KR101021789B1

KR101021789B1 - The production method of natural indirubin from indican using wild type e. coli cells

Info

Publication number: KR101021789B1
Application number: KR1020100093541A
Authority: KR
Inventors: 김근중; 이진영; 신윤숙
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2011-03-17

Abstract

PURPOSE: A method for producing indiruvin from indican using wild type E.coli is provided to simplify reaction process using whole cells of E.coli. CONSTITUTION: A method for producing indiruvin by aerobic reaction of whole cell of E.coli comprises a step of adding E.coli to indicant containing plant or plant extract to convert the indicant to indirubin, and a step of adding E.coli. The whole cell of E.coli is wild type E.coli of E.coli K12 or C(KCTC 2571) or mutant strain E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or BL21(DE3). The reaction is performed in a reaction solution containing 20-70 mM Tris-HCl buffer, 0.1-10 mM indicant, and 0.01-5% triton surfactants.

Description

The production method of natural indirubin from indican using wild type E. coli cells}

본 발명은 야생형 대장균을 이용하여 인디칸으로부터 인디루빈을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인디칸 대사능을 지닌 자연적인 대장균(Escherichia coli) 전세포의 호기성 반응에 의한 인디루빈의 생산방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for producing indirubin from indican using wild-type Escherichia coli, and more particularly, natural Escherichia coli having indican metabolism. coli ) relates to a method for producing indirubin by aerobic reaction of whole cells.

인디고의 이소머(isomer)인 인디루빈은 붉은 빛을 띄며 중국의 전통적인 치료제중의 하나인 Danggui Longhui Wan으로부터 발견되었다. 다양한 질병에 대해 약리활성을 지니며, 특히 백혈병 치료와 항염증에 효과가 있고, 건선 및 피부 발진 치료제로 아주 유용하게 사용되고 있어 매우 높은 가치를 지닌다. 따라서 현재 분자수준에서 인디루빈이 세포와 효소활성에 미치는 영향을 규명하기 위한 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 특히 화학적 추가 변형(chemical modification)을 통해 제조된 인디루빈 유도체 중에는 다양한 질병에 대해 아주 높은 약리 활성을 지닌다는 결과가 보고되고 있다. Indigo isomer, an indigo isomer, was found in red and was found in Danggui Longhui Wan, one of the traditional Chinese medicines. It has pharmacological activity against various diseases, and is particularly effective in treating leukemia and anti-inflammatory, and is very useful as a treatment for psoriasis and skin rashes. Therefore, the research to investigate the effect of indirubin on the cell and enzyme activity at the molecular level is being extensively conducted. In particular, it has been reported that among indirubin derivatives prepared through chemical modification, they have very high pharmacological activity against various diseases.

이러한 인디루빈은 의약, 염색, 식품산업 등에 높은 이용가치를 지니고 있음에도 생체내의 명확한 합성경로나 관련된 유전자와 단백질에 관한 정보가 부족해, 전통발효과정에서 인디고를 생산할 때 나오는 부산물(by-product) 정도의 양만이 얻어지고 있다. 쪽 발효 시 부산물로 생산되는 인디루빈의 생산 경로는 정확히 알려지지 않았지만 기질과 중간체, 그리고 최종 산물의 구조를 토대로 유추가 가능하다. 발효과정 중에 식물자체 효소(베타-글루코시다아제)에 의해 인디칸으로부터 인독실이 유리되고, 이를 또 다른 식물 효소 혹은 발효 미생물 효소(모노 혹은 디옥시게나아제)가 이사틴으로 전환하면, 두 물질이 산소가 존재하는 조건에서 자발적으로 결합(dimerization)해 인디루빈을 생성하는 것으로 보인다. 따라서 두 효소원의 자연적인 존재 정도와 상대적인 효소 활성비, 발효액내의 용존 산소 양에 따라 인디루빈의 생성정도가 달라질 것이다. 이런 이유로, 생성되는 양이 매우 적으며, 비균일하고, 재현성이 없는 결과가 얻어지는 것으로 추정된다.Although indirubin has high value in medicine, dyeing, food industry, etc., there is a lack of clear synthetic pathways and related genes and proteins in vivo, which is a by-product of indigo production in traditional foot effect tablets. Only sheep are being obtained. The route of production of indirubin, which is produced as a by-product during side fermentation, is not exactly known, but induction is possible based on the structure of the substrate, the intermediate, and the final product. During the fermentation process, the phytoenzyme (beta-glucosidase) is released from the indica from the indica, and when another plant enzyme or fermentation microbial enzyme (mono or deoxygenase) is converted to isatin, It appears to spontaneously dimerize in the presence of oxygen to produce indirubin. Therefore, the degree of production of indirubin will depend on the natural presence of the two enzyme sources, the relative enzyme activity ratio, and the amount of dissolved oxygen in the fermentation broth. For this reason, it is estimated that the amount produced is very small, non-uniform, and not reproducible.

아직까지 재현성과 생산성이 담보된 인디루빈 생산기술은 확립되지 않은 상태이나, 자연 발효 과정을 공학적으로 모사해 인디루빈을 생산하려는 시도는 계속되고 있다. 대표적인 공정이 유전자를 조작한 재조합 대장균을 이용해 인디루빈을 생산하려는 시도이다. 하지만 생산경로가 자연 발효 기질인 인디칸을 이용하지 않고, 방향족 아미노산의 대사물인 인돌을 이용함으로 실제 발효과정과는 다르다. 따라서 이를 산화하는 옥시게나아제 역시 자연 발효과정과는 다른 것을 이용하는 것으로 추정되어 진다. Indirubin production technology, which has yet to be ensured with reproducibility and productivity, has not been established, but attempts to produce indirubin by engineering the natural fermentation process continue. A representative process is an attempt to produce indirubin using recombinant E. coli, which is genetically engineered. However, the production route is different from the actual fermentation process by using indole, a metabolite of aromatic amino acids, without using indican, which is a natural fermentation substrate. Therefore, it is assumed that the oxygenase which oxidizes it is also different from the natural fermentation process.

현재까지 많은 미생물과 동물세포로부터 선별된 산화효소를 채용해 인디루빈의 생산 가능성을 확인하였으나 인디고의 생산경로로 개발된 효소공정 특성상 인디루빈은 소량만이 비균일하게 생산되는 것으로 알려져 있고, 정제 비용이 많이 드는 것은 물론, 재조합 미생물 발효비용과 발효에 첨가해야하는 항생제 오염의 문제 등으로 인해 실 공정으로의 적용은 어려운 실정이다. The use of oxidases selected from many microorganisms and animal cells to date has confirmed the possibility of production of indirubin. However, due to the enzymatic process developed as an indigo production route, only a small amount of indirubin is known to be produced non-uniformly. Of course, due to the cost of recombinant microbial fermentation and the problem of antibiotic contamination to be added to the fermentation, it is difficult to apply to the actual process.

이러한 공정은 자연 발효과정에 비해 상대적으로 경제적인 인돌, 혹은 트립토판의 대사 과정에 필요한 모든 효소를 지닌 미생물을 이용할 때, 포도당으로부터 직접 인디루빈을 생산 할 수 있는 장점이 있는 것은 분명하다. 하지만, 자연 발효과정과 진화과정을 고려할 때, 쪽 식물에 풍부(20 내지 40 g/kg 쪽 식물)하게 존재하는 인디칸을 기질로 이용할 수 있으면 과량의 인디루빈을 효율적으로 생산할 수 있을 것이다. 이는 쪽 식물 주변, 혹은 인디루빈에 노출되어 진화해온 야생형 미생물에 내재된(innate) 효소 활성이 최적화된 상태로 발현될 수 있기 때문이다. 특히 불용성 인디고에 비해 상대적으로 수용성인 인디루빈 생성 과정이, 체내 독성을 줄이고 외부로 배출이 쉬운 특성을 지니고 있기 때문이다. It is clear that this process has the advantage of producing indirubin directly from glucose when using indole or microorganisms with all the enzymes necessary for the metabolism of tryptophan, compared to natural fermentation. However, considering the natural fermentation process and the evolutionary process, it is possible to efficiently produce excess indirubin if the indican present in abundance (20-40 g / kg side plants) in the side plants can be used as a substrate. This is because the enzyme activity innate in wild-type microorganisms that have evolved due to exposure to indirubin or around the plant can be optimized. In particular, the process of producing indirubin, which is relatively water-soluble compared to insoluble indigo, is characterized by reducing the toxicity in the body and easy to be discharged to the outside.

이에 본 발명자들은 미생물을 이용한 인디고 및 인디루빈의 대량생산에 대해 예의 연구 노력한 결과, 인디칸 대사능을 지닌 자연적인 미생물 균주를 이용하여 재연성이 매우 높은 인디루빈의 효율적인 전환과정을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have made intensive research on the mass production of indigo and indirubin using microorganisms, and have confirmed an efficient conversion process of indirubin having a very high reproducibility using natural microbial strains having indican metabolism. Was completed.

본 발명의 목적은 인디칸으로부터 인디칸 대사능을 지닌 자연적인 미생물 균주를 이용하여 인디루빈의 효율적인 생산방법을 제공하기 위한 것이다.An object of the present invention is to provide an efficient production method of indirubin using a natural microbial strain having indican metabolism from indican.

보다 상세하게는 대장균 K12 또는 C(KCTC 2571)의 야생형 대장균; 및 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 또는 BL21(DE3)의 대장균 변이주;로부터 선택되는 1 종 이상의 대장균(Escherichia coli) 전세포의 호기성 반응에 의한 인디루빈의 생산방법을 제공하기 위한 것이다.More specifically, E. coli K12 or C (KCTC 2571) wild-type E. coli; And E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, E. coli TOP10 or mutants of BL21 (DE3); at least one selected from the E. coli (Escherichia coli ) to provide a method for producing indirubin by aerobic reaction of whole cells.

본 발명은 인디칸으로부터 인디루빈을 생산하는 방법의 어려움과 재현성을 극복하기 위한 것으로, 균주의 제작 및 개량과정에 들어가는 비용을 줄임은 물론 기존에 인돌을 기질로 인디루빈을 생산하는 과정에서 발생하는 불순물을 획기적으로 줄일 수 있고, 생산과 분리공정을 가능케 하는 자연적인 미생물 균주를 이용하는 인디루빈의 생산방법을 제공한다.The present invention is to overcome the difficulty and reproducibility of the method of producing indirubin from indican, while reducing the cost of producing and improving the strain, as well as the existing indole rubbine produced in the process of producing indolebin substrate It provides a method for producing indirubin using natural microbial strains that can dramatically reduce impurities and enable production and separation processes.

본 발명의 인디루빈의 생산방법은 식물 또는 그의 추출물에 포함되어 있는 인디칸으로부터 인디칸 대사능을 지닌 자연적인 미생물 균주인 대장균 전세포를 이용하는 것을 특징으로 한다.The production method of indirubin of the present invention is characterized by using E. coli whole cells, which is a natural microbial strain having indican metabolism from indicans contained in plants or extracts thereof.

본 인디루빈의 생산방법은 대장균 K12 또는 C(KCTC 2571)의 야생형 대장균; 및 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 또는 BL21(DE3)의 대장균 변이주;로부터 선택되는 1 종 이상의 대장균 전세포를 이용하는 것을 특징으로 한다.The production method of this indirubin is E. coli K12 or C (KCTC 2571) wild-type E. coli; And E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or E. coli mutant strains of BL21 (DE3);

본 발명의 인디루빈의 생산방법은 20 내지 40℃의 온도, 7 내지 9의 pH 조건하에서, 20 내지 70 mM Tris-HCl 완충용액, 0.1 내지 10 mM 인디칸 및 0.01 내지 5% 트리톤(Triton)계 계면활성제가 함유된 반응액을 이용하여 호기성 반응을 이용하는 것을 특징으로 한다.The production method of indirubin of the present invention is 20 to 70 ℃ Tris-HCl buffer, 0.1 to 10 mM indican and 0.01 to 5% Triton system at a temperature of 20 to 40 ℃, pH conditions of 7 to 9 It is characterized by using an aerobic reaction using a reaction solution containing a surfactant.

본 발명의 인디루빈의 전환율을 증진시키는 인디루빈의 생산방법은 쪽 식물 또는 그의 추출물에 포함되어 있는 인디칸 함유 반응액에 대장균 전세포를 가하여 인디칸이 인디루빈으로 전환이 완료된 반응액으로부터 대장균을 제거 한 후, 대장균을 더 가하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.The production method of indirubin to improve the conversion rate of indirubin of the present invention is to add E. coli to the indican-containing reaction solution contained in the plant or extracts of E. coli from the reaction solution is complete indikan conversion to indirubin After removing, characterized in that it comprises the step of adding more E. coli.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 대장균(Escherichia coli) 전세포의 호기성 반응에 의한 인디루빈의 생산방법으로서, 상기 대장균을 쪽 식물 또는 그의 추출물에 포함되어 있는 인디칸에 가하여 인디칸을 인디루빈으로 전환시키는 단계를 포함하는, 인디루빈의 생산방법을 제공한다. 도 1을 참조한다.The present invention provides a method for producing indirubin by aerobic reaction of E. coli ( Esherichia coli ) whole cells, comprising the step of adding the E. coli to the indican contained in the plant or extracts thereof, converting the indican to indirubin It also provides a method for producing indirubin. See FIG. 1.

본 발명에 있어서, 상기 대장균은 대장균 K12 또는 C(KCTC 2571)의 야생형 대장균; 및 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 또는 BL21(DE3)의 대장균 변이주;로부터 선택되는 1 종 이상인 것을 특징으로 한다.In the present invention, the E. coli is E. coli K12 or C (KCTC 2571) wild-type E. coli; And E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or BL21 (DE3) Escherichia coli mutant strains.

상기 본 발명의 대장균(Escherichia coli) 전세포는 유전자조작 과정에 이용하기 위해 몇몇 유전자가 결손되어 있지만, 자연적으로 다양한 글루코시다아제 유전자를 지니고 있어 인디칸을 탄소원으로 이용될 수 있는 장점으로, 본 발명에서 중요한 의미를 가진다. Escherichia coli of the present invention coli ) Whole cells are deficient in several genes for use in the genetic engineering process, but naturally have a variety of glucosidase genes that can be used as a carbon source, has an important meaning in the present invention.

보다 상세하게는 옥시게나아제(oxygenase), 디옥시게나아제(dioxygenase)와 같은 다양한 산화 환원 효소를 발현시킨 재조합 균주를 이용하면, 인돌계 화합물의 대사가 가능하다고 알려져 있다. 본 발명에 있어서, 상기 대장균 전세포 즉, 대장균 K12 또는 C(KCTC 2571)의 야생형 대장균을 포함한 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 및 BL21(DE3)의 대장균 변이주는 재조합 과정을 거치지 않더라도 야생형 균주에 존재하는 다수의 산화환원 효소의 일부가 인돌이나 인디칸에 반응을 지닐 수 있음을 단백질 서열 특이성과 추정되는 반응 기작을 통해 유추할 수 있으며, 유전자조작 과정에 이용하기 위해 몇몇 유전자가 결손되어 있지만, 자연적으로 다양한 글루코시다아제 유전자를 지니고 있어 인디칸을 탄소원으로 이용할 수 있다.More specifically, it is known that metabolism of indole compounds is possible by using recombinant strains expressing various redox enzymes such as oxygenase and dioxygenase. In the present invention, E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 and BL21 (DE3) E. coli strains, including the E. coli whole cells, E. coli K12 or C (KCTC 2571) It is possible to infer that some of the redox enzymes present in wild-type strains can react to indole or indican even without the process through protein sequence specificity and presumed reaction mechanisms. Although some genes are missing, naturally having a variety of glucosidase genes, indican can be used as a carbon source.

본 발명의 구현을 위하여 우선 인디칸에 분해능이 있거나, 인디칸을 단일 영양원으로 첨가 했을 때 독립성장이 가능한 균주를 실험실 보유 균주와 균주 분양 기관 등에서 공여 받아 일차 선별하였다. 일차 선별된 모든 균주를 대상으로 인디칸이 포함된 배지에서 액체 배양한 후, 세포를 수확해 잔존하는 인디칸과 배지성분을 제거하였다. 준비된 전세포에 인디칸을 기질로 첨가해 반응을 유도하였을 때, 붉은 빛의 인디루빈과 푸른 빛의 인디고 생성 여부를 육안으로 확인하였고, 다음으로 HPLC 분석을 통해 대상이 되는 균주를 최종 선별하였다. 상기 과정에서, 유전자 조작에 쓰이는 일반적인 대장균이 인디고 생성이 극히 적으며, 인디루빈으로 추정되는 붉은 빛의 화합물을 과량으로 생산하는 것이 확인하였다.For the implementation of the present invention, the strains capable of independent growth when the indican is added or when the indican is added as a single nutrient source were firstly selected by donations from laboratory-owned strains and strain distribution institutions. After culturing liquid in the medium containing indican for all the primary strains, the cells were harvested to remove the remaining indican and medium components. When indican was added to the prepared whole cells as a substrate to induce a reaction, it was visually confirmed whether red indirubin and blue indigo were produced, and finally, the target strain was finally selected through HPLC analysis. In the above process, it was confirmed that the general E. coli used for genetic manipulation produced very little indigo and produced an excessive amount of red light compound, which is assumed to be indirubin.

본 발명에 있어서, 상기 생산방법은 인디칸을 인디고 염료를 전환시키는 단계 후, 대장균을 추가적으로 더 가하는 것을 특징으로 한다.In the present invention, the production method is characterized in that after the step of converting the indican dye indican, E. coli is further added.

본 발명에 있어서, 상기 발효는 20 내지 70 mM Tris-HCl 완충용액, 0.1 내지 10 mM 인디칸 및 0.01 내지 5% 트리톤(Triton)계 계면활성제가 함유된 반응액에서 진행되는 것으로, 20 내지 40℃의 온도, 7 내지 9의 pH 조건하에서 진행되는 것을 특징으로 한다. 도 3 및 도 5를 참조한다.In the present invention, the fermentation proceeds in a reaction solution containing 20 to 70 mM Tris-HCl buffer, 0.1 to 10 mM indican and 0.01 to 5% Triton-based surfactant, 20 to 40 ℃ The temperature is, characterized in that proceeds under a pH of 7 to 9. See FIGS. 3 and 5.

본 발명은 쪽 식물 또는 그의 추출물에 포함되어 있는 인디칸 함유 반응액에 대장균(Escherichia coli) 전세포를 가하여 인디칸을 인디루빈으로 전환시키는 단계; 및 상기 전환이 완료된 반응액으로부터 대장균을 제거 한 후, 대장균을 더 가하는 단계;를 포함하는 인디루빈의 전환율을 증진시키는 인디루빈의 생산방법을 제공한다.The present invention comprises the steps of converting indican to indirubin by adding whole Escherichia coli cells to the indican- containing reaction solution contained in the plant or extract thereof; And removing E. coli from the reaction solution in which the conversion is completed, and further adding E. coli, thereby providing a production method of indirubin.

상기 인디루빈의 전환율을 증진시키는 생산방법은 20 내지 70 mM Tris-HCl 완충용액, 0.1 내지 10 mM 인디칸 및 0.01 내지 5% 트리톤(Triton)계 계면활성제가 함유된 반응액에 대장균을 가하여 인디칸을 인루빈으로 전환시키는 단계; 및 상기 전환이 완료된 반응액으로부터 대장균을 제거 한 후, 대장균을 더 가하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다. The production method for enhancing the conversion of indirubin is added to the reaction solution containing 20 to 70 mM Tris-HCl buffer, 0.1 to 10 mM indican and 0.01 to 5% Triton-based surfactant to the indican Converting to inrubin; And removing E. coli from the reaction solution in which the conversion is completed, and further adding E. coli.

보다 상세하게는 인디칸을 인디고 염료로 전환시키는 과정에 있어, 대장균 전세포가 지닌 효소의 활성이 감소 또는 생성된 인디루빈에 의한 세포독성이 수득되는 인디루빈의 생성량의 변화에 영향을 미침을 확인하고자, 인디루빈 양의 변화가 없는 반응액내의 전세포를 원심분리과정으로 제거한 후, 배양한 전세포를 새로이 첨가해 인디루빈의 추가 생성 여부를 확인해 보았다. 그 결과 전세포를 재 첨가할 경우, 생산량이 2배 정도 증가하는 것을 확인 할 수 있었으며, 반복하여 같은 양의 전세포를 계속해서 재 첨가할 경우 추가적인 인디루빈의 생산이 확인되지 않는 것을 확인할 수 있었다.More specifically, in the process of converting indicans to indigo dyes, it was confirmed that the activity of enzymes contained in all E. coli cells was reduced or the cytotoxicity caused by the produced indirubin influenced the change in the amount of indirubin produced. To remove the whole cells in the reaction solution without a change in the amount of indirubin by centrifugation, and then cultured whole cells were added to check whether the additional production of indirubin. As a result, when re-adding whole cells, the yield increased about 2 times, and it was confirmed that the production of additional indirubin was not confirmed when the same amount of whole cells were repeatedly added again and again. .

따라서 완전한 유전체와 단백질을 지닌 야생형 대장균를 배양해 인디칸과 반응시켜 생성되는 본 발명의 인디루빈의 생산방법은 반복 실험을 통해 재현성을 확인하는 과정과, 반응액내의 붉은 빛의 화합물이 인디루빈과 동일한 물리/화학적 특성을 지님을 확인함으로써, 본 발명의 기본적인 공정을 확립할 수 있었다. Therefore, the production method of indirubin of the present invention produced by culturing wild-type Escherichia coli with a complete genome and protein and reacting with indican is a process of confirming reproducibility through repeated experiments, and the red light compound in the reaction solution is the same as indirubin. By confirming its physical / chemical properties, it was possible to establish the basic process of the present invention.

본 발명에 따른 인디루빈의 생산방법은 천연물질인 쪽 식물에 포함되어 있는 인디칸을 기질로 특정한 유전자로 형질전환되지 않은 대장균과 함께 반응시켜 인디루빈의 생산함으로써 형질전환과 같은 재조합 과정이 필요 없고, 반응에 대장균의 전세포(whole cell)를 이용하기 때문에 효소를 이용하는 다른 공정에 비해 반응 공정이 간단한 장점이 있다.The method for producing indirubin according to the present invention does not require a recombination process such as transformation by producing indirubin by reacting indican contained in a natural plant with E. coli which is not transformed with a specific gene as a substrate. For example, since the whole cell of E. coli is used for the reaction, the reaction process is simpler than other processes using enzymes.

또한 인디루빈의 생산에 있어, 불순물의 생산이 적어 분리 및 정제가 쉬운 장점을 가지며, 천연물질 유래의 인디칸을 기질로 이용하기 때문에 인체에 적용 가능한 화장품과 의약품 산업에 직접 활용이 가능한 장점이 있다.In addition, in the production of indirubin, it has the advantage of easy to separate and purify due to the low production of impurities, and has the advantage that it can be directly used in the cosmetics and pharmaceutical industry applicable to the human body because it uses indican derived from natural substances as a substrate. .

도 1은 본 발명에 따른 인디루빈의 생산공정의 모식도를 보여주는 것이고,
도 2는 본 발명의 제조방법과 기존의 형질전환 대장균을 이용한 제조방법에 따른 인디루빈의 생산을 비교한 결과이며,
(A:형질전환 대장균을 이용한 제조방법, B: 본 발명의 대장균 전세포를 이용한 제조방법)
도 3은 본 발명의 인디루빈 생산방법에 있어 pH 변화에 따른 인디루빈의 생성능을 비교한 결과이고,
도 4는 본 발명의 다양한 대장균에 따른 인디루빈의 생성능을 비교한 결과이며,
도 5는 동일 조건에서 본 발명의 대장균 및 진화적으로 밀접한 살모넬라의 인디루빈의 생성정도를 비교한 결과이고,
도 6은 본 발명의 인디루빈 생산방법에 있어 온도 변화에 따른 인디루빈의 생성능을 비교한 결과이며,
도 7은 본 발명의 제조방법에 따른 생성물이 인디루빈임을 확인한 결과를 보여주는 것이다.
(A:HPLC, B: H-NMR)Figure 1 shows a schematic diagram of the production process of indirubin according to the present invention,
Figure 2 is a result of comparing the production of indirubin according to the production method using the production method of the present invention and transformed E. coli,
(A: production method using transformed E. coli, B: production method using whole E. coli cells of the present invention)
3 is a result of comparing the production ability of indirubin according to the pH change in the indirubin production method of the present invention,
4 is a result of comparing the production ability of indirubin according to various E. coli of the present invention,
5 is a result of comparing the production of E. coli and evolutionarily close Salmonella indirubin of the present invention under the same conditions,
Figure 6 is a result of comparing the production ability of indirubin according to the temperature change in the indirubin production method of the present invention,
Figure 7 shows the result confirming that the product according to the production method of the present invention is indirubin.
(A: HPLC, B: H-NMR)

본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.The invention is explained in more detail by the following examples. However, the following examples are only intended to help the understanding of the present invention, and the scope of the present invention in any sense is not limited by these examples.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.Hereinafter, the technical and scientific terms used herein will be understood by those skilled in the art without departing from the scope of the present invention. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily blurred are omitted.

[[ 실시예Example 1] 대장균을 이용한 1] using E. coli 인디루빈Indirubin 생성능Generation 조사 Research

선별과정에서 인디칸 전환반응을 보인 야생형 대장균의 인디루빈 생성 확인을 위한 균주로는 일반적인 숙주로서 폭 넓게 이용되며, 대장균 K12 또는 C(KCTC 2571)의 야생형과 매우 밀접한 E. coli XL1-blue를 이용하였다. 기존 공정을 채용한 대조군으로는 동일한 균주에 베타 글로시디사제(β-glucosidase)와 옥시게네이즈(oxygenase)가 형질전환 된 재조합 균주를 이용하였다.A strain for confirming indirubin production of wild-type Escherichia coli that exhibited indican conversion during the screening process is widely used as a general host, and E. coli XL1-blue, which is very close to the wild type of Escherichia coli K12 or C (KCTC 2571), is used. It was. As a control group employing the existing process was used a recombinant strain transformed beta-glucosidase (β-glucosidase) and oxygenase (oxygenase) in the same strain.

대장균은 37℃ 항온 배양기와 진탕 배양기를 이용하여 하기와 같은 방법을 통해 배양하였다. LB 고체배지에 상기 균주들을 각각 접종한 후, 12 내지 16시간이 경과해 형성된 콜로니를 LB 액체 배지에서 OD600 값이 0.7 내지 1.0 이 될 때까지 전배양 하였다. 상기 전배양된 균주를 1 내지 2%(v/v) 비율로 새로운 배지에 재접종해, OD600 값이 2.5 내지 2.7 이 되는 시점에서 원심분리(3500 rpm, 10분)로 세포를 수득하였다. 상기 수득된 대장균을 식염수로 2회 세척한 후, 반응액(50 mM Tris-HCl, 1 mM indican, 1% triton x-100)에 첨가하였다. Escherichia coli was cultured by the following method using a 37 ° C incubator and shaking incubator. After inoculating the strains into the LB solid medium, colonies formed after 12 to 16 hours were preincubated in the LB liquid medium until the OD600 value was 0.7 to 1.0. The precultured strains were re-inoculated in fresh medium at a rate of 1 to 2% (v / v) to obtain cells by centrifugation (3500 rpm, 10 minutes) at an OD600 value of 2.5 to 2.7. The obtained E. coli was washed twice with saline, and then added to the reaction solution (50 mM Tris-HCl, 1 mM indican, 1% triton x-100).

대장균 전세포의 호기성 반응은 37℃ 진탕 배양기(225 rpm)를 이용하여 호기적 조건에서 약 3일 동안 진행하였다. 붉은 빛의 인디루빈 화합물이 생성되고, 더 이상 증가하지 않는 시점(3일)에서 원심분리기를 이용하여 세포와 잔존물이 제거된 붉은 빛의 상층액만 회수하였다. The aerobic reaction of all E. coli cells was carried out for about 3 days in aerobic conditions using a 37 ℃ shaking incubator (225 rpm). When the red indirubin compound was produced and no longer increased (3 days), only the red supernatant from which the cells and the residue were removed was recovered using a centrifuge.

그 결과 도 2에서도 확인할 수 있듯이, 붉은 빛의 인디루빈은 과량 생성되는 것을 확인할 수 있었고, 인디고의 생산은 극히 적어 육안으로는 측정이 되지 않는 것을 확인할 수 있었다. 대조군인 재조합 균주의 경우, 동일한 조건에서 인디고가 과 생산되고 인디루빈의 생성량은 극히 적은 기존 공정의 문제점을 보여주었다. As a result, as can be seen in Figure 2, it was confirmed that the indirubin of red light is produced excessively, the production of indigo was very small, it was confirmed that the naked eye can not be measured. In the case of the recombinant strain as a control, indigo was overproduced under the same conditions, and the production of indirubin showed a problem of the existing process with very little.

상기 회수된 상층액내의 유기 고분자(단백질과 핵산등)와 다른 불순물은 중탕조건에서 열처리(boiling)로 제거하였다. 이때, 상층액내의 붉은 빛은 물중탕 과정(약 20분)을 거치면 아래로 침전된다. 붉은 색소층은 남기고 변성된 단백질과 다른 불순물은 피펫이나 진공펌프(vacumn pump)를 이용하여 완전히 제거하였다. 다음 단계로 붉은 색소층 내의 단백질과 다른 불순물은 원심분리를 통해 제거하고, 상등액을 적정량의 물이나 완충액에 녹인 후, HPLC를 이용해 최종 분리하였다.The organic polymer (protein, nucleic acid, etc.) and other impurities in the recovered supernatant were removed by heat treatment (boiling) in a bath. At this time, the red light in the supernatant is settled down through the water bath process (about 20 minutes). Leaving the red pigment layer, denatured protein and other impurities were completely removed using a pipette or vacuum pump. In the next step, proteins and other impurities in the red pigment layer were removed by centrifugation, the supernatant was dissolved in an appropriate amount of water or buffer, and finally separated using HPLC.

분리조건은 다음과 같다; mobile phage(60% Acetonitrile), column(C18 shim-pack PREP-ODS (H) Kit), flow rate(1 ㎖/min), oven temperature(35℃), detector wave length(552 nm). 인디루빈은 대략 8.5 min 의 채류시간에서 단일 피크로 분리되었고, 프렉숀콜렉터(Fraction collector)로 회수한 용액을 진공 증착기(vacuum evaporator)를 이용해 증발시켜 파우더 형태의 인디루빈을 수득하였다.The separation conditions are as follows; mobile phage (60% Acetonitrile), column (C18 shim-pack PREP-ODS (H) Kit), flow rate (1 ml / min), oven temperature (35 ° C.), detector wave length (552 nm). Indirubin was separated into a single peak at a holding time of approximately 8.5 min, and the solution recovered by the Fraction Collector was evaporated using a vacuum evaporator to obtain indirubin in powder form.

[[ 실시예Example 2] 대장균을 이용한 2] using E. coli 인디루빈Indirubin 최적 생산조건 조사 Optimal production condition investigation

자연계에 존재하는 여러 미생물의 표현 형질과 세포 안의 효소 활성은 주위의 온도, pH 등의 주변 환경에 따라 그 활성이 달라질 수 있다. 몇몇 효소의 경우 효소 주변의 다양한 매개변수에 따라 그 구조나 기능이 달라지기도 하며, 2차 활성과 같이 정상적인 환경에서는 나타나지 않던 활성이 검출되기도 한다. 이러한 세포와 효소의 특성은 대장균에서도 일반적인 현상임으로, 인디루빈이 과량으로 생성될 수 있는 최적의 조건을 찾기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. Expression traits of various microorganisms present in nature and enzyme activity in cells may vary depending on the surrounding environment such as ambient temperature and pH. Some enzymes have different structures or functions depending on various parameters around the enzyme. Some enzymes may detect activities that did not appear in normal environments, such as secondary activity. Since the characteristics of these cells and enzymes are common in Escherichia coli, the following experiments were conducted to find the optimal conditions for the production of excess indirubin.

(1) (One) pHpH 조건을 달리한 반응액에서 In the reaction solution under different conditions 인디루빈Indirubin 생성양Amount 비교 compare

반응액에는 대장균이 지닌 효소에 기질의 접근이 용이하도록 소량의 계면활성제(0.01 내지 5% Triton x-100)를 포함시켰다. 실험에 사용한 반응액의 조성은 50mM Tris-HCl에 Triton 1%, pure indican 1 mM이 되도록 하였고, 반응액의 다양한 pH의 조건에서 반응 시켰을 때 인디루빈의 생성양은 조사하였다.The reaction solution contained a small amount of surfactant (0.01 to 5% Triton x-100) to facilitate access of the substrate to the enzyme of E. coli. The composition of the reaction solution used in the experiment was 50% Tris-HCl in Triton 1%, pure indican 1 mM, and the amount of indirubin was investigated when the reaction solution was reacted at various pH conditions.

그 결과 도 3에서 확인할 수 있듯이 pH 7.5 내지 8.5 사이에서 인디루빈이 과량 생성되며, 특히 8.0에서 가장 많은 양이 생성됨을 확인할 수 있었다.As a result, as can be seen in Figure 3 it was confirmed that the excess amount of indirubin is generated between pH 7.5 to 8.5, in particular the most amount is generated in 8.0.

(2) 다른 종의 대장균과 유사 종을 이용한 (2) using other strains of E. coli and similar species 인디루빈Indirubin 생산능Productivity 비교 compare

실험실에서 주로 형질전환의 용도로 사용되어지는 대장균 XL1-Blue를 반응 액과 인디칸을 넣어 함께 반응시키면 특정 pH에서 인디루빈이 과량 생성되는 것을 확인할 수 있다. 하지만 XL1-Blue의 경우 유전자 조작에 적합하도록 몇몇 유전자를 넉 아웃(knock out)시켜 제작하였기 때문에, 실제 야생형 대장균과는 유전형질과 표현형질이 조금 다르다. When E. coli XL1-Blue, which is mainly used for transformation in a laboratory, is reacted with a reaction solution and an indican, it can be confirmed that excess indirubin is produced at a specific pH. However, in the case of XL1-Blue, some genes were knocked out to be suitable for genetic manipulation, so the genotype and phenotype are slightly different from those of E. coli.

따라서 다른 종의 대장균에서의 인디루빈 생성능을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다. 주변에서 쉽게 구할 수 있는 대장균 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 및 BL21(DE3) 변이주를 상기한 조건으로 배양한 후, XL1-Blue에서 확립한 조건과 동일하게 반응액(pH 7.5 와 8.0)을 준비해 인디루빈 생성능을 확인하였다. Therefore, the following experiment was performed to confirm the ability of indirubin generation in E. coli of other species. E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10, and BL21 (DE3) mutants, which are readily available in the surroundings, were cultured under the above conditions, and then the reaction solution was the same as the conditions established in XL1-Blue. (pH 7.5 and 8.0) were prepared to confirm the ability to produce indirubin.

그 결과 도 4에서 확인할 수 있듯이, 다소 약간의 차이는 있지만, B strain인 BL21을 제외하고 다른 K-12 계열의 대장균 변이들에서는 일정 수준 이상의 인디루빈이 생성되는 것을 확인하였다. 동일한 실험 방법으로 대장균 야생형 균주인 K-12 strain 과 C strain(KCTC 2571)을 이용한 실험에서도 같은 결과를 확인할 수 있었다. As a result, as can be seen in Figure 4, there is a slight difference, but it was confirmed that more than a certain level of indirubin is produced in other K-12 strains of E. coli except for B21 strain B21. By the same experimental method, the same result was confirmed in the experiment using the E. coli wild-type strain K-12 strain and C strain (KCTC 2571).

또한 대장균과 비슷한 생리 활성을 지닌 야생형 살모넬라(Salmonella) 균주를 이용하여 동일한 실험을 진행한 결과, 도 5에서도 확인할 수 있듯이, 대장균에 비해 매우 적은 양으로 인디루빈이 생성되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기한 K-12 계열의 대장균 E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 및 BL21(DE3)의 변이주에서 인디루빈을 생산할 수 있음을 확인한 결과이도 하다. 그러나 상기 대장균 전세포를 제외한 다른 균주에서는 인디루빈이 극 소량만이 생성되거나 검출되지 않는 것으로 최종 확인하였다. In addition, as a result of the same experiment using a wild-type Salmonella strain having a physiological activity similar to Escherichia coli, as can be seen in Figure 5, it was confirmed that indirubin is produced in a very small amount compared to Escherichia coli. These results are also confirmed that the indirubin can be produced in the mutant strains of the above K-12 series of E. coli E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 and BL21 (DE3). However, it was finally confirmed that only a very small amount of indirubin was not produced or detected in other strains except the E. coli whole cells.

상기의 결과로부터 비특이적 반응이나 다른 요소에 의해 인디루빈이 생성되는 것이 아니라 야생형 대장균을 포함한 모든 K-12 종과 C 종의 변이주가 우수한 인디루빈의 생성능을 가짐을 확인할 수 있어, 균주의 제작 및 개량과정에 들어가는 비용을 줄일 수 있음을 물론 효율적으로 고순도의 인디루빈을 과량 생산할 수 있음을 확인한 결과이기도 하다.From the above results, it was confirmed that indirubin was not produced by nonspecific reactions or other factors, but that all K-12 and C strains including wild-type Escherichia coli had excellent ability to produce indirubin. In addition to reducing the cost of the process, it was also confirmed that it can efficiently over-produce high purity indirubin.

(3) 반응 온도에 따른 (3) according to the reaction temperature 인디루빈Indirubin 생성량 비교 Generation amount comparison

여러 유형의 미생물들은 각각 고유의 생장 가능한 온도 범위와 생장 최적 온도를 갖는다. 이는 온도가 미생물의 생장에 큰 영향을 미치기 때문인데, 대표적인 예로 온도가 높아지면 세포 내 화학/효소 반응이 보다 빠른 속도로 이루어져 생장이 빨라지는 것으로 확인되어 진다. 하지만 온도가 적정한 범위를 벗어날 경우, 열에 민감한 단백질과 핵산의 변성으로 인해 생장이 급속도로 감소하며 결국은 사멸로 이어진다. 따라서 인디루빈 생산에 참여하는 대장균 전세포 효소들의 최적온도 조건을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. Different types of microorganisms each have their own growth range and optimum growth temperature. This is because the temperature has a great influence on the growth of microorganisms. For example, when the temperature increases, the growth of the chemical / enzyme reaction in the cell is faster and the growth is faster. However, if the temperature is outside the proper range, growth is rapidly reduced due to the degeneration of heat-sensitive proteins and nucleic acids, eventually leading to death. Therefore, an experiment was carried out to determine the optimal temperature conditions of E. coli whole cell enzymes participating in indirubin production.

세포의 배양과 반응액의 조성은 전술한 상기 실시예와 동일하게 준비하였고, 진탕 배양기의 온도만 달리하며 인디루빈 생성양을 비교하였다.The culture of the cells and the composition of the reaction solution were prepared in the same manner as in the above-described example, and only the temperature of the shaking incubator was changed to compare the amount of indirubin production.

그 결과 도 6에서 확인할 수 있듯이, 37℃ 근처의 온도에서 가장 많은 양의 인디루빈이 생성되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 반응에 이용하는 효소원이 전세포임으로, 최적 성장 조건과 유사한 온도에서 최적화된 효소반응이 나타나는 결과이기도 하다.As a result, as can be seen in Figure 6, it was confirmed that the largest amount of indirubin is produced at a temperature near 37 ℃. These results indicate that the enzyme source used for the reaction is whole cells, and thus, the optimized enzyme reaction appears at a temperature similar to the optimum growth conditions.

[[ 실시예Example 3] 다양한 배지에서 배양된 대장균 3] Escherichia coli cultured in various media XL1XL1 -- BlueBlue 의 of 인디루빈Indirubin 생산능Productivity 조사 Research

같은 종의 대장균이라고 하더라도 배지의 조성에 따라 성장하는 속도와 특정 단백질의 발현유도 혹은 억제에 따른 표현 형질은 다르게 나타난다. 이는 환경인자나 영양소에 따라 이를 이용하기 위해 발현시키는 단백질과 반응에 이용하기 위한 효소의 조성비, 더 나아가서는 반응 경로도 달라질 수 있기 때문이다. Even in the same species of E. coli, the growth rate and the expression trait according to the expression induction or inhibition of a specific protein are different depending on the composition of the medium. This is because, depending on the environmental factors or nutrients, the composition ratio of the protein to be used for the use and the enzyme to be used for the reaction, and moreover, the reaction route may also vary.

본 발명에서도 대장균의 내재된 효소활성을 이용하므로 배지조성이 달라졌을 때, 인디루빈의 생성에 관여하는 효소 활성이 달라질 수 있다. 이를 확인하기 위해 각기 다른 성분을 지닌 배지에서 배양한 XL1-Blue를 pH 8.0 의 반응액에 첨가하여 인디루빈 생성 정도를 비교하였다. 대장균의 배양은 LB(10 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl), SOB(20 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 0.5 g NaCl, 10 mM MgCl₂), SOC(20 mM glucose, 20 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 0.5 g NaCl, 10 mM MgCl₂), 2xYT(16 g bacto tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl), TB(12 g bacto tryptone, 24 g yeast extract, 4 ㎖ glycerol) 배지에서 전술한 과정과 동일하게 실시하였다. 붉은 색의 인디루빈의 생성양이 최대가 되는 시점에서 반응을 종료한 후, 생성된 인디루빈과 인디고의 양을 측정하였다. In the present invention, since the intrinsic enzyme activity of E. coli is used, when the composition of the medium is changed, the enzyme activity involved in the production of indirubin may be changed. In order to confirm this, XL1-Blue cultured in a medium having different components was added to the reaction solution of pH 8.0 to compare the degree of indirubin production. Escherichia coli cultures were LB (10 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 10 g NaCl), SOB (20 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 0.5 g NaCl, 10 mM MgCl ₂ ), SOC (20 mM glucose, 20 g bacto tryptone, 5 g yeast extract, 0.5 g NaCl, 10 mM MgCl ₂ ), 2xYT (16 g bacto tryptone, 10 g yeast extract, 5 g NaCl), TB (12 g bacto tryptone, 24 g yeast extract, 4 ml glycerol) in the same manner as described above. After the reaction was terminated when the amount of red indirubin was maximized, the amount of indirubin and indigo produced was measured.

그 결과 인디루빈의 경우, 2xYT > SOB > LB > TB > SOC 배지에서 배양한 순서대로 과생성되었고, 인디고는 TB > SOC > SOB > 2xYT > LB 순서대로 측정양이 감소하였다. 상기의 결과는 인디루빈 생산에 보다 적합한 배지 조성을 만든 뒤, 탄소원이며 발현유도제로 기능할 수 있는 인디칸을 추가로 공급하면, 보다 많은 양의 인디루빈 생산이 가능한 대장균 전세포를 확보할 수 있음을 보여주는 결과이기도 하다.As a result, indirubin was overproduced in 2xYT> SOB> LB> TB> SOC medium, and indigo decreased in the order of TB> SOC> SOB> 2xYT> LB. The above results indicate that by making a more suitable medium composition for indirubin production, and supplying additional indica which is a carbon source and can function as an expression inducing agent, it is possible to obtain E. coli whole cells capable of producing a greater amount of indirubin. This is also the result.

[[ 실시예Example 4] 4] 전세포의Whole cell 재 첨가에In addition 의한 by 인디루빈Indirubin 생산능Productivity 조사 Research

인디칸과 대장균 전세포를 함께 반응시켜 인디루빈을 생산할 때 생성된 인디루빈의 양은 기질이 모두 전환되어 생성될 수 있는 양의 1/10 수준으로 확인되었다. 이는 세포가 지닌 효소의 활성이 감소해 더 이상 반응이 진행되지 않는 이유이거나 생성된 인디루빈에 의한 세포독성과 관련이 있을 것으로 추정되었다. 전자가 원인을 경우, 반응이 중단되어 더 이상의 인디루빈이 생성되지 않는 1차 반응액에서 세포를 제거한 후, 새로 배양한 전세포를 첨가할 경우 추가적인 생산이 가능할 것이다. 따라서 인디루빈 양의 변화가 없는 반응액내의 전세포를 원심분리과정으로 제거한 후, 배양한 전세포를 새로이 첨가해 인디루빈의 추가 생성 여부를 확인해 보았다. When the indican and the whole E. coli cells were reacted together to produce indirubin, the amount of indirubin produced was found to be about one-tenth the amount that all substrates could be converted. This may be due to a decrease in the activity of the enzyme in the cell and no further reaction, or possibly related to the cytotoxicity caused by the indirubin produced. If the former is the cause, the reaction is stopped and the cells are removed from the primary reaction solution where no further indyrubin is produced, and then additional production of whole cultured cells will be possible. Therefore, after removing the whole cells in the reaction solution with no change in the amount of indirubin by centrifugation process, the newly cultured whole cells were added to check whether additional inirubin was produced.

그 결과 하기 표 1에서 확인할 수 있듯이 대장균 전세포를 재 첨가할 경우, 생산량이 2배 정도(기질 대비 인디루빈 생성비는 약 1/6 수준)늘어나는 것을 확인할 수 있었으나 같은 과정을 반복하여 전세포를 재 첨가한 반응에서는 추가적인 인디루빈의 생산이 확인되지 않았다.As a result, as shown in Table 1 below, when the whole E. coli whole cells were added again, the yield increased by about 2 times (the indirubin generation ratio relative to the substrate was about 1/6 level), but the whole process was repeated by repeating the same process. Re-added reactions did not confirm the production of additional indirubin.

인디루빈에 의한 세포독성, 특히 산물 저해현상(product inhibition)에 관련된 생성 효과를 부분적으로 확인하기 위해 재첨가 과정의 전세포 양을 2배로 늘려 실험한 결과, 16 ug/ml 수준으로 인디루빈이 생성되는 것을 확인하였다. 상기의 결과는 초기에 첨가한 인디칸의 1/3 수준으로, 순환을 통한 신선한 반응액과 대장균 전세포의 공급, 인디루빈의 회수를 통한 산물제거 현상을 해결할 경우 보다 과량의 인디루빈 생산이 가능함을 확인한 결과이기도 하다. In order to partially confirm the production effects related to cytotoxicity caused by indyrubin, in particular product inhibition, the result of experiment was to double the total cell volume of the re-addition process to produce 16 inug / ml. It confirmed that it became. The above result is about 1/3 of the initially added indican, and it is possible to produce more excess indirubin when solving the product removal phenomenon through the supply of fresh reaction solution and whole E. coli cells through the circulation and recovery of indirubin. This is also the result of checking.

[실시예 5] HPLC와 진공 증착기를 이용한 분리 정제 및 H-NMR 분석Example 5 Separation Purification and H-NMR Analysis Using HPLC and Vacuum Evaporator

인디루빈은 분자량 262.3의 C₁₆H₁₀N₂O₂ 으로 이루어진 화합물로 완전히 건조시키면 보라색 파우더 형태가 된다. DMSO(10 mg/ml)와 메탄올(0.3 mg/ml)과 같은 친수성 용매에 잘 녹으며, 순수한 물에는 소량(12.5 ug/ml)만이 용해된다. 빛에 민감해 장기간 보관을 위해서는 파우더 형태로 냉장 보관하는 것이 유리하다고 알려져 있다. 이러한 특성이 본 발명의 인디루빈과 일치하는지 확인하기 위한 실험을 진행하였다. Indirubin is a compound consisting of C ₁₆ H ₁₀ N ₂ O ₂ , having a molecular weight of 262.3, which when dried completely forms a purple powder. Soluble in hydrophilic solvents such as DMSO (10 mg / ml) and methanol (0.3 mg / ml), and only a small amount (12.5 ug / ml) is dissolved in pure water. It is known to be refrigerated in powder form for long-term storage because it is sensitive to light. An experiment was conducted to confirm whether these characteristics are consistent with the indirubin of the present invention.

인디루빈의 순수분리 과정은 상기 실시예의 인디루빈의 회수 방법을 이용하였다. 간략히 살펴보면, 반응이 종료된 반응액을 짧은 시간동안 중탕(약 20분)하여 세포 찌꺼기와 단백질의 변성을 유도한 후 원심분리를 통해 제거하고, 분획된 상등액을 C18 컬럼이 장착된 HPLC를 이용하여 분획한다. 이후에 진공 증착기(vacuum evaporator)를 이용하여 분리 과정에 사용한 용매를 제거하였다. 준비된 시료를 표준 인디루빈 시료와 동량으로 같은 조건의 용매에 녹여 비교하였다. The pure separation process of indirubin was used to recover the indirubin of the above embodiment. In brief, the reaction solution was completed by agitation (about 20 minutes) for a short time to induce cell debris and protein denaturation, and then removed by centrifugation, and the fractionated supernatant was purified using a HPLC equipped with a C18 column. Fraction. Thereafter, a solvent used in the separation process was removed using a vacuum evaporator. The prepared samples were compared by dissolving them in the same conditions in the same amount as the standard indirubin sample.

그 결과 도 7에서 확인할 수 있듯이 HPLC와 MS, NMR을 통해 분석하였을 때, 각각 동일한 머무름 시간(Retension time)과 분자량, 원자 공명 특성 피크를 보임으로써 야생형 대장균으로부터 생성된 반응 산물이 인디루빈임을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 과정을 통해 확인된 인디루빈 생산 수율은 기질 대비 36 내지 40%였으며, 인디고 블루는 육안으로나 기계적으로 극히 미미한 정도(<1%)만이 생산되는 것을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 7, when analyzed by HPLC, MS, and NMR, the same reaction time, molecular weight, and atomic resonance peaks showed the same reaction products generated from wild-type E. coli, respectively. there was. In addition, the indirubin production yield confirmed through this process was 36 to 40% of the substrate, and indigo blue was able to confirm that only a very small amount (<1%) was produced visually and mechanically.

Claims

E. coli ( Esherichia coli ) A method for producing indirubin by aerobic reaction of whole cells, comprising the step of converting the indican to indirubin by adding the E. coli to the indican contained in the plant or its extract, E. coli Whole cells were E. coli K12 or C (KCTC 2571) wild-type E. coli; Or mutant E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or BL21 (DE3);

The method of claim 1,
The production method is a method for producing indirubin, characterized in that further adding E. coli after the step of converting indican to indirubin.

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The method of claim 1,
The E. coli is E. coli K12 or C (KCTC 2571) wild-type E. coli; Or one or more Escherichia coli whole cells selected from mutant E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or BL21 (DE3) in 2xYT, SOB, LB, TB, SOC medium. Method for producing indirubin, characterized in that the use.

The method of claim 1,
The reaction is performed in a reaction solution containing 20 to 70 mM Tris-HCl buffer, 0.1 to 10 mM indican and 0.01 to 5% Triton-based surfactant.

The method of claim 4, wherein
The reaction is a method for producing indirubin, characterized in that the temperature is carried out under a temperature of 20 to 40 ℃, pH of 7 to 9.

The indican-containing reaction solution contained in the side plants or extracts thereof is E. coli XL1-blue, JM104, DH5alpha, SURE, JM104, TOP10 or BL21 (DE3) of E. coli K12 or C (KCTC 2571). Converting indican to indirubin by adding at least one Escherichia coli whole cell; And removing E. coli from the reaction solution in which the conversion is completed, and further adding E. coli, wherein the conversion rate of indirubin is improved.

The method of claim 7, wherein
The production method is a step of converting the indican to indirubin by adding E. coli to the reaction solution containing 20 to 70 mM Tris-HCl buffer, 0.1 to 10 mM indican and 0.01 to 5% Triton-based surfactant ; And removing E. coli from the reaction solution in which the conversion is completed, and further adding E. coli, wherein the conversion rate of indirubin is improved.

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