KR101021817B1 - ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제 - Google Patents

ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제 Download PDF

Info

Publication number
KR101021817B1
KR101021817B1 KR1020097009737A KR20097009737A KR101021817B1 KR 101021817 B1 KR101021817 B1 KR 101021817B1 KR 1020097009737 A KR1020097009737 A KR 1020097009737A KR 20097009737 A KR20097009737 A KR 20097009737A KR 101021817 B1 KR101021817 B1 KR 101021817B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ucp1
pparδ
cells
expression
gene
Prior art date
Application number
KR1020097009737A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090074800A (ko
Inventor
가즈요시 야마오까
겐이찌로 다까기
겐이찌로 가따오까
마사노리 야마모또
도시히로 지까니시
Original Assignee
데이진 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=19050972&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR101021817(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 데이진 가부시키가이샤 filed Critical 데이진 가부시키가이샤
Publication of KR20090074800A publication Critical patent/KR20090074800A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101021817B1 publication Critical patent/KR101021817B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • G01N33/5079—Mitochondria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C12N7/06—Inactivation or attenuation by chemical treatment
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)

Abstract

본 발명은, PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 열생성 항진작용을 갖는 물질의 선택방법 및 그 약제 내지 항당뇨병, 항비만 및 내장축적지방 저감화 기능을 갖는 약제를 제공한다.
본 발명은, 퍼옥시좀 증식물질 활성화 수용체 PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 비근진전성 열생성 (nonshivering thermogenesis ; nST) 을 항진시키고, 지방조직 등의 세포 중 미토콘드리아의 언커플링 호흡 또는 미토콘드리아 내막에서의 양자 누출을 특이적으로 항진시켜 UCP1 의 발현량을 증대시키는 작용을 갖는 약제, 이 화합물을 함유하는 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제이다. 또, 본 발명은, PPARδ활성화 작용의 측정에 의한 이 화합물의 선택방법이다.
PPARδ, 비근진전성 열생성, UCP1

Description

ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제 {METHOD OF SELECTING SUBSTANCE CHARACTERIZED BY ASSAYING PPARD ACTIVATING EFFECT AND DRUG}
본 발명은, 퍼옥시좀 증식물질 활성화 수용체 δ(peroxisome proliferator activated receptor : PPARδ) 활성화 작용을 측정하는 것에 의한 열생성 항진작용을 갖는 물질의 선택방법 및 PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 화합물을 함유하는 열생성 항진작용을 갖는 약제에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 지방산, 피루브산을 기질로 하는 에너지 대사 (호흡) 세포내 소기관인 미토콘드리아의 기능 중, 언커플링 단백질 (UCP ; Uncoupling Protein) 에 의해 야기되는 언커플링 호흡 또는 미토콘드리아 내막의 양자 누출 (이하, 양자 누출이라 총칭함) 을 특이적으로 항진시키는 약제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제 또는 내장지방축적 억제제에 관한 것이다.
생체의 에너지 대사 조절계는, 섭식 조절계와 에너지 소비 조절계로 이루어져 있다. 에너지 소비 조절계는, 생명 유지를 위한 기초 대사에 사용되는 에너지 소비와, 그 이외의 에너지 소비로 나누어진다. 후자의 범위에서 주요한 것 이 열생성인 비근진전성 열생성 (nonshivering thermogenesis ; nST) 으로, 그 기능적 의의는 갓 태어난 때, 한냉 폭로시, 동면에서 깰 때 등의 체온 유지나 과잉섭취 에너지 소비에 의한 비만, 당지질 대사장애의 방어 등을 들 수 있다. 특히, 항온동물인 포유동물이나 조류, 특히 소동물에 있어서 체온을 유지하기 위해 nST 는 중요하다. nST 의 야기 기전에는, 미토콘드리아의 양자 누출, 즉 세포 호흡사슬의 전자전달계와 ATP 합성의 관여가 중요하다.
갈색지방조직 (BAT) 에는, 이 갈색지방세포 (BA) 의 호흡사슬 전자전달계와, ATP 합성을 언커플링시키는 특이적 단백질인 언커플링 단백질-1 (UCP1) 이라고 불리는 약 300 아미노산으로 이루어지는 분자량 32 kD 의 단백질이 미토콘드리아막에 존재한다. UCP1 은 약 100 개의 아미노산으로 이루어지는 도메인의 3 회 반복구조로 이루어지고, 각 도메인에 2 군데씩 합계 6 개소의 막관통 부위가 있어, 이들 막관통 부위가 미토콘드리아막에 채널을 형성하고 있다.
UCP1 은 양자를 수송하는 캐리어이다. UCP1 등이 형성하는 양자채널은, 전기화학적인 구배에 따라 자유롭게 양자를 투과시켜 열을 방출하는 기능을 발현시키고 있다. 이것이 nST 가 된다. 요컨대, nST 는, 양자채널의 양자 투과에 의해 언커플링을 일으키고, 언커플링에 의해 ATP 합성이 저하되고, ATP 와 ADP 의 비를 일정하게 유지시키기 위해 미토콘드리아 내의 호흡이 활발해져, 그 결과로서 대량의 지방과 당이 산화되어 열이 발생되어 생긴다.
UCP1 의 생리적 의의로는, 갓 태어난 때, 한냉 폭로시 등에서의 체온유지기능이 중요하지만, 이 밖에 트랜스제닉 마우스를 사용한 연구로부터 비만의 방어에 관여한다는 것이 판명되었다. 비만의 발증, 진전, 유지에 UCP1 이 관여한다는 것은, 여러가지 비만 모델에서 UCP1 의 발현이 저하되고 있는 사실로부터 시사되었다. 예컨대, BAT 감소 트랜스제닉 마우스에서 과식없이 비만이 발증한다는 사실이 확인되었다 (Lowell 등, Nature, 366, 740-742 (1993)). 또, UCP1 유전자를 지방세포 특이적인 유전자 aP2 의 프로모터에 삽입하고, UCP1 을 강제적으로 대량 발현시킨 마우스에서는, 체지방의 감소, 고지방식 부하로 인한 식이성 비만에 대한 저항성이 관찰되었다 (Kopecky 등, J. Clin. Invest., 96, 2914-2923 (1995)). 또한, UCP1 의 발현이 1/3 로 억제된 마우스에서는, 한냉 폭로시의 체온유지기능의 저하, 체지방량 증가로 인한 비만, 그리고 인슐린 저항성이 확인되었다 (Lowell B. B. 등, Nature 366, 740-742 (1993)). 또한, UCP1 를 녹아웃한 마우스는 한냉에 비내성이었다 (Enerback S. 등, Nature 387, 90-94 (1997)). 이상과 같이, UCP1 이 열생성 분자로서 체온조절이나 에너지 소비에 중요한 역할을 갖고, 비만과 밀접한 관계가 있다는 것은 동물실험의 결과로부터 명백해지고 있다.
UCP1 의 발현량은, 주로 핵내 유전자의 전사레벨에서 조절되고 있으며, cAMP 농도 상승에 따라 UCP1 유전자 발현은 증가한다 (사이토 등, 최신 의학, 52, 1095-1096 (1997)).
세포내 에너지 소비의 약 20 ∼ 40 % 는 미토콘드리아 내막의 양자 누출에 의해 발생한다고 여겨지고 있다. BAT 가 소량밖에 없는 인간 성인이나 기타 동물에서는 nST 의 대부분은 골격근이나 백색지방조직 (WAT) 에서 생긴다고 여겨지고 있었다. 이상의 사실로부터, BAT 이외의 조직에서의 UCP 의 존재가 추정되고 있었다. 1997 년에는, 두 그룹에서 연이어 BAT 이외의 조직으로부터 UCP2 의 cDNA 클로닝이 보고되었다. (Fleury 등, Nature Genet, 15, 269-272 (1997) ; Gimeno 등, Diabetes 46, 900-906 (1997)).
인간 UCP2 는 인간 UCP1 과 59 % 의 상동성을 나타내고, UCP1 과 동일하게 6 개소의 막관통 부위를 갖는 채널을 형성하며, 또한 푸린 뉴클레오티드 결합부위를 갖고 있다. UCP2 는 UCP1 과는 달리, 전신조직에 광범위하게 발현되고 있으며, 특히 폐, 췌장에서 고농도로 발현되고 있다. 이 밖에도 심장, 간, 뇌, 신장, 정소, WAT, BAT, 골격근에서 발현이 검출되고 있다.
UCP2 의 기능에 대해서는, 고지방식 부하 마우스에서 부정소 주위 지방조직의 UCP2 유전자 발현의 항진이 관찰되고 있다. 그러나, UCP2 를 녹아웃한 마우스는, 한냉 조건하에서 체온유지기능이 정상이라는 것이 보고되었다 (Arsenijevic D. 등, Nature Genet 26, 387-388 (2000)). 또, 상기 기술한 UCP1 를 녹아웃한 마우스에서는, 대상작용이라고 생각되는 갈색지방조직에서의 UCP2 의 대폭적인 발현 항진이 관찰되지만, 이 마우스는 한냉에 비내성이었다 (Enerback S. 등, Nature 387, 90-94 (1997)). 또한, UCP2 는 췌장 β세포에서 세포내 ATP 농도 변화를 통해 인슐린 분비를 억제하고 있음이 나타났다 (Zhang C.-Y. 등, Cell 105, 745-755 (2001)). 이것은 항당뇨병의 관점에서 보면, 상반되는 특성이었다. 이상과 같이, UCP2 에 대해서는, 그 양자채널로서의 언커플링 기능은 확인되었지만, 아직까지 에너지 소비/비만의 관련성은 명확하게는 밝혀지지 않고 있다.
생체내 잉여에너지는, 먼저 우선적으로 내장지방 (특히, 장관막지방) 으로서 축적된다. 이 내장지방은 다른 부위의 지방 (특히, 피하지방) 에 비해 지방공급을 받기 쉬우며, 빠르게 분해되어 소비된다. 이 내장지방 (비만) 은 생활습관병 (성인병) 발증의 다중 위험인자로 간주되고 있다. 그 이유는, WAT 의 백색지방세포 (WA) 로부터의 분비 지방산이 문맥을 경유해 직접 간에 유입되어 인슐린 저항성과 지방 합성을 항진하고, 그 결과, 내당기능 이상, 고혈압 및 고지혈증을 야기시키고, 최종적으로는 이들이 합병되어 동맥경화를 발증시키기에 이르고 있기 때문이다. 따라서, 내장지방의 축적억제와 축적내장지방의 저감화가, 인간 성인의 당뇨병을 비롯한 생활습관병 발증 예방 및 그 치료에 유효할 것으로 기대된다.
퍼옥시좀 증식물질 활성화 수용체 (peroxisome proliferator activated receptor : PPAR) 는, 그 구조 등으로부터 핵내 수용체 (핵호르몬 수용체) 슈퍼 패밀리의 일원이라고 생각된다. 지금까지, PPARα, PPARδ(별칭 NUC-1, PPARβ, FAAR) 및 PPARγ라고 일컬어지는 3 종의 PPAR 의 서브타입이 동정되고, 이들 유전자 (cDNA) 가 클로닝되어 있다 (Lemberger 등, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 12, 335-363 (1996)).
이들 3 종 중 PPARα에 관해서는, 그 리간드 효과를 갖는다는 것이 알려져 있는 피브레이트계 약제에 임상에서 강한 혈청 트리아실글리세롤 레벨 저하작용이 확인되었다 (Forman 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4312-4317 (1997)).
PPARγ는 특히 지방조직에서 발현되고 있으며, 지방세포의 분화에 깊이 관여 하는 인자로 여겨지고 있다 (Tontonoz 등, Genes and Development, 8, 1224-1234 (1994) ; Tontonoz 등, Cell, 79, 1147-1156 (1994)). 각종 티아졸리딘디온 유도체는, 인슐린 비의존성 당뇨병 (NIDDM : non-insulin-dependent diabetes melitus) 의 모델 동물에서 혈당강하작용을 나타내어 인슐린 저항성 해제작용을 갖는 새로운 NIDDM 치료약으로서 기대되고 있다. 이들 티아졸리딘디온 유도체는 또한 PPARγ의 리간드로서 작용하며, PPARγ를 특이적으로 활성화시킨다는 사실이 최근의 연구로 밝혀졌다 (Lehmann 등, J. Biol. Chem., 270, 12953-12956 (1995)).
그러나, PPARδ의 생리작용은 밝혀지지 않고 있다 (Willson 등, J. Med. Chem. 43 (4), 527-50 (2000)). WO97/28149 호 명세서에는 PPARδ리간드의 혈중 HDL 상승작용이, 또 WO9904815 호 명세서에는 PPARδ수용체를 활성화시키는 물질 투여에 의한 콜레스테롤 저하작용이 개시되어 있다. 그러나, PPARδ와 열생성 항진작용의 관계나 PPARδ와 언커플링 단백질의 관계에 대해서는 개시는 물론 시사도 되어 있지 않다.
또, 아라키돈산과 같은 불포화지방산, 카르바프로스타사이클린 (cPGI) 및 L-165041(4-(3-(2-프로필-3-히드록시-4-아세틸-페녹시)프로필옥시)-페녹시 아세트산) 이 UCP2 의 발현을 증가시킨다는 사실을 알 수 있었다 (The Journal Of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 14, 4 월 6 일 발행, pp. 10853-10860, 2001). 그러나, UCP1 과 PPARδ의 관계에 대해서는 밝혀지지 않고 있다.
본 발명의 목적은, 열생성을 항진시키는 작용을 갖는 물질의 선택방법 및 그 약제를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은, 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제 또는 내장지방축적 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 생체 에너지 소비 조절계 중의 nST 촉진에 의한 열생성 항진작용에 착안하였다. 그리고, 미토콘드리아의 언커플링 호흡의 항진, nST 의 조직으로는 상대적으로 작은 BAT 내 미토콘드리아의 양자 누출 항진에 더불어, WAT 내 미토콘드리아 양자 누출 및 언커플링 단백질 동족체인 UCP1 의 기능을 항진시키는 수단을 창조함으로써, 그 효율을 향상시키기를 의도하였다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하는 것을 목표로 하여 예의 연구한 결과, 비특이적 PPAR 리간드인 카르바프로스타사이클린 (cPGI : 6,9α-메틸렌-11α, 15S-디히드록시-프로스타-5E, 13E-디엔-1-산) 이나 일로프로스트 (Iloprost : 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-히드록시-6-[(E)-(3S,4RS)-3-히드록시-4-메틸-5-옥텐-6-이닐]-비시클로[3.3.0]-옥탄-3-일리덴}펜탄산) 가, 골격근 세포 또는 지방세포에 있어서 UCP1 발현의 항진작용을 갖는다는 것을 발견하였다.
그리고, 이 새로운 지견 및 PPARα의 리간드인 피브레이트계 화합물 및 Wy14643 이나, PPARγ의 리간드인 티아졸리딘디온계 화합물에 UCP1 발현의 항진작용이 거의 관찰되지 않는다는 지견을 종합하고, UCP1 발현의 항진작용에는 PPARδ 가 주로 관여하고 있는 것은 아닌가 생각하여, PPARδ활성화 작용을 갖는 화합물에 대해 더욱 연구하였다.
그리고, PPARδ활성화 작용을 갖는 물질이 UCP1 의 발현 항진작용을 나타낸다는 것을 인간 및 설치류의 골격근세포 및 지방세포를 사용한 실험에 의해 명백히 하였다.
또한, 본 발명자들은, 이와 같이 UCP 유전자의 발현이 PPARδ에 의해 제어되고 있다는 사실로부터 PPARδ활성화 작용을 측정함으로써, UCP1 유전자의 발현을 증가시켜 nST 기능을 증진시키는 열생성 항진작용을 갖는 물질의 스크리닝이 가능하다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명은 이하의 사항을 포함한다.
(1) PPARδ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 열생성 항진작용을 갖는 물질의 선택방법.
(2) PPARδ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아의 언커플링 호흡을 항진시키는 작용을 갖는 물질의 선택방법.
(3) PPARδ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 내막에서의 양자 누출을 항진시키는 작용을 갖는 물질의 선택방법.
(4) PPARδ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 미토콘드리아 함유 세포의 UCP1 의 발현량을 증대시키는 물질의 선택방법.
(5) PPARδ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 지방산 β산화를 항진시키는 물질의 선택방법.
(6) 리포터 유전자를 이용하는 (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 물질의 선택방법.
(7) 하기 ① 내지 ③ 의 공정을 포함하는 (6) 에 기재된 열생성 항진작용을 갖는 물질의 선택방법.
① UCP1 유전자를 발현시키는 세포에 PPARδ활성화 작용을 갖는 물질을 접촉 및/또는 도입하는 공정.
② 상기 세포에 있어서의 UCP1 유전자의 발현량을 측정하는 공정.
③ 상기 세포에 있어서의 상기 UCP1 유전자의 발현량을 증가시키는 화합물을 선택하는 공정.
(8) 상기 UCP1 유전자를 발현시키는 세포가 지방세포 또는 골격근세포인 (7) 에 기재된 선택방법.
(9) 상기 UCP1 유전자를 발현시키는 세포가 지방세포인 (7) 에 기재된 선택방법.
(10) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 열생성 항진작용을 갖는 약제.
(11) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 미토콘드리아의 언커플링 호흡을 항진시키는 약제.
(12) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 미토콘드리아 내막에서의 양자 누출을 항진시키는 약제.
(13) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 미토콘드리아 함유 세포의 UCP1 의 발현량을 증대시키는 약제.
(14) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 지방산 β 산화를 항진시키는 약제.
(15) 상기 PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질이 비특이적 PPAR 리간드 또는 PPARδ리간드인 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 약제.
(16) 상기 PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질이, 카르바프로스타사이클린, 일로프로스트 또는 p-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필페녹시)프로폭시)페닐 아세트산인 (10) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 약제.
(17) 상기 미토콘드리아가 골격근, 백색지방조직 또는 갈색지방조직의 세포인 (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 약제.
(l8) 상기 미토콘드리아가 백색지방조직 또는 갈색지방조직의 세포인 (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 약제.
(19) PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 물질을 유효성분으로서 함유하는 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제 또는 내장지방축적 억제제.
(20) (10) 내지 (18) 중 어느 하나에 기재된 약제를 유효성분으로서 함유하는 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제 또는 내장지방축적 억제제.
본 발명의 nST 조직의 미토콘드리아의 양자 누출 등을 특이적으로 항진하는 작용을 갖는 약제는, PPARδ활성화 작용을 갖는 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 한다. 본 발명의 약제는, 상기 유효성분 그 자체여도, 이것을 포함하는 적당한 배합물, 조성물, 혼합물이어도 된다. 또, PPAR 활성화 작용을 갖는 화 합물이란,「PPAR 리간드」로서 PPAR 에 결합됨으로써 PPAR 의 표적유전자의 전사활성화 능력을 제어하는 화합물을 가리키며, 천연에 존재하는 것만이 아니라, 인공적으로 합성된 것도 포함된다.
상기 유효성분의 유용성을 밝히기 위해, 실시예에 구체적으로 나타나 있는 바와 같이, 각종 PPAR 리간드를 각종 골격근세포, 지방세포에 첨가하여 UCP1 의 mRNA 량을 측정하였다. 그 결과, 측정한 PPARα리간드, PPARγ리간드에 대해 유의하게 UCP1 의 mRNA 의 발현량이 많은 것은 PPARδ리간드였다. 또한, PPARδ리간드로는, 예컨대 콜레스테롤 저하작용을 나타내는 화합물로서 WO9904815 호 명세서에 기재된 P-(3-(4-아세틸-3-히드록시-2-프로필페녹시)프로폭시)페닐 아세트산(YM-16638) 등을 들 수 있다.
어느 물질에 대해 PPAR 에 대한 결합/활성화 정도를 간편하면서 고감도로 알 수 있는 방법으로서 리포터 유전자가 이용된다. 예컨대, 효모의 전사인자인 GAL4 의 DNA 결합영역과 PPAR 의 리간드 결합영역을 결합시킨 융합 단백질 발현용 벡터, 및 GAL4 의 응답배열 (GAL4 binding element) 에 연결된 리포터 유전자를 포함하는 리포터 플라스미드를 도입한 동물세포를 사용하는 방법이 알려져 있다 (W096/33724 ; Lehmann 등, J. Biol. Chem. 270, 12953-12956 (1995) ; Willson 등, J. Med. Chem., 39, 665-668 (1996)). 리포터 유전자를 이용하는 방법이란, 예컨대, 먼저 피험 화합물이 PPAR 에 결합 또는 활성화되는 물질이면, 피험 화합물이 GAL4 의 PPAR 의 리간드 결합영역에 결합된다. 그러면, PPAR 의 리간드 결합영역에 융합시킨 GAL4 의 DNA 결합영역이 리포터 플라스미드의 GAL4 의 응답배 열에 결합되어 리포터 유전자의 발현이 항진된다. 리포터 유전자에 의해 발현된 단백질의 활성 등을 측정하는 것, 즉 리포터 활성을 검출함으로써 피험 화합물이 PPAR 에 결합 또는 활성화되는 물질인지 여부를 검출할 수 있다.
따라서, PPAR 에 결합하는 미지의 리간드의 스크리닝이나 피험 화합물이 PPAR 에 결합되는 리간드인지 여부의 검사에 있어서, 그 천연 또는 인공적으로 합성된 리간드를 검출하고, 단리시킬 수 있다. 또한, 리포터 활성의 검출은 리포터 유전자의 종류에 따라 염색, 형광, 세포의 생사 등을 지표로 당업자의 기술 상식에 따라 적당히 실시할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의 스크리닝 방법은, 상기 기술한 리포터 활성 검출 시스템에 (a) UCP1 유전자를 발현시키는 세포에 피험 시료를 접촉 및/또는 도입하는 공정, (b) 이 세포에 있어서의 UCP1 유전자의 발현량을 측정하는 공정, (c) 이 세포에 있어서의 UCP1 유전자의 발현량을 증가시키는 화합물을 선택하는 공정을 추가할 수 있다.
스크리닝에 사용하는「UCP1 유전자를 발현시키는 세포」로는 특별히 제한은 없으나, 특히 백색지방세포나 갈색지방세포 등의 지방세포, 골격근세포가 바람직하다. 세포는, 동물조직으로부터 분리된 초대배양세포여도 되고, 암화 또는 불사화한 주화 세포여도 된다. 지방세포로는, 예컨대 후술하는 실시예에 기재된 인간 백색지방세포 또는 래트 갈색지방세포, 3T3-L1 (마우스 지방세포) 등의 각종 지방세포가, 골격근세포로는, 예컨대 SkMC (인간 골격근세포), C2C12 (마우스 골격근 세포) 등의 각종 골격근세포가 바람직하게 사용된다. 또한, UCP 패밀리 (언커플링 단백질 동족체) 유전자로는, 예컨대 UCP1 유전자, UCP2 유전자, UCP3 유전자, UCP4 유전자를 들 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법의 일 공정에서는, 이들 UCP1 유전자를 발현시키는 세포에 피험 물질을 접촉 및/또는 도입하여 UCP1 유전자의 발현량을 측정한다. 유전자의 발현량의 측정에는, 당업자에게 잘 알려져 있는 여러 가지 방법을 사용할 수 있다. 예컨대, 노던 블롯법 (Sambrook 등, Mo1ecular Cloning, 201-206 (1987), Cold Spring Harbor Laboratory) 또는 RT-PCR 법 (Shaffer 등, Anal. Biochem., 190, 292-296 (1990)) 등의 방법으로 DNA, RNA 또는 단백질을 측정함으로써 실시할 수 있다.
UCP1 유전자의 발현량 측정의 결과, UCP1 유전자 발현의 유의한 증가가 관찰되면, 사용한 피험 시료의 화합물은 nST 기능을 증진시키는 작용을 갖는다. nST 의 조직내 세포의 미토콘드리아에서 지방 및 당이 연소되기 위해서는 UCP1 의 발현이 불가결하지만, 본 발명의 유효성분은, 상기와 같이 이 조직내 세포의 UCP1 발현량을 현저히 증대시키는 작용을 갖는다. 이 분자 레벨에서의 지견으로부터, 본 발명의 약제는 내장지방축적의 억제 및 축적내장지방의 저감화에 유효하다.
실제로, 실시예에서는 PPARδ리간드에 의해 발현이 항진된 UCP 가 내장지방축적을 억제 및 저감하도록 기능할 수 있는지, 즉 세포내 지방 및 당의 연소를 촉진시키는지 확인하기 위해, 각종 PPAR 리간드를 초대 인간 지방세포에 첨가하고, 지방연소 항진의 지표의 하나로서 알려진 지방산 β산화를 측정하였다. 실시예 에 구체적으로 나타나 있는 바와 같이, UCP 의 발현량에 비례하여 지방산 β산화도 항진되었다. 그리고, 지방산 β산화가 가장 항진된 것은 PPARδ리간드였다.
본 발명의 약제는, nST 에 관여하는 골격근, 지방 등의 비근진전성 열생성 조직세포 중 미토콘드리아에 있는 내막 관통형 단백질의 UCP1 의 발현량을 증대시키고, 상기 세포 중 미토콘드리아의 언커플링 호흡, 양자 누출 및 열생성을 특이적으로 항진시키는 작용을 갖는다. 본 발명의 약제는, PPARδ활성화 작용을 갖는 화합물 또는 그 유도체를 유효성분으로 하는 것으로, 상기한 바와 같이, 지방, 골격근 등의 nST 조직세포 중의 UCP1 의 발현량을 현저히 증대시키는 고 UCP1 발현작용을 갖는다. 본 발명의 약제는, UCP1 발현 활성을 지표로 하여 동정 및 분리ㆍ정제할 수 있다. 이렇게 하여 얻어진 물질을 유효성분으로 함으로써, 특히 항비만에 현저한 효과를 갖는 내장축적지방 저감화제 내지 내장지방축적 억제제를 조제할 수 있다.
본 발명의 약제는, 에너지 대사나 지질 대사를 촉진시키고, 혈장 지질을 저하시키기 때문에, 특히 포유동물 (예컨대, 인간, 마우스, 래트, 모르모트, 개, 원숭이, 고양이, 말, 토끼 등) 이나 조류의 비만의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 또한, 비만에 합병되는 질환 (예컨대, 당뇨병, 고혈압증, 고지혈증, 동맥경화, 허혈성 심질환 등의 성인병 등) 등의 예방 또는 치료에도 유효하다.
해당 저감제 또는 억제제의 담체로는, 그 사용 형태에 따라, 적당한 충전제, 결합제, 증량제, 붕괴제, 표면 활성제, 방습제, 부형제, 희석제 등을 사용할 수 있다. 제제 형태는, 그 사용 목적에 따라 적당히 결정하면 되고, 특별히 한정되 지 않지만, 예컨대 정제, 과립제, 분말제, 환제, 캡슐 등의 고형제나, 액제, 현탁제, 유제 등이 예시된다. 이렇게 하여 얻어지는 항당뇨병제, 항비만제 또는 내장축적지방 저감화제 내지 내장지방축적 억제제는 경구 투여가 바람직하고, 그 투여량은, 투여하는 사람의 증상 등에 따라 적당히 선택된다. 따라서, 투여량, 투여 횟수 등은 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 약제는, 에너지 대사나 지질 대사를 촉진시키고, 혈장 지질을 저하시키기 때문에, 특히 포유동물 (예컨대, 인간, 마우스, 래트, 모르모트, 개, 원숭이, 고양이, 말, 토끼 등) 이나 조류의 비만의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 또한, 비만에 합병되는 질환 (예컨대, 당뇨병, 고혈압증, 고지혈증, 동맥경화, 허혈성 심질환 등의 성인병 등) 등의 예방 또는 치료에도 유효하다.
다음으로, 실시예에 기초하여 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 해당 실시예에 의해 전혀 한정되지 않는다. 또한, 하기 실시예에 있어서, 각 조작은 특별히 명시하지 않는 한,「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하였다. 또한, 시판의 시약이나 키트를 사용하는 경우에는, 시판품에 첨부된 지시서에 따랐다.
[실시예 1] 인간 백색지방세포에 있어서의 UCP1 및 UCP2 mRNA 발현 유도에 대한 약제의 영향
(1) 인간 백색지방세포의 배양과 RNA 조제
인간 지방세포는, 피하지방조직 유래의 미분화 동결 전구지방세포 (Cat. No. SP-F, Lot. No. L011399) 를 미국 Zen-Bio 사로부터 구입하였다. 이것을 24 웰 플레이트에서 배양하고, 업자의 지시에 따라 분화를 유도함으로써 지방세포를 얻어 인간 백색지방조직 유래 지방세포로서 사용하였다. 즉, 24 웰 플레이트에서 지방전구세포 배지 중, 컨플루언트 (confluent) 상태까지 37 ℃ 로 CO2 인큐베이터에서 배양 후, 분화 배지로 배지 교환하고, 약 72 시간 배양함으로써 분화 유도를 실시하였다. 또한, 지방세포 배지로 배지 교환하고, 14 일 동안 배양하여 백색지방세포로 분화시켰다. 이 배양세포에 대해 다시 이하의 조건에서 배양하였다.
각종 피험 화합물을 최종 농도 10 μM 이 되도록 배지에 첨가하고, 6 시간 동안 배양하였다 (n = 3). 각종 피험 화합물은, PPARα리간드의 베자피브레이트 (Bezafibrate), WY14643, PPARδ리간드의 YM-16638, PPARγ리간드의 트로글리타존 (Troglitazone), 로시글리타존 (Rosiglitazone), 비특이적 PPAR 리간드의 cPGI, 일로프로스트 (Iloprost), β3 아드레날린 수용체 효현제의 L755507 로 하였다. 컨트롤은 피험 화합물의 용매인 DMSO 를 최종 농도 0.5 % 가 되도록 첨가하고, 동일하게 배양하였다. 배양한 세포를 각각 회수하여 세포 용해용 완충액 (RLT 용액, QIAGEN 사 제조) 150 ㎕ 에 현탁시킨 후, 세포를 파쇄하여 세포 추출액을 얻었다. 이 세포 추출액으로부터 총 RNA 를 조제하였다. RNA 의 조제는 RNA 조 제 키트 (상품명 : RNeasy total RNA 키트, QIAGEN 사 제조) 를 사용하고, 지시서에 따라 실시하였다.
(2) UCP1 mRNA 발현량의 측정
전항 (1) 에서 얻은 RNA (총 RNA, 약 0.1 ㎍) 를 템플레이트로 하고, 이하와 같이 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real Time PCR) 에 의해 UCP1 mRNA 발현량을 측정하였다.
인간 UCP1 유전자용 PCR 프라이머로는, 5’-AACCCACAGAGGTCGTGAAAG-3’(정방향 프라이머) 및 5’-CGTGTAGCGAGGTTTGATTCC-3’(역방향 센스 프라이머) 의 2 종을 사용하였다. PCR 프로브로는, 5’-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3’을 사용하였다. 프로브에 결합된 형광색소는 FAM 이었다. 또, 2-Reporter Assay 로서 동시에 측정한 G3PDH mRNA 의 측정에 대해서는 PE Applied Biosystems 가 추천하는 방법에 따라 실시하였다. 또한, 프라이머의 화학 합성은 Amersham Pharmacia Biotech 사, 프로브의 화학합성 (형광색소의 결합을 포함함) 은 PE Applied Biosystems 사에 의뢰하였다.
조제한 피험 총 RNA, 상기 프라이머 및 프로브, 시판의 실시간 검출 PCR 용 시약 키트 (TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent Kit (상품명), PE Applied Biosystems 사 제조) 를 사용하여 반응 튜브 1 개당 표 1 에 나타내는 반응액을 조제하였다.
성분 최종 농도
템플레이트 RNA
5 ×TaqMan EZ buffer A 1 ×
10 mM dATP 300 μM
10 mM dGTP 300 μM
10 mM dCTP 300 μM
20 mM dUTP 600 μM
10 μM UCP1 정방향 프라이머 200 nM
10 μM UCP1 역방향 프라이머 200 nM
5 μM UCP1 프로브 100 nM
10 μM G3PDH 정방향 프라이머 40 nM
10 μM G3PDH 역방향 프라이머 40 nM
10 μM G3PDH 프로브 100 nM
rTth DNA 중합효소 (2.5 U/㎕) 0.1 U/㎕
AMP Erase UNG (1 U/㎕) 0.01 U/㎕
25 mM Mn (OAc)2 3 mM
PCR Perkin Elmer Microamp Optical Tube (상품명, PE Applied Biosystems 사 제조) 1 개당 상기 반응액을 25 ㎕ 조제하고, 캡핑을 한 후, ABI PRISM 7700 Sequence Detection System (상품명, PE Applied Biosystems 사 제조) 에 세팅하고, 이하의 조건으로 반응을 실시하였다.
혼입 DNA 의 UNG 에 의한 분해반응 50 ℃, 50 분, 역전사 공정 60 ℃, 10 분, UNG 의 실활 95 ℃, 2 분 후, PCR 반응을 변성 공정 95 ℃, 15 초, 어닐링 공정 58 ℃, 90 초의 조건 (사이클 수 : 40 사이클) 에서 실시하였다. 반응 개시 후, 형광 강도를 실시간으로 자동 측정함으로써 UCP1 mRNA 발현량을 측정하였다. UCP1 mRNA 발현량은 대조인 블랭크 대조군을 100 으로 했을 때의 상대값으로 나타내고, G3PDH mRNA 발현량으로 보정하여 산출하였다.
그 결과를 도 1 에 나타냈다. UCP1 mRNA 발현량은 PPARδ리간드 (PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 화합물) 인 YM-16638 에서 컨트롤의 약 12 배의 증가를 나타냈다. 이로부터, PPARδ리간드는 이러한 작용을 현저히 발현시킨다는 것이 명확해졌다. 본 실험에 있어서 PPARδ리간드는 UCP1 유전자를 특이적으로 증강시킨다는 것이 판명된 사실로부터, PPARδ리간드에 의한 WAT 의 기능 항진작용은, PPARδ리간드의 WAT 에 대한 직접적인 작용인 것을 알 수 있었다. UCP1 은, 설치류뿐만 아니라 인간 백색지방세포에 있어서 현저한 발현의 증대가 관찰된다는 사실로부터, 인간의 당뇨병이나 비만에 대해 PPARδ리간드가 매우 유효하다는 것이 나타났다.
(3) UCP2 mRNA 발현량의 측정
전항 (1) 에서 얻은 RNA (총 RNA, 약 0.1 ㎍) 를 템플레이트로 하고, 전항 (2) 와 동일하게 실시간 중합효소 연쇄반응에 의해 UCP2 mRNA 발현량을 측정하였다. 인간 UCP2 유전자용 PCR 프라이머로는, 5’-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3’(정방향 프라이머) 및 5’-GCCCTTGGTGTAGAACTGTTTGA-3’(역방향 센스 프라이머) 의 2 종을 사용했다. PCR 프로브로는, 5’-TGTCCGCATCGGCCTGTATGATTC-3’을 사용하였다. 프로브에 결합된 형광색소는 FAM 이었다.
그 결과를 도 2 에 나타냈다. UCP2 mRNA 발현량은 PPARδ리간드 (PPARδ를 활성화시키는 작용을 갖는 화합물) 인 YM-16638 에서 대조군의 약 2 배의 증가를 나타냈다.
[실시예 2] 인간 백색지방세포에 있어서의 유리지방산 β산화에 대한 약제의 영향
실시예 1 에서 서술한 방법과 동일하게 인간 백색지방세포를 분화 유도 후 상등액을 제거하고, 지방세포 배지에 올레산 및 팔미트산을 각각 0.67 mM 및 O.33 mM 가 되도록 용해시킨 배지 500 ㎕ 로 교환하였다. 각종 피험 화합물을 최종 농도 10 μM 이 되도록 배지에 첨가한 후, [9,10(n)-3H]팔미트산 (아마삼 팔마시아 제조, 최종 농도 1? Ci/㎖) 을 첨가하고, 37 ℃ 에서 48 시간 동안 배양하였다. 피험 화합물은, PPARδ리간드인 YM-16638, PPARα리간드인 WY14643, β3 아드레날린 수용체 효현제인 L755, 507, PPARγ리간드인 로지글리타존 (Rosiglitazone) 으로 하였다. 대조군은 피험 화합물의 용매인 DMSO 를 최종 농도 0.5 % 가 되도록 첨가하고, 동일하게 배양하였다. 또한, 배양 중, 세포에 의한 [9,10(n)-3H]팔미트산의 β산화에 의해 생긴 3H2O 가 증산되지 않도록, 스미토모베이크라이트사 제조 미니컬쳐 필터 (MS-30055) 로 배양 플레이트를 밀봉하였다.
48 시간 동안 배양 후, 배지 상등액 200 ㎕ 를 1.5 ㎖ 에펜돌프 튜브로 옮기고, 50 % 트리클로로아세트산을 50 ㎕ 첨가하고, 빙상에서 30 분 동안 침전을 형성시키고, 15,000 rpm 으로 10 분 동안 원심하였다. 다음으로, 미리 500 ㎕ 의 순수를 넣은 20 ㎖ 유리바이알 중에 뚜껑없는 1.5 ㎖ 에펜돌프 튜브를 넣고, 이 에펜돌프 튜브에 상기 원심에 의해 얻어진 상등액을 전량 옮기고, 폴리프로필렌 패킹된 뚜껑으로 엄중히 밀봉하였다. 이 바이알을 50 ℃ 에서 18 시간 동안 가열하여 바이알 내를 3H2O 로 포화시키고, 4 ℃ 에서 냉각 후, 원심하고 (1000 rpm, 1 분), 바이알 내 에펜돌프 튜브에 남아있는 배지 상등액과 에펜돌프 튜브를 폐기하였다. 바이알 내에 남은 3H2O 를 함유한 순수에 5 ㎖ 의 액체 섬광체 (울티머 골드, 패커드사 제조) 를 첨가하고, 충분히 혼화 후, 카운팅하였다.
이 결과를 제 3 도에 나타냈다. PPARδ리간드 YM16638 10 μM 에 의해 세포의 β산화는 30 % 항진되었다. 한편, PPARγ리간드 로지글리타존 l0 μM 에서는 15 % 의 항진, PPARα리간드 WY14643 10 μM 및 β3 아드레날린 수용체 효현제 L755,507 10 μM 에서는 β산화의 항진은 관찰되지 않았다. 이 결과는 실시예 1 에서 나타낸 각종 PPAR 리간드의 UCPl mRNA 발현 항진작용과 잘 관련되어 있다. 즉, PPARδ리간드는 UCP1 유전자의 발현항진에 의해 그 단백량도 증가시키며, UCP1 의 기능 중 하나인 유리지방산을 기질로 한 β산화를 항진, 나아가서는 에너지 대사를 촉진시켜 내장지방축적을 억제 및 저감시키는 것을 나타내는 것이다. 이 사실로부터도 PPARδ리간드가 인간의 항당뇨병, 항비만에 대해 유효하다는 것이 나타났다.
본 발명에 의해, 열생성 항진작용 등을 갖는 물질을 얻을 수 있고, 이것을 함유하는 항당뇨병제, 항비만제, 내장축적지방 저감화제 또는 내장지방축적 억제제 등의 약제를 얻을 수 있다.
도 1 은, PPARδ리간드 외 각종 피험 화합물에 의해 인간 지방세포에 있어서 유도되는 UCP1 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 2 는, PPARδ리간드 외 각종 피험 화합물에 의해 인간 지방세포에 있어서 유도되는 UCP2 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 3 은, PPARδ리간드 외 각종 피험 화합물에 의해 인간 지방세포에 있어서 야기되는 유리지방산 β산화 항진의 정도를 나타낸다.
<110> TElJlN LlMITED <120> METHOD OF SELECTING SUBSTANCE CHARACTERIZED BY ASSAYING PPARD ACTIVATING EFFECT AND DRUG <130> T-456 <150> JP P2001-216502 <151> 2001-07-17 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PCR of human UCP1 gene <400> 1 aacccacaga ggtcgtgaaa g 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for PCR of human UCP1 gene <400> 2 cgtgtagcga ggtttgattc c 21 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for PCR of human UCP1 gene <400> 3 cagacttcaa gcatagagcc atctcca 27 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for PCR of human UCP2 gene <400> 4 cgccaaatga gctttgcct 19 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-sense primer for PCR of human UCP2 gene <400> 5 gcccttggtg tagaactgtt tga 23 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for PCR of human UCP2 gene <400> 6 tgtccgcatc ggcctgtatg attc 24

Claims (2)

  1. PPARδ 활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하고, 하기 (1) 및 (2) 의 공정을 포함하는 내장축적지방저감화제, 또는 내장지방축적 예방제의 유효성분이 되는 물질의 선택 방법:
    (1) PPARδ 단백질과 피험 화합물의 결합, 또는 피험 화합물에 의한 PPARδ 단백질의 활성화를 측정하는 공정.
    (2) 상기 PPARδ 단백질과 결합하는 피험 화합물, 또는 PPARδ 단백질을 활성화하는 피험 화합물을 내장축적지방저감화제, 또는 내장지방축적 예방제의 유효성분이 되는 물질로 선택하는 공정.
  2. 삭제
KR1020097009737A 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제 KR101021817B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2001216502 2001-07-17
JPJP-P-2001-216502 2001-07-17

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047000532A Division KR100912852B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는물질의 선택방법 및 약제

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107026032A Division KR101106518B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090074800A KR20090074800A (ko) 2009-07-07
KR101021817B1 true KR101021817B1 (ko) 2011-03-17

Family

ID=19050972

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020097009737A KR101021817B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제
KR1020107026032A KR101106518B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제
KR1020047000532A KR100912852B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는물질의 선택방법 및 약제

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107026032A KR101106518B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제
KR1020047000532A KR100912852B1 (ko) 2001-07-17 2002-07-17 ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는물질의 선택방법 및 약제

Country Status (10)

Country Link
US (2) US7396642B2 (ko)
EP (1) EP1416273B1 (ko)
JP (2) JP3888998B2 (ko)
KR (3) KR101021817B1 (ko)
CN (3) CN102912016A (ko)
AT (1) ATE448481T1 (ko)
AU (1) AU2002318743B2 (ko)
CA (1) CA2452246A1 (ko)
DE (1) DE60234348D1 (ko)
WO (1) WO2003008967A1 (ko)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007186515A (ja) * 2003-05-02 2007-07-26 Takara Bio Inc 治療剤
JP4525221B2 (ja) * 2004-07-16 2010-08-18 アステラス製薬株式会社 受容体リガンド同定法
ES2426005T3 (es) 2004-07-23 2013-10-18 Acceleron Pharma Inc. Polipéptidos del receptor ACTRII, procedimientos y composiciones
AU2006318449B2 (en) 2005-11-23 2012-07-05 Acceleron Pharma Inc. Activin-actRIIa antagonists and uses for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
CA2677007A1 (en) 2007-02-01 2008-08-07 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
TWI782836B (zh) 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
TWI667038B (zh) 2007-02-09 2019-08-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 包含ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白的醫藥組合物；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防與癌症相關的骨質流失之用途；ＡｃｔＲＩＩａ-Ｆｃ融合蛋白於治療或預防多發性骨髓瘤之用途
US7960343B2 (en) 2007-09-18 2011-06-14 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for decreasing or inhibiting FSH secretion
CA2763548C (en) * 2008-05-27 2019-01-15 Energesis Pharmaceuticals, Inc. Brown adipocyte progenitors in human skeletal muscle
SI3750552T1 (sl) 2008-08-14 2023-10-30 Acceleron Pharma Inc. GDF pasti
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
CA2749544A1 (en) 2009-01-13 2010-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
EP3845239A1 (en) 2009-06-08 2021-07-07 Acceleron Pharma Inc. Use of anti-actriib proteins for increasing thermogenic adipocytes
CN107267520A (zh) 2009-06-12 2017-10-20 阿塞勒隆制药公司 截短的actriib‑fc融合蛋白
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
US9044606B2 (en) 2010-01-22 2015-06-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Methods and devices for activating brown adipose tissue using electrical energy
US8476227B2 (en) 2010-01-22 2013-07-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Methods of activating a melanocortin-4 receptor pathway in obese subjects
CN103298832A (zh) 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途
CA2867922A1 (en) 2011-11-10 2013-05-16 Energesis Pharmaceuticals, Inc. Brown adipocyte progenitors in human skeletal muscle
CA2890217C (en) 2012-11-02 2021-07-20 Yifu FANG Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
WO2015192111A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
BR112017011722A2 (pt) 2014-12-03 2018-02-27 Acceleron Pharma Inc antagonistas de activina-actrii e usos para o tratamento de anemia
US10080884B2 (en) 2014-12-29 2018-09-25 Ethicon Llc Methods and devices for activating brown adipose tissue using electrical energy
US10092738B2 (en) 2014-12-29 2018-10-09 Ethicon Llc Methods and devices for inhibiting nerves when activating brown adipose tissue
CN107638569A (zh) * 2016-07-21 2018-01-30 上海聿健生物科技有限公司 增强褐色脂肪细胞产热效率的方法和应用
USD824964S1 (en) 2016-08-19 2018-08-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Refrigerator door
JP2020528900A (ja) * 2017-07-27 2020-10-01 アラーガン、インコーポレイテッドＡｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ 体脂肪低減のためのプロスタサイクリン受容体アゴニスト
CN116875603B (zh) * 2023-09-06 2023-12-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种靶向线粒体解偶联蛋白mRNA的miRNA分子及其应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6300361B1 (en) * 1990-07-25 2001-10-09 Novartis Ag Stabilized pharmaceutical compositions comprising acid donors
US6022897A (en) * 1995-04-25 2000-02-08 The Salk Institute For Biological Studies Selective modulators of peroxisome proliferator activated receptor-gamma, and methods for the use thereof
WO1997028149A1 (en) 1996-02-02 1997-08-07 Merck & Co., Inc. Method for raising hdl cholesterol levels
WO1997027847A1 (en) 1996-02-02 1997-08-07 Merck & Co., Inc. Method of treating diabetes and related disease states
JP4427825B2 (ja) 1997-07-24 2010-03-10 アステラス製薬株式会社 コレステロール低下作用を有する医薬組成物
GB9914977D0 (en) * 1999-06-25 1999-08-25 Glaxo Group Ltd Chemical compounds

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JBC Vol.274(10):6718-6725 (1999)
Nippon Rinsho Vol.56(7):1722-1728 (1998)*

Also Published As

Publication number Publication date
CN1533504A (zh) 2004-09-29
US20080287544A1 (en) 2008-11-20
DE60234348D1 (de) 2009-12-24
EP1416273B1 (en) 2009-11-11
KR20040017300A (ko) 2004-02-26
CN101259276A (zh) 2008-09-10
EP1416273A4 (en) 2005-06-15
JPWO2003008967A1 (ja) 2004-11-11
US20040265817A1 (en) 2004-12-30
KR20110002097A (ko) 2011-01-06
EP1416273A1 (en) 2004-05-06
KR20090074800A (ko) 2009-07-07
CN100419425C (zh) 2008-09-17
US7396642B2 (en) 2008-07-08
ATE448481T1 (de) 2009-11-15
AU2002318743B2 (en) 2008-02-21
JP3888998B2 (ja) 2007-03-07
WO2003008967A1 (fr) 2003-01-30
KR101106518B1 (ko) 2012-01-20
JP2012062315A (ja) 2012-03-29
CN102912016A (zh) 2013-02-06
KR100912852B1 (ko) 2009-08-18
CA2452246A1 (en) 2003-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101021817B1 (ko) ＰＰＡＲ δ활성화 작용을 측정하는 것을 특징으로 하는 물질의 선택방법 및 약제
Berger et al. Distinct properties and advantages of a novel peroxisome proliferator-activated protein γ selective modulator
Minn et al. Resistin is expressed in pancreatic islets
Sandouk et al. The antidiabetic agent pioglitazone increases expression of glucose transporters in 3T3-F442A cells by increasing messenger ribonucleic acid transcript stability
KR19990045756A (ko) Ｒｘｒ 작용제를 이용하는 ｎｉｄｄｍ 치료 방법
US7741080B2 (en) Adiponectin expression-inducing agents and uses thereof
IL182574A (en) 41gpr and its vests for the treatment of insulin-related disorders
Yu et al. Evodia alkaloids suppress gluconeogenesis and lipogenesis by activating the constitutive androstane receptor
Cabrero et al. Uncoupling protein-3 mRNA levels are increased in white adipose tissue and skeletal muscle of bezafibrate-treated rats
JPWO2005084697A1 (ja) アディポネクチン受容体発現制御剤
US9775879B2 (en) Use of human small leucine zipper protein in adipocyte differentiation procedure
Strobel et al. Effect of thiazolidinediones on expression of UCP2 and adipocyte markers in human PAZ6 adipocytes
Zhao et al. Murine double minute 2 aggravates adipose tissue dysfunction through ubiquitin-mediated six-transmembrane epithelial antigen of prostate 4 degradation
Lustig et al. Regulation and function of adiponectin receptors in skeletal muscle
JP4870464B2 (ja) ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤
Rieusset et al. Regulation of p85α phosphatidylinositol-3-kinase expression by peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs) in human muscle cells
US20020098169A1 (en) Novel sequences and their use
EP0969100A1 (en) Method for screening heat shock protein expression induction regulators
Cabrero et al. Uncoupling protein-3 mRNA up-regulation in C2C12 myotubes after etomoxir treatment
CA2801162A1 (en) Diagnostic, screening and therapeutic applications of ocab-based tools
Wu et al. Protective Effects of Oleoylethanolamine on Diabetic Nephropathy: Role of AMP-Activated Protein Kinase/Nuclear Factor-E2-Related Factor 2 Pathway
EP4149962A1 (en) Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
Cabrero et al. Down-regulation of acyl-CoA oxidase gene expression and increased NF-B activity in etomoxir-induced cardiac hypertrophy
Ye Identification of TRPV4 as a Regulator of Adipose Oxidative Metabolism, Inflammation and Energy Homeostasis by a Chemical Biology Approach

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee