KR101031349B1 - 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 플라스미노겐 액티베이터의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종자특이 글루테린 프로모터 서열, 벼 유래의 글루테린 단백질의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA), 식물의 단백질 발현 최적화를 위한 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자(st-PA), 발현양 증대와 당쇄 결합 변형을 위한 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAER), 정제를 용이하게 하기 위해 His₆ 태그 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAHis₆) 및 단백체 I으로 표적하기 위한 플로라민 유전자가 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA-prolamine)의 군에서 선택된 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 제공한다.

플라스미노겐 액티베이터, 식물, 벼

Description

플라스미노겐 액티베이터 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 플라스미노겐 액티베이터의 생산방법{A vector for transgenic plant comprising plasminogen activator gene, a Transgenic plant, and Producing method of plasminogen activator using the same}

본 발명은 플라스미노겐 액티베이터 유전자를 함유하는 식물 형질전환용 벡터 및 이를 응용하는 기술에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물 세포에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 활성 있는 형태로 발현시킬 수 있어 기존의 혈전용해제 생산방법에 비하여 생산단가가 매우 저렴하고, 부작용이 없는 혈전용해제를 식물체에서 대량생산할 수 있는 형질전환용 벡터, 형질전환식물, 형질전환 방법 및 동 방법에 의한 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 제조방법에 관한 것이다.

조직형 플라스미노겐 액티베이터 (tissue-type plasminogen activator, 이하 ‘t-PA’로 약칭함)는 피브린 용해에 수반되는 세린 프로테아제로써, t-PA는 혈관 내피세포 등의 인체 조직에서 생산되는 분자량 약 68,000 달톤 정도의 당단백질로 서 혈전 용해제로 사용되고 있다. 혈전이란 혈관내에 생기는 혈액의 덩어리로 이로 인해 모세혈관이 막혀서 수족마비, 뇌 경색, 심근 경색 등이 발생한다. 혈전의 주성분은 피브린이라는 당단백질이며, 플라스민에 의해 분해된다. t-PA는 혈전을 형성하는 피브린에 대한 친화성이 높을 뿐만 아니라 피브린이 존재할 때 그 활성도가 100-200배 증가하는 특성이 있어서 피브린 표면에서 국소적으로 작용하여 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키며, 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등과 같은 다른 혈전용해제에 비해 특이성이 높은 것으로 알려져 있다(Bergmann, S. R. et al., Science 220: 1181-1183. 1981). 한편, 스트랩토카이네이즈나 유로카이네이즈 등은 혈액내에 순환하는 플라스미노겐까지도 활성화시키기 때문에 심한 출혈현상 등과 같은 부작용을 나타내기도 한다고 보고되어 있으나, 플라스미노겐 액티베이터에서는 이러한 부작용이 보고된 바 없다.

한편, 종래 플라스미노겐 액티베이터를 생산하는 방법으로는 미국특허 제4,853,330호와 제5,869,314호에 사람조직 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 대장균과 차이니즈 햄스터의 난소세포인 CHO 세포에서 발현하는 방법이 개시된 바 있으며, 미국특허 제 5,106,741호에 플라스미노겐 액티베이터 변이체를 대장균과 효모에서 발현시키는 방법이 개시된 바 있다. 그러나 미생물 발현의 경우 대부분은 불용성 형태로 발현되고, 재접힘 반응을 필수적으로 행하여야 하며, 당이 붙지 않는 문제점이 있었다. 동물세포 발현의 경우에는 생산단가에 있어 고비용이 소요되므로 가격 경쟁력 측면에서 비효율적이라는 단점이 있었다. 따라서, 기존의 혈전용해제에 비하여 획기적인 가격 경쟁력을 갖으며, 활성형태의 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법이 요구되고 있다.

본 발명은 상기한 바와 같이 종래기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 안출된 것으로, 그 목적은 식물 세포에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 활성 있는 형태로 발현시킬 수 있어 기존의 혈전용해제 생산방법에 비하여 생산단가가 매우 저렴하고, 부작용이 없는 혈전용해제를 식물체에서 대량생산할 수 있는 형질전환용 벡터, 형질전환식물, 형질전환 방법 및 동 방법에 의한 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 제조방법을 제공함에 있다.

상기한 바와 같은 본 발명의 기술적 과제는 다음과 같은 수단에 의해 달성되어진다.

(1) 종자특이 글루테린 프로모터 서열, 벼 유래의 글루테린 단백질의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA), 식물의 단백질 발현 최적화를 위한 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자(st-PA), 발현양 증대와 당쇄 결합 변형을 위한 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAER), 정제를 용이하게 하기 위해 His₆ 태그 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAHis₆) 및 단백체 I으로 표적하기 위한 플로라민 유전자가 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA-prolamine)의 군에서 선택된 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.

(2) 상기 제 1항에 있어서, 상기 글루테린 단백질 신호서열은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.

(3) 상기 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 액티베이터 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.

(4) 상기 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 액티베이터 유전자는 서열번호 4~6에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.

(5) 상기 제 1항에 있어서, 상기 식물 형질전환용 벡터는 도 1B에 개시된 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.

(6) 상기 제 1항 내지 제 5항 중에서 선택된 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 세균.

(7) 상기 제 5항에 있어서, 상기 세균이 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세균.

(8) 상기 제 1항의 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 식물.

(9) 상기 제 1항의 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 벼.

(10) 상기 제 1항의 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 벼의 제조방법.

(11) 상기 제 1항의 벡터를 식물세포에 도입시키고, 상기 식물세포내에서 플라스미노겐 액티베이터를 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법.

본 발명에 의하면, 식물 세포에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 활성 있는 형태로 발현시킬 수 있기 때문에 기존의 혈전용해제 생산방법에 비하여 생산단가가 매우 저렴하고, 부작용이 없는 혈전용해제를 식물체에서 대량생산할 수 있는 효과가 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 종자특이 글루테린 B1 프로모터 (GluB1 promoter), 글루테린 B1의 신호서열, 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자 또는 합성 플라스미노겐 액티베이터 (synthetic tissue-type plasminogen activator) 유전자가 순차적으로 연결된 식물형질전환용 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 플라스미노겐 액티베이터에 His₆ 태그, 소포체 지연서 열 또는 플로라민(prolamine) 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터에 의해서 유전자가 도입된 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator), 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAER), His₆ 태그를 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAHis₆), 플로라민으로 단백체(Protein body) I으로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA-prolamine) 단백질을 발현하는 형질전환 벼를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물세포의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터를 식물세포에 도입시켜 발현하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질 및 플라스미노겐 액티베이터 변형 단백질의 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.

일반적으로 플라스미노겐 액티베이터 및 그 변이체의 생산은 CHO 세포와 대장균을 이용하여 생산하며, 식물 벼세포에서 플라스미노겐 액티베이터를 발현시키는 것은 보고된 바 없다. 그러나 본 발명자들은 종자특이 글루테린 B1 프로모터 (GluB1 promoter), 글루테린 B1의 신호서열, 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator, t-PA) 유전자, 식물의 단백질 발현 최적화를 위한 플라스미노겐 액티베이터 합성 유전자(st-PA), 발현양 증대와 당쇄 결합 변형을 위한 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAER), 플로라민으로 단백체 I으로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PA-prolamine) 및 정제를 용이하게 하기 위한 His₆ 유전자에서 선택된 어느 하나의 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터를 포함한다.

본 발명에서는 이러한 형질전환용 벡터를 이용하여 벼 종자내에 상기 유전자를 도입함으로써 벼에서 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명에 의해 생산되는 단백질은 불용성 형태가 아닌 활성 있는 형태로써 발현된다.

상기 ‘벼 유래의 글루테린 B1 단백질(glutelin B1 protein)의 신호서열’은 GenBank No. X54314 에 개시되어 있는 것으로 서열번호 9로 표시되는 염기서열을 가진다. 본 발명에서는 플라스미노겐 액티베이터의 글라이코실레이션(glycosylation)과 올바른 폴딩(folding) 구조를 가지도록 하기 위하여, 벼 유래의 글루테린 B1 단백질(glutelin B1 protein)의 신호서열을 플라스미노겐 액티베이터 유전자의 상부에 가진다.

또한 본 발명에서는 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 벼 세포내 소기관인 단백체 I으로 표적하기 위하여, 낙동벼 유래의 플로라민 단백질 (prolamine protein)의 서열(서열번호 7) 또는 이의 변형서열(서열번호 8)을 플라스미노겐 액 티베이터 유전자의 종결코돈 다음에 삽입하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여 사용되는 ‘플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자’는 플라스미노겐 액티베이터 단백질 또는 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 갖는 것이 바람직하다. 상기 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 상기에서 '동등한 생리활성'이란 피브린 분해 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물이란 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩타이드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 3의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성된 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met) 등을 포함한다. 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 아울러 상기 플라스미노겐 액티베이터의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.

본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 2로 표시되는 플라스미노겐 액티베이터 유전자, 서열번호 3-5로 표시되는 글루테린 B1 신호서열이 연결된 플라스미노겐 액티베이터 유전자 변이체(9~80번 위치는 글루테린 B1신호서열) 및 서열번호 6으로 표시되는 글루테린 B1 신호서열이 연결된 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자(45~116번 위치는 글루테린 B1신호서열)를 이용하였다.

또한, 본 발명은 상기 천연형의 플라스미노겐 액티베이터 유전자 대신 플라스미노겐 액티베이터의 유전자 변이체를 이용할 수 있는데, 상기 플라스미노겐 액티베이터의 변이체에 대해서는 미국특허 제4,963,357호, 제5,037,752호, 제5,087,572호, 제5,094,953호, 제5,100,666호, 제5,106,741호, 제5,108,901호, 제5,156,969호, 제5,185,259호, 제5,232,847호, 제5,242,819호, 제5,244,676호, 제5,258,180호, 제5,258,298호, 제5,262,170호, 제5,270,198호, 제5,302,390호, 제5,314,818호, 제5,338,546호, 제5,346,824호, 제5,366,886호, 제5,376,547호, 제5,385,732호, 제5,405,771호, 제5,411,871호, 제5,486,471호, 제5,504,001호, 제 5,520,911호, 제5,520,913호, 제5,556,621호, 제5,580,559호, 제5,589,361호, 제5,614,190호, 제5,616,486호, 제5,648,250호, 제5,714,144호, 제5,714,145호, 제5,714,372호, 제5,728,565호, 제5,728,566호, 제5,728,567호, 제5,736,134호, 제5,739,012호, 제5,753,486호, 제5,756,093호, 제5,770,425호, 제5,770,426호, 제5,821,105호, 제5,830,849호, 제5,840,533호, 제5,840,564호, 제5,869,314호, 제5,908,625호 및 제6,706,504에 개시되어 있으며, 이에 대한 설명은 본원에 인용된다.

본 발명의 종자특이 글루테린 B1 프로모터 (GluB1 promoter), 글루테린 B1의 신호서열, 및 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 벡터는 공지의 식물 형질전환용 벡터를 기본 벡터로 하여 제조될 수 있으며, 일반적인 이원 벡터(binary vector) 또는 코인테그레이션 벡터(cointegration vector)가 사용될 수 있다. 식물 형질전환시 널리 사용되는 바이너리 벡터의 종류는 매우 다양하며, 거의 모든 바이너리 벡터가 CAMBIA(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture, GPO Box 3200, Canberra ACT2601, Australia)와 같은 국제센터 및 대학연구소에서 입수가능하며, 기본적인 바이너리 벡터의 골격은 T_i 플라스미드를 모체로 하여 유전자가 전달되는 좌측 및 우측경계 부위에 형질전환체 선별 표지 유전자, 프로모터, 전사종결부위 유전자 등을 다양하게 변형시켜 사용하고 있다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 도 1에 개시된 개열 지도를 포함한다. 즉, 본 발명의 식물 형질전환용 벡터는 종자특이 글루테린 B1 프로모터 (GluB1 promoter), 글루테린 B1의 신호서열, TpinII (potato protease inhibitor II)의 터미네이터, 칼리플라워 모자이크 바이러스의 35S 프로모터, 선택 표지 유전자로서 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(제초제 저항성 유전자), Tnos(nopaline synthase) 터미네이터 및 MAR(matrix-attached region)가 순차적으로 연결된 유전자 구조물을 포함한다.

본 발명에 따른 벡터는 식물 형질전환용 벡터이므로, 당업계에 알려진 다양한 식물체-기능적 프로모터가 사용될 수 있으며, 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터, 피그워트 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 슈가케인 바실리폼 바이러스 프로모터, 코메리나 옐로우 모틀 바이러스 프로모터, 리불로스-1,5-비스-포스페이트 카르복실라아제의 소단위(ssRUBISCO)로부터의 빛-유도성 프로모터, 쌀 사이토졸릭 트리오세포스페이트 이소머라아제(TPI) 프로모터, 아라비돕시스(Arabidopsis)로부터의 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 (APRT) 프로모터, 옥수수의 유비키틴 프로모터, 쌀 액틴 1 유전자 프로모터, 알파-아밀라제 3D 프로모터 (alpha-amylase, 3D promoter), 글로부린 프로모터, 글루테린 A 또는 B 프로모터, 플로라민 프로모터, 만노핀 신타아제 및 옥토핀 신타아제 프로모터를 포함하며, 바람직하게는 칼리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 35S 프로모터를 사용한다. 또한, 상기 선별 표지 유전자는 항생제 저항성 유전자, 제초제 저항성 유전자, 대사관련 유전자, 발광 유전자, GFP (green fluorescence protein) 유전자, GUS (β-glucuronidase) 유전자, GAL (β-galactosidase) 유전자 등을 포함하지만 그것에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 Ⅱ (NPT Ⅱ) 유전자, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 유전자 또는 다이하이드로폴레이트 환원효소 유전자 등이 사용될 수 있지만, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제가 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법을 사용하여, 벼 유래의 글루테린 B1 단백질의 신호서열과 연결되어 있는 t-PA 유전자, 소포체지연서열을 가지는 t-PA 유전자, His₆ 태그를 가지는 t-PA 유전자, 합성 t-PA 유전자 또는 프롤라민 서열을 포함하는 t-PA 유전자를 글루테린 B1 프로모터와 TpinII (potato protease inhibitor II) 터미네이터를 포함하는 식물 발현 벡터 (pMJ21)에 클로닝하여 칼리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터, 선택 표지 유전자로서 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자(제초제 저항성 유전자), Tnos(nopaline synthase) 터미네이터 서열이 순차적으로 연결된 벡터 pMJ21GluB1-tPA, pMJ21GluB1-tPAER, pMJ21GluB1-tPAHis₆, pMJ21GluB1-tPA-prolamine, pMJ21GluB1-stPA를 제조하여 사용하였다(도 1 참조).

상기의 당 분야에 공지된 분자생물학적 기법인 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 다음 문헌에 기재되어 있다(Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1989; by Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY, 1984; and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-lnterscience , 1987).

상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 식물에 도입하는 방법으로는 당분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다 (Horsch et al., Science 227:1229-1231, 1985). 예를 들면 벼에 대한 아그로박테리움-매개 형질전환법은 당업계의 문헌 등에 공지되어 있다(An et al., EMBO J 4:227-288,1985).

따라서, 본 발명은 본 발명의 식물 형질전환용 벡터로 형질전환된 세균을 제공한다. 상기 세균으로는 아그로박테리움 속 세균이 있다. 형질전환용 숙주로 사용되는 아그로박테리움은 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes) 등이 사용된다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 투마파시엔(Agrobacterium tumefaciens)에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 유전자가 도입되도록 하였다.

본 발명은 또한, 상기 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질을 발현하는 형질전환 식물을 제공한다. 본 발명에 서 ‘식물’이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자를 모두 포함한다. 상기 본 발명에 따른 방법이 적용될 수 있는 식물체로는 단자엽 식물 또는 쌍자엽 식물이 포함된다. 상기 단자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마 및 생강이 있다. 쌍자엽 식물의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 애기장대, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 버즈풋 트레포일, 감자, 개구리밥, 들깨, 비둘기콩, 알팔파 및 완두가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 벼를 사용하였다 (실시예 2 참조).

또한 본 발명은 상기의 벡터를 식물세포에 도입하는 단계를 포함하여 플라스미노겐 액티베이터(tissue-type plasminogen activator) 단백질, 플라스미노겐 액티베이터 파생 단백질 (t-PAER과 t-PAAHis₆), 플라스미노겐 액티베이터 (tissue-type plasminogen activator) 단백질을 벼세포내 단백체 I으로 표적하도록 발현하는 형질전환 식물의 제조방법 및 이에 의해 제조된 식물에서 플라스미노겐 액티베이터 (tissue-type plasminogen activator) 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 식물은 벼이다.

한편, 상기와 같은 방법으로 본 발명의 합성 유전자가 도입된 형질전환 식물들은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 캘러스 유도, 발근 및 토양 순화와 같 은 과정을 거쳐 식물체로 재분화시킬 수 있으며, 꺾꽂이, 접붙이기 등과 같은 무성번식방법 및 종자를 이용하여 유성번식방법에 의해 생산할 수 있다.

본 발명에 의해 제조되는 플라스미노겐 액티베이터는 활성 형태의 단백질로 본 발명의 방법에 의해 제조된 형질전환 벼 종자로부터 공지된 방법에 의해 추출 및 정제하여 생산할 수 있다.

본 발명의 실험예에서는 상기와 같이 재분화된 식물체내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 단백질로 안정하게 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 형질전환체 시료를 사용하여 웨스턴 블럿 및 ELISA를 한 결과, 단백질 레벨에서도 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다(도 4 및 도 6 참조).

또한 본 발명의 또 다른 실험예에서는 본 발명의 방법에 의해 생산된 플라스미노겐 액티베이터 단백질이 활성 형태인지 여부를 피브린 플레이트법을 통하여 확인한 결과 피브린의 분해 활성이 있는 것을 확인하였고(도 5 참조) 본 발명의 방법에 의해 생산된 플라스미노겐 액티베이터 단백질이 활성 형태임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기와 같이 형질전환 벼내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 안정적으로 도입되었는지를 확인하기 위하여, 형질전환체 시료에 플라스미노겐 액티베이터 특이적 프라이머를 사용하여 서던블랏을 수행한 결과, 형질전환 벼 게놈 DNA에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 성공적으로 삽입되었음을 확인하였다 (도 7참조)

이하 본 발명의 내용을 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 다만 하기 예시된 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시되는 것일 뿐 이에 의해 본 발명의 권리범위가 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

<실시예 1> 식물 형질전환용 벡터 및 아그로박테리움 형질전환체 제조

<1-1> 식물 형질전환용 벡터의 제작

벼 유래의 글루테린 B1 단백질 (GenBank accession no. X54314)의 신호서열과 연결되어 있는 t-PA 유전자 (1,664bp), t-PAER 유전자 (1,676bp), t-PAHis₆ 유전자 (1,685 bp) 및 합성 st-PA 유전자 (1,700 bp)를 글루테린 B1 프로모터, 코작 서열 (Kozak sequence), 글루테린 B1 리더서열 및 Tnos (nopaline synthase) 터미네이터를 포함하는 식물 발현 벡터 pMJ21(Oh et al., advances in rice genetics 451-454, 2003)에 클로닝하기 위해서 다음과 같이 발현 벡터를 제조하였다.

pBluscript SK 벡터에 글루테린 B1 프로모터 (Takaiwa Plant Mol. Biol. 17, 875-885, 1991)가 삽입된 벡터 (pSK-GluB1)에 글루테린 B1 리더서열과 t-PA 유전자를 순차적으로 삽입하기 위해서 서열 9 glutelinssF1 프라이머 ( 5'-ATGGCGAGTTCCGTTTTCTCTCGGTTTTCTATATACTTTTGTGTTCTTCTATTATGCCATGGTTCTATGGCC-3')과 서열 10 glutelinssR1 프라이머 (5‘-GGCCATAGAACCATGGCATAATAGAAGAACACAAAAGTATATAGAAAACCGAGAGAAAACGGAACTCGCCAT-3‘)을 100℃로 가열 후 상온에서 상보적으로 어닐링(annealing) 되도록 하였다. 또한 서열 15 5’인에 인산화되어 있는 HTPAphosF 프라이머(5’- TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3’)와 서열 16 HTPAR7 프라이머(5‘-ataagaatgcggccgcTCACGGTCGCATGTTGTCACG-3’)를 이용하여 PCR법으로 증폭된 t-PA 유전자를 증폭하였다. 위의 두 반응물을 T4DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 16℃에서 30분간 접합(ligation)한 후 정제하였다. 그런 후 글루테린 B1 신호서열과 t-PA 유전자가 연결된 DNA를 증폭하기 위해서 서열 17 glutelinssF2 프라이머 (5‘-cgggatccaaatagctATGGCGAGTTCCGTTTTCTCTC-3’)와 서열 16 HTPAR7 프라이머(5‘-ataagaatgcggccgcTCACGGTCGCATGTTGTCACG-3’)를 이용하여 PCR법으로 증폭 후 제한 효소 BamHI과 Hind III로 절단 후 탈인산화 된 pSK-GluB1에 삽입하였다. 이 벡터를 PBSglutelinsstpa라 명명 하였다. 그런 후 플라스미드 PMJ 21 (khush 등, Advance in Rice Genetics, IRRI, 2003)에 삽입하기 위해서 Xho I과 Not I로 절단 후 상기 PMJ 21가 Xho I과 Not I로 절단 후 탈인산화 된 벡터에 연결하여 플라스미드 pMJ21GluB1-tPA를 제조하였다. 상기 플라스미드 pMJ21GluB1-tPA를 주형으로이용하여 서열 20 OsglutelinF2 프라이머(5‘-ccgctcgagTTTTTGAGGAATTTTAGAAGttgaac-3’)와 서열 18 OsHTPAHIS6R2 프라이머 (5‘- ataagaatgcggccgcTcAcacgtggtgatggtgatgatgCGGTCGCATGTTGTCACgaatcc-3’)를 이용하여 PCR 법으로 증폭 후 Xho I과 Not I로 절단 후 PMJ 21가 Xho I과 Not I로 절단 후 탈인산화 된 벡터에 연결하여 플라스미드 pMJ21GluB1-tPAHis₆를 제조하였다. 상기 플라스미드 pMJ21GluB1-tPA를 주형으로 이용하여 서열 20 OsglutelinF2 프라이머(5‘-ccgctcgagTTTTTGAGGAATTTTAGAAGttgaac-3’)와 서열 19 OsHTPAHDEL R1 프라 이머 (5‘-ataagaatgcggccgcTcAgagctcgtcgtgCGGTCGCATGTTGTCACgaatcc-3’)를 이용하여 PCR 법으로 증폭 후 Xho I과 Not I로 절단 후 PMJ 21을 Xho I과 Not I로 절단 후 탈인산화된 벡터에 연결하여 소포체 지연 서열 HDEL를 포함하는 플라스미드 pMJ21GluB1-tPAER을 제조하였다.

서열 6의 합성된 t-PA 유전자를 제한 효소 Bam HI과 Hind III로 절단 후 탈인산화 된 pSK-GluB1에 삽입하였다. 그런 후 플라스미드 PMJ 21에 삽입하기 위해서 Xho I과 Not I로 절단 후 상기 PMJ 21이 Xho I과 Not I로 절단 후 탈인산화 된 벡터에 연결하여 플라스미드 pMJ21GluB1-stPA를 제조하였다. 프로틴 바디 I (protein body I)으로 t-PA 단백질을 표적하기 위해서 플로라민 단백질 유전자를 서열 11 osprolamin7F1 프라이머 (5‘-atgaagatcattttcgtctttgctctccttgc-3’)와 서열 12의 osprolamin7R1 프라이머 (5‘- tttgttctttattggaataaaaggacgg-3’)를 이용하여 낙동벼로부터 RT-PCR법을 이용하여 증폭하여 염기서열을 결정하였다 (서열 7). 이렇게 증폭된 플로라민 단백질 서열과 3‘UTR (untranslated sequence)을 t-PA 유전자와 결합하기 위해서 시작 코돈이 ATG에서 TTG로 바뀐 서열 13 osprolamin7F2 프라이머 (5’- ATAAGAATGCGGCCGCttgaagatcattttcgtctttgct-3‘)과 서열 14 osprolamin7R2 프라이머 (5‘-ATAAGAATGCGGCCGCtttgttctttattggaataaaaggac-3’)를 이용하여 PCR법으로 증폭 후 NotI으로 절단 후, NotI으로 절단 후 탈인산화 된 pMJ21GluB1-tPA벡터에 연결하여 플라스미드 pMJ21GluB1-tPA-prolamine 벡터를 만들었다.

상기 유전자 증폭 및 클로닝을 위한 다음과 같은 PCR 반응조건 (95도 5분, 1 회; 94도 30초, 60도 30초, 72도 2분, 30회; 72도 7분, 1회)을 이용하여 증폭하였으며, 제한 효소 절단 후 DNA는 1% 아가로스 젤 전기영동을 실시하여 DNA 절편 크기 확인 및 정제를 하였다.

<1-2> 아그로박테리움 형질전환체 제조

상기 실시예 <1-1>에서 제조한 pMJ21GluB1-tPA, pMJ21GluB1-tPAER, pMJ21GluB1-tPAHis₆, pMJ21GluB1-tPA-prolamine 및 pMJ21GluB1-stPA 벡터를 triparental mating 방법 (Glevin et al., Plant Mmolecular Biology Manual. Kluwer academic Publishers B1, 1-19,1994)으로 아그로박테리아 LBA4404 (pSB1) (Hiei et al., Plant J 6:271-282.204, 1994)에 도입시켰다. 이후, 상기 형질전환된 아그로박테리아를 2일간 AB 배지[AB buffer (60 g/L K₂HPO₄, 20 g/L NaH₂PO₄), AB salts (20 g/L NH₄Cl, 6 g/L MgSO₄ㆍ7H₂O, 3 g/L KCl. 0.2 g/L CaCl₂, 0.05 g/L FeSO₄ㆍ7H₂O), 5 g/L glucose, 15 mg/ml tetracycline, 50 mg/ml spectinomycine, 50 mg/ml kanamycine]에서 배양하여 이를 AAM 배지 [1X N6 macro elements, 1X N6 micro elements, 1X AA amino acids (877 mg/L glutamine, 228 mg/L arginine, 75 mg/L glycine, 266 mg/L aspartic acid), 1X MS vitamines, 500 mg/L Casamino acids, 36 g/L glucose, 68.5g/L sucrose, 100 μM/L acetosyringone]로 흡광도 600 nm에서 1.5로 재현탁시켰다.

<실시예 2> 벼 형질전환체의 제조

플라스미노겐 액티베이터 유전자를 벼 종자에서 발현하고자 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 아그로박테리아 LBA4404 (Glevin et al., Plant Mmolecular Biology Manual. Kluwer academic Publishers B1, 1-19,1994;Hiei et al., Plant J 6:271-282.204, 1994)를 벼 캘러스에 형질전환하였다.

소독한 벼 종자를 2N6 배지에 파종하여 암조건하에서 4주간 무균 배양한 신선한 캘러스를 채취하였다. 흡광도 1.5로 정량된 아그로박테리아를 상기 캘러스에 20분간 감염 후 2N6 배지에 상온에서 3일간 암조건에서 공동 배양하였다. 3일 후 증유수로 세척 후, 250 mg/L 세파탁심과 6 mg/L ppt (phosphinotricin)를 함유하는 2N6-비타민 포함 배지(Maxim-Bio)에서 3주간 암배양하였다. 갈변되지 않고 건강하게 살아 남은 캘러스를 위의 동일한 배지에서 2주간 암배양하였다. 저항성을 띤 캘러스를 MSR 배지 [(4.4g/L MS salt, 30g/L sucurose, 2 mg/L kinetin, 1 mg/L NAA, 2.5 g phytagel, 250 mg/L cefotaxime, 6 mg/L ppt)]에서 한 달간 명배양하여 재분화를 유도 하였고, 14일 간격으로 캘러스를 동일 배지에 계대하였다. 줄기가 나온 식물을 MS배지에서 뿌리를 유도하였고, 뿌리가 나온 후 1주일 지나 배양실에서 순화 후 온실에서 증식하였다. 형질전환 벼를 판별하기 위해서 ppt가 포함된 배지에서 계속 계대를 하여 생존하는 형질전환체를 구별하였다.

실험결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 6 mg/L ppt에 의해 생존하는 형질전환 벼를 선별할 수 있었다.

<실험예 1> PCR을 이용한 형질전환 벼에서의 플라스미노겐 액티베이터 유전자 확인

플라스미노겐 액티베이터를 증폭하기 위하여, t-PA, t-PAHis₆, t-PAER, t-PA-prolamine의 경우는 정방향 프라이머로 t-PA F1와 역방향 프라이머 (5‘-TCTTACCAAGTGATCTGCAGAG-3’)로 t-PA R1 (5‘-TCACGGTCGCATGTTGTCACG-3‘)를 사용하였고, st-PA의 경우는 정방향 프라이머로 각각 PCRs OS F1 (5’-TCTTACCAGGTGATCTGCAGGA-3‘)을 사용하였고 역방향 프라이머로 각각 PCRs OS R1 (5’-TCAAGGTCGCATGTTGTCCCTG-3’)을 사용하였다.

상기 PCR 조건은 95℃에서 5분간 전처리 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 2분간 30회 반복한 다음 72℃에서 7분간 연장(extension)하였다.

실험결과, 도 2C에 나타난 바와 같이, 대략 1.6 kb에 해당하는 PCR 산물이 증폭되어, 형질전환 벼 내에 플라스미노겐 액티베이터 유전자가 제대로 삽입된 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 2> 웨스턴 블럿을 이용한 형질전환 벼종자에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 확인

형질전환체에서 발현된 재조합 단백질의 분자량을 측정하고자 웨스턴 블럿 분석을 실시하였다. 형질전환체 100 mg에 lysis buffer (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 5mM EDTA, 0.5 % Triton X-100) 0.5 ml을 넣고 4℃에서 60분간 방치 하여 호모게나이즈 한 후, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 상층액만을 분리하였다. Bradford 방법으로 정량된 5 ㎍의 단백질을 웨스턴 블랏에 사용하였다. 1차 항체로는 t-PA에 대한 다클로날(polyclonal)항체(Abcam)를 사용하여 하룻밤 동안 4℃에서 배양하였고, PBS-0.2% Tween 20 용액으로 5회 세척한 다음, HRP (horseradish peroxidase)가 붙어 있는 이차 항체(Pierce)와 상온에서 2시간 배양 후 5회 세척하였으며 마지막으로 ECL 용액을 이용하여 X-ray 필름에 감광시켜 발현을 확인하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이 형질전환체에서 약 68,000 Da의 플라스미노겐 액티베이터 단백질 밴드가 확인되어, 단백질 레벨에서도 안정적으로 발현됨을 확인할 수 있었다.

<실험예 3> ELISA을 이용한 형질전환체에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 발현율 확인

피브린 플레이트에서 가장 높은 분해활성을 갖는 총 305개 (형질전환벡터 별로 33-203개)의 벼를 대상으로 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 항원력 검증과 발현양을 측정하고자 ELISA를 실시하였다. Soluble t-PA ELISA 키트(CalBiochem사)를 이용하여 형질전환체 내에 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질 양을 측정하였다.

PBS-0.5 % Tween 20 추출 시료 1 ㎍/100 ㎕와 상온에서 1시간 반응 후 PBS-1 % Tween 20 으로 3회 세척 후 HRP가 붙어 있는 이차 항체를 사용하여 상온에 서 2시간 반응 후 다시 PBS-1% Tween으로 3회 세척 후 100 ㎕의 TMB (tetramethyl-benzidine)를 처리하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이 2.8 ㎍/㎎에서 1.2 ㎍/㎎ 까지 단백질이 발현되었고, 평균 0.279 ㎍/㎎이 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 대조군으로 사용된 야생형(wt)에서는 흡광도의 변화가 없었다.

<실험예 4> 피브린 플레이트법(fibrin-plate method)을 통한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 효소 활성 확인

형질전환체에서 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터의 피브린 분해활성을 측정하고자 피브린 플레이트법을 이용하여 재조합 효소의 피브린 분해능을 측정하였다.

0.8%의 피브리노겐(fibrinogen) 용액 40 ml과 5 유닛의 트롬빈을 혼합한 후 플레이트에 붓고 30분간 상온에 방치하여 피브린을 형성시켰다. 각각 30개에서 224개의 벼를 대상으로 PBS-0.5 % Tween 20 추출물 1 ㎍을 점적한 후 습도가 높은 37℃ 배양기에서 하룻밤 정치하였다.

실험결과, 도 5A에 나타난 바와 같이 효소의 피브린 분해활성은 본 발명의 형질전환체 추출시료 대부분에서 활성을 나타내었고, 그중 t-PA 군에서는 24, 34, 35, 44, 46, 90, 129번 형질전환체가, t-PA His 군에서는 3, 4, 7, 38, 40, 21, 30, 39 번, t-PA ER 군에서는 1, 2, 37, 42, 57, 70, 78, 79번, st-PA 군에서는 44, 158, 217, 231, 218, 232, 254, 294번, t-PA-prolamine 군에서는 61, 75, 88, 94, 105, 138, 166, 233번 형질전환체가 분해 활성이 높음을 확인하였다. 음성 대조군으로 사용된 야생형 벼의 추출물에서는 어떠한 분해활성 반응도 찾아볼 수 없었다.

<실험예 5> 서던블랏분석법(Southern blot analysis)을 통한 플라스미노겐 액티베이터 유전자 삽입 확인

t-PA 유전자 형질전환 벼 (5 그룹: t-PA, st-PA, t-PAHIS6, t-PAER, t-PA-prolamine) 식물체의 잎에서 분리한 각각의 genomic DNA 10 ㎍을 제한효소 Bam HI (10 U/㎍)으로 절단한 후 0.8% agarose 젤에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 젤을 1.5 M NaCl, 0.5 N NaOH 용액 내에서 45분간 부드럽게 교반하여 젤상의 DNA를 변성시켰다. 젤을 멸균수로 헹군 후 1 M Tris (pH 7.4), 1.5 M NaCl 용액에 넣어 부드럽게 교반하였고, 30분 후 새로운 용액으로 교체하여 15분 동안 추가로 교반하였다. Capillary transfer 방법으로 나일론 막 (Hybond^TM-N⁺, GE Healthcare)에 DNA 밴드들을 전이시킨 후 막을 5분 동안 6 x SSC 용액에 넣어 막 상에 남아있는 젤을 제거하였고, 3 MM 종이를 이용하여 30분 동안 건조하였다. 막 상의 DNA는 80℃에서 2시간 동안 보관하여 고정시켰고, ³²P가 표지된 st-PA (st-PA 그룹에 사용함) 또는 t-PA 프로브 (t-PA, t-PAHIS₆, t-PAER, t-PA-prolamine 그룹에 사용함)로 65℃에서 결합 반응을 수행하였다. 2 x SSC, 0.5% SDS 용액 (5분), 2 x SSC, 0.1% SDS 용액 (15분), 0.1 x SSC, 0.5% SDS 용액 (37℃와 65℃, 각각 1시간) 및 0.1 x SSC 용액 으로 막을 배양과 세척한 후 X-ray 필름과 이미지 분석 스크린을 이용하여 -70℃에서 24시간 동안 보관하였고, X-ray 필름 상의 밴드는 오토레디오그라피(autoradiography)를 이용하여 검출하였다.

상기와 같이, 본 발명의 바람직한 실시 예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

도 1a는 본 발명에 따른 식물 형질전환용 벡터의 모벡터(pMJ21)의 모식도(A) 이다.

도 1b는 본 발명에 따른 식물 형질전환용 벡터의 모식도이다. (PGluB1: 글루테린 B1 프로모터, bar: 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 유전자, TpinII: 포테이토 프로테아제 인히비터 II, P35S: 콜리플라워모자이크 바이러스 35S 프로모터, Tnos: 노팔린 신세이즈 터미네이터, MAR: matrix-attached region, 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PA), 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (st-PA), 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAER), His₆가 포함된 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAHis₆) 및 플로라민이 포함된 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PA-prolamine)가 상기 벡터에 삽입된 식물 형질전환용 벡터를 나타낸다.

도 2는 본 발명의 식물 형질전환용 벡터를 제한효소로 절단한 후 아가로스 젤을 이용하여 확인하는 과정을 나타내는 사진이다 (a : pMJ21GluB1-tPA ; b (1-5), pMJ21GluB1-tPAHis₆; b (6-10), pMJ21GluB1-tPAER; c, pMJ21GluB1-tPA-prolamine; d, pMJ21GluB1-stPA).

도 3a는 본 발명의 벡터로 형질전환된 벼로 정상적으로 종자를 맺고 있음을 나타내는 사진이다.

도 3b는 본 발명의 벼 형질전환체의 잎 추출물을 이용하여 비선택적 제초제 인 PPT (phosphinotricin)에 저항성을 나타내게 하는 PAT (phosphoacetyltransfersae) 단백질이 발현되는 것을 bar strip으로 확인한 사진이다 (wt : 대조군 화영벼, 레인 1-16 : 형질전환체).

도 3c는 형질전환체에서의 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PA), 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAER), His₆가 포함된 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PAHis₆), 플로라민이 포함된 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (t-PA-prolamine) 및 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자 (st-PA)의 삽입여부를 PCR로 확인한 결과이다.

도 4는 웨스턴 블랏을 통한 형질전환벼 종자에서의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 확인한 결과이다(1: t-PA 대조군, 2: 대조군 화영벼, 3: t-PA, 4:t-PAHis6, 5:t-PAER , 6: st-PA, 7: t-PA-prolamine으로 발현된 벼 종자 추출물).

도 5a는 형질전환된 벼 종자에서 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 소포체 지연서열을 갖는 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PAER), His₆가 포함된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PAHis₆), 플로라민으로 단백체 I으로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA-prolamine) 및 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (st-PA)들의 섬유소 분해 활성을 피브린 플레이트법(fibrin-plate method)을 통해 확인한 결과이다 [(t-PA , t-PAER, t-PAHis6, st-PA, t-PA-prolamine: 발현 벡터로 형질 전환된 벼 종자 추출물의 섬유소 분해활성 및 상업적으로 판매되는 대조군 t-PA 농도별 섬유소 분해활성(100-3000 pg)].

도 5b는 형질전환된 벼 종자에서 발현된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA), 소포체 지연서열을 갖는 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PAER), His₆가 포함된 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PAHis₆), 플로라민으로 단백체 I으로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (t-PA-prolamine) 및 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자로 발현을 유도한 재조합 플라스미노겐 액티베이터 (st-PA)들의 피브린 분해 활성을 면적으로 나타낸 도표이다.

도 6은 ELISA를 통한 형질전환된 벼 종자의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 발현량을 확인한 결과이다.[TSP : 총 가용성단백질(total soluble protein)]

도 7은 서던블랏 분석법으로 형질전환된 벼 종자의 재조합 플라스미노겐 액티베이터 유전자 삽입수를 확인한 결과이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> A vector for transgenic plant comprising plasminogen activator gene, a Transgenic plant, and Producing method of plasminogen activator using the same <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Tyr Gln Val Ile Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln 1 5 10 15 Gln His Gln Ser Trp Leu Arg Pro Val Leu Arg Ser Asn Arg Val Glu 20 25 30 Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gln Cys His Ser Val Pro Val 35 40 45 Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gln Gln 50 55 60 Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Glu Gly Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Glu Ile Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gln 85 90 95 Gly Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu 100 105 110 Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gln Lys Pro Tyr Ser Gly 115 120 125 Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys 130 135 140 Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Phe Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly 165 170 175 Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His 180 185 190 Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile 195 200 205 Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr Ala Gln Asn Pro Ser Ala Gln Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys 225 230 235 240 Pro Trp Cys His Val Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys 245 250 255 Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro 260 265 270 Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro 275 280 285 Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 305 310 315 320 Ala His Cys Phe Gln Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile 325 330 335 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe 340 345 350 Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 355 360 365 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 370 375 380 Ala Gln Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp 385 390 395 400 Leu Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 405 410 415 His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 420 425 430 Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 450 455 460 Gly Pro Gln Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly 465 470 475 480 Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile 485 490 495 Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr 500 505 510 Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525 <210> 2 <211> 1584 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcttaccaag tgatctgcag agatgaaaaa acgcagatga tataccagca acatcagtca 60 tggctgcgcc ctgtgctcag aagcaaccgg gtggaatatt gctggtgcaa cagtggcagg 120 gcacagtgcc actcagtgcc tgtcaaaagt tgcagcgagc caaggtgttt caacgggggc 180 acctgccagc aggccctgta cttctcagat ttcgtgtgcc agtgccccga aggatttgct 240 gggaagtgct gtgaaataga taccagggcc acgtgctacg aggaccaggg catcagctac 300 aggggcacgt ggagcacagc ggagagtggc gccgagtgca ccaactggaa cagcagcgcg 360 ttggcccaga agccctacag cgggcggagg ccagacgcca tcaggctggg cctggggaac 420 cacaactact gcagaaaccc agatcgagac tcaaagccct ggtgctacgt ctttaaggcg 480 gggaagtaca gctcagagtt ctgcagcacc cctgcctgct ctgagggaaa cagtgactgc 540 tactttggga atgggtcagc ctaccgtggc acgcacagcc tcaccgagtc gggtgcctcc 600 tgcctcccgt ggaattccat gatcctgata ggcaaggttt acacagcaca gaaccccagt 660 gcccaggcac tgggcctggg caaacataat tactgccgga atcctgatgg ggatgccaag 720 ccctggtgcc acgtgctgaa gaaccgcagg ctgacgtggg agtactgtga tgtgccctcc 780 tgctccacct gcggcctgag acagtacagc cagcctcagt ttcgcatcaa aggagggctc 840 ttcgccgaca tcgcctccca cccctggcag gctgccatct ttgccaagca caggaggtcg 900 cccggagagc ggttcctgtg cgggggcata ctcatcagct cctgctggat tctctctgcc 960 gcccactgct tccaggagag gtttccgccc caccacctga cggtgatctt gggcagaaca 1020 taccgggtgg tccctggcga ggaggagcag aaatttgaag tcgaaaaata cattgtccat 1080 aaggaattcg atgatgacac ttacgacaat gacattgcgc tgctgcagct gaaatcggat 1140 tcgtcccgct gtgcccagga gagcagcgtg gtccgcactg tgtgccttcc cccggcggac 1200 ctgcagctgc cggactggac ggagtgtgag ctctccggct acggcaagca tgaggccttg 1260 tctcctttct attcggagcg gctgaaggag gctcatgtca gactgtaccc atccagccgc 1320 tgcacatcac aacatttact taacagaaca gtcaccgaca acatgctgtg tgctggagac 1380 actcggagcg gcgggcccca ggcaaacttg cacgacgcct gccagggcga ttcgggaggc 1440 cccctggtgt gtctgaacga tggccgcatg actttggtgg gcatcatcag ctggggcctg 1500 ggctgtggac agaaggatgt cccgggtgtg tacaccaagg ttaccaacta cctagactgg 1560 attcgtgaca acatgcgacc gtga 1584 <210> 3 <211> 1664 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aaatagctat ggcgagttcc gttttctctc ggttttctat atacttttgt gttcttctat 60 tatgccatgg ttctatggcc tcttaccaag tgatctgcag agatgaaaaa acgcagatga 120 tataccagca acatcagtca tggctgcgcc ctgtgctcag aagcaaccgg gtggaatatt 180 gctggtgcaa cagtggcagg gcacagtgcc actcagtgcc tgtcaaaagt tgcagcgagc 240 caaggtgttt caacgggggc acctgccagc aggccctgta cttctcagat ttcgtgtgcc 300 agtgccccga aggatttgct gggaagtgct gtgaaataga taccagggcc acgtgctacg 360 aggaccaggg catcagctac aggggcacgt ggagcacagc ggagagtggc gccgagtgca 420 ccaactggaa cagcagcgcg ttggcccaga agccctacag cgggcggagg ccagacgcca 480 tcaggctggg cctggggaac cacaactact gcagaaaccc agatcgagac tcaaagccct 540 ggtgctacgt ctttaaggcg gggaagtaca gctcagagtt ctgcagcacc cctgcctgct 600 ctgagggaaa cagtgactgc tactttggga atgggtcagc ctaccgtggc acgcacagcc 660 tcaccgagtc gggtgcctcc tgcctcccgt ggaattccat gatcctgata ggcaaggttt 720 acacagcaca gaaccccagt gcccaggcac tgggcctggg caaacataat tactgccgga 780 atcctgatgg ggatgccaag ccctggtgcc acgtgctgaa gaaccgcagg ctgacgtggg 840 agtactgtga tgtgccctcc tgctccacct gcggcctgag acagtacagc cagcctcagt 900 ttcgcatcaa aggagggctc ttcgccgaca tcgcctccca cccctggcag gctgccatct 960 ttgccaagca caggaggtcg cccggagagc ggttcctgtg cgggggcata ctcatcagct 1020 cctgctggat tctctctgcc gcccactgct tccaggagag gtttccgccc caccacctga 1080 cggtgatctt gggcagaaca taccgggtgg tccctggcga ggaggagcag aaatttgaag 1140 tcgaaaaata cattgtccat aaggaattcg atgatgacac ttacgacaat gacattgcgc 1200 tgctgcagct gaaatcggat tcgtcccgct gtgcccagga gagcagcgtg gtccgcactg 1260 tgtgccttcc cccggcggac ctgcagctgc cggactggac ggagtgtgag ctctccggct 1320 acggcaagca tgaggccttg tctcctttct attcggagcg gctgaaggag gctcatgtca 1380 gactgtaccc atccagccgc tgcacatcac aacatttact taacagaaca gtcaccgaca 1440 acatgctgtg tgctggagac actcggagcg gcgggcccca ggcaaacttg cacgacgcct 1500 gccagggcga ttcgggaggc cccctggtgt gtctgaacga tggccgcatg actttggtgg 1560 gcatcatcag ctggggcctg ggctgtggac agaaggatgt cccgggtgtg tacaccaagg 1620 ttaccaacta cctagactgg attcgtgaca acatgcgacc gtga 1664 <210> 4 <211> 1685 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 aaatagctat ggcgagttcc gttttctctc ggttttctat atacttttgt gttcttctat 60 tatgccatgg ttctatggcc tcttaccaag tgatctgcag agatgaaaaa acgcagatga 120 tataccagca acatcagtca tggctgcgcc ctgtgctcag aagcaaccgg gtggaatatt 180 gctggtgcaa cagtggcagg gcacagtgcc actcagtgcc tgtcaaaagt tgcagcgagc 240 caaggtgttt caacgggggc acctgccagc aggccctgta cttctcagat ttcgtgtgcc 300 agtgccccga aggatttgct gggaagtgct gtgaaataga taccagggcc acgtgctacg 360 aggaccaggg catcagctac aggggcacgt ggagcacagc ggagagtggc gccgagtgca 420 ccaactggaa cagcagcgcg ttggcccaga agccctacag cgggcggagg ccagacgcca 480 tcaggctggg cctggggaac cacaactact gcagaaaccc agatcgagac tcaaagccct 540 ggtgctacgt ctttaaggcg gggaagtaca gctcagagtt ctgcagcacc cctgcctgct 600 ctgagggaaa cagtgactgc tactttggga atgggtcagc ctaccgtggc acgcacagcc 660 tcaccgagtc gggtgcctcc tgcctcccgt ggaattccat gatcctgata ggcaaggttt 720 acacagcaca gaaccccagt gcccaggcac tgggcctggg caaacataat tactgccgga 780 atcctgatgg ggatgccaag ccctggtgcc acgtgctgaa gaaccgcagg ctgacgtggg 840 agtactgtga tgtgccctcc tgctccacct gcggcctgag acagtacagc cagcctcagt 900 ttcgcatcaa aggagggctc ttcgccgaca tcgcctccca cccctggcag gctgccatct 960 ttgccaagca caggaggtcg cccggagagc ggttcctgtg cgggggcata ctcatcagct 1020 cctgctggat tctctctgcc gcccactgct tccaggagag gtttccgccc caccacctga 1080 cggtgatctt gggcagaaca taccgggtgg tccctggcga ggaggagcag aaatttgaag 1140 tcgaaaaata cattgtccat aaggaattcg atgatgacac ttacgacaat gacattgcgc 1200 tgctgcagct gaaatcggat tcgtcccgct gtgcccagga gagcagcgtg gtccgcactg 1260 tgtgccttcc cccggcggac ctgcagctgc cggactggac ggagtgtgag ctctccggct 1320 acggcaagca tgaggccttg tctcctttct attcggagcg gctgaaggag gctcatgtca 1380 gactgtaccc atccagccgc tgcacatcac aacatttact taacagaaca gtcaccgaca 1440 acatgctgtg tgctggagac actcggagcg gcgggcccca ggcaaacttg cacgacgcct 1500 gccagggcga ttcgggaggc cccctggtgt gtctgaacga tggccgcatg actttggtgg 1560 gcatcatcag ctggggcctg ggctgtggac agaaggatgt cccgggtgtg tacaccaagg 1620 ttaccaacta cctagactgg attcgtgaca acatgcgacc gcatcatcac catcaccacg 1680 tgtga 1685 <210> 5 <211> 1676 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 aaatagctat ggcgagttcc gttttctctc ggttttctat atacttttgt gttcttctat 60 tatgccatgg ttctatggcc tcttaccaag tgatctgcag agatgaaaaa acgcagatga 120 tataccagca acatcagtca tggctgcgcc ctgtgctcag aagcaaccgg gtggaatatt 180 gctggtgcaa cagtggcagg gcacagtgcc actcagtgcc tgtcaaaagt tgcagcgagc 240 caaggtgttt caacgggggc acctgccagc aggccctgta cttctcagat ttcgtgtgcc 300 agtgccccga aggatttgct gggaagtgct gtgaaataga taccagggcc acgtgctacg 360 aggaccaggg catcagctac aggggcacgt ggagcacagc ggagagtggc gccgagtgca 420 ccaactggaa cagcagcgcg ttggcccaga agccctacag cgggcggagg ccagacgcca 480 tcaggctggg cctggggaac cacaactact gcagaaaccc agatcgagac tcaaagccct 540 ggtgctacgt ctttaaggcg gggaagtaca gctcagagtt ctgcagcacc cctgcctgct 600 ctgagggaaa cagtgactgc tactttggga atgggtcagc ctaccgtggc acgcacagcc 660 tcaccgagtc gggtgcctcc tgcctcccgt ggaattccat gatcctgata ggcaaggttt 720 acacagcaca gaaccccagt gcccaggcac tgggcctggg caaacataat tactgccgga 780 atcctgatgg ggatgccaag ccctggtgcc acgtgctgaa gaaccgcagg ctgacgtggg 840 agtactgtga tgtgccctcc tgctccacct gcggcctgag acagtacagc cagcctcagt 900 ttcgcatcaa aggagggctc ttcgccgaca tcgcctccca cccctggcag gctgccatct 960 ttgccaagca caggaggtcg cccggagagc ggttcctgtg cgggggcata ctcatcagct 1020 cctgctggat tctctctgcc gcccactgct tccaggagag gtttccgccc caccacctga 1080 cggtgatctt gggcagaaca taccgggtgg tccctggcga ggaggagcag aaatttgaag 1140 tcgaaaaata cattgtccat aaggaattcg atgatgacac ttacgacaat gacattgcgc 1200 tgctgcagct gaaatcggat tcgtcccgct gtgcccagga gagcagcgtg gtccgcactg 1260 tgtgccttcc cccggcggac ctgcagctgc cggactggac ggagtgtgag ctctccggct 1320 acggcaagca tgaggccttg tctcctttct attcggagcg gctgaaggag gctcatgtca 1380 gactgtaccc atccagccgc tgcacatcac aacatttact taacagaaca gtcaccgaca 1440 acatgctgtg tgctggagac actcggagcg gcgggcccca ggcaaacttg cacgacgcct 1500 gccagggcga ttcgggaggc cccctggtgt gtctgaacga tggccgcatg actttggtgg 1560 gcatcatcag ctggggcctg ggctgtggac agaaggatgt cccgggtgtg tacaccaagg 1620 ttaccaacta cctagactgg attcgtgaca acatgcgacc gcacgacgag ctctga 1676 <210> 6 <211> 1700 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tcacatcaat tagcttaagt ttccataagc aagtacaaat agctatggcg agttccgttt 60 tctctcggtt ttctatatac ttttgtgttc ttctattatg ccatggttct atggcctctt 120 accaggtgat ctgcagggac gagaagaccc agatgatcta ccagcagcac caaagctggc 180 taagacccgt tctgaggagt aaccgtgtcg agtactgctg gtgcaacagc ggtagagctc 240 aatgccactc ggttccagtc aagagctgca gcgaaccaag gtgcttcaac ggcgggacct 300 gccagcaggc cctgtacttc agcgacttcg tgtgtcagtg cccagaggga ttcgcaggga 360 agtgctgcga gatcgacact agggctacct gctacgagga tcaggggatc agctacagag 420 ggacgtggag tactgccgaa agtggtgccg agtgcacgaa ctggaacagc tcagcacttg 480 cacagaagcc gtacagcgga aggcgacctg atgccatcag actgggtttg ggcaaccaca 540 actactgccg taacccggat agggactcca aaccgtggtg ctacgtgttc aaggctggga 600 agtacagctc ggagttctgc tcaactccag cgtgtagcga gggtaactcg gactgctact 660 tcggcaacgg ttccgcgtac agaggcacgc attcgctgac cgaaagcggt gcttcctgtc 720 ttccgtggaa cagcatgatc ctcatcggca aggtctacac cgcacagaac ccaagcgcgc 780 aagcgctcgg cctagggaag cacaactact gccgaaatcc ggatggagac gccaaaccgt 840 ggtgccacgt gctgaagaac cggaggttga cctgggagta ctgtgacgta ccctcctgtt 900 cgacgtgtgg ccttcgccag tactcccaac ctcagttccg gatcaaagga ggcctgtttg 960 ccgacattgc gagccatcct tggcaagcgg caatcttcgc caagcacagg cgttcacctg 1020 gcgaacggtt cctgtgcgga ggcatcctca tctccagctg ctggattctt agcgctgcgc 1080 attgcttcca ggagcgtttt ccaccccacc atctcaccgt catccttggc aggacctaca 1140 gggtagttcc gggagaagag gaacagaagt tcgaggtcga gaagtacatc gtgcacaagg 1200 agttcgacga cgacacctac gacaacgaca tcgcccttct ccagctgaag tcggactcct 1260 cacgttgtgc ccaggaaagc tcagtggtga ggaccgtatg cttaccccct gccgaccttc 1320 aactccccga ctggacagag tgcgaactca gtggctacgg caagcatgag gcactatcgc 1380 cgttctactc cgagaggctg aaggaagcgc atgtcaggct ctacccgtca agcaggtgta 1440 cgtcccaaca cctcctgaac cggacagtca ccgacaacat gctctgtgct ggagacacac 1500 gaagtggcgg accccaagcg aacctgcatg acgcctgtca aggggattca gggggaccac 1560 tcgtatgcct gaacgacggg aggatgactc tcgtcgggat catctcctgg ggtctaggtt 1620 gcggccagaa ggatgttcct ggcgtgtaca cgaaggtgac gaactacctg gactggatca 1680 gggacaacat gcgaccttga 1700 <210> 7 <211> 748 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgaagatca 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taggtcaaag ttataggcaa tatcagctgc agtcgcctgt cctgctacag 120 caacaggtgc ttagcccata taatgagttc gtaaggcagc agtatggcat agcggcaagc 180 cccttcttgc aatcagctgc gtttcaactg agaaacaacc aagtctggca acagctcgcg 240 ctggtggcgc aacaatctca ctatcaggac attaacattg ttcaggccat agcgcagcag 300 ctacaactcc agcagtttgg tgatctctac tttgatcgga atctggctca agctcaagct 360 ctgttggctt ttaacgtgcc atctagatat ggtatctacc ctaggtacta tggtgcaccc 420 agtaccatta ccacccttgg cggtgtcttg taatgagttt taacagtata gtggttcgga 480 agttaaaaat aagctcagat atcatcatat gtgacatgtg aaactttggg tgatataaat 540 agaaaaaaag ttgtctttca tatttaaata ccatgcctct ataaggatat atcctagtac 600 gttgtcgtga ctaattacca tcatcggtac tctacaattt tactgggtgc ttacattcga 660 tccgaagcta ctttgttttt aagatagaaa tggagcgtat aaaggatgtc cgtcctttta 720 ttccaataaa gaacaaagcg gattctcc 748 <210> 9 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> signal sequence <400> 9 atggcgagtt ccgttttctc tcggttttct atatactttt gtgttcttct attatgccat 60 ggttctatgg cc 72 <210> 10 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ggccatagaa ccatggcata atagaagaac acaaaagtat atagaaaacc gagagaaaac 60 ggaactcgcc at 72 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atgaagatca ttttcgtctt tgctctcctt gc 32 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tttgttcttt attggaataa aaggacgg 28 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ataagaatgc ggccgcttga agatcatttt cgtctttgct 40 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ataagaatgc ggccgctttg ttctttattg gaataaaagg ac 42 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 tcttaccaag tgatctgcag ag 22 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ataagaatgc ggccgctcac ggtcgcatgt tgtcacg 37 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cgggatccaa atagctatgg cgagttccgt tttctctc 38 <210> 18 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ataagaatgc ggccgctcac acgtggtgat ggtgatgatg cggtcgcatg ttgtcacgaa 60 tcc 63 <210> 19 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ataagaatgc ggccgctcag agctcgtcgt gcggtcgcat gttgtcacga atcc 54 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 ccgctcgagt ttttgaggaa ttttagaagt tgaac 35 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 tcttaccaag tgatctgcag ag 22 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tcacggtcgc atgttgtcac g 21 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 tcttaccagg tgatctgcag ga 22 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 tcaaggtcgc atgttgtccc tg 22

Claims (11)

1. 종자특이 글루테린 프로모터 서열, 벼 유래의 글루테린 단백질의 신호서열 및 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA), 식물의 단백질 발현 최적화를 위한 합성 플라스미노겐 액티베이터 유전자(st-PA), 발현양 증대와 당쇄 결합 변형을 위한 소포체 지연서열을 갖는 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAER), 정제를 용이하게 하기 위해 His6 태그 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PAHis₆) 및 단백체 I으로 표적하기 위한 플로라민 유전자가 부착된 플라스미노겐 액티베이터 유전자(t-PA-prolamine)의 군에서 선택된 유전자가 순차적으로 연결된 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
2. 제 1항에 있어서, 상기 글루테린 단백질 신호서열은 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
3. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 액티베이터 유전자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
4. 제 1항에 있어서, 상기 플라스미노겐 액티베이터 유전자는 서열번호 4~6에서 선택되는 어느 하나의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
5. 제 1항에 있어서, 상기 식물 형질전환용 벡터는 도 1B에 개시된 개열지도를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 형질전환용 벡터.
6. 제 1항 내지 제 5항 중에서 선택된 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 세균.
7. 제 5항에 있어서, 상기 세균이 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 라이조게네스(Agrobacterium rhizogenes)인 것을 특징으로 하는 형질전환된 세균.
8. 제 1항의 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 식물.
9. 제 1항의 벡터가 도입된 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 벼.
10. 제 1항의 벡터를 식물세포에 도입시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터 단백질을 발현하는 형질전환 벼의 제조방법.
11. 제 1항의 벡터를 식물세포에 도입시키고, 상기 식물세포내에서 플라스미노겐 액티베이터를 발현시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미노겐 액티베이터 단백질의 생산방법.

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