KR101034806B1

KR101034806B1 - 고충증 진단용 항원단백질

Info

Publication number: KR101034806B1
Application number: KR1020090040304A
Authority: KR
Inventors: 주정원; 이명노; 조신형; 김동수; 양혜원
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2009-05-08
Filing date: 2009-05-08
Publication date: 2011-05-16
Also published as: KR20100121240A

Abstract

본 발명은 고충증 진단용 항원단백질에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고충의 단백체로부터 분리한 고충증 진단용 항원 단백질에 관한 것이다.

고충증, 항원 단백질

Description

고충증 진단용 항원단백질{A antigenic protein for diagnosing sparganosis}

최근 우리나라에서 토양매개성 연충 감염증이 현저히 감소한 반면 식용동물매개성 연충 감염증은 증가 또는 현상 유지되고 있는 실정이다. 특히, 고충증(sparganosis)은 폐흡충의 이소기생 및 유구낭미충증과 함께 우리나라의 3대 조직침입 연충질환이며 아직까지 적절한 치료약제가 없어서 국민보건을 위협하는 주요한 기생충증의 하나이다.

Spirometra 조충은 일반적으로 물벼룩(cyclops)를 제 1 중간숙주로 하고, 올챙이 및 개구리를 제 2 중간숙주로, 뱀이나 조류 및 포유류를 운반 숙주로, 개 및 고양이류를 종숙주로 하여 생활사가 영위된다. 고충의 인체감염은 1881년에 Manson이 중국의 Amoy에서 중국인 남자를 부검하던 중에 처음 발견하였으며 그 후 세계 각처에서 발견, 보고되어 왔다. 우리나라에서는 1917년에 Uemura가 발견한 증례를 Doi와 Boku가 일본에서 발견한 증례와 같이 보고한 것이 처음인 것으로 알려져 있고, 그 이후 많은 증례가 발견, 보고되어 왔다. 근래에 와서는 혈청학적 및 방사선학적 진단법의 발달로 더 많은 증례가 검출되고 있다.

고충의 병리기전에 관한 연구는 많지 않은 편이며, 일본에서는 고충의 분비배설물에서 분리한 당단백질이 염증반응과 용골세포의 생성 (osteoclastogenesis)을 억제한다는 연구 보고가 있다(Kina Y, Fukumoto S, Miura K, Tademoto S, Nunomura K, Dirgahayu P, Hirai K. Int J Parasitol. 2005 Nov;35(13):1399-406. Epub 2005 Jul 18. ). 국내의 경우, 고충의 충체에서 항원 단백질의 확인에 관한 연구가 다수 있으나(Chung YB, Kong Y, Yang HJ, Cho SY. Korean J Parasitol. 2000 Sep;38(3):145-50; Kong Y, Kang SY, Kim SH, Chung YB, Cho SY. Parasitology. 1997 Mar;114 ( Pt 3):263-71; Morakote N, Kong Y. Korean J Parasitol. 1993 Jun;31(2):169-71; Cho SY, Kang SY, Kong Y. Korean J Parasitol. 1990 Sep;28(3):135-42), 일차원 전기영동과 면역화학법을 적용한 조사로 정확한 단백질의 동정은 이루어지지 않고 있다.

고충감염증에 대한 진단 및 치료를 위한 표적 단백질의 분석을 위해 이차원 전기영동과 질량분석을 통한 단백체 분석과 EST DB 구축을 통한 전사체 분석이 필요하며, 이번 연구에서는 항원성 단백질의 동정을 위해 고충의 충체로부터 분리된 단백질을 면역단백체학 분석을 수행하고, EST 분석을 통하여 전사체에서 생물정보학적 분석을 수행하였다.

Spirometra 속(genus) 조충의 plerocercoid(충미충) 유충을 고충(sparganum)이라 한다. Spirometra 조충은 일반적으로 물벼룩(cyclops)를 제 1 중간숙주로 하고, 올챙이 및 개구리를 제 2 중간숙주로, 뱀이나 조류 및 포유류를 운반숙주로, 개 및 고양이류를 종숙주로 하여 생활사가 영위된다. 종숙주의 장내에서 성충이 산란한 충란이 대변과 함께 배출되어 연못이나 시냇물 또는 강물로 들어와 물속에서 발육, 부화하여 섬모유충(coracidium)이 되고, 이 유충들이 물속을 헤엄치고 다니다가 수서 요각류(copepode)인 물벼룩에 먹힌다. 물벼룩에 먹힌 섬모유충은 물벼룩의 복강내에서 원미충(procercoid)으로 발육하고 원미충을 갖고 있는 물벼룩을 올챙이가 잡아먹거나 조류나 포유류가 물을 마실 때 우연히 먹게 되면 이들 동물의 체내에서 원미충이 충미충(plerocercoid)으로 발육한다. 고충이 감염되어 있는 올챙이나 개구리 또는 각종 동물들이 먹이사슬에 의해 다른 동물에 먹히면 그대로 고충 상태로 되거나 성충이 되는데 전자의 동물을 운반숙주라고 하고 후자의 동물을 종숙주라고 한다. 이 조충의 성충이 인체에서도 가끔씩 발견되어 중국, 일본 및 우리나라 등에서 10례 정도가 보고되어 있으나 인체에서는 주로 충미충(plerocercoid)이 고충증(sparganosis)을 일으켜 임상적인 문제를 야기한다.

고충의 인체감염은 1881년에 Manson이 중국의 Amoy에서 중국인 남자를 부검하던 중에 처음 발견하였으며 그 후 세계 각처에서 발견, 보고되어 왔다. 우리나라에서는 1917년에 Uemura가 발견한 증례를 Doi와 Boku가 일본에서 발견한 증례와 같이 보고한 것이 처음인 것으로 알려져 있고, 그 이후 많은 증례가 발견, 보고되어 왔다. 근래에 와서는 혈청학적 및 방사선학적 진단법의 발달로 더 많은 증례가 검출되고 있다.

인체 고충증의 병리학적 소견 및 증상은 충체의 기생부위에 따라 달라진다. 감염된 충체가 주로 복벽, 음낭, 하지 흉벽 등의 피하조직을 이행하면서 심한 염증을 유발하고 충체를 중심으로 육아조직과 섬유조직이 둘러싸서 피하결절이 형성된다. 초기에는 이물감, 가려움증 등을 수반하는 피하결절이 나타나는 경우가 많으나 가끔씩 침범된 부위가 농양으로 발전할 수도 있다. 피하조직 이외에 복강, 흉강, 안구, 척수 및 뇌 등을 침입하기도 한다. 고충증증의 가장 중요하고 치명적인 증상은 중추신경계를 침범할 경우로, 뇌를 침입한 경우, 간질 발작 및 두통 등을 유발하고 척수 감염시는 하반신 마비가 있을 수 있다(Walker MD, Zunt JR. Neuroparasitic infections: cestodes, trematodes, and protozoans.Semin Neurol. 2005 Sep;25(3):262-77; Dunn IJ, Palmer PE. Sparganosis. Semin Roentgenol. 1998 Jan;33(1):86-8. Review). 인체 고충증은 주로 우리나라, 일본, 대만, 월남 등의 아시아 지역과 북미 지역에서 유행하고 있으며 우리나라의 경우, 공식적으로 200여례가 보고되어 있으나 실제 감염자는 훨씬 더 많을 것으로 추측된다. 실제적으로 우리나라에서 과거력이 확실히 밝혀진 121례를 분석한 바에 따르면 뱀을 날로 먹고 감염된 예가 70례(57.9%)로 가장 많았고, 처리하지 않은 자연수를 먹은 예가 19례(15.7%), 개구리를 날로 먹은 예가 18례(14.9%), 다른 종류의 동물의 근육을 날로 먹은 예가 13례(10.7%), 안질이 생긴 눈에 개구리 근육 현탁액을 넣어서 감염된 예가 1례이었다. 다른 지역에 비하여 강원도에서 고충 감염률이 높은 것으로 나타나 있으며, 최근의 ELISA 검사법을 통한 혈청학적 검사 결과, Lee (2002)등의 조사에서는 조사 대상의 3.3%, Park (2001)등의 조사에서는 11.4%가 양성으로 확인되었다. 외국의 경우, 중국 대만 그리고 호주 등에서 지속적인 환자 발생이 보고되고 있으며(Wiwanitkit V. Int J Infect Dis. 2005 Nov;9(6):312-6. Epub 2005 Jul 14; Hughes AJ, Biggs BA. Intern Med J. 2002 Nov;32(11):541-53. Review), 러시아의 경우도 감염률이 비교적 높은 것으로 알려져 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 고충증 진단에 활용가능한 후보물질을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 고충증 진단용 항원성 단백질을 제공한다.

본 발명의 단백질은 서열번호 1 내지 3의 단백질 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 본 발명의 목적인 고충증을 진단하는 용도를 가지는 모든 변이 단백질을 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 본 발명의 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 고충증 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 서열은 서열번호 1 내지 3의 단백질을 코딩하는 서열 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 변형된 동일한 활성을 가진 모든 변형단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 4 내지 6에 기재된 것이 더욱 바람직하나 코드 디제너리시 등을 고려하여 서열번호 2와 적어도 80% 이상의 상동성을 가진 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4 내지 6에 기재된 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 단백질을 유효성분으로 하는 고충증 진단용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 유전자를 유효성분으로 하는 고충증 진단용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명자들은 고충의 중간 감염 숙주인 꽃뱀 등을 채집하여 고충을 분리한 후, 단백체 분석시료를 얻기 위해 전처리 조건을 확립하였다. 단백체 시료는 고충을 급냉 후 균질 파쇄기를 이용, 파쇄한 후 원심분리하여 상층액을 취하였다. 이차원 전기영동에 적용하기 위해 시료 전처리의 표준화를 시도하여, 정확한 단백체 분리를 위한 적정 조건을 확정하였다. 항원성 단백질을 동정하기 위해 항혈청을 얻기 위한 실험을 수행하였다. 단백체 분쇄물을 감염동물인 쥐와 토끼등에 면역시켜 혈청을 얻은 후 항원성을 ELISA와 Immunoblot을 이용하여 확인하였다.

고충의 단백체로부터 항원 단백질을 확인하기 위해 고충을 균질 파쇄기를 이용, 파쇄한 후 원심분리하여 상층액을 취하였고, 고충의 단백질 시료를 단백체 전개지도 pI 3-11 범위에서 확인하였다.

항원성 단백질의 분리능을 높이기 위해서 pI에 따라 고충의 단백체를 전분리하였고, 이차원 전기영동을 통하여 세부 전개지도를 구축한 후 면역이적법을 통하여 항원단백질을 확인하고,항원 후보 단백질은 질량분석을 통해 동정하였다.

동정된 단백질의 유전자를 고충의 cDNA library를 이용하여 클로닝하고 pQE 발현벡터를 이용하여 BL21 세균에서 재조합 단백질을 제작하고 순수 분리하여 고충 환자의 혈청으로 항원성을 검증하였다.

본 발명은 고충의 단백체 발현지도를 구축하고, 면역화학적 분석과 질량분석을 통하여 고충증의 혈청학적 진단에 적용 가능한 항원성 후보 단백질들을 발굴하였으며, 이들 중 paramyosin의 경우 재조합 단백질 발현을 통해 고충증 감염 환자 혈청에 대한 항원성을 나타냄을 검증한 결과는 기생충 감염증의 진단 물질 개발에 면역단백체학 분석(immuno-proteomic analysis)이 유용함을 보여준다고 사료된다. 또한 고충증 특이 단백질에 대한 정보 및 항체개발은 면역학적인 방법을 통한 진단의 정확성을 높이고, 생체에서 이를 조기에 진단할 수 있는 조기진단법을 개발함으로써 신속하고 정확한 진단 및 치료 그리고 예방대책 수립의 기반 확보에 기여할 수 있을 것이다.

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 목적으로 기재한 것으로 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되지 아니한다.

실시예 1: 동정된 단백질의 유전자 클로닝

항원 후보 단백질로 동정된 paramyosin의 클로닝을 위해 유구조충(Taenia solium)과 단방조충(Echinococcus granulosus)의 염기서열과 비교분석하여 9종류의 PCR-primer를 제작하였고, 흡충류의 염기서열을 비교 분석하고 MS 분석결과에서 나온 아미노산 서열을 참고하여 10종류의 degenerate PCR-primer를 제작하였다(도 1, 표 1). 고충의 충체로부터 total RNA를 얻고 transcriptase와 oligo-dT를 이용하여 cDNA를 만들고 이를 template로 PCR를 수행한 결과, 517bp(Sp-D1F와 Spa6R), 685bp(Spa5F와 Spa6R), 2592bp(Spa1F와 Spa6R), 1299bp(Spa4F와 Spa6R), 1949bp(Sp-D6F와 Sp-D1R), 1206bp(Sp-D5F와 Sp-D1R), 585bp(Sp-3DF와 Spa6R), 517bp(Sp-D1F와 Spa6R), 2592bp(Spa1F와 Spa6R), 1311bp(Spa1F와 Spa4R) 크기의 PCR 산물을 확인(Table 5)하였으며, 이를 T-vector에 클로닝하여 염기서열을 분석하였다.

고충의 EST 서열분석 결과, 3개의 클론이 paramyosin과 유사한 서열을 가지고 있음을 확인하였고, 고충 paramyosin의 전체 유전자서열을 얻기 위해 PCR primer (Sp1 : GGATCCATGGCCGCTGTACAAATAAG(서열번호 7), Sp300 : AAGCTTCTCCTCAAATTCCTCCGTC(서열번호 8), Sp301 : GGATCCATGAAACGTAAGCTCAACGTC(서열번호 9), Sp550:AAGCTTAGCATTGGCCTTGTT

CGCC(서열번호 10), Sp551:GGATCCAACCTCAATCGTGAAAACAAAG(서열번호 11), Sp863 : GGTACCTTACATAATGCTCGTGGCAC(서열번호 12))를 제작하였다. 재조합 단백질 합성을 위한 발현벡터(pQE30)로의 삽입을 위해 primer 전후에 각각 제한효소(BamHI과 HindIII)를 넣고, Sp863의 경우 HindIII대신에 KpnI를 넣어 제작하였다. cDNA library를 mass excision하여 PCR를 수행하였다. PCR 산물은 T-vector에 클로닝하 여 염기서열을 분석하였다.

Primer name	Sequence	Location
Spa-1F(서열번호 13)	5’- ATGTCTGAATCACACGTCAA -3’	1-20
Sp-D1F (서열번호 14)	5’- CTG AAY GCT GAG GTW CTY CG -3’	2075-2094
Sp-D1R (서열번호 15)	5’- CGR AGW ACC TCA GCR TTC AG -3’
Sp-D3F (서열번호 16)	5’- GTC ATG CAR GGC GAT CTC GA -3’	2009-2028
Spa-4F(서열번호 17)	5’- GAATCGTCGACTGACCGAT -3’	1293-1311
Spa-4R(서열번호 18)	5’- ATCGGTCAGTCGACGATTC -3’
Spa-5F(서열번호 19)	5’- TTACCAATGACAAACGTCGACT -3’	1907-1928
Sp-D5F (서열번호 20)	5’- TTC AAC GCY GAT ATG GCT GC -3’	887-906
Sp-D6F (서열번호 21)	5’- GAA YTG GAG GAC YTG CTC GA -3’	145-164
Spa-6R(서열번호 22)	5’- CTACATGATGCTGGTTGCAC -3’	2573-2592

표 1은 고충 paramyosin의 PCR 프라이머에 대한 서열이다.

실시예 2: 재조합 단백질 제작 및 분리

고충 paramyosin의 항원성 분석을 위한 재조합단백질 발현을 위해, 933bp(SpI), 753bp(SpII), 942bp(SpIII)로합성된 DNA 조각을 pQE30 발현벡터에 삽입하여 클로닝하고 BL21 세균에 형질전환하였다. 클로닝된 BL21 세균을 배양하여 OD가 0.7이 되었을 때 IPTG 1mM를 첨가하여 히스티딘이 tag된 재조합 paramyosin을 과발현시켰다. 과발현시킨 BL21 세균을 lysis하고 supernatant를 Ni-NTA agarose (Qiagen) affinity chromatography을 통하여 재조합 paramyosin을 분리하였다.

실시예 3: 항원성 검증

추출된 고충의 재조합 paramyosin 5 을 12% polyacrylamide gel상에서 분리하였다. 전개된 단백질은 PVDF membrane으로 이적시켰다. 이때 완충용액은 Tris-glycine (pH 8.0)이며, 4℃를 유지하면서 30V에서 1시간을 전이시킨 후 membrane은 PBST(1X PBS, 0.05% Tween 20)에서 5% skim milk를 첨가하여 blocking을 1시간 실시하였다. Blocking이 끝난 후 PBST로 10분씩 3회 membrane을 세척하고, 500배 희석된 anti-His, 혼합된 고충 환자의 혈청, 간흡충 환자의 혈청과 다른 조충류에 감염된 환자(echinococcosis)의 혈청으로 1시간 동안 천천히 흔들어주면서 membrane에 반응시켰다. 반응이 완료된 후 membrane은 3회 세척하고 각각 peroxidase-conjugated anti-mouse, rabbit, human IgG(1:1,000희석)로 1시간 실온에서 반응시켰으며, membrane은 PBST로 10분씩 3회 세척하였다. 세척 후 membrane은 ECL western blotting detection reagent (Amersham Bioscience)를 이용하여 X-ray film에 감광시켜 항원성 단백질을 확인하였다.

상기 실시예의 결과는 다음과 같다.

1) Reverse transcriptase-PCR을 이용한 paramyosin 유전자 클로닝과 재조합 단백질 발현 및 항원성 확인

유구조충(Taenia solium)과 단방조충(Echinococcus granulosus)의 염기서열과 비교분석하여 제작된 10종류의 PCR-primer를 이용하여 PCR를 수행한 결과, 10개 PCR primer 조합에서 PCR 산물을 얻을 수 있었다(도 2). 각 PCR 산물을 T-vector에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과 8번째 PCR 프라이머 조합만이 paramyosin의 일부분으로 확인되었다. Taenia solium의 염기서열과 비교 했을 때 828bp부터 2031bp까지의 서열과 match되는 1203개의 유전자 서열을 확인하였다.

1203 base pair의 PCR 산물의 염기 서열과 예상되는 아미노산 서열은 다음과 같다(도 3A, B). 얻어진 염기서열을 이용하여 BlastX 분석한 결과 다른 조충류와 흡충류등의 paramyosin과 유사함을 확인할 수 있었다 (도 3C).

재조합 단백질 발현을 위해 paramyosin 부분 염기서열을 transformation 하였다. 부분 유전자 염기서열을 histidine이 tag된 발현벡터(pQE30)에 클로닝하고 BL21/DE3 세균에 transformation 하였다. 1mM IPTG로 재조합 paramyosin의 발현을 유도하여 약 50 kDa의 재조합 단백질 발현을 SDS-PAGE를 통하여 확인하였고, Ni-NTA agarose chromatography를 통하여 재조합 단백질을 부분 정제하였다(도 4A). 부분 정제된 재조합단백질의 진위를immuno blot 분석을 통하여 histidine 항체에 반응 하는 것으로 확인하였다(도 4B). 또한, 고충 환자 혈청에 대한 immuno blot 분석을 통하여 항원성을 나타냄을 확인하였다(도 4C). 분리된 재조합 paramyosin의 진위를 질량분석을 통하여 재확인하였다. LC-MS/MS를 통하여 질량 분석 후 Mascot으로 peptide match 정도를 분석한 결과 고충의 paramyosin peptide 일부가 확인되었다(도 5).

상기의 결과로부터 비록 고충 paramyosin의 전체 유전자 서열 및 재조합단백질을 확보하지 못했지만 paramyosin 일부(677개 아미노산)를 coding하고 있는 유전자를 확보하고 그로부터 합성된 재조합 단백질이 고충환자의 혈청에 대하여 항원성을 나타냄을 확인 할 수 있었다.

2) 고충의 cDNA library를 이용한 paramyosin유전자 클로닝과 재조합 단백질 합성 및 항원성 검증

고충의 cDNA library를 제작하고 5760개의 클론을 무작위로 염기서열 분석한 EST DB에서 3개의 클론이 paramyosin과 유사한 아미노산 서열을 가지고 있음을 확인 할 수 있었다(도 6A). 각각의 유전자 서열정보를 유구조충(Taenia solium)의 paramyosin의 아미노산 서열과 비교했을 때, SPest1(A018LGAA11C85738)은 1번부터 173번까지, SPest2 (A018LGAA11S- 806416)는 179번부터 677번까지, 그리고 SPest3(A018LGAA11C85823)는 763번부터 863번까지를 각각 포함하고 있었다(도 6B).

Taenia solium의 paramyosin에서 항원작용기를 mapping 분석한 Jose(2001) 등은 paramyosin의 항원성이 552번 아미노산에서 863번 아미노산을 포함하는 C-말단 부위에서 강하게 나타남을 보고한 바 있다. 이 근거를 바탕으로 고충 paramyosin의 epitope mapping을 위해, 전체 단백질 서열을 SpI (sparganum paramyosin의 N말단 부위,1번-311번 아미노산), SpII (sparganum paramyosin의 가운데 부분, 312번-563번 아미노산), SpIII (sparganum paramyosin의 C말단 부위, 564번-877번 아미노산)로 나누어 각각 유전자 클로닝하고 재조합 단백질 발현을 통한 항원성 검증을 위해 PCR primer를 제작하였다 (도 6C, D). 제작된 primer와 cDNA library를 excision(phagemid에서 plasmid를 떼어낸 library)한 것을 주형(template)으로 하여 PCR한 결과 SpII와 SpIII 부분의 PCR 산물을 얻을 수 있었다(도 7). 한편, cDNA library를 무작위로 염기서열을 분석한 결과, SpI 부분을 가지고 있는 것으로 확인된 SPest1을 주형(template)으로 PCR를 수행하여 SpI을 얻을 수 있었다(도 7A).

각 클론의 유전자 서열 분석 결과를 종합하여 고충 paramyosin의 전체 염기서열 2628bp(876 aa)을 확인 할 수 있었으며, 이를 유구조충(Taenia solium)의 paramyosin의 아미노산 서열(863aa)과 비교분석한 결과 66%의 서열 상동성을 확인할 수 있었다(도 8).

3) 고충 Paramyosin 재조합 단백질 발현을 통한 항원성 검증

paramyosin 재조합 단백질 발현을 위하여 확인된 각각의 유전자 클론을 pQE30 발현벡터에 삽입하여 클로닝하고 BL21 세균에 transformation 하였다. 클로닝된 BL21 세균을 배양하여 OD가 0.7이 되었을때 IPTG 1mM를 첨가하여 histidine이 tag된 재조합 paramyosin의 과발현을 유도하였다. 과발현시킨 BL21 세균을 lysis하고 supernatant를 Ni-NTA agarose (Qiagen)에 loading하여 histidine이 tag된 재조합 paramyosin을 부분 정제한 후 SDS-PAGE를 통하여 확인하였다(도 9A). 그 결과 SpI은 약 34.21kDa, SpII는 27.61 kDa, SpIII는 34.54kDa의 분자량을 나타내었다. SpIII의 경우 단일밴드로 발현된 SpI, SpII와 달리 약 4개의 서로 다른 크기로 발현됨을 확인하였으며, 각 밴드의 질량분석 결과 paramyosin의 C-말단을 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 재조합 paramyosin의 진위를 확인하기 위해 LC-MS/MS로 질량 분석 후 Mascot 분석한 결과, 세 개의 부분 단백질 모두에서 고충의 paramyosin 염기서열과 일치하는 펩타이드 서열을 확인하였다.

확인된 세부분의 각 paramyosin을 고충 환자 혈청, 간흡충 환자 혈청 그리고 다른 조충류의 하나인 낭미충(Cysticercosis) 환자 혈청에 대해 항원성을 확인하고, 교차반응을 확인하였다(도 9B). 그 결과 SpI은 고충, 간흡충, 낭미충 환자의 혈청과 교차반응이 있는 것으로 확인되었으며, SpII의 경우 고충환자의 혈청과 잘 반응하였고 다른 조충증의 하나인 낭미충 환자의 혈청과도 교차반응을 하는 것으로 확인되었지만 간흡충 환자혈청에는 교차반응을 나타내지 않았다. SpIII의 경우 고충환자의 혈청에 대한 항원성이 SpI, SpII에 비해 상대적으로 강하였으며, 낭미충 감염환자 및 감흡충 감염환자의 혈청에 대해 교차반응을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다.

도 1은 고충 paramyosin의 프라이머 위치에 대한 도식적인 설명이다.

도 2는 디제너레이트 PCR 분석을 나타낸다. I: Sp-D1F 및 Spa6R, II: Sp-D3F 및 Spa6R, III: Sp-D3F 및 Sp-D1R, IV: Spa5F 및 Spa6R, V: Spa1F 및 Spa6R, VI: Spa4F 및 Spa6R, VII: Sp-D6F 및 Sp-D1R, VIII: Sp-D5F 및 Sp-D1R, IX: Spa1F 및 Spa6R, X: Spa1F 및 Spa4R, 레인 1: 포워드 프라이머만, 레인 2: 리버스 프라이머만, 레인 3: 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머, 레인 4: 주형없는(음성 대조군l).

도 3은 고충의 부분적인 유전자의 분석을 나타냄. (A) DNA 서열, (B) 고충의 paramyosin의 아미노산 서열, C) 고충의 paramyosin의 DNA 서열에 대한 BlastX의 결과.

도 4는 고충의 재조합 paramyosin의 정제 및 동정. (A) SDS-PAGE 분석, (B) 항-his에 대한 면역블럿 분석, (C) 항-고충 환자 혈청에 대한 면역블럿.

도 5는 Mascot 서치 결과. 고충의 추정 paramyosin가 분석됨. Probability Based Mowse Score는 -10*Log(P), 여기서 P는 관찰된 매치가 랜덤 이벤트인 확률이다. Individual ions scores > 55는 아이덴티티 또는 광범위한 호모로지를 나타냄 (p<0.05). 단백질 스코어는 단백질 히드를 랭킹하기 위한 비-개연론적(probabilistic) 기반으로서 이온 스코어로부터 유래한다.

도 6은 고충의 cDNA 라이브러리에 의하여 얻은 paramyosin 유전자의 분석.

(A) 고충의 cDNA 라이브러리의 EST에 대한 서열분석의 결과, 상기 세개 결정 된 paramyosin (B) Taenia solium에서 paramyosin의 아미노산 서열을 부분적으로 얻어진 고충 paramyosin을 나타냄 (C) 본 발명에서 사용되는 고충 paramyosin의 산물 (D) 각 재조합 단백질의 크기.

도 7은 고충 paramyosin의 PCR 분석.

도 8은 고충 paramyosin과 Taenia solium의 것과의 배열. Score = 980 bits (2534), Expect = 0.0 Identities = 574/866 (66%), Positives = 697/866 (80%), Gaps = 5/866 (0%) Frame = +1

도 9는 고충 paramyosin의 정제된 재조합 산물을 사용한 면역블럿 분석. (A) 항-His 항체, (B) 환자 혈청.

<110> Republic Of Korea(Korea Center for Disease Control and Prevention) <120> A antigenic protein for diagnosing sparganosis <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SpI <400> 1 Met Ala Ala Val Gln Ile Ser Glu Pro Glu Gly His Val Ser Met Asn 1 5 10 15 His Ser Ile Tyr Arg Ser Ser Ser Pro Gly Cys Ala Arg Leu Glu Met 20 25 30 Arg Ile Ala Glu Leu Glu Glu Arg Leu Glu Glu Glu Arg Ser Phe Arg 35 40 45 Asn Lys Asn Gln Arg Glu Thr Cys Glu Tyr Ala Leu Glu Ile Glu Ser 50 55 60 Leu Asn Gln Arg Leu Glu Glu Ala Asn Glu Thr Ile Asn Gln Gln Leu 65 70 75 80 Asp Val Ile Lys Arg Arg Glu Ala Glu Ser Ala Met Val His Lys Glu 85 90 95 Arg Asp Ile Leu Lys Gln Thr Leu Glu Ala Asp Ala Ala Ser Ala Arg 100 105 110 Arg Arg His Gln Ala Ala Leu Asn Glu His Gln Asp Glu Leu Glu Asp 115 120 125 Leu Arg Lys Thr Lys Ala Lys Leu Glu Lys Glu Arg Ser Glu Leu Phe 130 135 140 Gln Glu Ala Glu Lys Leu Ala Ser Glu Leu Ser Lys Val Gln Lys Met 145 150 155 160 Asn Glu Ala Leu Glu Gly Lys Ile Asp Gly Phe Glu Cys His Thr Thr 165 170 175 Arg Leu Lys Ala Gly Asn Glu Asp Leu Leu Lys Gln Leu Ala Glu Met 180 185 190 Lys Ala Arg Asn Asn Ser Leu Met Ala Thr Glu Ala Glu Asn Val Lys 195 200 205 Asn Leu Asp Lys Ala Thr Asn Ala Leu Ser Ile Ala Gln Arg Gln Val 210 215 220 Ala Ser Leu Gln Lys Glu Val Asp Asp Leu Lys Asn Gln Leu His Glu 225 230 235 240 Glu Thr Thr Ser Arg Glu His Leu Gln Ser Arg Gln Thr Leu Leu Gln 245 250 255 Thr Gly Leu Glu Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu Asp Glu Ala Glu Ser 260 265 270 Ala Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu Ser Lys Thr Ala Ala Glu Leu Gly 275 280 285 Ala Leu Arg Asn Arg His Glu Arg Glu Met Ser Glu Leu Gln Ala Glu 290 295 300 Met Thr Glu Glu Phe Glu Glu 305 310 <210> 2 <211> 251 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spII <400> 2 Met Lys Arg Thr Lys Leu Asn Val Arg Ile Asn Glu Leu Thr Asp Met 1 5 10 15 Ala Glu His Glu Arg Thr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Lys Thr Lys Asn 20 25 30 Lys Leu Thr Ile Glu Ile Arg Asp Leu Gln Ala Glu Asn Glu Ala Leu 35 40 45 Ala Ala Asp Asn Ala Glu Leu Thr Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu His 50 55 60 Gln Ala Ala Glu Leu Gln Arg Arg Val Asp Glu Leu Thr Ile Glu Val 65 70 75 80 Asn Asn Leu Thr Ser Ala Asn Asn Ala Leu Glu Gln Asp Asn Ile Arg 85 90 95 Leu Lys Ala Gln Val Asn Asp Leu Thr Asp Arg Ile Ser Asn Leu Asp 100 105 110 Arg Glu Asn Asn Gln Leu Ser Glu Gln Leu Lys Glu Thr Lys Ser Ala 115 120 125 Leu Arg Asp Ala Asn Arg Arg Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Arg Ser 130 135 140 Gln Leu Glu Ala Glu Arg Asp Asn Leu Ala Ser Ala Leu His Asp Ala 145 150 155 160 Glu Glu Ala Leu Lys Asp Leu Glu Ala Lys Tyr Gln Ser Ser Gln Ser 165 170 175 Ala Leu Ala His Leu Lys Ser Glu Met Glu Gln Arg Leu Arg Glu Lys 180 185 190 Asp Glu Glu Leu Glu Asn Leu Arg Lys Ser Thr Thr Arg Thr Ile Glu 195 200 205 Glu Leu Thr Ala Thr Ile Thr Glu Met Glu Val Arg Phe Lys Ser Glu 210 215 220 Thr Ser Arg Leu Lys Lys Lys Tyr Glu Ala Thr Ile Ser Glu Leu Glu 225 230 235 240 Met Gln Leu Asp Met Ala Asn Lys Ala Asn Ala 245 250 <210> 3 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> spIII <400> 3 Asn Leu Asn Arg Glu Asn Lys Ala Leu Ala Gln Arg Val Gln Glu Leu 1 5 10 15 Gln Val Ala Leu Asp Asp Glu Arg Arg Ala Arg Glu Ala Ala Glu Gly 20 25 30 Asn Leu Gln Ala Ser Glu Arg Lys Arg Ile Gln Leu Thr Ala Glu Ile 35 40 45 Glu Glu Ile Arg Ser Ser Leu Glu Val Cys Glu Arg Ala Arg Lys Asn 50 55 60 Ala Glu Asn Glu Leu Gly Glu Ala Asn Asn Arg Val Ser Glu Leu Thr 65 70 75 80 Met Gln Val Asn Ala Leu Thr Asn Asp Lys Arg Arg Leu Glu Gly Asp 85 90 95 Leu Gly Val Met Gln Gly Asp Leu Asp Glu Ala Val Asn Ala Arg Lys 100 105 110 Ala Ala Glu Asp Arg Ala Asp Arg Leu Asn Ala Glu Val Leu Arg Leu 115 120 125 Ala Asp Glu Leu Arg Gln Glu Gln Glu Asn Tyr Lys Arg Ala Glu Thr 130 135 140 Leu Arg Lys Gln Leu Glu Ile Glu Ile Arg Glu Ile Thr Val Lys Leu 145 150 155 160 Glu Glu Ala Glu Ser Phe Ala Thr Arg Glu Gly Arg Arg Met Val Gln 165 170 175 Lys Leu Gln Asn Arg Val Arg Glu Leu Glu Ala Glu Leu Asp Ala Glu 180 185 190 Ile Arg Arg Ser Lys Asp Ala Ala Ala Asn Ala Arg Lys Tyr Glu Arg 195 200 205 Gln Phe Lys Glu Leu Gln Thr Gln Cys Glu Glu Asp Arg Arg Met Val 210 215 220 Leu Glu Leu Gln Asp Leu Leu Asp Lys Thr Gln Met Lys Met Lys Ala 225 230 235 240 Tyr Lys Arg Gln Leu Asp Glu Gln Glu Glu Val Ser Gln Leu Thr Met 245 250 255 Asn Lys Tyr Arg Lys Ala Gln Gln Gln Ile Glu Glu Ala Glu His Arg 260 265 270 Ala Asp Met Ala Glu Arg Ser Ile Thr Ile Lys Arg Thr Thr Ile Gly 275 280 285 Pro Gly Leu Arg Ala Leu Ser Val Ala Arg Glu Met Ser Thr Ser Val 290 295 300 Ala Arg Gly Gly Arg Ala Thr Ser Ile Met 305 310 <210> 4 <211> 933 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpI <400> 4 atggccgctg tacaaataag tgagccggaa ggacacgtct caatgaacca ttcaatctac 60 cgctcttctt cgcccgggtg tgctagactg gagatgagaa tcgctgagct tgaagaacgc 120 ctcgaggaag aacggtcttt tcgtaacaaa aaccagcggg agacctgtga atatgctctg 180 gaaattgaat ccctcaatca aaggcttgag gaagcaaatg aaaccattaa tcagcagctc 240 gacgttataa aacgccgcga agcggaatcg gcgatggtgc acaaggaaag ggacatactg 300 aagcagactc tcgaagctga cgcagcctct gctcgtcgcc gtcatcaggc tgctcttaat 360 gaacaccagg atgagctgga ggatctgcga aagacaaagg ccaagctgga aaaagaacgc 420 agcgaactat ttcaagaggc agagaagctg gcaagtgaac tttcaaaagt gcagaaaatg 480 aacgaagctc tggagggcaa aatagatgga ttcgaatgcc atacaactcg actaaaggct 540 ggtaacgagg acttgctaaa gcagcttgcg gaaatgaagg cccgcaacaa tagcctcatg 600 gcgactgagg ccgaaaatgt gaagaacttg gacaaagcca ccaatgcact gtcgattgct 660 caaaggcagg ttgcttcgtt acaaaaggag gtggatgact tgaaaaacca actacacgag 720 gagacaacgt caagagagca ccttcagtct cggcagactc tgctgcagac tgggctcgaa 780 gccgcagagg ccagggcgga agatgaggct gagagcgccg cgcaggcaca gcaacaactt 840 tctaaaactg ccgccgagct gggcgccctg cgcaaccgac acgaacgcga gatgtcagaa 900 ctgcaggcgg agatgacgga ggaatttgag gag 933 <210> 5 <211> 750 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpII <400> 5 atgaaacgaa agctcaacgt ccgaatcaat gagctgactg acatggccga gcatgaacgt 60 acacgcgcct ccaacctgga gaagaccaag aataagctca cgatcgaaat ccgggatctt 120 caggctgaga atgaggcgtt ggccgctgac aatgccgagc tcacccgtcg cgccaaggct 180 gctgaacatc aagctgccga actgcagcgc cgcgttgacg aattgaccat cgaagtgaat 240 aacctcacct cggccaacaa tgccctcgaa caggacaaca ttcgtctcaa ggctcaggtc 300 aacgacctca ccgatcgaat cagcaacctc gatcgtgaga ataatcaact ctccgagcaa 360 ctgaaagaga ccaagtccgc cttgcgtgac gcaaaccgcc gcctgactga ccttgaggct 420 ctgcgttcgc aactggaggc tgaaagagac aatctagcct ctgccctcca tgatgccgag 480 gaggccctta aagacctcga agctaaatac caatcctcac aatccgctct ggctcacctg 540 aaatcggaga tggaacagcg tctgcgcgag aaggatgaag aattggagaa cctgcgcaag 600 agcactactc gcacaatcga agagttgacc gccaccatca ccgagatgga ggttcgtttc 660 aagtcggaga cgtcgcgtct taagaagaag tacgaggcta cgatcagcga attggaaatg 720 cagttggata tggcgaacaa ggccaatgct 750 <210> 6 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpIII <400> 6 aacctcaatc gtgaaaacaa agcccttgct caacgtgtcc aggagctaca ggttgccctt 60 gacgacgaac gcagagctcg tgaggccgca gagggcaatc ttcaggcaag cgaacgcaag 120 cgcatccaac tgacagccga gatcgaagaa attcgcagct ctcttgaggt ttgcgaacgc 180 gctcgcaaga acgctgagaa cgagctcggt gaggctaaca accgcgttag tgagctgaca 240 atgcaagtga atgcgttgac caatgacaag cgtcgtcttg agggtgacct tggtgtcatg 300 cagggcgacc ttgatgaggc agtcaacgcc cgaaaggccg ccgaggaccg tgctgatcgt 360 ctgaatgccg aggttctccg tctcgctgac gaactgcgcc aggagcagga gaactacaaa 420 cgtgctgaga ccctccgcaa acagcttgaa atcgaaatcc gcgagatcac cgtgaagctt 480 gaggaggctg aatccttcgc cacccgggag ggccgtcgca tggttcagaa gctccagaac 540 cgtgtgcgtg aactcgaagc cgagctggac gcggaaattc gccgaagcaa ggatgccgcg 600 gcaaacgcac gcaaatacga acgtcaattc aaggagctac agacccaatg tgaggaggat 660 cgccgcatgg tgttggaact gcaggatttg cttgacaaga cccaaatgaa gatgaaggcc 720 tataaacgtc agctcgatga gcaggaggag gtatctcagc tgacgatgaa caagtaccgc 780 aaggcccaac aacagattga ggaggccgag cacagggctg acatggctga gcgcagcatc 840 accatcaaga gaaccaccat tggtccaggt ctgcgtgccc tttcggtcgc tcgtgagatg 900 agcactagcg tggctcgagg aggccgtgcc acgagcatta tgtaa 945 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggatccatgg ccgctgtaca aataag 26 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aagcttctcc tcaaattcct ccgtc 25 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ggatccatga aacgtaagct caacgtc 27 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 aagcttagca ttggccttgt tcgcc 25 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggatccaacc tcaatcgtga aaacaaag 28 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ggtaccttac ataatgctcg tggcac 26 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spa-1F <400> 13 atgtctgaat cacacgtcaa 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-D1F <400> 14 ctgaaygctg aggtwctycg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-D1R <400> 15 cgragwacct cagcrttcag 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-D3F <400> 16 gtcatgcarg gcgatctcga 20 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spa-4F <400> 17 gaatcgtcga ctgaccgat 19 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spa-4R <400> 18 atcggtcagt cgacgattc 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spa-5F <400> 19 ttaccaatga caaacgtcga ct 22 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-D5F <400> 20 ttcaacgcyg atatggctgc 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sp-D6F <400> 21 gaaytggagg acytgctcga 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Spa-6R <400> 22 ctacatgatg ctggttgcac 20

Claims

서열번호 1 내지 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 고충증 진단용 항원성 단백질.
제 1항의 단백질을 코딩하는 고충증 진단용 항원성 유전자.
제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 4 내지 서열번호 6에 기재된 염기서열을 가지는 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 고충증 진단용 항원성 유전자.
제 1항의 단백질을 유효성분으로 하는 고충증 진단용 조성물.
제2항 또는 제3항의 유전자를 유효성분으로 하는 고충증 진단용 조성물.