감소하였다 (p <0.05).

표 2 및 도 2에서 나타난 바와 같이, 상동적 행동량(Rearing)에서 정상군은 6.50± 3.43, 급성 니코틴 투여군은 9.25± 3.15, 만성 니코틴 투여군은 56.67± 20.01로 만성 니코틴 투여군에서 유의적인 행동적 민감화가 관찰되었고, 시호추출 물 25 mg/kg 투여군은 318.00± 14.38, 50 mg/kg 투여군은 8.50± 5.07, 100 mg/kg 투여군은 9.86± 3 .68로 나타나 시호 추출물 각각의 투여군에서는 농도 의존적으로 상동적 행동량이 감소하였고, 시호추출물 50, 100 mg/kg 투여군에서 유의하게 감소하였다.

또한, 도 3에서 나타난 바와 같이, 정상상태에서의 시호추출물의 영향을 알아보기 위하여 시호추출물 100 mg/kg를 경구투여하고 한 시간 뒤, 생리식염수를 복강주사한 후 보행성 활동량과 상동적 행동량을 측정한 결과 정상군과 비슷한 양상을 보여, 정상상태에서는 별다른 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

처치법(Treatment Regimen)
그룹	전처리 (Day 1-7)	철회기간(Withdrawal) (Day 8-10)	니코틴 투여(Challenge) (Day 11)
정상군	S	X	vehicle+생리식염수
급성 니코틴군	S	X	vehicle+니코틴
만성 니코틴군	N	X	vehicle+니코틴
시호추출물 25 mg/kg투여군	N	X	시호추출물 25 mg/kg+니코틴
시호추출물 50 mg/kg투여군	N	X	시호추출물 50 mg/kg+니코틴
시호추출물 100 mg/kg투여군	N	X	시호추출물 100 mg/kg+니코틴
시호추출물 100 mg/kg 단독투여군	S	X	시호추출물 100 mg/kg+생리식염수

행동 측정(Behavioral measurement)
그룹	보행성 활동량 (Locomotor activity)	상동적 행동량 (Rearing)
정상군	812.78± 207.55	6.50± 3.43
급성 니코틴군	2170.65± 555.15	9.25± 3.15
만성 니코틴군	6240.62± 724.84	56.67± 20.05
시호추출물 25 mg/kg 투여군	3942.19± 996.76	18.00± 14.38
시호추출물 50 mg/kg 투여군	3800.54± 463.67	8.50± 5.07
시호추출물 100 mg/kg투여군	3383.74± 390.91	9.86± 3.68
시호추출물 100 mg/kg 단독투여군	1228.02± 316.15	5.75± 2.95

실험예 2. 니코틴 투여에 의한 면역조직화학분석법을 이용한 c-Fos 및 FosB 발현에 대한 시호추출물의 효과

행동학적 기전을 규명하기 위하여 뇌의 측좌핵에서 신경활성지표인 c-Fos, 및 FosB 발현에 대한 시호추출물의 효과를 알아보기 위해서, 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 실험을 하였다(Jang EY, et al., Eur J Pharmacol., 587(1-3), pp 124-128, 2008)

실험당일 검사단계에서 시호추출물 100 mg/kg 복강투여한 다음, 30분 후 니코틴 0.4 mg/kg를 피하 주사하여, 그로부터 1 시간 뒤 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital; 80 mg/kg)로 마취시킨 후, 심장을 통해 500 ml의 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, PFA)로 혈액을 관류시켜 뇌 조직을 고정시켰다. 뇌 조직을 꺼낸 후 10% 수크로스(sucrose)/4% PFA에 2시간 고정시킨 다음, 20% sucrose/PBS에 담궈 4℃ 냉장 상태로 하룻밤 방치하였다. 그 다음 -20℃상태에서 크라이오톰(cryotome, Leica, Biosystems, Nussloch, Germany)로 30 um두께로 뇌 조직을 절편하여 측핵 부위를 취하여 0.1% 소듐 아지드화물(sodium azide)/PBS에 넣어 4℃에 보관하였다.

조직절편은 PBS(phosphate buffer solution)용액에 3회 세척하여 2% Triton-X-100/PBS에서 5분간 막(membrane)의 지질(lipid)를 제거하는 과정을 거친 후 3% BSA/PBS로 블록킹(blocking)하였다. 그리고 0.1% BSA/PBS에 1:2000으로 희석된 primary rabbit anti-fos antibody (Santa cruz), FosB(Santa cruz)를 이용하여 20시간 반응시킨 후 , 발색제로는 DAB를 사용하여 Fos 단백질을 발현시켰다.

실험결과, 도 4에서 나타내는 바와 같이 측좌핵에서 만성 니코틴 투여군에 비해 시호 추출물 100 mg/kg투여군은 c-Fos 및 FosB의 발현을 감소시킴을 알 수 있었다.

실험예 3. 니코틴 투여에 의한 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 이용한 c-Fos 및 FosB 발현에 대한 시호추출물의 효과

행동학적 기전을 규명하기 위하여 선조체에서 신경활성지표인 c-Fos 및 FosB 발현에 대한 시호추출물의 효과를 알아보기 위해서, 웨스턴 블롯(western blot)법을 이용하여 하기와 같이 수행하였다(Marttila K, et al., Neuropharmacology., 51(1), pp.44-51, 2006).

실험 11일째, vehicle 또는 시호추출물 100 mg/kg를 복강주사하고 30분 뒤, 생리식염수 또는 니코틴을 재투여 하였다. 1 시간 후 소듐 펜토바르비탈(sodium pentobarbital; 80 mg/kg)을 복강 주사 하여 마취시킨 후, 신속하게 뇌를 척출하여 드라이아이스 위에 슬라이드를 올려놓고 재빠르게 뇌의 선조체 부분을 분리한 후, 단백질 억제제(protein inhibitor)와 프로테아제 억제제(protease inhibitor)가 포함된 세포 용해 용액(lysis buffer; 50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 2mM EDTA, 1mM EGTA)를 넣어 용해시킨 후, 30 분 동안 배양시킨 후, 12,000 rpm으로 4℃에서 25분간 원심 분리하였다. 원심분리가 끝난 후 상층액만 취하여 브래드 포드(Brad ford)방법으로 단백질을 정량하였다. 그리고 나서 80℃에서 10분간 끓인 후, 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 100V로 2시간 30분 동안 전기영동 한 후, gel을 NC membrane(PROTRAN^R, Schleicher&Schuell, Germany)으로 65V로 2시간 동안 전이(transfer)하였다. 그 후 5% 탈지유-TBST(TBS containing 0.1% Tween-20)로 비특이적인 결합을 막기 위해 블록킹(blocking) 시켰다. 2% 탈지유에 c-Fos antibody(Santa cruz biotechnology, 1:1000 dilution), FosB (Santa cruz biotechnology, 1:1000 dilution), GAPDH (Santa cruzbiotechnology,1:1000dilution)를 붙여 4℃에서 하룻밤 방치시킨 후 TBST로 10분 동안 3번 씻은 후 상온에서 1시간 동안 goat anti-rabbit antibody conjugated to horse-radish peroxidase (Santa cruz biotechnology, 1:1000 dilution)를 붙인 후 다시 TBST로 10분 동안 3 번 씻었다. 그 후 ECL (enhanced chemoluminescence) reagent (Supex, Neuronex, Korea)를 사용하여 1분간 반응한 뒤 x-ray 필름에 노출시켰다.

실험결과, 도 5에서 나타내는 바와 같이 선조체에서 만성 니코틴 투여군에 비해 시호 추출물 100 mg/kg 투여군은 c-Fos, 및 FosB의 발현을 감소시킴을 알 수 있었다.

실험예 4. 급성독성실험

상기 실시예 1에서 얻은 시호추출물의 투여에 의한 독성을 확인하기 위하여 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 실험을 하였다 (이형철 외, 동의병리학회지, 15(4), pp.543-547, 2001).

6 주령의 특정병원체부재 (Specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹당 2마리씩의 동물에 본 발명의 백지추출물을 500 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

실험결과, 본 발명의 시호추출물은 랫트에서 각각 500 ㎎/㎏ 까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량 (LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 시호추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

시호추출물(BF) 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

시호추출물(BF) 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

시호추출물(BF) 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

시호추출물(BF) 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4,12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

시호추출물(BF) 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

시호추출물(BF) 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

시호추출물(BF) 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호]

515-82-06593

[부처명]

지식경제부

[연구사업명]

지역혁신센터 사업

[연구과제명]

뇌질환 치료를 위한 한방제제 및 천연물 신약개발

[주관기관]

대구한의대학교 산학협력단

[연구기간]

2008년 03월 01일 ~ 2009년 02월 28일

도 1은 니코틴 투여로 인한 흰쥐의 보행성 활동량에 대한 시호추출물(BF)의 효과를 나타낸 도이고,

도 2은 니코틴 투여로 인한 흰쥐의 상동적 행동량(rearing)에 대한 시호추출물(BF)의 효과를 나타낸 도이며,

도 3은 시호추출물(BF, 100 mg/kg) 단독 투여시의 보행성 활동량과 상동적 행동량에 대한 시호추출물의 효과를 나타낸 도이고,

도 4는 니코틴 투여에 의한 흰쥐의 측핵 내 c-Fos, 및 FosB 발현에 대한 시호추출물(BF)의 효과를 면역조직화학분석법으로 나타낸 도이며,

도 5는 니코틴 투여에 의한 흰쥐의 선조체 내 c-Fos, 및 FosB 발현에 대한 시호추출물(BF)의 효과를 웨스턴 블롯법으로 나타낸 도이다.

Claims

시호추출물을 유효성분으로 함유하는 니코틴 중독 및 금단증상의 예방 및 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 용매 또는 이들의 혼합 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 시호추출물을 0.02 내지 50 중량%로 포함됨을 특징으로 하는 약학조성물.
시호추출물을 유효성분으로 함유하는 니코틴 중독 및 금단증상의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 건강기능식품.