KR20200145076A - Method for preparing indoleninone and method for preparing indirubin derivatives through the synthesis of indoleninone - Google Patents

Method for preparing indoleninone and method for preparing indirubin derivatives through the synthesis of indoleninone Download PDF

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Abstract

The present invention provides a novel method for biologically manufacturing an indirubin derivative. In addition, the present invention provides indoleninone, which is an important intermediate in biologically preparing the indirubin derivative, and provides a novel method for manufacturing indoleninone. The present invention is differentiated from previous studies in that it first presented the method for biological synthesis of the indirubin derivative.

Description

인돌렌인온의 제조 방법 및 인돌렌인온 합성을 통한 인디루빈 유도체의 제조 방법 {Method for preparing indoleninone and method for preparing indirubin derivatives through the synthesis of indoleninone}Method for preparing indoleninone and method for preparing indirubin derivatives through indoleninone synthesis {Method for preparing indoleninone and method for preparing indirubin derivatives through the synthesis of indoleninone}

본 발명은 생물학적으로 인디루빈 유도체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 생물학적으로 인디루빈 유도체를 제조함에 있어서, 중요 중간체인 인돌렌인온을 제조하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a method of biologically preparing an indirubin derivative. In addition, the present invention relates to a method for preparing indoleninone, an important intermediate in preparing an indirubin derivative biologically.

인디루빈은 한방에서 만성 백혈병에 처방되는 당귀 (Danggui Longhui Wan) 에서 발견된 항암 물질이다. 인디루빈은 사이클린 의존성 인산화 효소 (cycline-dependent kinase, CDK) 를 비롯해 세포주기 조절에 관여하는 단백질의 억제제로 작용하여 항암효과가 있다고 밝혀졌다. 임상실험에서도 인디루빈이 심각한 부작용 없이 질병 완화에 효과적이었다고 발표되었다. 최근에는 인디루빈의 효능과 용해도를 향상시키기 위해, 인디루빈 유도체의 화학적 합성과 물성 평가가 진행되고 있다. 또한, 2 개의 서로 다른 인돌 고리로 구성된 인디루빈 유도체가 같은 인돌 고리로 구성된 인디루빈보다도 항암 효과가 더 우수하다고 보고된 바 있다 (비특허문헌 1 ~ 3). Indirubin is an anti-cancer substance found in Danggui Longhui Wan , which is prescribed for chronic leukemia in oriental medicine. Indirubin has been shown to have anticancer effects by acting as an inhibitor of proteins involved in cell cycle regulation, including cycline-dependent kinase (CDK). In clinical trials, it was also reported that indirubin was effective in alleviating disease without serious side effects. Recently, in order to improve the efficacy and solubility of indirubin, chemical synthesis and physical property evaluation of indirubin derivatives have been conducted. In addition, it has been reported that indirubin derivatives composed of two different indole rings have better anticancer effects than indirubin composed of the same indole ring (Non-Patent Documents 1 to 3).

약리학적 활성을 갖는 인디루빈 유도체를 선택적으로 합성하기 위해 많은 화학적 합성법이 개발되었다. 인디루빈은 2 개의 인돌 고리로 구성된 비스인돌 화합물이다. 가장 간단한 방법은 이사틴 (isatin) 을 환원제와 섞어 반응을 시키는 것이다. 그러나 이러한 합성법으로는 인디루빈을 구성하는 2 개의 인돌 고리가 동일한 유도체를 지니게 된다. Many chemical synthesis methods have been developed to selectively synthesize indirubin derivatives having pharmacological activity. Indirubin is a bisindole compound composed of two indole rings. The simplest way is to mix isatin with a reducing agent to react. However, with this synthesis method, the two indole rings constituting indirubin have the same derivative.

2 개의 서로 다른 인돌 고리로 구성된 인디루빈 유도체를 합성하기 위해서는 각각의 인돌 고리 유래를 다르게 만들어 반응을 진행한다. 공통적으로 벤젠 화합물로부터 합성한 3-인독실 아세테이트 (3-indoxyl acetate) 유도체와 이사틴 유도체, 그리고 적합한 촉매를 섞어 2 개의 다른 인돌 고리로 구성된 인디루빈 유도체를 합성한다. In order to synthesize an indirubin derivative composed of two different indole rings, the reaction proceeds by making the origin of each indole ring differently. Commonly, a 3-indoxyl acetate derivative synthesized from a benzene compound, an isatin derivative, and an indirubin derivative composed of two different indole rings are synthesized by mixing a suitable catalyst.

인디루빈을 구성하는 2 개의 인돌 고리가 상이한 인디루빈 유도체의 화학적 합성 방법이 알려져 있다 (특허문헌 1). 그러나, 화학적 합성법은 많은 반응 단계를 필요로 하기 때문에, 녹색화학 (green chemistry) 을 실현하지 못한다는 문제점이 있다. A chemical synthesis method of an indirubin derivative having two different indole rings constituting indirubin is known (Patent Document 1). However, since the chemical synthesis method requires many reaction steps, there is a problem in that it cannot realize green chemistry.

한편, 생물학적 인디루빈 합성은 인돌 고리를 가진 아미노산인 트립토판 (tryptophan) 에서 시작한다 (특허문헌 2). 식물에서는 인디칸 (indican) 으로부터 인디루빈이 합성된다고 알려져 있다 (특허문헌 3). 생산 공정 측면에서 식물보다 시간과 자본이 절약되는 미생물에서도 인디루빈 합성이 시도된 바 있다 (특허문헌 4). On the other hand, biological indirubin synthesis begins with tryptophan, an amino acid having an indole ring (Patent Document 2). In plants, it is known that indirubin is synthesized from indican (Patent Document 3). In terms of production process, indirubin synthesis has been attempted in microorganisms that save time and capital compared to plants (Patent Document 4).

그러나, 생물학적 인디루빈 합성법은 인디루빈의 합성에 머무르고 있다. 또한, 생물학적 인디루빈 합성법의 문제는 구조 이성질체인 인디고 합성이 인디루빈보다 선호된다는 점이다. 인디고와 인디루빈 모두의 전구체 물질인 인독실은 불안정하여 자연 산화 및 이합체화를 통해 쉽게 인디고가 된다. 인디루빈은 인독실이 2-옥스인돌 (2-oxindole) 또는 이사틴 (isatin) 과 반응하여 만들어지는데 인독실의 자연산화로 인해 합성이 저해된다. However, the biological indirubin synthesis method remains in the synthesis of indirubin. In addition, a problem with the biological indirubin synthesis method is that indigo synthesis, which is a structural isomer, is preferred over indirubin. Indoxyl, a precursor of both indigo and indirubin, is unstable and easily becomes indigo through natural oxidation and dimerization. Indirubin is made by reacting indoxyl with 2-oxindole or isatin, and its synthesis is inhibited due to natural oxidation of indoxyl.

트립토판 과생산 재조합 대장균에 모노옥시게네이스를 발현시키고 최적화를 통해 인디루빈을 생산하였다고 보고된 바 있다 (비특허문헌 4). 그러나 이는 인디루빈 선택적 생산에 실패했다. It has been reported that monooxygenase was expressed in tryptophan-overproducing recombinant E. coli and indirubin was produced through optimization (Non-Patent Document 4). However, it failed to selectively produce indirubin.

또한, 최근 플라빈 함유 모노옥시게네이스를 이용한 대장균의 배양액에 시스테인을 첨가하여 인디고 합성을 줄이고 인디루빈에 집중된 생물학적 공정을 개발하였다고 보고된 바 있다 (비특허문헌 5). In addition, it has recently been reported that cysteine was added to the culture medium of Escherichia coli using flavin-containing monooxygenase to reduce indigo synthesis and develop a biological process focused on indirubin (Non-Patent Document 5).

하지만 아직 구체적인 원리가 밝혀진바 없으며 최근 인디루빈 유도체에 대한 수요가 증가함에도 불구하고, 2 개의 인돌 고리가 서로 다른 인디루빈 합성이 어렵다는 점에서 생물학적 공정으로 인디루빈 유도체 생산이 시도되지 못했다.However, a specific principle has not yet been revealed, and in spite of the recent increase in demand for indirubin derivatives, the production of indirubin derivatives by biological processes has not been attempted because it is difficult to synthesize indirubin having two different indole rings.

일본 특허공개공보 제2002-541244호Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2002-541244 한국 특허등록공보 제10-1092515호Korean Patent Registration Publication No. 10-1092515 한국 특허등록공보 제10-1021789호Korean Patent Registration Publication No. 10-1021789 중국 특허공개공보 제103627748호Chinese Patent Publication No. 103627748

HOESSEL, Ralph, et al. Indirubin, the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine, inhibits cyclin-dependent kinases. Nature cell biology, 1999, 1. 1: 60. CHENG, Xinlai, et al. Identification of a water-soluble indirubin derivative as potent inhibitor of insulin-like growth factor 1 receptor through structural modification of the parent natural molecule. Journal of medicinal chemistry, 2017, 60. 12: 4949-4962.

Figure pat00001
, Tina, et al. Indirubin and indirubin derivatives for counteracting proliferative diseases. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2015, 2015. KUGEL, Susann, et al. Cryptic indole hydroxylation by a non-canonical terpenoid cyclase parallels bacterial xenobiotic detoxification. Nature communications, 2017, 8: 15804. HAN, Gui Hwan, et al. Enhanced indirubin production in recombinant Escherichia coli harboring a flavin-containing monooxygenase gene by cysteine supplementation. Journal of biotechnology, 2013, 164. 2: 179-187. HOESSEL, Ralph, et al. Indirubin, the active constituent of a Chinese antileukaemia medicine, inhibits cyclin-dependent kinases. Nature cell biology, 1999, 1. 1: 60. CHENG, Xinlai, et al. Identification of a water-soluble indirubin derivative as potent inhibitor of insulin-like growth factor 1 receptor through structural modification of the parent natural molecule. Journal of medicinal chemistry, 2017, 60. 12: 4949-4962.
Figure pat00001
, Tina, et al. Indirubin and indirubin derivatives for counteracting proliferative diseases. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2015, 2015. KUGEL, Susann, et al. Cryptic indole hydroxylation by a non-canonical terpenoid cyclase parallels bacterial xenobiotic detoxification. Nature communications, 2017, 8: 15804. HAN, Gui Hwan, et al. Enhanced indirubin production in recombinant Escherichia coli harboring a flavin-containing monooxygenase gene by cysteine supplementation. Journal of biotechnology, 2013, 164. 2: 179-187.

이와 같은 상황 하에서, 본 발명의 목적은, 생물학적인 방법으로 인디루빈 유도체를 선택적으로 제조하는 신규한 방법과, 신규한 중간체인 인돌렌인온을 제공하기 위한 것이다. Under such circumstances, an object of the present invention is to provide a novel method for selectively preparing an indirubin derivative by a biological method, and a novel intermediate, indoleninone.

본 발명자들은, 생물학적으로 인디루빈 유도체를 선택적으로 제조함에 있어서, 인돌렌인온 (2-설파닐인돌-3-온) 이 중요 중간체라는 것을 최초로 알아내었고, 이의 생물학적 합성법을 발견하였다. The present inventors first discovered that indoleninone (2-sulfanylindol-3-one) is an important intermediate in selectively preparing an indirubin derivative biologically, and discovered a biological synthesis method thereof.

또한, 인돌렌인온을 중간체로 하여 생촉매 또는 전세포 반응을 통한 다양한 인디루빈 유도체 제조 방법을 발견하였다. In addition, a method for preparing various indirubin derivatives through a biocatalyst or whole cell reaction was discovered using indoleninone as an intermediate.

나아가, 부산물 제거를 통해 인디루빈 유도체 합성의 선택성을 증대시켰다. Furthermore, the selectivity of synthesis of indirubin derivatives was increased by removing by-products.

구체적으로, 본 발명은 하기를 제공한다. Specifically, the present invention provides the following.

1) 하기의 단계를 포함하는, 하기 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법:One) A method for producing a compound represented by the following formula (I), comprising the following steps:

식 (I)Equation (I)

Figure pat00002
Figure pat00002

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고,(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms,

Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 5 is hydrogen, an amino group, or 1 to 5 carbon atoms It is an alkyl group of.)

(A) 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 준비하는 단계,(A) preparing a transformed E. coli expressing an oxidase or hydrolytic enzyme,

(B) 하기 식 (1) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 산화 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하거나, (B) from the compound represented by the following formula (1), using a transformed E. coli expressing the oxidative enzyme, a compound represented by the following formula (3) is produced through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, or

또는, 하기 식 (2) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하는 단계, Alternatively, from a compound represented by the following formula (2), using a transformed E. coli expressing the hydrolytic enzyme, producing a compound represented by the following formula (3) through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction,

식 (1)Equation (1)

Figure pat00003
Figure pat00003

식 (2)Equation (2)

Figure pat00004
Figure pat00004

식 (3)Equation (3)

Figure pat00005
Figure pat00005

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R1 은 당 또는 -COR3 이며, R3 는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 1 is a sugar or -COR 3 , and R 3 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.)

(C) 상기 식 (3) 으로 나타내는 화합물 및 하기 식 (4) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물을 합성하는 단계, 및(C) synthesizing a compound represented by the following formula (5) by reacting a compound represented by the above formula (3) and a compound represented by the following formula (4), and

식 (4)Equation (4)

Figure pat00006
Figure pat00006

식 (5)Equation (5)

Figure pat00007
Figure pat00007

(식 중, R2 는 비치환 또는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)(Wherein, R 2 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or hydrogen which is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxy group, an amino group, a carboxyl group, and a thio group.)

(D) 상기 식 (5) 로 나타내는 화합물과 하기 식 (6) 또는 식 (7) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 상기 식 (I) 으로 나타내는 화합물을 합성하는 단계. (D) synthesizing a compound represented by the formula (I) by reacting a compound represented by the formula (5) with a compound represented by the following formula (6) or (7).

식 (6)Equation (6)

Figure pat00008
Figure pat00008

식 (7)Equation (7)

Figure pat00009
Figure pat00009

(식 중, Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)(In the formula, Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 5 is hydrogen, an amino group, or It is a C1-C5 alkyl group.)

2) 1) 에 있어서, 상기 산화 효소가 상기 식 (1) 로 나타내는 화합물의 3 번 위치를 산화시킬 수 있는 효소인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 2) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 1), wherein the oxidative enzyme is an enzyme capable of oxidizing the position 3 of the compound represented by the formula (1).

3) 2) 에 있어서, 상기 산화 효소가 사이토크롬 P450, 플라빈 함유 모노옥시게네이스 또는 나프탈렌 다이옥시게네이스인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 3) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 2), wherein the oxidative enzyme is cytochrome P450, flavin-containing monooxygenase, or naphthalene dioxygenase.

4) 1) 에 있어서, 상기 가수 분해 효소가 글루코시데이스 (glucosidase) 또는 갈락토시데이스 (galactosidase) 인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 4) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 1), wherein the hydrolytic enzyme is glucosidase or galactosidase.

5) 1) 에 있어서, 상기 (B) 단계에서 생촉매 반응을 통하는 경우, 상기 (A) 및 (B) 단계 사이에, 형질 전환 대장균으로부터 효소를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 5) In 1), in the case of through a biocatalytic reaction in step (B), between steps (A) and (B), it further comprises the step of purifying the enzyme from transformed E. coli, the formula A method for producing a compound represented by (I).

6) 1) 에 있어서, 상기 당이 글루코오스, 갈락토오스 또는 프록토오스인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 6) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 1), wherein the sugar is glucose, galactose or fructose.

7) 1) 에 있어서, 상기 식 (4) 로 나타내는 화합물은, 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나를 원료로 하여, (A) 단계에서 준비된 형질 전환 대장균으로부터 합성된 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법:7) In 1), the compound represented by formula (4) is synthesized from transformed E. coli prepared in step (A) using one of the following (i) to (iii) as a raw material, formula (I Method for producing a compound represented by ):

(i) 설파이드 (sulfide), 티오설페이트 (thiosulfate), 설파이트 (sulfite) 또는 설페이트 (sulfate) ; 및 세린 (serine) (i) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And serine

(ii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 및 포도당 또는 글리세롤 (ii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And glucose or glycerol

(iii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 포도당 또는 글리세롤 ; 및 세린. (iii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; Glucose or glycerol; And serine.

8) 1) 에 있어서, 상기 R2 가 수소, -CH2CH(NH2)COOH, -CH2CH(OH)CH(OH)CH2SH 또는 -CH2CH2OH 인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 8) In 1), wherein R 2 is hydrogen, -CH 2 CH(NH 2 )COOH, -CH 2 CH(OH)CH(OH)CH 2 SH or -CH 2 CH 2 OH, A method for producing a compound represented by formula (I).

9) 1) 에 있어서, 상기 (C) 및 (D) 단계 사이에, 상기 (C) 단계에서 발생한 부산물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 9) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 1), further comprising, between steps (C) and (D), removing by-products generated in step (C).

10) 1) 에 있어서, 상기 (C) 단계에서, pH 를 6.0 이상으로 설정하거나, 또는, 산소를 제공하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. 10) The method for producing a compound represented by formula (I) according to 1), wherein in the step (C), the pH is set to 6.0 or higher, or oxygen is provided.

11) 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물. 11) A compound represented by the following formula (5).

식 (5)Equation (5)

Figure pat00010
Figure pat00010

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R2 는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 2 is a hydroxy group, an amino group, It is a C1-C5 alkyl group or hydrogen substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a carboxy group and a thio group.)

12) 하기의 단계를 포함하는, 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물의 제조 방법:12) A method for producing a compound represented by the following formula (5), comprising the following steps:

(A) 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 준비하는 단계,(A) preparing a transformed E. coli expressing an oxidase or hydrolytic enzyme,

(B) 하기 식 (1) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 산화 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하거나, (B) from the compound represented by the following formula (1), using a transformed E. coli expressing the oxidative enzyme, a compound represented by the following formula (3) is produced through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, or

또는, 하기 식 (2) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하는 단계, 및Alternatively, from a compound represented by the following formula (2), using a transformed E. coli expressing the hydrolytic enzyme, producing a compound represented by the following formula (3) through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, and

식 (1)Equation (1)

Figure pat00011
Figure pat00011

식 (2)Equation (2)

Figure pat00012
Figure pat00012

식 (3)Equation (3)

Figure pat00013
Figure pat00013

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R1 은 당 또는 -COR3 이며, R3 는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 1 is a sugar or -COR 3 , and R 3 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.)

(C) 상기 식 (3) 으로 나타내는 화합물 및 하기 식 (4) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물을 합성하는 단계. (C) A step of synthesizing a compound represented by the following formula (5) by reacting a compound represented by the above formula (3) and a compound represented by the following formula (4).

식 (4)Equation (4)

Figure pat00014
Figure pat00014

식 (5)Equation (5)

Figure pat00015
Figure pat00015

(식 중, R2 는 비치환 또는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)(Wherein, R 2 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or hydrogen which is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxy group, an amino group, a carboxyl group, and a thio group.)

본 발명은 인돌렌인온을 통해 인디루빈 유도체를 선택적으로 합성할 수 있는 생물학적 제조 방법을 제시하고 있는바, 인디루빈 유도체의 생물학적 합성법을 최초로 제시하였다는 측면에서 선행연구와 차별성을 갖는다. The present invention proposes a biological preparation method capable of selectively synthesizing an indirubin derivative through indoleninone, and has differentiation from previous studies in that a biological synthesis method of an indirubin derivative was first proposed.

또한, 본 발명은 화학적 공정에 사용되는 기질과 동일하거나 자연계에서 더 쉽게 취득할 수 있는 기질을 사용하고, 상대적으로 반응 단계도 현격히 줄였다는 측면에서 녹색화학 (green chemistry) 을 실현시킨 발명이다. In addition, the present invention is an invention in which green chemistry is realized in that a substrate that is the same as the substrate used in a chemical process or can be obtained more easily in nature is used, and the reaction step is significantly reduced.

또한, 본 발명은 최근 발표된 인돌 고리의 생물학적 할로겐화 반응 및 니트로화 반응을 조합하면 오직 아미노산과 염으로부터 생물학적으로 인디루빈 유도체를 합성할 수 있는 가능성과, 추후 인디루빈 유도체의 생물학적 대량생산의 가능성을 보여준 발명이다. In addition, the present invention demonstrates the possibility of biologically synthesizing an indirubin derivative from only amino acids and salts by combining the recently announced biological halogenation reaction and nitration reaction of the indole ring, and the possibility of biological mass production of indirubin derivatives in the future. It is an invention that has been shown.

도 1 은, 인돌 또는 인독실 유도체로부터 인독실의 합성, 인독실과 황 화합물로부터 인돌렌인온의 합성, 인돌렌인온과 2-옥스인돌 또는 이사틴으로부터 인디루빈 유도체의 합성을 보여주는 반응 모식도이다.
도 2 는, 인돌 또는 인디칸으로부터 인돌렌인온을 합성하기 위한 개념도를 나타낸 것이다.
도 3 은, 전세포 반응을 통해 인디고 (A), 인돌렌인온 (B), 인디루빈 (C) 의 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 4 는, 도 3 에서 생성된 인디고, 인돌렌인온, 인디루빈의 상대적인 생산량을 나타낸 것이다.
도 5 는, 인돌렌인온이 합성되기 위한 시스테인 및 산소 요구성 결과를 나타낸 것이다.
도 6 은, 인돌, 6-클로로인돌, 6-브로모인돌로부터 그에 상응하는 인돌레인온 (및 그 유도체) 이 합성된 결과를 나타낸 것이다.
도 7 은, 산화 효소를 발현시킨 재조합 대장균을 이용한 인디루빈 유도체 합성 전략을 나타낸 모식도이다.
도 8 은, 산화 효소를 발현시킨 재조합 대장균으로부터 합성된 인디루빈 유도체 합성 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9 는, 산화 효소를 이용한 인디루빈 유도체 합성 전략을 나타낸 모식도이다.
도 10 은, 산화 효소를 이용한 인디루빈 유도체 선택적 합성 전략을 나타낸 모식도로서, 도 9 에서 추출 (extraction) 과정을 추가한 모식도이다.
도 11 은, 산화 효소를 이용한 인디루빈 유도체 합성 및 선택적 합성 전략의 결과를 나타낸 것으로, 옥스인돌을 넣어주지 않은 경우 (레인 1), 2-옥스인돌을 다시 넣어준 경우 (레인 2), 6-클로로-2-옥스인돌 (레인 3), 6-브로모-2-옥스인돌 (레인 4), 그리고 5-니트로-2-옥스인돌 (레인 5) 을 추가해준 경우의 결과를 나타낸다.
도 12 는, 옥스인돌 대신 이사틴을 이용하여 pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0 에서 인디루빈 유도체를 합성한 결과를 나타낸 것이다. 1 is a reaction schematic diagram showing the synthesis of indoxil from indole or indoxyl derivatives, synthesis of indoleninone from indoxyl and sulfur compounds, and synthesis of indoleninone from indoleninone and 2-oxindole or isatin. to be.
2 shows a conceptual diagram for synthesizing indoleninone from indole or indican.
3 shows the production results of indigo (A), indolenin (B), and indirubin (C) through a whole cell reaction.
FIG. 4 shows the relative production amounts of indigo, indoleninone, and indirubin produced in FIG. 3.
5 shows the results of cysteine and oxygen requirements for synthesizing indoleninone.
6 shows the result of synthesis of corresponding indoleinone (and its derivatives) from indole, 6-chloroindole, and 6-bromoindole.
7 is a schematic diagram showing a strategy for synthesizing an indirubin derivative using recombinant Escherichia coli expressing an oxidative enzyme.
8 shows the results of synthesis analysis of an indirubin derivative synthesized from recombinant E. coli expressing an oxidative enzyme.
9 is a schematic diagram showing a strategy for synthesizing an indirubin derivative using an oxidative enzyme.
FIG. 10 is a schematic diagram showing a strategy for selective synthesis of an indirubin derivative using an oxidase, and is a schematic diagram in which an extraction process is added in FIG. 9.
FIG. 11 shows the results of the synthesis of indirubin derivatives and selective synthesis strategies using oxidative enzymes, when oxindole was not added (lane 1), 2-oxindole was added again (lane 2), 6- The results when chloro-2-oxindole (lane 3), 6-bromo-2-oxindole (lane 4), and 5-nitro-2-oxindole (lane 5) were added are shown.
12 shows the result of synthesizing an indirubin derivative at pH 7.0, pH 8.0, and pH 9.0 using isatin instead of oxindole.

이하에서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 구현 예는, 아래 모식도와 같은 인디루빈 유도체의 제조 방법에 관한 것이다. One embodiment of the present invention relates to a method of preparing an indirubin derivative as shown in the schematic diagram below.

Figure pat00016
Figure pat00016

상기 제조 방법에 기재된 인돌, 인독실, 인돌렌인온, 이사틴, 옥스인돌, 인디루빈은 그 유도체를 포함하는 의미이다. Indole, indoxyl, indoleninone, isatin, oxindole, and indirubin described in the above production method are meant to include derivatives thereof.

식 (I) 로 나타내는 화합물인 인디루빈 (및 그 유도체) 은 아래와 같다. Indirubin (and its derivatives) as a compound represented by Formula (I) are as follows.

식 (I)Equation (I)

Figure pat00017
Figure pat00017

여기서, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고,Here, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms,

Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기이며, Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 5 is hydrogen, an amino group, or 1 to 5 carbon atoms Is an alkyl group of,

X1 ~ X4 및 Y1 ~ Y4 중 적어도 하나는 수소가 아닌 것이 바람직하다. It is preferable that at least one of X 1 to X 4 and Y 1 to Y 4 is not hydrogen.

식 (I) 로 나타내는 화합물의 제조 방법은 하기의 단계를 포함한다:The method for producing the compound represented by formula (I) includes the following steps:

(A) 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 준비하는 단계.(A) preparing a transformed E. coli expressing an oxidase or hydrolytic enzyme.

여기서, 상기 산화 효소는, 이에 제한되지는 않으나, 식 (1) 로 나타내는 화합물의 3 번 위치를 산화시킬 수 있는 효소일 수 있고, 사이토크롬 P450, 플라빈 함유 모노옥시게네이스 또는 나프탈렌 다이옥시게네이스인 것이 바람직하며, 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) 유래 플라빈 함유 모노옥시게네이스인 것이 보다 바람직하다. Here, the oxidative enzyme, although not limited thereto, may be an enzyme capable of oxidizing the 3 position of the compound represented by formula (1), and cytochrome P450, flavin-containing monooxygenase, or naphthalene dioxygenase It is preferable that it is, and it is more preferable that the methylopha is a flavin-containing monooxygenase derived from aminisulfidivorans ( Methylophaga aminisulfidivorans ).

또한, 상기 가수 분해 효소는, 이에 제한되지는 않으나, 식 (2) 로 나타내는 화합물을 가수분해 하는 효소일 수 있고, 글루코시데이스 (glucosidase) 또는 갈락토시데이스 (galactosidase) 인 것이 바람직하며, 베타-글루코시데이스인 것이 보다 바람직하다. In addition, the hydrolytic enzyme may be, but is not limited to, an enzyme that hydrolyzes the compound represented by formula (2), and is preferably glucosidase or galactosidase, and beta -It is more preferable that it is glucosidase.

또한, 상기 대장균은, 이에 제한되지는 않으나, BL21(DE3) 일 수 있다. In addition, the E. coli may be BL21 (DE3), but is not limited thereto.

(B) 하기 식 (1) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 산화 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하거나,(B) from the compound represented by the following formula (1), using a transformed E. coli expressing the oxidative enzyme, a compound represented by the following formula (3) is produced through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, or

또는, 하기 식 (2) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하는 단계.Alternatively, from a compound represented by the following formula (2), using a transformed E. coli expressing the hydrolytic enzyme, a biocatalytic reaction or a whole cell reaction to produce a compound represented by the following formula (3).

식 (1)Equation (1)

Figure pat00018
Figure pat00018

식 (2)Equation (2)

Figure pat00019
Figure pat00019

식 (3)Equation (3)

Figure pat00020
Figure pat00020

여기서, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, 수소, 할로겐 또는 니트로기인 것이 바람직하다. Here, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and is preferably hydrogen, halogen or nitro group. .

또한, R1 은 당 또는 -COR3 이고, R3 는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기이며, 상기 당은 글루코오스, 갈락토오스 또는 프록토오스일 수 있다. Further, R 1 is a sugar or -COR 3 , R 3 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, and the sugar may be glucose, galactose, or fructose.

또한, 상기 (B) 단계에서 생촉매 반응을 통하는 경우, 상기 (A) 및 (B) 단계 사이에, 형질 전환 대장균으로부터 효소를 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. In addition, when the biocatalytic reaction is performed in step (B), between steps (A) and (B), the step of purifying the enzyme from transformed E. coli may be further included.

(C) 상기 식 (3) 으로 나타내는 화합물 및 하기 식 (4) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물을 합성하는 단계. (C) A step of synthesizing a compound represented by the following formula (5) by reacting a compound represented by the above formula (3) and a compound represented by the following formula (4).

식 (4)Equation (4)

Figure pat00021
Figure pat00021

식 (5)Equation (5)

Figure pat00022
Figure pat00022

여기서, R2 는 비치환 또는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소이고, R2 는 수소, -CH2CH(NH2)COOH, -CH2CH(OH)CH(OH)CH2SH 또는 -CH2CH2OH 인 것이 바람직하며, -CH2CH(NH2)COOH 인 것이 보다 바람직하다. Here, R 2 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or hydrogen unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxy group, an amino group, a carboxyl group, and a thio group, and R 2 is hydrogen, -CH 2 CH(NH 2 )COOH , -CH 2 CH(OH)CH(OH)CH 2 SH or -CH 2 CH 2 OH is preferably, and more preferably -CH 2 CH(NH 2 )COOH.

또한, 상기 식 (4) 로 나타내는 화합물은 상기 (C) 단계에서 별도로 첨가되어 반응이 진행될 수도 있고, 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나를 원료로 하여, (A) 단계에서 준비된 형질 전환 대장균으로부터 합성되어 반응이 진행될 수도 있다. In addition, the compound represented by the formula (4) may be added separately in the step (C) to proceed with the reaction, and transformed E. coli prepared in step (A) using one of the following (i) to (iii) as a raw material It may be synthesized from and the reaction may proceed.

(i) 설파이드 (sulfide), 티오설페이트 (thiosulfate), 설파이트 (sulfite) 또는 설페이트 (sulfate) ; 및 세린 (serine)(i) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And serine

(ii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 및 포도당 또는 글리세롤(ii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And glucose or glycerol

(iii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 포도당 또는 글리세롤 ; 및 세린. (iii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; Glucose or glycerol; And serine.

또한, 상기 (C) 단계에서, pH 를 6.0 이상으로 설정하는 것이 바람직하고, pH 를 6.0 이상 10.0 이하로 설정하는 것이 보다 바람직하다. Further, in the step (C), it is preferable to set the pH to 6.0 or more, and more preferably to set the pH to 6.0 or more and 10.0 or less.

pH 가 6.0 미만으로 낮으면 식 (5) 로 나타내는 화합물이 가수분해될 수 있다. pH 는 사용된 산화 효소 또는 가수 분해 효소에 따라 반응성이 가장 높은 최적의 pH 로 조절하는 것이 가장 바람직하다. When the pH is as low as less than 6.0, the compound represented by formula (5) may be hydrolyzed. It is most preferable to adjust the pH to an optimum pH with the highest reactivity depending on the oxidase or hydrolytic enzyme used.

또한, 상기 (C) 단계에서, pH 를 6.0 이상으로 설정하는 것 대신에, 산소를 제공할 수 있다. 산소를 제공해 주면, 식 (5) 로 나타내는 화합물을 보다 안정적으로 얻을 수 있다. In addition, in step (C), instead of setting the pH to 6.0 or more, oxygen may be provided. When oxygen is provided, the compound represented by formula (5) can be obtained more stably.

상기 식 (5) 로 나타내는 인돌렌인온 화합물은, 인독실을 안정하게 포획할 수 있고, 이를 중간체로 사용함으로써, 생촉매 또는 전세포 반응을 통해 다양한 식 (I) 로 나타내는 화합물을 선택적으로 제조할 수 있다. The indoleninone compound represented by the above formula (5) can stably capture indoxyl and, by using it as an intermediate, selectively prepare a compound represented by various formula (I) through a biocatalyst or whole cell reaction. can do.

(D) 상기 식 (5) 로 나타내는 화합물과 하기 식 (6) 또는 식 (7) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 상기 식 (I) 으로 나타내는 화합물을 합성하는 단계. (D) synthesizing a compound represented by the formula (I) by reacting a compound represented by the formula (5) with a compound represented by the following formula (6) or (7).

식 (6)Equation (6)

Figure pat00023
Figure pat00023

식 (7)Equation (7)

Figure pat00024
Figure pat00024

여기서, Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, 수소, 할로겐 또는 니트로기인 것이 바람직하며, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기이다. Here, Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and is preferably a hydrogen, halogen or nitro group. , Y 5 is hydrogen, an amino group, or an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.

상기 (C) 및 (D) 단계 사이에, 상기 (C) 단계에서 발생한 부산물을 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 부산물 제거 단계에서는 클로로포름 또는 에틸 아세테이트를 유기 용매로서 사용할 수 있다. 부산물 제거 단계를 추가함으로써 원치 않는 인디루빈 생성을 억제할 수 있다. Between the steps (C) and (D), a step of removing the by-product generated in the step (C) may be further included, and in the step of removing the by-product, chloroform or ethyl acetate may be used as an organic solvent. Unwanted production of indirubin can be suppressed by adding a by-product removal step.

본 발명의 다른 구현 예는, 상기 식 (5) 로 나타내는 인돌렌인온의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 (A) 내지 (C) 단계를 포함한다. Another embodiment of the present invention relates to a method for producing indoleninone represented by the formula (5), and includes steps (A) to (C).

본 발명의 다른 구현 예는, 상기 식 (5) 로 나타내는 인돌렌인온 화합물에 관한 것이다. 식 (5) 로 나타내는 화합물을 중간체로서 사용함으로써, 생물학적인 인디루빈 유도체의 선택적인 제조가 가능하게 되었다. Another embodiment of the present invention relates to an indoleninone compound represented by the above formula (5). By using the compound represented by formula (5) as an intermediate, it has become possible to selectively prepare a biological indirubin derivative.

[실시예][Example]

본 발명에서 사용되는 용어는 다르게 정의되지 않는 한, 실시예가 해당되는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 것과 동일하다. 일반 용어의 경우 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 이상적이거나 과도하게 해석되어선 안 된다. Unless defined differently, terms used in the present invention are the same as those commonly used in the technical field to which the embodiment is applied. In the case of a general term, it should be interpreted as having a meaning consistent with the meaning in the context of the related technology, and not ideally or excessively interpreted.

아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 실시예에서 사용한 용어는 특정 상황을 한정하려는 의도가 아니며 실시예를 설명하기 위한 것이다. Various changes may be made to the embodiments described below. The embodiments described below are not intended to be limited to the embodiments, and should be understood as including all changes and substitutes for them. The terms used in the examples are not intended to limit a specific situation and are intended to describe the embodiments.

형질 전환 대장균 제작 및 재조합 단백질 발현Production of transformed E. coli and expression of recombinant protein

본 발명에서는 인돌렌인온 합성을 위해 메틸로파가 아미니설피디보란스 유래 플라빈 함유 모노옥시게네이스 (산화 효소) 또는 베타-글루코시데이스 (가수 분해 효소) 를 사용하였다. 대장균에서 산화 효소 또는 가수 분해 효소 발현을 위해 목표 유전자를 PCR 로 증폭시켰다. 증폭된 유전자는 pET28a 대장균 발현벡터에 삽입하였고, 이 발현벡터를 대장균에 삽입시켜 형질전환 대장균을 제작하였다. In the present invention, for the synthesis of indoleninone, a flavin-containing monooxygenase (oxidase) or beta-glucosidase (hydrolytic enzyme) derived from methylopaga aminisulfidiborans was used. The target gene was amplified by PCR for the expression of oxidase or hydrolytic enzyme in E. coli. The amplified gene was inserted into the pET28a E. coli expression vector, and this expression vector was inserted into E. coli to produce a transformed E. coli.

형질전환 대장균에서 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시키기 위해 우선 카나마이신이 포함된 LB 아가 플레이트에서 형질전환 대장균 콜로니 하나를 선별하였다. 하나의 콜로니를 해당 항생제가 포함된 LB 배지에 접종하여 37 ℃ 에서 오버나이트 (overnight) 배양하였다. 새로운 액체 TB 배지를 준비하여 LB 배양액을 2 v/v% 로 넣어주었다. TB 배지를 다시 37 ℃ 에서 배양하여 OD (600 nm) 가 0.7 ~ 0.9 에 도달했을 때 IPTG 를 첨가하였다. 30 ℃ 에서 6 시간 또는 18 ℃ 에서 18 시간 동안 추가로 배양한 뒤 원심분리를 통해 목표 효소가 발현된 대장균을 얻었다. In order to express oxidative enzyme or hydrolytic enzyme in transformed E. coli, one transformed E. coli colony was first selected on an LB agar plate containing kanamycin. One colony was inoculated in LB medium containing the corresponding antibiotic and cultured overnight at 37°C. A new liquid TB medium was prepared and the LB culture solution was added at 2 v/v%. The TB medium was again cultured at 37° C. and IPTG was added when the OD (600 nm) reached 0.7 to 0.9. After further incubation at 30° C. for 6 hours or 18 hours at 18° C., E. coli expressing the target enzyme was obtained through centrifugation.

인돌렌인온 합성은 2 가지 형태로 시도했으며 전세포 in vivo 반응 또는 생촉매를 이용한 in vitro 반응을 진행하였다. 전세포 반응에 필요한 대장균은 해당 대장균을 PBS 버퍼용액으로 3 번 워싱 (washing) 하여 얻었다. 생촉매 반응을 위해 필요한 효소는 해당 대장균의 용해액으로부터 FPLC 또는 Ni-NTA 컬럼으로 효소를 분리하여 얻었다. 얻은 대장균 또는 효소는 반응을 위해 적합한 버퍼 용액에 희석하여 사용하였다. Indoleninone synthesis was attempted in two forms, and whole cell in vivo reactions or in vitro reactions using biocatalysts were performed. E. coli required for the whole cell reaction was obtained by washing the E. coli 3 times with a PBS buffer solution. The enzyme required for the biocatalytic reaction was obtained by separating the enzyme from the lysate of the E. coli by using an FPLC or Ni-NTA column. The obtained E. coli or enzyme was diluted in a buffer solution suitable for the reaction and used.

형질전환 대장균을 이용한 인돌렌인온 합성 및 인디루빈 유도체 합성Synthesis of indoleninone and indirubin derivative using transformed E. coli

전세포 반응을 이용해 인돌렌인온을 합성하기 위해 PBS 버퍼 용액으로 세척한 대장균 용액을 Tris-HCl pH 7.0 100 mM 수용액에 희석하였다. 이 때 OD600 = 10 이 되도록 하였다. 이 때 포도당은 최종농도 0.6 %, 인돌 또는 인돌 유도체는 최종 농도 1 mM 이 되도록 대장균 용액에 첨가하였다. 마지막으로 L-시스테인을 5 mM 추가하였다. 해당 전세포 반응계는 30 ℃ 에서 200 rpm 으로 진탕 배양되었다. 인돌렌인온 분석은 LC-ESI/MS 를 이용해 진행하였다. 배양액 400 μl 에 같은 부피의 메탄올을 넣고 충분히 볼텍싱 (vortexing) 하여 반응을 중단하였다. 20 분 동안 저온 원심분리기로 4 ℃ 에서 15,000 xg 처리하여 세포 부산물을 제거하였다. 상등액은 추가로 3 k 원심 분리기 (centrifugal filter) 를 이용해 잔류하고 있는 고분자를 제거하였다. 액체 크로마토그래피에는 C18 컬럼을 사용하였고 분리하기 위한 이동상 조건은 다음과 같았다. 이동상 A (H2O + 포름산 0.1 %), 이동상 B (아세토니트릴 + 포름산 0.1 %); 400 μl/min; 0-5 min A 90%; 20-25 min A 10%; 26-35 min A 90%. 질량분석기 조건은 다음과 같았다. 포지티브 모드 (positive mode); 4000 kV; 베이퍼라이저 (vaporizer) 온도 270 ℃; 캐필러리 (capillary) 온도 260 ℃; 충돌 에너지 (collision energy) 20 eV. In order to synthesize indoleninone using the whole cell reaction, the E. coli solution washed with a PBS buffer solution was diluted in 100 mM Tris-HCl pH 7.0 and 100 mM aqueous solution. At this time, OD600 = 10. At this time, glucose was added to the E. coli solution so that the final concentration was 0.6% and the indole or indole derivative was 1 mM. Finally, 5 mM L-cysteine was added. The whole cell reaction system was incubated with shaking at 30°C at 200 rpm. Indoleninone analysis was performed using LC-ESI/MS. The same volume of methanol was added to 400 μl of the culture solution and sufficiently vortexed to stop the reaction. Cell by-products were removed by treating 15,000 xg at 4° C. with a low-temperature centrifuge for 20 minutes. The supernatant was additionally removed using a 3k centrifugal filter. A C18 column was used for liquid chromatography, and the mobile phase conditions for separation were as follows. Mobile phase A (H 2 O + 0.1% formic acid), mobile phase B (acetonitrile + 0.1% formic acid); 400 μl/min; 0-5 min A 90%; 20-25 min A 10%; 26-35 min A 90%. The mass spectrometer conditions were as follows. Positive mode; 4000 kV; Vaporizer temperature 270 °C; Capillary temperature 260° C.; Collision energy 20 eV.

전세포 반응을 이용해 인디루빈 유도체 합성법은 위 조건에서 위 반응계에 Tris-HCl pH 8.0 버퍼 1 M 을 추가하고 2-옥스인돌 유도체 1 mM 을 추가하는 것이다. 이후 배양 조건, 분석 조건은 위 조건과 동일하다. The method of synthesizing an indirubin derivative using whole cell reaction is to add 1 M of Tris-HCl pH 8.0 buffer and 1 mM of 2-oxindole derivative to the reaction system under the above conditions. Subsequent culture conditions and analysis conditions are the same as those above.

재조합 단백질을 이용한 인돌렌인온 합성 및 인디루빈 유도체 선택적 합성Indoleninone synthesis and selective synthesis of indirubin derivatives using recombinant protein

재조합 단백질을 이용해 인돌렌인온을 합성하기 위해서 정제된 효소를 사용하였다. 인돌로부터 인돌렌인온을 합성하기 위해 Tris-HCl pH 7.0 50 mM 수용액에 정제된 산화 효소를 1 μM 이 되도록 희석하였다. NADPH 재생 반응을 위해 포도당 탈수소효소 (glucose dehydrogenase) 5 유닛, 포도당 10g/L, NADP 100 μM 을 추가하였다. 마지막으로 L-시스테인을 5 mM 추가하였다. 해당 생촉매 반응계는 37 ℃ 에서 200 rpm 으로 진탕 배양되었다. 인돌렌인온 분석 조건은 위와 같다. 인돌렌인온을 합성하기 위해서는 인돌을 이용하고, 여기에 인디루빈 유도체 합성을 위해 2-옥스인돌 유도체 1 mM 또는 이사틴 1 mM 을 추가하는 것이다. 이후 배양 조건, 분석 조건은 위 조건과 동일하다. 인독실 화합물로부터 인돌렌인온을 합성하기 위해 Tris-HCl 버퍼 용액 50 mM 에 정제된 가수분해 효소를 1 μM 이 되도록 희석하였다. 여기에 L-시스테인을 5 mM 을 추가하였다. 해당 생촉매 반응계는 30 ℃ 에서 배양되었다. 인돌렌인온 분석 조건은 위와 같다. A purified enzyme was used to synthesize indoleninone using a recombinant protein. To synthesize indoleninone from indole, the purified oxidase was diluted to 1 μM in a 50 mM aqueous solution of Tris-HCl pH 7.0. For the NADPH regeneration reaction, 5 units of glucose dehydrogenase, 10 g/L of glucose, and 100 μM of NADP were added. Finally, 5 mM L-cysteine was added. The biocatalytic reaction system was incubated with shaking at 200 rpm at 37°C. Indolenin-one analysis conditions are as above. Indole is used to synthesize indoleninone, and 1 mM of 2-oxindole derivative or 1 mM isatin is added thereto to synthesize indirubin derivative. Subsequent culture conditions and analysis conditions are the same as those above. In order to synthesize indoleninone from the indoxyl compound, the purified hydrolytic enzyme was diluted to 1 μM in 50 mM Tris-HCl buffer solution. 5 mM L-cysteine was added thereto. The biocatalytic reaction system was incubated at 30°C. Indolenin-one analysis conditions are as above.

재조합 단백질을 이용해 인디루빈을 합성하기 위해 위 반응계에 Tris-HCl pH 8.0 버퍼 1 M 을 추가하고 2-옥스인돌 또는 그 유도체 또는 이사틴 1 mM 를 추가하였다. 해당 반응계는 다시 37 ℃ 에서 16 시간 배양되었다. 합성된 인디루빈은 반응계의 2 배 부피의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 진공농축기를 이용해 에틸 아세테이트는 모두 제거되었고 고체형태의 추출물은 에탄올에 녹였다. 에탄올 시료는 LC-ESI/MS 와 TLC 로 분석되었다. 인디루빈 유도체의 LC-ESI/MS 분석 조건은 상기 인돌렌인온 분석 조건에서 포지티브 모드 (positivie mode) 를 네거티브 모드 (negative mode) 로 바꾼 조건을 사용하였다. TLC 의 경우, 이동상으로 헥세인 : 에틸 아세테이트 = 6 : 4 용액을 사용하였다. To synthesize indirubin using a recombinant protein, 1 M of Tris-HCl pH 8.0 buffer was added to the reaction system, and 2-oxindole or a derivative thereof or 1 mM isatin was added. The reaction system was further incubated at 37°C for 16 hours. The synthesized indirubin was extracted with ethyl acetate of twice the volume of the reaction system. Ethyl acetate was all removed using a vacuum concentrator and the solid extract was dissolved in ethanol. Ethanol samples were analyzed by LC-ESI/MS and TLC. LC-ESI/MS analysis conditions of the indirubin derivative were used as conditions in which positive mode was changed to negative mode in the indolenin-one analysis condition. In the case of TLC, a hexane:ethyl acetate = 6:4 solution was used as the mobile phase.

재조합 단백질을 이용해 인디루빈 유도체의 선택적 합성을 하기 위해서, 인돌렌인온 반응계에서 발생한 부산물을 유기용매로 추출하였다. 여기서 가능한 부산물은 첨가한 인돌 유도체로부터 만들어지는 2-옥스인돌 또는 이사틴을 포함한다. 유기용매로 부산물이 제거된 수용액에 Tris pH 8.0 1 M 용액을 추가하고 2-옥스인돌 또는 그 유도체 또는 이사틴 1 mM 를 추가하였다. 해당 반응계는 37 ℃ 에서 16 시간 배양되었다. 합성된 인디루빈 유도체의 추출과정 및 분석조건은 위에서 설명한 것과 동일하다. In order to selectively synthesize the indirubin derivative using the recombinant protein, by-products generated in the indoleninone reaction system were extracted with an organic solvent. Possible by-products here include 2-oxindole or isatin made from the added indole derivative. Tris pH 8.0 1 M solution was added to the aqueous solution from which by-products were removed with an organic solvent, and 2-oxindole or a derivative thereof or 1 mM isatin was added. The reaction system was incubated at 37°C for 16 hours. The extraction process and analysis conditions of the synthesized indirubin derivative are the same as those described above.

이후 실시예에서 특별한 설명이 언급되어있지 않는 한, 이와 동일한 조건에서 실험이 진행되었다. Experiments were conducted under the same conditions, unless otherwise specified in the examples.

[실시예 1] 전세포 반응을 이용한 인돌렌인온 합성[Example 1] Synthesis of indoleninone using whole cell reaction

인돌레인온 합성을 위해 도 2 의 모식도와 같이 반응을 진행하였다. 메틸로파가 아미니설피디보란스 (Methylophaga aminisulfidivorans) 유래 플라빈 함유 모노옥시게네이스를 발현시킨 형질전환 대장균을 준비하였다. 준비된 대장균을 Tris-HCl 수용액에 희석시켜 OD600 값이 10 에 도달하도록 만들고 포도당과 인돌을 첨가하였다. 인돌렌인온 합성 여부를 비교하기 위해 L-시스테인을 넣지 않은 경우 (도 3, A), L-시스테인을 넣고 Tris-HCl pH 7.0 수용액을 사용한 경우 (도 3, B), L-시스테인을 넣고 Tris-HCL pH 9.0 수용액을 사용한 경우 (도 3, C) 를 비교하였다. 도 4 에서 보여주듯이, A 에서는 파란 빛의 인디고, B 에서는 노란 빛의 인돌렌인온, C 에서는 붉은 빛의 인디루빈이 주로 합성되는 것을 확인하였다. 인돌렌인온을 합성하는데 있어서 부산물인 인디고를 제거하기 위해서는 시스테인과 같은 황 화합물 첨가가 필요하며, 인디루빈으로 반응이 더 진행되지 않기 위해서는 반응 pH 를 7.0 으로 설정하는 것이 중요함을 확인하였다. For the synthesis of indoleinone, the reaction was carried out as shown in the schematic diagram of FIG. 2. Transgenic Escherichia coli in which methylophaga aminisulfidivorans expressed flavin-containing monooxygenase derived from Methylophaga aminisulfidivorans was prepared. The prepared E. coli was diluted in an aqueous Tris-HCl solution to reach an OD600 of 10, and glucose and indole were added. In order to compare whether or not indoleninone is synthesized, when L-cysteine is not added (Fig. 3, A), L-cysteine is added, and Tris-HCl pH 7.0 aqueous solution is used (Fig. 3, B), L-cysteine is added. When using the Tris-HCL pH 9.0 aqueous solution (Fig. 3, C) was compared. As shown in FIG. 4, it was confirmed that blue indigo in A, yellow indoleninone in B, and red indirubin in C were mainly synthesized. In synthesizing indoleninone, the addition of a sulfur compound such as cysteine is necessary to remove indigo, which is a by-product, and it has been confirmed that it is important to set the reaction pH to 7.0 in order to prevent further reaction with indirubin.

[실시예 2] 효소를 이용한 인돌렌인온 및 인돌렌인온 유도체 합성[Example 2] Synthesis of indoleninone and indoleninone derivatives using enzymes

효소를 이용한 인돌렌인온 합성 또한 도 2 의 모식도와 같이 진행하였다. 먼저 인디칸으로부터 인돌렌인온 합성을 진행하기 위해 정제된 베타-글루코시데이스 (beta-glucosidase) 를 사용하였다. L-시스테인 첨가 유무 및 산소 요구성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다 (도 5). 공통적으로 인디칸 1 mM 을 기질로 사용하였다. 베타-글루코시데이스와 시스테인을 추가할 경우, 최종 농도가 각각 0.5 μM 와 5 mM 이 되도록 희석하였다. N2 버블링 (bubbling) 은 반응계를 100 % 질소로 10 분 동안 버블링한 것으로 산소 요구성을 확인하기 위한 산소 제거하는 과정을 뜻한다. 도 5 의 좌측 그림에서 볼 수 있듯이 시스테인과 질소 버블링이 없을 때만 인디고가 합성되었다. 질량분석기로 인돌렌인온을 분석한 결과, 시스테인이 추가되고 산소가 제공되었을 때 (질소 버블링이 없을 때, 도 5 의 c) 인돌렌인온이 합성되는 것을 확인하였다. 즉, 인디칸으로부터 당 가수 분해 효소로 인돌렌인온을 합성하였다. Indoleninone synthesis using an enzyme was also carried out as in the schematic diagram of FIG. First, purified beta-glucosidase was used to synthesize indoleninone from indican. An experiment was conducted to confirm the presence or absence of L-cysteine addition and oxygen demand (FIG. 5). In common, 1 mM of Indycan was used as a substrate. When beta-glucosidase and cysteine were added, the final concentration was diluted to 0.5 μM and 5 mM, respectively. N 2 bubbling refers to the process of removing oxygen to confirm oxygen demand by bubbling the reaction system with 100% nitrogen for 10 minutes. As can be seen in the left figure of FIG. 5, indigo was synthesized only when cysteine and nitrogen bubbling were not present. As a result of analyzing indoleninone by a mass spectrometer, it was confirmed that indoleninone was synthesized when cysteine was added and oxygen was provided (when there was no nitrogen bubbling, c of FIG. 5). That is, indoleninone was synthesized from indican with a sugar hydrolyzing enzyme.

다음으로 인돌로부터 인돌렌인온 합성을 진행하기 위해 정제된 산화 효소를 사용하였다. 이 때 산화 효소는 메틸로파가 아미니설피디보란스 유래 플라빈 함유 모노옥시게네이스를 사용하였다. 상기 작성한 산화 효소를 이용한 인돌렌인온 합성 조건을 사용하였다. 인돌을 기질로 사용할 경우 m/z 251의 인돌렌인온 합성을 확인하였다 (도 6, A). 인돌 유도체를 기질로 사용할 경우 상응하는 인돌렌인온이 합성되는 것을 확인하였다. 6-클로로인돌을 기질로 사용할 경우 m/z 285.1 의 클로로인돌렌인온 (도 6, B), 6-브로모인돌을 기질로 사용할 경우 m/z 329/331 의 브로모인돌렌인온 (도 6, C) 합성이 확인되었다. Next, purified oxidative enzyme was used to synthesize indoleninone from indole. At this time, as the oxidative enzyme, a flavin-containing monooxygenase derived from methylopaga aminisulfidiborans was used. The conditions for synthesizing indoleninone using the prepared oxidase were used. When indole was used as a substrate, the synthesis of indoleninone of m/z 251 was confirmed (FIG. 6, A). When using the indole derivative as a substrate, it was confirmed that the corresponding indoleninone was synthesized. When 6-chloroindole is used as a substrate, m/z 285.1 of chloroindoleninone (Fig. 6, B), and when 6-bromoindole is used as a substrate, m/z 329/331 of bromoindoleninone (Fig. 6, C) Synthesis was confirmed.

[실시예 3] 전세포 반응을 이용한 인디루빈 유도체 합성 및 분석[Example 3] Synthesis and analysis of indirubin derivatives using whole cell reaction

전세포 반응에서 만들어진 인돌렌인온으로부터 인디루빈 유도체를 합성하였다. [실시예 1] 에서 만들어진 인돌렌인온 반응계에 2-옥스인돌 유도체 1 mM 과 Tris-HCl pH 8.0 버퍼를 추가하고, 16 시간 동안 추가로 배양하여 인디루빈 유도체 합성을 유도하였다 (도 7). 사용된 2-옥스인돌 유도체는 6-클로로-2-옥스인돌 (도 8, 레인 1 위쪽 빨간색 상자), 6-브로모-2-옥스인돌 (도 8, 레인 2 위쪽 빨간색 상자), 그리고 5-니트로-2-옥스인돌 (도 8, 레인 3 아래쪽 빨간색 상자) 이다. 질량분석기를 통해 6-클로로인디루빈 (도 8, 레인 1), 6-브로모인디루빈 (도 8, 레인 2), 5-니트로인디루빈 (도 8, 레인 3)이 합성된 것을 확인하였다. 그러나 레인 1 에서부터 레인 3 까지 인디루빈 또한 합성된 것을 확인할 수 있었다 (도 8, 레인 1, 2 아래쪽 검정색 상자 및 레인 3 위쪽 검정색 상자). Indirubin derivatives were synthesized from indoleninone produced in the whole cell reaction. To the indoleninone reaction system prepared in [Example 1], 1 mM 2-oxindole derivative and a Tris-HCl pH 8.0 buffer were added, and incubated for 16 hours to induce indirubin derivative synthesis (FIG. 7). The 2-oxindole derivatives used were 6-chloro-2-oxindole (Fig. 8, red box above lane 1), 6-bromo-2-oxindole (Fig. 8, red box above lane 2), and 5- It is nitro-2-oxindole (Figure 8, red box at the bottom of lane 3). It was confirmed that 6-chloroindirubin (FIG. 8, lane 1), 6-bromoindirubin (FIG. 8, lane 2), and 5-nitroindirubin (FIG. 8, lane 3) were synthesized through a mass spectrometer. However, it was confirmed that indirubin was also synthesized from lane 1 to lane 3 (FIG. 8, lanes 1 and 2 lower black boxes and lane 3 upper black boxes).

도 8 의 레인 4 는 전세포 반응을 이용한 인돌렌인온 합성 방법에서 기질로 6-클로로인돌을 사용하고 5-니트로-2-옥스인돌을 추가해준 반응계의 결과이다. 질량분석기를 통해 6‘-클로로-5-니트로인디루빈 (도 8, 레인 4 아래쪽 빨간색 상자)이 합성된 것을 확인하였으며 6,6’-다이클로로인디루빈(도 8, 레인 4 위쪽 검정색 상자)이 부산물로 합성된 것을 확인하였다. Lane 4 of FIG. 8 is a result of a reaction system in which 6-chloroindole was used as a substrate and 5-nitro-2-oxindole was added in a method for synthesizing indoleninone using a whole cell reaction. It was confirmed that 6'-chloro-5-nitroindirubin (Fig. 8, red box at the bottom of lane 4) was synthesized through a mass spectrometer, and 6,6'-dichloro-5-nitroindirubin (black box at the top of Fig. 8, lane 4) was It was confirmed that it was synthesized as a by-product.

결과적으로 전세포반응으로 합성한 인돌렌인온과 추가한 2-옥스인돌 유도체로 인디루빈 유도체를 합성하였다. 그러나 부산물로 인돌 고리가 동일하게 유도체화된 인디루빈이 합성되었다. As a result, indoleninone synthesized through the whole cell reaction and indirubin derivatives were synthesized with the added 2-oxindole derivative. However, as a by-product, indirubin, in which the indole ring was derivatized, was synthesized.

[실시예 4] 산화 효소를 이용한 인디루빈 유도체 합성 및 분석[Example 4] Synthesis and Analysis of Indirubin Derivatives Using Oxidase

산화 효소를 이용한 인돌렌인온으로부터 인디루빈 유도체를 합성하였다 (도 9). [실시예 2] 에서 만든 인돌렌인온 반응계에 옥스인돌 유도체와 Tris-HCl pH 8.0 버퍼를 추가하고, 16 시간 동안 추가 배양하여 인디루빈 유도체 합성을 유도했다. Indirubin derivatives were synthesized from indoleninone using an oxidative enzyme (Fig. 9). To the indoleninone reaction system prepared in [Example 2], an oxindole derivative and a Tris-HCl pH 8.0 buffer were added, and the indirubin derivative was synthesized by further incubating for 16 hours.

도 11 레인 a 는 인디루빈 기준 물질이며 도 11 레인 b 는 5-니트로-2-옥스인돌 1 mM 를 추가한 반응계의 결과이다. 레인 b 에서는 5-니트로인디루빈과 더불어 부산물로 인디루빈이 합성되는 것을 확인하였다. FIG. 11 lane a is an indirubin reference substance, and FIG. 11 lane b is a result of a reaction system in which 1 mM 5-nitro-2-oxindole was added. In lane b, it was confirmed that indirubin was synthesized as a by-product along with 5-nitroindirubin.

원치 않는 인디루빈 생성을 억제하기 위해 유기 용매를 이용한 부산물 추출 과정을 추가하여 인디루빈 유도체를 합성하였다 (도 10). [실시예 2] 에서 얻은 인돌렌인온 합성 반응계를 2 배 부피의 클로로포름으로 2 번 추출하였다. 결과적으로 인돌렌인온 합성 반응계에서 2-옥스인돌, 인돌, 이사틴을 제거하였다. In order to suppress unwanted indirubin generation, an indirubin derivative was synthesized by adding a by-product extraction process using an organic solvent (FIG. 10). The indoleninone synthesis reaction system obtained in [Example 2] was extracted twice with twice the volume of chloroform. As a result, 2-oxindole, indole, and isatin were removed from the indoleninone synthesis reaction system.

물층에 해당하는 상등액을 분리하여 인디루빈 유도체 합성을 시도하였다. 옥스인돌을 넣어주지 않은 경우에는 (도 11, 레인 1) 인디루빈이 생성되지 않았으며 2-옥스인돌을 다시 넣어준 경우에는 (도 11, 레인 2) 인디루빈이 생성되는 것을 확인하였다. 6-클로로-2-옥스인돌 (도 11, 레인 3), 6-브로모-2-옥스인돌 (도 11, 레인 4), 그리고 5-니트로-2-옥스인돌 (도 11, 레인 5) 를 추가해준 경우에는 각각 6-클로로인디루빈, 6-브로모인디루빈, 5-니트로인디루빈이 합성되었으며 부산물로 인디루빈이 생성되지 않았다. 결과적으로 인디루빈 유도체를 선택적으로 합성할 수 있는 방법을 제시하였다. The supernatant corresponding to the water layer was separated to attempt to synthesize an indirubin derivative. When the Oxindole was not added (FIG. 11, lane 1), indirubin was not generated, and when 2-Oxindole was added again (FIG. 11, lane 2), it was confirmed that indirubin was generated. 6-chloro-2-oxindole (Fig. 11, lane 3), 6-bromo-2-oxindole (Fig. 11, lane 4), and 5-nitro-2-oxindole (Fig. 11, lane 5) When added, 6-chloroindirubin, 6-bromoindirubin, and 5-nitroindirubin were synthesized, respectively, and indirubin was not produced as a by-product. As a result, a method for selectively synthesizing indirubin derivatives was proposed.

[실시예 5] 이사틴을 이용한 인디루빈 유도체 합성 및 분석[Example 5] Synthesis and analysis of indirubin derivatives using isatin

물층에 해당하는 상등액을 분리하여 옥스인돌 외에 이사틴을 이용해 인디루빈 합성을 시도하였다. 수용액의 pH 를 7.0, 8.0, 9.0 으로 적정한 뒤에 이사틴 1 mM 과 시스테인 1 mM 를 추가한 결과, pH 8 이상에서 인디루빈이 생성되는 것을 확인하였으며, pH 7 에서는 인디루빈이 소량 생성되었다 (도 12). 결과적으로 인디루빈을 인돌렌인온과 2-옥스인돌 또는 이사틴으로부터 합성할 수 있는 방법을 제시하였다. The supernatant corresponding to the water layer was separated, and indirubin synthesis was attempted using isatin in addition to oxindole. As a result of adding 1 mM isatin and 1 mM cysteine after titrating the pH of the aqueous solution to 7.0, 8.0, and 9.0, it was confirmed that indirubin was produced at pH 8 or higher, and indirubin was produced in a small amount at pH 7 (Fig. 12). ). As a result, a method to synthesize indirubin from indoleninone and 2-oxindole or isatin was proposed.

Claims (12)

하기의 단계를 포함하는, 하기 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법:
식 (I)
Figure pat00025

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고,
Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)
(A) 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 준비하는 단계,
(B) 하기 식 (1) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 산화 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하거나,
또는, 하기 식 (2) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하는 단계,
식 (1)
Figure pat00026

식 (2)
Figure pat00027

식 (3)
Figure pat00028

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R1 은 당 또는 -COR3 이며, R3 는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)
(C) 상기 식 (3) 으로 나타내는 화합물 및 하기 식 (4) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물을 합성하는 단계, 및
식 (4)
Figure pat00029

식 (5)
Figure pat00030

(식 중, R2 는 비치환 또는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)
(D) 상기 식 (5) 로 나타내는 화합물과 하기 식 (6) 또는 식 (7) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 상기 식 (I) 으로 나타내는 화합물을 합성하는 단계.
식 (6)
Figure pat00031

식 (7)
Figure pat00032

(식 중, Y1 ~ Y4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, Y5 는 수소, 아미노기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)A method for producing a compound represented by the following formula (I), comprising the following steps:
Equation (I)
Figure pat00025

(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms,
Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 5 is hydrogen, an amino group, or 1 to 5 carbon atoms It is an alkyl group of.)
(A) preparing a transformed E. coli expressing an oxidase or hydrolytic enzyme,
(B) from the compound represented by the following formula (1), using a transformed E. coli expressing the oxidative enzyme, a compound represented by the following formula (3) is produced through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, or
Alternatively, from a compound represented by the following formula (2), using a transformed E. coli expressing the hydrolytic enzyme, producing a compound represented by the following formula (3) through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction,
Equation (1)
Figure pat00026

Equation (2)
Figure pat00027

Equation (3)
Figure pat00028

(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 1 is a sugar or -COR 3 , and R 3 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.)
(C) synthesizing a compound represented by the following formula (5) by reacting a compound represented by the above formula (3) and a compound represented by the following formula (4), and
Equation (4)
Figure pat00029

Equation (5)
Figure pat00030

(Wherein, R 2 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or hydrogen which is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxy group, an amino group, a carboxyl group, and a thio group.)
(D) synthesizing a compound represented by the formula (I) by reacting a compound represented by the formula (5) with a compound represented by the following formula (6) or (7).
Equation (6)
Figure pat00031

Equation (7)
Figure pat00032

(In the formula, Y 1 to Y 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and Y 5 is hydrogen, an amino group, or It is a C1-C5 alkyl group.) 제 1 항에 있어서, 상기 산화 효소가 상기 식 (1) 로 나타내는 화합물의 3 번 위치를 산화시킬 수 있는 효소인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for producing a compound represented by formula (I) according to claim 1, wherein the oxidative enzyme is an enzyme capable of oxidizing the position 3 of the compound represented by formula (1). 제 2 항에 있어서, 상기 산화 효소가 사이토크롬 P450, 플라빈 함유 모노옥시게네이스 또는 나프탈렌 다이옥시게네이스인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for producing a compound represented by formula (I) according to claim 2, wherein the oxidative enzyme is cytochrome P450, flavin-containing monooxygenase, or naphthalene dioxygenase. 제 1 항에 있어서, 상기 가수 분해 효소가 글루코시데이스 (glucosidase) 또는 갈락토시데이스 (galactosidase) 인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for producing a compound represented by formula (I) according to claim 1, wherein the hydrolytic enzyme is glucosidase or galactosidase. 제 1 항에 있어서, 상기 (B) 단계에서 생촉매 반응을 통하는 경우, 상기 (A) 및 (B) 단계 사이에, 형질 전환 대장균으로부터 효소를 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method of claim 1, wherein when the biocatalytic reaction is carried out in step (B), between steps (A) and (B), it further comprises the step of purifying the enzyme from transformed E. coli, A method for producing a compound represented by formula (I). 제 1 항에 있어서, 상기 당이 글루코오스, 갈락토오스 또는 프록토오스인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for producing a compound represented by formula (I) according to claim 1, wherein the sugar is glucose, galactose, or fructose. 제 1 항에 있어서, 상기 식 (4) 로 나타내는 화합물은, 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나를 원료로 하여, (A) 단계에서 준비된 형질 전환 대장균으로부터 합성된 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법:
(i) 설파이드 (sulfide), 티오설페이트 (thiosulfate), 설파이트 (sulfite) 또는 설페이트 (sulfate) ; 및 세린 (serine)
(ii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 및 포도당 또는 글리세롤
(iii) 설파이드, 티오설페이트, 설파이트 또는 설페이트 ; 포도당 또는 글리세롤 ; 및 세린. The method according to claim 1, wherein the compound represented by formula (4) is synthesized from transformed E. coli prepared in step (A) using one of the following (i) to (iii) as a raw material, Method for producing a compound represented by I):
(i) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And serine
(ii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; And glucose or glycerol
(iii) sulfide, thiosulfate, sulfite or sulfate; Glucose or glycerol; And serine. 제 1 항에 있어서, 상기 R2 가 수소, -CH2CH(NH2)COOH, -CH2CH(OH)CH(OH)CH2SH 또는 -CH2CH2OH 인 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The formula of claim 1, wherein R 2 is hydrogen, -CH 2 CH(NH 2 )COOH, -CH 2 CH(OH)CH(OH)CH 2 SH or -CH 2 CH 2 OH A method for producing a compound represented by (I). 제 1 항에 있어서, 상기 (C) 및 (D) 단계 사이에, 상기 (C) 단계에서 발생한 부산물을 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for preparing a compound represented by formula (I) according to claim 1, further comprising a step of removing by-products generated in step (C) between steps (C) and (D). . 제 1 항에 있어서, 상기 (C) 단계에서, pH 를 6.0 이상으로 설정하거나, 또는, 산소를 제공하는 것을 특징으로 하는, 식 (I) 으로 나타내는 화합물의 제조 방법. The method for producing a compound represented by formula (I) according to claim 1, wherein in step (C), the pH is set to 6.0 or higher, or oxygen is provided. 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물.
식 (5)
Figure pat00033

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R2 는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)A compound represented by the following formula (5).
Equation (5)
Figure pat00033

(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 2 is a hydroxy group, an amino group, It is a C1-C5 alkyl group or hydrogen substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a carboxy group and a thio group.) 하기의 단계를 포함하는, 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물의 제조 방법:
(A) 산화 효소 또는 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 준비하는 단계,
(B) 하기 식 (1) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 산화 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하거나,
또는, 하기 식 (2) 로 나타내는 화합물로부터, 상기 가수 분해 효소를 발현시킨 형질 전환 대장균을 이용하여, 생촉매 반응 또는 전세포 반응을 통해 하기 식 (3) 으로 나타내는 화합물을 생성하는 단계, 및
식 (1)
Figure pat00034

식 (2)
Figure pat00035

식 (3)
Figure pat00036

(식 중, X1 ~ X4 는, 각각 독립적으로, 수소, 할로겐, 아미노기, 니트로기, 설폰기, 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 탄소수 1 ~ 5 의 알콕시기이고, R1 은 당 또는 -COR3 이며, R3 는 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기임.)
(C) 상기 식 (3) 으로 나타내는 화합물 및 하기 식 (4) 로 나타내는 화합물을 반응시켜 하기 식 (5) 로 나타내는 화합물을 합성하는 단계.
식 (4)
Figure pat00037

식 (5)
Figure pat00038

(식 중, R2 는 비치환 또는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기 및 티오기로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 탄소수 1 ~ 5 의 알킬기 또는 수소임.)A method for producing a compound represented by the following formula (5), comprising the following steps:
(A) preparing a transformed E. coli expressing an oxidase or hydrolytic enzyme,
(B) from the compound represented by the following formula (1), using a transformed E. coli expressing the oxidative enzyme, a compound represented by the following formula (3) is produced through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, or
Alternatively, from a compound represented by the following formula (2), using a transformed E. coli expressing the hydrolytic enzyme, producing a compound represented by the following formula (3) through a biocatalytic reaction or a whole cell reaction, and
Equation (1)
Figure pat00034

Equation (2)
Figure pat00035

Equation (3)
Figure pat00036

(In the formula, X 1 to X 4 are each independently hydrogen, halogen, amino group, nitro group, sulfone group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, or an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, and R 1 is a sugar or -COR 3 , and R 3 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms.)
(C) A step of synthesizing a compound represented by the following formula (5) by reacting a compound represented by the above formula (3) and a compound represented by the following formula (4).
Equation (4)
Figure pat00037

Equation (5)
Figure pat00038

(Wherein, R 2 is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms or hydrogen which is unsubstituted or substituted with one or more substituents selected from the group consisting of a hydroxy group, an amino group, a carboxyl group, and a thio group.)
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