JPWO2003008967A1 - ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物を含有する熱産生亢進作用を有する物質の選択方法、及びその薬剤、並びに抗糖尿病、抗肥満、及び内臓蓄積脂肪低減化機能を有する薬剤を提供する。本発明は、ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物を含有する、非ふるえ熱産生（ｎｏｎｓｈｉｖｅｒｉｎｇｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｎＳＴ）を亢進させ、脂肪組織等の細胞中のミトコンドリアの脱共役呼吸又はミトコンドリア内膜でのプロトンリークを特異的に亢進させ、ＵＣＰ１の発現量を増大させる作用を有する薬剤、該化合物を含有する抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤である。また本発明は、ＰＰＡＲδ活性化作用の測定による該化合物の選択方法である。

Description

技術分野
本発明は、ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体δ（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲδ）活性化作用を測定することによる熱産生亢進作用を有する物質の選択方法、及びＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物を含有する熱産生亢進作用を有する薬剤に関する。また本発明は、脂肪酸、ピルビン酸を基質とするエネルギー代謝（呼吸）細胞内の小器官であるミトコンドリアの機能のうち、脱共役蛋白質（ＵＣＰ）によって惹起される脱共役呼吸又はミトコンドリア内膜のプロトンリーク（以下、プロトンリークと総称する）を特異的に亢進させる薬剤に関する。さらに本発明は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂肪蓄積抑制剤に関する。
背景技術
生体のエネルギー代謝調節系は、摂食調節系とエネルギー消費調節系からなっている。エネルギー消費調節系は、生命維持のための基礎代謝に使用されるエネルギー消費と、それ以外のエネルギー消費に分けられる。後者の範疇で主要なものが熱産生である非ふるえ熱産生（ｎｏｎｓｈｉｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ；ｎＳＴ）で、その機能的な意義は生まれ立て時、寒冷暴露時、冬眠から覚める時などの体温維持や、過剰摂取エネルギーの消費による肥満、糖脂質代謝障害の防御などが挙げられる。特に、恒温動物である哺乳動物や鳥類、特に小動物において、体温維持のため、ｎＳＴは重要である。ｎＳＴの惹起機序には、ミトコンドリアのプロトンリーク、すなわち細胞の呼吸鎖の電子伝達系とＡＴＰ合成の関与が重要である。
褐色脂肪組織（ＢＡＴ）には、その掲色脂肪細胞（ＢＡ）の呼吸鎖電子伝達系と、ＡＴＰ合成を脱共役させる特異的蛋白質である脱共役蛋白質−１（ＵＣＰ１）とよばれる約３００アミノ酸からなる分子量３２ｋＤの蛋白質が、ミトコンドリアの膜に存在する。ＵＣＰ１は約１００個のアミノ酸からなるドメインの３回繰り返し構造からなり、各ドメインに２箇所ずつ、合計６箇所の膜貫通部位があって、これらの膜貫通部位がミトコンドリアの膜にチャネルを形成している。
ＵＣＰ１はプロトンを輸送するキャリアである。ＵＣＰ１等が形成するプロトンチャネルは、電気化学的な勾配に従って自由にプロトンを透過させて熱を放出する機能を発現している。これがｎＳＴとなる。つまりｎＳＴは、プロトンチャネルのプロトン透過によって脱共役を起こし、脱共役によりＡＴＰの合成が低下し、ＡＴＰとＡＤＰの比を一定に維持するためにミトコンドリア内の呼吸が活発になり、その結果として大量の脂肪と糖が酸化されて熱が発生して生じる。
ＵＣＰ１の生理的意義としては、生まれ立て時、寒冷暴露時などにおける体温維持機能が重要であるが、そのほかにトランスジェニックマウスを使った研究より、肥満の防御に関与することが明らかになっている。肥満の発症、進展、維持にＵＣＰ１が関与していることは、様々な肥満モデルでＵＣＰ１の発現が低下していることから示唆されていた。例えば、ＢＡＴ減少トランスジェニックマウスで過食無しに肥満が発症することが確認された（Ｌｏｗｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６，７４０−７４２（１９９３））。また、ＵＣＰ１遺伝子を脂肪細胞特異的な遺伝子ａＰ２のプロモーターに組込み、ＵＣＰ１を強制的に大量発現させたマウスでは、体脂肪の減少、高脂肪食負荷による食餌性肥満に対する抵抗性が観察された（Ｋｏｐｅｃｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９６，２９１４−２９２３（１９９５））。さらに、ＵＣＰ１の発現が１／３に抑えられたマウスでは、寒冷暴露時の体温維持能低下、体脂肪量増加による肥満、そしてインスリン抵抗性が確認された（Ｌｏｗｅｌｌ Ｂ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７４０−７４２（１９９３））。さらにＵＣＰ１のノックアウトマウスは寒冷非耐性であった（Ｅｎｅｒｂａｃｋ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７））。以上のように、ＵＣＰ１が熱産性分子として体温調節やエネルギー消費に重要な役割を有し、肥満と密接な関係にあることは動物実験の結果から明らかとなっている。
ＵＣＰ１の発現量は、主に核内の遺伝子の転写レベルで調節されており、ｃＡＭＰ濃度上昇によりＵＣＰ１遺伝子発現は増加する（斎藤ら、最新医学、５２，１０９５−１０９６（１９９７））。
細胞内のエネルギー消費の約２０〜４０％はミトコンドリア内膜のプロトンリークによって生じると考えられている。ＢＡＴが少量しかないヒト成人やその他の動物では、ｎＳＴの大部分は骨格筋や白色脂肪組織（ＷＡＴ）で生じると考えられていた。以上のことから、ＢＡＴ以外の組織におけるＵＣＰの存在が推定されていた。１９９７年には、二つのグループから相次いでＢＡＴ以外の組織からＵＣＰ２のｃＤＮＡクローニングが報告された（Ｆｌｅｕｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ，１５，２６９−２７２（１９９７）；Ｇｉｍｅｎｏら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４６，９００−９０６（１９９７））。
ヒトＵＣＰ２はヒトＵＣＰ１と５９％のホモロジーを示し、ＵＣＰ１と同様に６箇所の膜貫通部位を有するチャネルを形成し、かつプリンヌクレオチド結合部位を有している。ＵＣＰ２はＵＣＰ１とは異なり、全身組織に広汎に発現しており、特に肺、膵臓で高濃度で発現している。ほかにも心臓、肝臓、脳、腎臓、精巣、ＷＡＴ、ＢＡＴ、骨格筋で発現が検出されている。
ＵＣＰ２の機能については、高脂肪食負荷マウスで副精巣周囲脂肪組織のＵＣＰ２遺伝子発現の亢進が認められている。しかし、ＵＣＰ２のノックアウトマウスは、寒冷条件下で体温維持能が正常であることが報告された（Ａｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃ Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ ２６，３８７−３８８（２０００））。また上述のＵＣＰ１のノックアウトマウスでは、代償作用と考えられる、掲色脂肪組織におけるＵＣＰ２の大幅な発現亢進が認められるが、このマウスは寒冷非耐性であった（Ｅｎｅｒｂａｃｋ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８７，９０−９４（１９９７））。さらに、ＵＣＰ２は膵β細胞において細胞内ＡＴＰ濃度変化を介し、インスリン分泌を抑制していることが示された（Ｚｈａｎｇ Ｃ．−Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １０５，７４５−７５５（２００１））。これは抗糖尿病の観点からみると相反する特性であった。以上のように、ＵＣＰ２については、そのプロトンチャンネルとしての脱共役能は確認されているものの、現在までのところ、エネルギー消費／肥満との関連性は明らかにはされていない。
生体内の余剰エネルギーは、まず優先的に内臓脂肪（特に腸管膜脂肪）として蓄積される。この内臓脂肪は他の部位の脂肪（特に皮下脂肪）に比べ、脂肪動員を受けやすく、速やかに分解され、消費される。この内臓脂肪（肥満）は生活習慣病（成人病）発症の多重危険因子とみなされている。その理由は、ＷＡＴの白色脂肪細胞（ＷＡ）からの分泌脂肪酸が門脈を経由して直接肝臓に流入してインスリン抵抗性と脂肪合成を亢進し、その結果、耐糖能異常、高血圧および高脂血症を惹起し、最終的にはこれらが合併して動脈硬化を発症するに至るためである。したがって、内臓脂肪の蓄積抑制と蓄積内臓脂肪の低減化が、ヒト成人の糖尿病をはじめとする生活習慣病発症予防およびその治療に有効であると期待される。
ペルオキシソーム増殖物質活性化受容体（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）は、その構造などから核内受容体（核ホルモン受容体）スーパーファミリーの一員と考えられている。これまで、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲδ（別称ＮＵＣ−１、ＰＰＡＲβ、ＦＡＡＲ）、およびＰＰＡＲγと称される３種のＰＰＡＲのサブタイプが同定され、それらの遺伝子（ｃＤＮＡ）がクローニングされている（Ｌｅｍｂｅｒｇｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１２，３３５−３６３（１９９６））。
これら３種のうち、ＰＰＡＲαに関しては、そのリガンド効果を有することが知られているフィブレート系薬剤に、臨床で強い血清トリアシルグリセロールレベル低下作用が認められている（Ｆｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４３１２−４３１７（１９９７））。
ＰＰＡＲγは特に脂肪組織で発現しており、脂肪細胞の分化に深く関与する因子であるとされている（Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８，１２２４−１２３４（１９９４）；Ｔｏｎｔｏｎｏｚら、Ｃｅｌｌ，７９，１１４７−１１５６（１９９４））。種々のチアゾリジンジオン誘導体は、インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ：ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｍｅｌｉｔｕｓ）のモデル動物で血糖降下作用を示し、インスリン抵抗性解除作用を有する新しいＮＩＤＤＭ治療薬として期待されている。これらチアゾリジンジオン誘導体はまた、ＰＰＡＲγのリガンドとして作用し、ＰＰＡＲγを特異的に活性化することが最近の研究で明らかとなった（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１２９５３−１２９５６（１９９５））。
しかしながら、ＰＰＡＲδの生理作用は明らかにされていない（Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３（４），５２７−５０（２０００））。ＷＯ９７／２８１４９号明細書にはＰＰＡＲδリガンドの血中ＨＤＬ上昇作用が、またＷＯ９９０４８１５号明細書にはＰＰＡＲδ受容体を活性化する物質を投与することによるコレステロール低下作用が開示されている。しかし、ＰＰＡＲδと熱産生亢進作用との関係や、ＰＰＡＲδと脱共役蛋白質との関係については開示も示唆もされていない。
また、アラキドン酸のような不飽和脂肪酸、カルバプロスタサイクリン（ｃＰＧＩ）、およびＬ−１６５０４１（４−（３−（２−ｐｒｏｐｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ａｃｅｔｙｌ−ｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｙｌｏｘｙ）−ｐｈｅｎｏｘｙ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）がＵＣＰ２の発現を増加させることがわかった（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７６，Ｎｏ．１４，Ｉｓｓｕｅ ｏｆ Ａｐｒｉｌ ６，ｐｐ．１０８５３−１０８６０，２００１）。しかし、ＵＣＰ１とＰＰＡＲδの関係については、明らかにされていない。
発明の開示
本発明の目的は、熱産生を亢進させる作用を有する物質の選択方法、及びその薬剤を提供することである。さらに、本発明の目的は、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤を提供することである。
本発明者らは、生体エネルギー消費調節系のうちのｎＳＴを促進することによる熱産生亢進作用に着眼した。そして、ミトコンドリアの脱共役呼吸の亢進、ｎＳＴの組織としては相対的に小さいＢＡＴ内ミトコンドリアのプロトンリーク亢進に加え、ＷＡＴ内ミトコンドリアプロトンリーク、及び脱共役蛋白質同族体であるＵＣＰ１の機能を亢進させる手段を創造し、よってその効率を向上させることを意図した。
本発明者らは、上記課題を解決することを目標として鋭意研究した結果、非特異的ＰＰＡＲリガンドであるカルバプロスタサイクリン（ｃＰＧＩ：６，９α−ｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−１１α，１５Ｓ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−ｐｒｏｓｔａ−５Ｅ，１３Ｅ−ｄｉｅｎ−１−ｏｉｃ ａｃｉｄ）やイロプロスト（Ｉｌｏｐｒｏｓｔ：５−｛（Ｅ）−（１Ｓ，５Ｓ，６Ｒ，７Ｒ）−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−６−［（Ｅ）−（３Ｓ，４ＲＳ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｍｅｔｈｙｌ−５−ｏｃｔｅｎ−６−ｉｎｙｌ］−ｂｉｃｙｃｌｏ［３．３．０］−ｏｃｔａｎ−３−ｙｌｉｄｅｎｅ｝ｐｅｎｔａｎｏｉｃ ａｃｉｄ）が、骨格筋細胞もしくは脂肪細胞においてＵＣＰ１発現の亢進作用を有することを見出した。
そして、この新たな知見、ならびにＰＰＡＲαのリガンドであるフィブレート系化合物およびＷｙ１４６４３や、ＰＰＡＲγのリガンドであるチアゾリジンジオン系化合物にＵＣＰ１発現の亢進作用がほとんど認められないという知見を総合し、ＵＣＰ１発現の亢進作用にはＰＰＡＲδが主に関与しているのではないかと考え、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物について更に研究した。
そして、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する物質が、ＵＣＰ１の発現亢進作用を示すことを、ヒトおよびげっ歯類の骨格筋細胞および脂肪細胞を用いた実験により明らかにした。
さらに本発明者らは、このようにＵＣＰ遺伝子の発現がＰＰＡＲδにより制御を受けていることから、ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することによって、ＵＣＰ１遺伝子の発現を増加させ、ｎＳＴ機能を増進させる、熱産生亢進作用を有する物質のスクリーニングが可能であることを見出した。
すなわち、本発明は以下の事項を包含する。
（１）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
（２）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる作用を有する物質の選択方法。
（３）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる作用を有する物質の選択方法。
（４）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる物質の選択方法。
（５）ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、脂肪酸β酸化を亢進させる物質の選択方法。
（６）レポーター遺伝子を利用する、（１）から（５）のいずれかに記載の物質の選択方法。
（７）下記▲１▼から▲３▼の工程を含む（６）に記載の熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
▲１▼ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞にＰＰＡＲδ活性化作用を有する物質を接触および／または導入する工程。
▲２▼前記細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する工程。
▲３▼前記細胞における前記ＵＣＰ１遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程。
（８）前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞又は骨格筋細胞である（７）に記載の選択方法。
（９）前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞である（７）に記載の選択方法。
（１０）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、熱産生亢進作用を有する薬剤。
（１１）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる薬剤。
（１２）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる薬剤。
（１３）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる薬剤。
（１４）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、脂肪酸β酸化を亢進させる薬剤。
（１５）前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、非特異的ＰＰＡＲリガンド又はＰＰＡＲδリガンドである（１０）から（１４）のいずれかに記載の薬剤。
（１６）前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、カルバプロスタサイクリン、イロプロスト、又はｐ−（３−（４−ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄである（１０）から（１４）のいずれかに記載の薬剤。
（１７）前記ミトコンドリアが骨格筋、白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（１１）から（１３）のいずれかに記載の薬剤。
（１８）前記ミトコンドリアが白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである（１１）から（１３）のいずれかに記載の薬剤。
（１９）ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。
（２０）（１０）から（１８）のいずれかに記載の薬剤を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。
発明を実施するための形態
本発明のｎＳＴ組織のミトコンドリアのプロトンリーク等を特異的に亢進する作用を有する薬剤は、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とする。本発明の薬剤は、上記有効成分そのものでも、それを含む適宜の配合物、組成物、混合物であってもよい。また、ＰＰＡＲ活性化作用を有する化合物とは、「ＰＰＡＲリガンド」としてＰＰＡＲに結合することにより、ＰＰＡＲの標的遺伝子の転写活性化能を制御する化合物を指し、天然に存在するものに限られず、人工的に合成されたものも含まれる。
上記有効成分の有用性を明らかにするために、実施例に具体的に示されているように、各種ＰＰＡＲリガンドを各種骨格筋細胞、脂肪細胞に添加してＵＣＰ１のｍＲＮＡ量を測定した。その結果、測定したＰＰＡＲαリガンド、ＰＰＡＲγリガンドに対し、有意にＵＣＰ１のｍＲＮＡの発現量が多いものはＰＰＡＲδリガンドであった。なお、ＰＰＡＲδリガンドとしては、例えば、コレステロール低下作用を示す化合物としてＷＯ９９０４８１５号明細書に記載された、ｐ−（３−（４−ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＹＭ−１６６３８）等が挙げられる。
ある物質について、ＰＰＡＲに対する結合／活性化の程度を簡便かつ高感度に知る方法として、レポーター遺伝子が利用される。例えば酵母の転写因子であるＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲのリガンド結合領域とを結合させた融合蛋白質発現用のベクター、およびＧＡＬ４の応答配列（ＧＡＬ４ ｂｉｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔ）に連結されたレポーター遺伝子を含むレポータープラスミドを導入した動物細胞を用いる方法が知られている（ＷＯ９６／３３７２４；Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，１２９５３−１２９５６（１９９５）；Ｗｉｌｌｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３９，６６５−６６８（１９９６））。レポーター遺伝子を利用する方法とは、例えば、まず被験化合物がＰＰＡＲに結合又は活性化する物質であると、被験化合物がＧＡＬ４のＰＰＡＲのリガンド結合領域に結合する。すると、ＰＰＡＲのリガンド結合領域に融合させたＧＡＬ４のＤＮＡ結合領域が、レポータープラスミドのＧＡＬ４の応答配列に結合し、レポーター遺伝子の発現が亢進する。レポーター遺伝子によって発現した蛋白質の活性等を測定すること、つまりレポーター活性を検出することによって、被験化合物がＰＰＡＲに結合又は活性化する物質か否かが検出できる。
したがって、ＰＰＡＲに結合する未知のリガンドのスクリーニングや被験化合物がＰＰＡＲに結合するリガンドであるか否かの検査において、その天然または人工的に合成されたリガンドを検出し、単離することができる。なお、レポーター活性の検出は、レポーター遺伝子の種類に応じ、染色、蛍光、細胞の生死などを指標に、当業者の技術常識に基づいて適宜行うことができる。
さらに、本発明におけるスクリーニング方法は、上述のレポーター活性の検出系に（ａ）ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞に被験試料を接触および／または導入する工程、（ｂ）該細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する工程、（ｃ）該細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程、を加えることができる。
スクリーニングに用いる「ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞」としては、特に制限はないが、特に白色脂肪細胞や褐色脂肪細胞等の脂肪細胞、骨格筋細胞が好適である。細胞は、動物組織から分離した初代培養細胞であってもよく、癌化もしくは不死化した株化細胞であってもよい。脂肪細胞としては、例えば、後述する実施例に記載のヒト白色脂肪細胞、あるいはラット褐色脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１（マウス脂肪細胞）などの各種脂肪細胞が、骨格筋細胞としては、例えば、ＳｋＭＣ（ヒト骨格筋細胞）、Ｃ２Ｃ１２（マウス骨格筋細胞）などの各種骨格筋細胞が好適に用いられる。なおＵＣＰファミリー（脱共役蛋白同族体）遺伝子としては、例えばＵＣＰ１遺伝子、ＵＣＰ２遺伝子、ＵＣＰ３遺伝子、ＵＣＰ４遺伝子が挙げられる。
本発明のスクリーニング方法の一工程では、これらＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞に被験物質を接触および／または導入し、ＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する。遺伝子の発現量の測定には、当業者によく知られた種々の方法を用いることが可能である。例えば、ノザンブロット法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，２０１−２０６（１９８７），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）あるいはＲＴ−ＰＣＲ法（Ｓｈａｆｆｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９０，２９２−２９６（１９９０））などの方法で、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は蛋白質を測定することによって、行うことができる。
ＵＣＰ１遺伝子の発現量測定の結果、ＵＣＰ１遺伝子の発現の有意な増加が認められれば、用いた被験試料の化合物はｎＳＴ機能を増進させる作用を有する。ｎＳＴの組織内細胞のミトコンドリアで脂肪および糖が燃焼するためにはＵＣＰ１の発現が不可欠であるが、本発明の有効成分は、前記のように該組織内細胞のＵＣＰ１発現量を顕著に増大させる作用を有する。この分子レベルでの知見から、本発明の薬剤は内臓脂肪蓄積抑制および蓄積内臓脂肪の低減化に有効である。
実際に、実施例ではＰＰＡＲδリガンドにより発現が亢進したＵＣＰが内臓脂肪蓄積を抑制および低減するべく機能しうること、すなわち細胞内の脂肪および糖の燃焼を促進することを確認するために、各種ＰＰＡＲリガンドを初代ヒト脂肪細胞に添加し、脂肪燃焼亢進の指標のひとつとして知られる脂肪酸β酸化を測定した。実施例に具体的に示されているように、ＵＣＰの発現量に比例して脂肪酸β酸化も亢進した。そして最も脂肪酸β酸化が亢進したのはＰＰＡＲδリガンドであった。
本発明の薬剤は、ｎＳＴに関与する骨格筋、脂肪等の非ふるえ熱産生組織細胞中のミトコンドリアにある内膜貫通型蛋白質のＵＣＰ１の発現量を増大させ、上記細胞中のミトコンドリアの脱共役呼吸、プロトンリーク、及び熱産生を特異的に亢進させる作用を有する。本発明の薬剤は、ＰＰＡＲδ活性化作用を有する化合物またはその誘導体を有効成分とするものであり、上記したように脂肪、骨格筋等のｎＳＴ組織細胞中のＵＣＰ１の発現量を著しく増大させる高ＵＣＰ１発現作用をもつ。本発明の薬剤は、ＵＣＰ１発現活性を指標として同定および分離・精製することができる。そうして得られた物質を有効成分とすることで、特に抗肥満に著効を有する内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤を調製することができる。
本発明の薬剤は、エネルギー代謝や脂質代謝を促進させ、血漿脂質を低下させるので、特に哺乳動物（例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、サル、ネコ、ウマ、ウサギ等）や鳥類の肥満の予防または治療に用いることができる。さらに、肥満に合併する疾患（例えば糖尿病、高血圧症、高脂血症、動脈硬化、虚血性心疾患等の成人病等）等の予防または治療にも有効である。
当該低減剤又は抑制剤の担体としては、その使用形態に応じて、適当な充填剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、表面活性剤、防湿剤、賦形剤、希釈剤などを使用することができる。製剤形態は、その使用目的に応じて適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば錠剤、顆粒剤、粉末剤、丸剤、カプセルなどの固剤や、液剤、懸濁剤、乳剤などが例示される。かくして得られる抗糖尿病剤、抗肥満剤、または内臓蓄積脂肪低減化剤ないし内臓脂肪蓄積抑制剤は経口投与が望ましく、その投与量は、投与する者の症状等に応じて適宜選択される。したがって、投与量、投与回数などは特に限定されない。
実施例
次に、実施例に基づいて本発明を具体的に説明するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるものではない。なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより発刊）に記載の方法により行った。なお、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品に添付の指示書に従った。
［実施例１］ヒト白色脂肪細胞におけるＵＣＰ１およびＵＣＰ２ｍＲＮＡ発現誘導に対する薬剤の影響
（１）ヒト白色脂肪細胞の培養とＲＮＡ調製
ヒト脂肪細胞は、皮下脂肪組織由来の未分化凍結前駆脂肪細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＳＰ−Ｆ，Ｌｏｔ．Ｎｏ．Ｌ０１１３９９）を米国Ｚｅｎ−Ｂｉｏ社から購入した。これを２４穴プレートにて培養し、業者の指示に従って分化誘導を行うことにより脂肪細胞を得、ヒト白色脂肪組織由来脂肪細胞として使用した。すなわち、２４穴プレートで、ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ培地中、コンフルエントな状態まで３７℃でＣＯ_２インキュベータで培養後、ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ培地に培地交換し、約７２時間培養することにより分化誘導を行った。さらにａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ培地に培地交換し、１４日間培養して白色脂肪細胞へと分化させた。この培養細胞についてさらに以下の条件で培養した。
各種被験化合物を終濃度１０μＭとなるように培地に加え、６時間培養した（ｎ＝３）。各種被験化合物は、ＰＰＡＲαリガンドのベザフィブレート（Ｂｅｚａｆｉｂｒａｔｅ）、ＷＹ１４６４３、ＰＰＡＲδリガンドのＹＭ−１６６３８、ＰＰＡＲγリガンドのトログリタゾン（Ｔｒｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、非特異的ＰＰＡＲリガンドのｃＰＧＩ、イロプロスト（Ｉｌｏｐｒｏｓｔ）、β３アドレナリンレセプターアゴニストのＬ７５５５０７とした。コントロールは被験化合物の溶媒であるＤＭＳＯを終濃度０．５％となるように加え、同様に培養した。培養した細胞を各々回収し、細胞溶解用緩衝液（ＲＬＴ溶液、ＱＩＡＧＥＮ社製）１５０μｌに懸濁した後、細胞を破砕し、細胞抽出液を得た。この細胞抽出液からトータルＲＮＡを調製した。ＲＮＡの調製はＲＮＡ調製キット（商品名：ＲＮｅａｓｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡキット、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて指示書に従って行った。
（２）ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量の測定
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、約０．１μｇ）をテンプレートとして、以下のようにリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ）によりＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量を測定した。
ヒトＵＣＰ１遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、５’−ＡＡＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＴＣＧＴＧＡＡＡＧ−３’（フォワード側プライマー）、および５’−ＣＧＴＧＴＡＧＣＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＣ−３’（リバース側センスプライマー）の２種を用いた。ＰＣＲプローブとしては、５’−ＣＡＧＡＣＴＴＣＡＡＧＣＡＴＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＣＣＡ−３’を用いた。プローブに結合した蛍光色素はＦＡＭであった。また、２−Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙとして同時に測定したＧ３ＰＤＨ ｍＲＮＡの測定についてはＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨する方法に従って行った。なお、プライマーの化学合成はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社、プローブの化学合成（蛍光色素の結合を含む）はＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社に依頼した。
調製した被験トータルＲＮＡ、上記プライマーおよびプローブ、市販のリアルタイム検出ＰＣＲ用試薬キット（ＴａｑＭａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（商品名）、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて反応チューブ１本あたり表１に示す反応液を調製した。
【表１】

ＰＣＲ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｍｉｃｒｏａｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｔｕｂｅ（商品名、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１本あたり上記反応液を２５μｌ調製し、キャップをした後、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（商品名、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にセットし、以下の条件で反応を行った。
混入ＤＮＡのＵＮＧによる分解反応５０℃、５０分、逆転写工程６０℃１０分、ＵＮＧの失活９５℃、２分の後、ＰＣＲ反応を変性工程９５℃、１５秒、アニーリング工程５８℃、９０秒の条件（サイクル数：４０サイクル）で行った。反応開始後、蛍光強度をリアルタイムで自動測定することによりＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量を測定した。ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量は対照であるブランクコントロールを１００とした場合の相対値で示し、Ｇ３ＰＤＨ ｍＲＮＡ発現量で補正をかけて算出した。
その結果を第１図に示した。ＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量は、ＰＰＡＲδリガンド（ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物）であるＹＭ−１６６３８でコントロールの約１２倍の増加を示した。これにより、ＰＰＡＲδリガンドはかかる作用を顕著に発現することが明確となった。本実験においてＰＰＡＲδリガンドはＵＣＰ１遺伝子を特異的に増強することが判明したことから、ＰＰＡＲδリガンドによるＷＡＴの機能亢進作用は、ＰＰＡＲδリガンドのＷＡＴへの直接的な作用であることがわかった。ＵＣＰ１は、げっ歯類のみならず、ヒト白色脂肪細胞において顕著な発現の増大が観察されたことから、ヒトの糖尿病や肥満に対し、ＰＰＡＲδリガンドが極めて有効であることが示された。
（３）ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量の測定
前項（１）で得たＲＮＡ（トータルＲＮＡ、約０．１μｇ）をテンプレートとして、前項（２）と同様にリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によりＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量を測定した。ヒトＵＣＰ２遺伝子用のＰＣＲプライマーとしては、５’−ＣＧＣＣＡＡＡＴＧＡＧＣＴＴＴＧＣＣＴ−３’（フォワード側プライマー）、および５’−ＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＡＣＴＧＴＴＴＧＡ−３’（リバース側センスプライマー）の２種を用いた。ＰＣＲプローブとしては、５’−ＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＧＧＣＣＴＧＴＡＴＧＡＴＴＣ−３’を用いた。プローブに結合した蛍光色素はＦＡＭであった。
その結果を第２図に示した。ＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量はＰＰＡＲδリガンド（ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する化合物）であるＹＭ−１６６３８で対照の約２倍の増加を示した。
［実施例２］ヒト白色脂肪細胞における遊離脂肪酸β酸化に対する薬剤の影響
実施例１で述べた方法と同様にヒト白色脂肪細胞を分化誘導後、上清を除去し、ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｍｅｄｉｕｍ培地にオレイン酸およびパルミチン酸をそれぞれ０．６７ｍＭおよび０．３３ｍＭとなるように溶解した培地５００μｌに交換した。各種被験化合物を終濃度１０μＭとなるように培地に加えた後、［９，１０（ｎ）−^３Ｈ］パルミチン酸（アマシャムファルマシア社製、終濃度１？Ｃｉ／ｍｌ）を加え、３７℃で４８時間培養した。被験化合物は、ＰＰＡＲδリガンドであるＹＭ−１６６３８、ＰＰＡＲαリガンドのＷＹ１４６４３、β３アドレナリンレセプターアゴニストのＬ７５５，５０７、ＰＰＡＲγリガンドのロシグリタゾン（Ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）とした。コントロールは被験化合物の溶媒であるＤＭＳＯを終濃度０．５％となるように加え、同様に培養した。また培養中、細胞による［９，１０（ｎ）−^３Ｈ］パルミチン酸のβ酸化により生じた^３Ｈ_２Ｏが蒸散しないように、住友ベークラート社製ミニカルチャーフィルター（ＭＳ−３００５５）で培養プレートをシールした。
４８時間培養後、培地上清２００μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し、５０％トリクロロ酢酸を５０μｌ添加し、氷上で３０分間沈殿を形成させ、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心した。次に、あらかじめ５００μｌの純水を入れた２０ｍｌガラスバイアルの中に蓋なし１．５ｍｌエッペンドルフチューブを入れ、このエッペンドルフチューブに上記遠心で得られた上清を全量移し、ポリプロピレンパッキン付きの蓋で厳重に封をした。このバイアルを５０℃で１８時間加温してバイアル内を^３Ｈ_２Ｏで飽和させ、４℃で冷却後、遠心し（１０００ｒｐｍ、１分）、バイアル内のエッペンドルフチューブに残っている培地上清とエッペンドルフチューブを廃棄した。バイアル内に残った^３Ｈ_２Ｏを含んだ純水に５ｍｌの液体シンチレーター（ウルチマゴールド、パッカード社製）を加え、十分に混和後、カウントした。
この結果を第３図に示した。ＰＰＡＲδリガンドＹＭ１６６３８ １０μＭにより細胞のβ酸化は３０％亢進した。一方、ＰＰＡＲγリガンドｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ １０μＭでは１５％の亢進、ＰＰＡＲαリガンドＷＹ１４６４３ １０μＭおよびβ３ ａｄｒｅｎａｇｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒアゴニストＬ７５５，５０７ １０μＭではβ酸化の亢進はみられなかった。この結果は実施例１で示した各種ＰＰＡＲリガンドのＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現亢進作用と良く相関している。すなわち、ＰＰＡＲδリガンドはＵＣＰ１遺伝子の発現亢進によりその蛋白量も増加させ、ＵＣＰ１の機能の一つである遊離脂肪酸を基質としたβ酸化を亢進、ひいてはエネルギー代謝を促進し、内臓脂肪蓄積を抑制および低減させることを示すものである。このことからもＰＰＡＲδリガンドがヒトの抗糖尿病、抗肥満に対して有効であることが示された。
産業上の利用可能性
本発明により、熱産生亢進作用等を有する物質が得られ、それを含む抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、又は内臓脂肪蓄積抑制剤等の薬剤が得られる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において誘導されるＵＣＰ１ ｍＲＮＡ発現量を示す。第２図は、ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において誘導されるＵＣＰ２ ｍＲＮＡ発現量を示す。第３図は、ＰＰＡＲδリガンドほか各種被験化合物によりヒト脂肪細胞において惹起される遊離脂肪酸β酸化亢進の程度を示す。

Claims (20)

1. ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
2. ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる作用を有する物質の選択方法。
3. ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる作用を有する物質の選択方法。
4. ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる物質の選択方法。
5. ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする、脂肪酸β酸化を亢進させる物質の選択方法。
6. レポーター遺伝子を利用する、請求の範囲第１項から請求の範囲第５項のいずれか１項に記載の物質の選択方法。
7. 下記（１）から（３）の工程を含む請求の範囲第６項に記載の熱産生亢進作用を有する物質の選択方法。
   （１）ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞にＰＰＡＲδ活性化作用を有する物質を接触および／または導入する工程。
   （２）前記細胞におけるＵＣＰ１遺伝子の発現量を測定する工程。
   （３）前記細胞における前記ＵＣＰ１遺伝子の発現量を増加させる化合物を選択する工程。
8. 前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞又は骨格筋細胞である請求の範囲第７項に記載の選択方法。
9. 前記ＵＣＰ１遺伝子を発現する細胞が、脂肪細胞である請求の範囲第７項に記載の選択方法。
10. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、熱産生亢進作用を有する薬剤。
11. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリアの脱共役呼吸を亢進させる薬剤。
12. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア内膜でのプロトンリークを亢進させる薬剤。
13. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、ミトコンドリア含有細胞のＵＣＰ１の発現量を増大させる薬剤。
14. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、脂肪酸β酸化を亢進させる薬剤。
15. 前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、非特異的ＰＰＡＲリガンド又はＰＰＡＲδリガンドである請求の範囲第１０項から第１４項のいずれか１項に記載の薬剤。
16. 前記ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質が、カルバプロスタサイクリン、イロプロスト、又はｐ−（３−（４−ａｃｅｔｙｌ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏｘｙ）ｐｒｏｐｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄである請求の範囲第１０項から第１４項のいずれか１項に記載の薬剤。
17. 前記ミトコンドリアが骨格筋、白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである請求の範囲第１１項から第１３項のいずれか１項に記載の薬剤。
18. 前記ミトコンドリアが白色脂肪組織、もしくは褐色脂肪組織の細胞のものである請求の範囲第１１項から第１３項のいずれか１項に記載の薬剤。
19. ＰＰＡＲδを活性化する作用を有する物質を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。
20. 請求の範囲第１０項から第１８項のいずれか１項に記載の薬剤を有効成分として含有する、抗糖尿病剤、抗肥満剤、内臓蓄積脂肪低減化剤、もしくは内臓脂肪蓄積抑制剤。

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