JP2020508671A - Recombinant Escherichia coli producing equol derivatives and method for synthesizing equol derivatives using the same - Google Patents
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Abstract
本発明は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来の酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ、ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現させる組換え大腸菌を利用して、ダイゼインまたはゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）から、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を選択的および効率的に合成する方法に関するものである。また、前記微生物菌株と５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを発現する生変換組成物は、抗酸化剤、抗がん剤などに使用することができ、更年期疾患の予防または治療に使用することができる。The present invention Surakkia iso Flavobacterium Nikon barman scan (Slackia isoflavoniconvertens) derived enzyme (daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, tetrahydrodaidzein reductase) using a recombinant E. coli expressing a, from daidzein or genistein (genistein), equol , Dihydroequol, 5-hydroxy-equol (5-hydroxy-equol) and 5-hydroxy-dehydroequol (5-hydroxy-dehydroequol). The biotransformation composition expressing the microorganism strain and 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol can be used as an antioxidant, an anticancer agent, etc., for preventing or treating climacteric diseases. Can be used.
Description
本発明は、エクオール誘導体を生産する組換え大腸菌およびこれを利用したエクオール誘導体の合成方法に関するものである。 The present invention relates to a recombinant Escherichia coli producing an equol derivative and a method for synthesizing an equol derivative using the same.
ヒトの腸内微生物のうち一部の嫌気性微生物は、ヒトがマメ科植物を通じて摂取したイソフラボンを代謝してエクオールへと生変換することが知られている。これまでに発見されたエクオール合成微生物はすべてバクテリアであり、代表的に、スラッキア属（Ｓｌａｃｋｉａ ｓｐ．）、エガセラ属（Ｅｇｇｅｒｔｈｅｌｌａ ｓｐ．）、アドレクルーツィア属（Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｉｚｉａ ｓｐ．）のように、大部分がコリオバクテリア属に属しており、例外的に、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）由来も存在する。 It is known that some anaerobic microorganisms among human intestinal microorganisms metabolize isoflavones which humans ingested through legumes and bioconvert to equol. The equol-synthesizing microorganisms discovered so far are all bacteria, typically, most, such as the genus Slackia sp., The genus Eggsella sp., And the genus Adlercreutizia sp. Belongs to the genus Coriobacterium, and there is an exception from Lactococcus.
前記のような腸内微生物の酵素反応により作られたエクオールは、Ｓ構造の光学異性体のみ合成され、これは、ヒトの人体に吸収されて植物性エストロゲン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）効果を示すことが知られている。したがって、エクオールを絶えず摂取する場合、乳がんの誘発といった従来の更年期症状治療剤の副作用なしに、女性の更年期症状、特に、骨粗しょう症の発病および症状が緩和されることが証明された。このような効果は、エクオールの分子構造がヒトのエストロゲンと類似性を有し、エストロゲン受容体αとβのうちαへの選択性が高いためである。それだけでなく、（Ｓ）‐エクオールは、心血管系疾患を予防し、前立腺がんを緩和させる効果も明らかにされている（非特許文献１）。エクオールの類似体である５‐ヒドロキシ‐エクオールは、イソフラボンであるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）から由来した物質で、エクオールに比べて明らかにされた生物学的効能は相対的に少ないものの、エクオールよりも優れた抗酸化性を示す植物性エストロゲンであることが報告されている（非特許文献２）。また、ジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）は、前立腺がんと卵巣がん細胞の成長を阻害するという報告があり、臨床第２期試験の結果、化学抗がん剤に耐性が生じた卵巣がんの抑制に効果があることが報告されている（非特許文献３）。 Equol produced by the enzymatic reaction of intestinal microorganisms as described above synthesizes only an optical isomer having an S structure, which is known to be absorbed by the human body and exhibit a phytoestrogenic effect. ing. Therefore, it has been demonstrated that the constant intake of equol alleviates the onset and symptoms of climacteric symptoms in women, especially osteoporosis, without the side effects of conventional climacteric symptoms, such as induction of breast cancer. Such an effect is because the molecular structure of equol has similarity to human estrogen, and the selectivity for estrogen receptors α and β to α is high. In addition, (S) -equol has also been shown to have an effect of preventing cardiovascular disease and alleviating prostate cancer (Non-Patent Document 1). 5-Hydroxy-equol, an analogue of equol, is a substance derived from the isoflavone, genistein, which has relatively less biological efficacy than equol, but is superior to equol. It is reported that it is a phytoestrogen exhibiting antioxidant properties (Non-Patent Document 2). In addition, it has been reported that dihydroequol inhibits the growth of prostate cancer and ovarian cancer cells. As a result of the second clinical trial, it suppresses ovarian cancer that has developed resistance to chemical anticancer drugs. Is reported to be effective (Non-Patent Document 3).
しかし、腸内微生物を利用するエクオール合成のための多様な努力と研究とは異なり、５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成の努力は制限的であった。ただ、エクオールを生合成するいくつかの腸内微生物が５‐ヒドロキシ‐エクオールを合成できることが、以下のように報告されている。ラットの腸で同定したコリオバクテリアＳｔｒａｉｎ Ｍｔ１Ｂ８とヒトの大便で同定したスラッキア・イソフラボニコンバーテンスを利用して、ゲニステインがジヒドロゲニステインを経て５‐ヒドロキシ‐エクオールへと生合成されることが明らかとされた（非特許文献４）。しかし、このような菌株を利用した５‐ヒドロキシエクオールの生産は、微生物を嫌気条件で生長させることに対する制限点があり、微生物の接種後、最少１５時間後から５‐ヒドロキシ‐エクオールが生産され、生産性が低く、標準物質の不在による正確な最終収率予測が難しいという限界点が存在する。 However, unlike the various efforts and studies for equol synthesis utilizing intestinal microorganisms, the efforts for the synthesis of 5-hydroxy-equol have been limited. However, it has been reported that some intestinal microorganisms that biosynthesize equol can synthesize 5-hydroxy-equol as follows. Utilizing the choriobacterium Strain Mt1B8 identified in rat intestine and Slackia isoflavoni convertans identified in human stool, it was revealed that genistein is biosynthesized to 5-hydroxy-equol via dihydrogenistein. (Non-Patent Document 4). However, production of 5-hydroxyequol using such a strain has a limitation on growing the microorganism under anaerobic conditions, and 5-hydroxy-equol is produced from a minimum of 15 hours after inoculation of the microorganism, There is a limitation that the productivity is low and it is difficult to accurately predict the final yield due to the absence of the standard substance.
イソフラボンの一つであるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）は、微生物Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ Ｓｔｒａｉｎ Ｍｔ１Ｂ８（１６）、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）（１７）、ｓｔｒａｉｎ ＡＵＨ‐ＪＬＣ１５９によって、５‐ヒドロキシ‐エクオールへと生転換されることが報告されたことがあるが、反応および培養時間が２〜３日と長く、嫌気性反応条件を要求し、基質であるゲニステインの量が０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上である場合、転換率が８０％以下に低下する問題点が存在する（特許文献１）。 Genistein, one of the isoflavones, was transformed by the microorganisms Coriobacteriaaceae Strain Mt1B8 (16), Slackia isoflavoniconvertens (17), and transformed into strain AUH-JLC159 by strain AUH-JLC159 by Slackia isoflavoniconvertens (17). When the reaction and cultivation time are as long as 2-3 days, anaerobic reaction conditions are required, and the amount of the substrate genistein is 0.6 mmol / L or more, the conversion rate Is reduced to 80% or less (Patent Document 1).
合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールは、ＤＰＰＨラジカル捕捉効果が（Ｓ）‐エクオールの２０倍であり、Ｃ・エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）の寿命とストレス抵抗性を増加させることが証明されている（非特許文献５）。しかし、５‐ヒドロキシ‐エクオールのその他の生理的活性は明らかにされていない。 Synthesized 5-hydroxy-equol has a DPPH radical scavenging effect 20 times that of (S) -equol, and has been proven to increase the longevity and stress resistance of C. elegans nematodes (Caenorhabditis elegans) (Non-Patent Document 5). However, other physiological activities of 5-hydroxy-equol have not been determined.
最近、ラクトコッカスおよびスラッキア属のバクテリアから、イソフラボンダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）をエクオールに変換させる役割をする４つの酵素が、２０１３年、Ａｎｎｅｔｔ Ｂｒａｕｎｅグループによって初めて同定された（非特許文献６）。前記酵素は、３つの還元酵素と、１つの異性化酵素で構成されており、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）である。 Recently, four enzymes that play a role in converting isoflavone daidzein to equol from bacteria of the genus Lactococcus and Slackia were first identified in 2013 by the Annett Braune group (Non-Patent Document 6). The enzyme is composed of three reductases and one isomerase, and is composed of daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, and dihydrodaidzein hydrozide. It is a reductase (tetrahydrodaidzein reductase).
本発明の目的は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つを発現する組換え大腸菌を提供することである。 It is an object of the present invention to provide a recombinant Escherichia coli which expresses four enzymes derived from Slackia isoflavoniconvertens.
また、本発明の他の目的は、新規な化合物である５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを提供することであり、これに対する合成方法は皆無であった。 Another object of the present invention was to provide a novel compound, 5-hydroxy-dihydroequol, for which there was no synthetic method.
そこで、本発明の他の目的は、前記組換え大腸菌を利用して、ダイゼインまたはゲニステインから、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成する方法を提供することである。 Therefore, another object of the present invention is to provide a method for synthesizing equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol from daidzein or genistein using the recombinant Escherichia coli. is there.
また、本発明の他の目的は、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つのうち２つまたは３つの酵素を組み合わせて発現する組換え大腸菌を利用して、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的および効率的に合成する方法を提供することである。 Another object of the present invention is to provide 5-hydroxy-equol, dihydroequol and 5-hydroxy-equol using recombinant Escherichia coli expressing two or three enzymes in combination from four enzymes derived from Slackia isoflavonivertase. It is to provide a method for selectively and efficiently synthesizing 5-hydroxy-dihydroequol.
前記目的を達成するために、本発明者らは、ヒトの腸内微生物であるスラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来のダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌および前記４つの酵素のうち２つまたは３つの酵素を組み合わせて発現する組換え大腸菌を製造した。 In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have proposed a daidzein reductase derived from the human intestinal microorganism Slackia isoflavoniconvertens, a dihydrodizein racemizing enzyme (dihydridase). And recombinant E. coli expressing dihydrodaidzein reductase, tetrahydrodaidzein reductase, and recombinant E. coli expressing two or three of the above four enzymes in combination.
また、本発明の組換え大腸菌は、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）からエクオール（ｅｑｕｏｌ）またはジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を生変換する全細胞触媒（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）として利用され得、ゲニステインを５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに選択的に生転換する全細胞触媒として利用され得る。 In addition, the recombinant Escherichia coli of the present invention can be used as a whole cell biocatalyst for bioconverting daidzein to equol or dihydroequol and converting genistein to 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-equol. It can be used as a whole cell catalyst that selectively bioconverts to 5-hydroxy-dihydroequol.
本発明は、好気性条件で基質の濃度約０．２〜約１ｍｍｏｌ／Ｌにおいて９５％の基質転換率で、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを生合成することができる。 The present invention biosynthesizes equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol at a substrate conversion of 95% at a substrate concentration of about 0.2 to about 1 mmol / L under aerobic conditions. be able to.
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。 Further, the present invention can selectively synthesize 5-hydroxy-equol, dihydroequol, or 5-hydroxy-dihydroequol.
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成を、好気性条件において数時間単位で遂行可能であるため、生産費用の節減および生産物による高付加価値の獲得が可能であり、効率的な大量生産を通じて、食品、医薬品などの多様な応用先への活用が可能である。 In addition, the present invention allows the selective synthesis of 5-hydroxy-equol, dihydroequol and 5-hydroxy-dihydroequol to be performed in aerobic conditions in a matter of hours, thereby reducing production costs and increasing product yield. It can acquire added value and can be used for various applications such as foods and pharmaceuticals through efficient mass production.
また、本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用する反応系への追加的な酸化還元酵素に適用する場合、多様なヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができることから、研究的に価値が高い。 In addition, when the recombinant Escherichia coli of the present invention is applied to an additional oxidoreductase in a reaction system using as a whole-cell catalyst, various hydroxy-isoflavonoids can be synthesized, which is of high research value. .
また、本発明によって合成された化合物は、更年期疾患の予防および治療に使用され得、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。また、化粧品または食品添加物の形態で抗酸化剤として使用され得る。 Further, the compound synthesized according to the present invention can be used for prevention and treatment of climacteric diseases, and can be used as an anticancer agent for treating prostate cancer and ovarian cancer. It can also be used as an antioxidant in the form of cosmetics or food additives.
本発明において使用される用語は、当業界において通常的に使用されるものであって、当業者であればその意味を誰でも理解することができるものであるが、本明細書において簡略に説明すると次のとおりである： The terms used in the present invention are those commonly used in the art, and those of ordinary skill in the art can understand the meaning of the terms. Then:
（１）発現：組換え遺伝子を含むベクターを含む微生物において組換えタンパク質を生産することを意味する。 (1) Expression: Production of a recombinant protein in a microorganism containing a vector containing a recombinant gene.
（２）ベクター：一本鎖、二本鎖、円形または超らせんＤＮＡまたはＲＮＡからなるポリヌクレオチドを意味する。ベクターは、組換えタンパク質を生産することができるように、適切な距離に作動的に連結されている複製オリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、核酸カセット、終結などから構成されている。発現する組換えタンパク質にコーディングする遺伝子を核酸カセットの位置に挿入する。 (2) Vector: A polynucleotide consisting of single-stranded, double-stranded, circular or supercoiled DNA or RNA. Vectors are composed of an origin of replication, a promoter, a ribosome binding site, a nucleic acid cassette, termination, and the like, operably linked at an appropriate distance so that recombinant proteins can be produced. The gene coding for the recombinant protein to be expressed is inserted at the position of the nucleic acid cassette.
（３）細胞抽出物：組換えタンパク質が発現された微生物を破砕した後、遠心分離器で固形細胞残渣を除去した後の上澄み液を意味する。本発明においては、ダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素、テトラヒドロダイゼイン還元酵素のうち一部または全部が発現された微生物抽出物を意味する。 (3) Cell extract: a supernatant obtained by crushing a microorganism in which a recombinant protein is expressed and removing solid cell residues with a centrifuge. In the present invention, it means a microorganism extract in which a part or all of daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, and tetrahydrodaidzein reductase are expressed.
（４）全細胞反応：特定の酵素を含む細胞を破砕して細胞抽出物を利用したり、または、酵素を分離精製せずに完全な細胞全体を利用した反応を意味する。 (4) Whole cell reaction: A reaction in which cells containing a specific enzyme are disrupted and a cell extract is used, or a whole cell is used without separating and purifying the enzyme.
本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌に関するものである。 The present invention relates to a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase, and a reductase that expresses a recombinant E. coli reductase that expresses a recombinant E. coli reductase that expresses a dihydrodaidzein reductase.
本発明においては、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Ｓｌａｃｋｉａ ｉｓｏｆｌａｖｏｎｉｃｏｎｖｅｒｔｅｎｓ）由来のダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素、テトラヒドロダイゼイン還元酵素に該当するＤＮＡ配列をポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を通じて増幅させた後、ｐＲＳＦＤｕｅｔまたはｐＣＤＦＤｕｅｔベクターにそれぞれ入れ、これをＥ．ｃｏｌｉにおいてｈｉｓ‐ｔａｇ（６ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）のように発現した。 In the present invention, the DNA sequences corresponding to daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, and tetrahydrodaidzein reductase derived from Slackia isoflavoniconvertens are subjected to polymerase chain reaction (Polymerase chain reaction). PCR) and placed in pRSFDuet or pCDFDuet vectors, respectively, and It was expressed in Escherichia coli as a his-tag (6 histidine).
前記組換え大腸菌は、基質であるダイゼインからエクオールまたはジヒドロエクオールを合成するにあたって利用され得る。 The recombinant E. coli can be used to synthesize equol or dihydroequol from daidzein as a substrate.
また、前記組換え大腸菌は、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成するにあたって利用され得る。 The recombinant E. coli can be used for synthesizing 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol from genistein as a substrate.
前記エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、（Ｓ）‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを合成するにあたって利用され得る。 The method for synthesizing equol or 5-hydroxy-equol can be used for synthesizing (S) -equol or 5-hydroxy- (S) -equol.
より具体的に、前記組換え大腸菌は、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）からエクオール（ｅｑｕｏｌ）およびジヒドロエクオール（ｄｅｈｙｄｒｏｅｑｕｏｌ）を生変換する全細胞触媒（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ）として利用され得、また、ゲニステインを５‐ヒドロキシ‐エクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール（５‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄｅｈｙｒｏｅｑｕｏｌ）に生転換する全細胞触媒として利用され得る。 More specifically, the recombinant Escherichia coli can be used as a whole cell biocatalyst for bioconverting daidzein to equol and dihydroequol, and can also use genistein for 5-hydroxy. -Equol (5-hydroxy-equol) and 5-hydroxy-dehydroequol (5-hydroxy-dehyroequol).
本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用するエクオール合成反応には、還元剤を添加して生成物の酸化を抑制し、還元剤としては、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、Ｌ‐アスコルビン酸、グルタチオン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）、ジチオスレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）、システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）などを使用することができる。添加した還元剤の濃度は、初期基質濃度の約１０〜約１００倍が好ましい。反応液には、ｐＨ緩衝作用のためにリン酸カリウム緩衝液が含まれ、リン酸カリウムの濃度は、約５０〜約４００ｍＭが好ましい。反応温度は、約１８〜約３７℃が好ましく、約２５〜約３０℃がより好ましい。反応液のｐＨは約５〜約１０が好ましく、約６〜約９がより好ましく、約７〜約８がさらに好ましい。反応器の攪拌速度は、約５０〜約４００ｒｐｍが好ましく、約８０〜約２５０ｒｐｍがより好ましく、約１００〜約２００ｒｐｍがさらに好ましい。 In the equol synthesis reaction using the recombinant Escherichia coli of the present invention as a whole-cell catalyst, a reducing agent is added to suppress the oxidation of the product, and NAD (P) H, L-ascorbic acid, glutathione (Glutathione), dithiothreitol, cysteine and the like can be used. The concentration of the added reducing agent is preferably about 10 to about 100 times the initial substrate concentration. The reaction solution contains a potassium phosphate buffer for pH buffering, and the concentration of potassium phosphate is preferably about 50 to about 400 mM. The reaction temperature is preferably from about 18 to about 37C, more preferably from about 25 to about 30C. The pH of the reaction solution is preferably about 5 to about 10, more preferably about 6 to about 9, and still more preferably about 7 to about 8. The stirring speed of the reactor is preferably about 50 to about 400 rpm, more preferably about 80 to about 250 rpm, and still more preferably about 100 to about 200 rpm.
前記エクオール合成反応器内の炭素供給源としては、グルコースおよびグリセロールを使用することができ、グルコースまたはグリセロールの濃度は、約１〜約５（ｗ／ｖ）％が好ましく、約１．５〜約４（ｗ／ｖ）％がより好ましく、約２〜約３（ｗ／ｖ）％がさらに好ましい。本発明の組換え微生物の濃度は、光学密度（Ｏｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ、以下、Ｏ．Ｄ．）約１〜１００が好ましく、約５〜約５０がより好ましく、約１０〜約３０がさらに好ましい。 As a carbon source in the equol synthesis reactor, glucose and glycerol can be used, and the concentration of glucose or glycerol is preferably about 1 to about 5 (w / v)%, and about 1.5 to about 5 (w / v). 4 (w / v)% is more preferred, and about 2 to about 3 (w / v)% is even more preferred. The concentration of the recombinant microorganism of the present invention is preferably about 1 to 100, more preferably about 5 to about 50, and still more preferably about 10 to about 30.
前記エクオール合成反応系の基質としては、合成しようとするイソフラバン（ｉｓｏｆｌａｖａｎ）またはイソフラベン（ｉｓｏｆｌａｖｅｎｅ）の種類に応じて、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、グリシテイン（ｇｌｙｃｉｔｅｉｎ）、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、オルト‐ヒドロキシ‐ダイゼイン（ｏｒｔｈｏ‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｄａｉｄｚｅｉｎ）、オルト‐ヒドロキシ‐ゲニステイン（ｏｒｔｈｏ‐ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）などを使用することができる。 Substrates of the equol synthesis reaction system include genistein, glycitein, daidzein, and ortho-hydroxy-dazein, depending on the type of isoflavane or isoflavene to be synthesized. Ortho-hydroxy-daidzein, ortho-hydroxy-genstein, and the like can be used.
前記基質の反応液に対する溶解度を向上させるために、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、および、β‐シクロデキストリン（β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、メチル‐β‐シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、２‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（２‐（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などを利用することができる。 In order to improve the solubility of the substrate in the reaction solution, polyethylene glycol (polyethylene glycol), polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol), and β-cyclodextrin (β-cyclodextrin-methyl) Methyl-β-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2- (hydroxypropyl) -β-cyclodextrin) and the like can be used.
図１は、初期ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）の濃度による（Ｓ）‐エクオールの収率を示した図表であり、図１に示されているように、初期ダイゼインの濃度が増加するほど（Ｓ）‐エクオールの収率（％）は減少するが、生産される（Ｓ）‐エクオール（ｍＭ）は増加する傾向を示す。 FIG. 1 is a table showing the yield of (S) -equol according to the initial daidzein concentration. As shown in FIG. 1, as the initial daidzein concentration increases, the (S) -equol concentration increases. Although the yield (%) of the compound decreases, the amount of (S) -equol (mM) produced tends to increase.
図２は、ダイゼインおよびゲニステインからダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌を利用した、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール合成反応の模式図である。 FIG. 2 shows the results from daidzein and genistein to daidzein reductase (DZNR), dihydrodaidzein racemase (DDRC), dihydrodaidzein reductase (DRC) FIG. 2 is a schematic diagram of the synthesis reaction of equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequol using recombinant Escherichia coli expressing).
前記図２に示されているように、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）は、ダイゼイン還元酵素（ＤＺＮＲ）によって（Ｒ）‐ジヒドロダイゼインに転換され、これは、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ＤＤＲＣ）によって（Ｓ）‐ジヒドロダイゼインに転換される。（Ｓ）‐ジヒドロダイゼインは、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ＤＨＤＲ）によって（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロダイゼインに転換され、これは、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ＴＨＤＲ）によってエクオールに転換されたり、脱水によってジヒドロエクオールに転換される。 As shown in FIG. 2 above, daidzein is converted to (R) -dihydrodaidzein by daidzein reductase (DZNR), which is converted to (S) -dihydrodaidzein by racemizing enzyme (DDRC). Converted to dihydrodaidzein. (S) -Dihydrodaidzein is converted to (3S, 4R) -trans-tetrahydrodaidzein by dihydrodaidzein reductase (DHDR), which can be converted to equol by tetrahydrodaidzein reductase (THDR) or dihydro by dehydration. Converted to equol.
また、前記図２に示されているように、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）は、ダイゼイン還元酵素（ＤＺＮＲ）によって（Ｒ）‐ジヒドロゲニステインに転換され、これは、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ＤＤＲＣ）によって（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインに転換される。（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインは、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ＤＨＤＲ）によって（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロゲニステインに転換され、これは、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ＴＨＤＲ）によって５‐ヒドロキシ‐エクオールに転換されたり、脱水によって５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに転換される。 Also, as shown in FIG. 2, genistein is converted to (R) -dihydrogenistein by daidzein reductase (DZNR), which is converted to (S) by racemic dihydrodaidzein (DDRC). )-Converted to dihydrogenistein. (S) -Dihydrogenistein is converted to (3S, 4R) -trans-tetrahydrogenistein by dihydrodaidzein reductase (DHDR), which can be converted to 5-hydroxy-equol by tetrahydrodaidzein reductase (THDR). Is converted to 5-hydroxy-dihydroequol by dehydration.
本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、前記４つの酵素のうちテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上過発現された組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法に関するものである。 The present invention relates to a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase, a dihydrodaidizein hydroreductase, and a tetrahydrodaidzeinreductase for reducing the expression of the tetrahydrodaidzeinreductase. The present invention relates to a method for selectively synthesizing 5-hydroxy-equol from genistein as a substrate using recombinant E. coli in which daidzein reductase is overexpressed five times or more as compared with the remaining three enzymes. Things.
具体的に、テトラヒドロダイゼイン還元酵素が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上、好ましくは１０倍以上過発現された組換え大腸菌を利用すると、５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができる。 Specifically, the use of recombinant E. coli in which tetrahydrodaidzein reductase is overexpressed 5 times or more, preferably 10 times or more as compared with the remaining three enzymes, selectively synthesizes 5-hydroxy-equol. Can be.
これは、図２に示されているように、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量を増加させると、テトラヒドロゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを合成する速度が増加して、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの生成が競争的に阻害されるためである。 This is because, as shown in FIG. 2, when the expression level of tetrahydrodaidzein reductase is increased, the rate of synthesis of 5-hydroxy-equol from tetrahydrogenistein is increased, and the production of 5-hydroxy-dihydroequol is increased. Is competitively inhibited.
前記組換え大腸菌の発現方法およびこれを利用した５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、前述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え大腸菌の製造方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。 The method for expressing the recombinant Escherichia coli and the method for synthesizing 5-hydroxy-equol using the same are described above by the method for producing the recombinant Escherichia coli expressing all four enzymes derived from Slackia isoflavonivertens and using the same. It is the same as the method for synthesizing equol.
図６は、図２および図４にて言及した組換え大腸菌の細胞抽出物におけるタンパク質の量をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで示したものであり、４つの酵素の発現量において、４つの組換え酵素を一つの大腸菌で発現したときよりも、ダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌およびジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌において、酵素の発現量が増加した。図６において、１：ＤＤＤＴは、図２において言及した４つの組換え酵素を一つの大腸菌で発現したときの場合であり、２：ＤＤは、図４においてダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌の細胞抽出物に該当し、３：ＤＴは、図４においてジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を一つのベクターで発現する組換え大腸菌の細胞抽出物に該当する。 FIG. 6 shows the amount of protein in the cell extract of the recombinant Escherichia coli referred to in FIGS. 2 and 4 by SDS-PAGE. Compared to when expressed in two Escherichia coli, in recombinant E. coli expressing daidzein reductase and dihydrodaidzein racemase in one vector and in recombinant E. coli expressing dihydrodaidzein reductase and tetrahydrodaidzein reductase in one vector, The expression level of the enzyme increased. In FIG. 6, 1: DDDT is the case where the four recombinant enzymes mentioned in FIG. 2 are expressed in one E. coli, and 2: DD is the case where daidzein reductase and dihydrodaidzein racemase are used in FIG. 3: DT corresponds to the cell extract of recombinant Escherichia coli expressing dihydrodaidzein reductase and tetrahydrodaidzein reductase in one vector in FIG. 4 and 3: DT corresponds to the cell extract of recombinant Escherichia coli expressed in one vector. I do.
図５は、反応時間による、ゲニステイン、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、５‐ヒドロキシ‐エクオールの反応系内濃度（μＭ）を示し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量が、残りの３つの酵素に比べて５倍以上増加した組換え大腸菌を発現したシステム（図６の２および３）を利用すると、４つの酵素をすべて発現した組換え大腸菌に関する図２に比べて、５‐ヒドロキシ‐エクオールの収率および生産性と５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに対する５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択性が増大し得ることを示している。 FIG. 5 shows the concentration (μM) of genistein, dihydrogenistein, and 5-hydroxy-equol in the reaction system according to the reaction time, and the expression amount of tetrahydrodaidzein reductase was 5% lower than that of the remaining three enzymes. Utilizing the system expressing recombinant E. coli with more than 2-fold increase (2 and 3 in FIG. 6), compared to FIG. 2 for recombinant E. coli expressing all four enzymes, the yield and production of 5-hydroxy-equol were compared. It shows that sex and selectivity of 5-hydroxy-equol to 5-hydroxy-dihydroequol can be increased.
また、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）を発現する組換え大腸菌１と、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）およびテトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現する組換え大腸菌２を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法に関するものである。 In addition, the present invention relates to a recombinant Escherichia coli 1 expressing daidzein reductase and dihydrodaidzein racemase, and tetrahydrodaidzein reductase and tetrahydrodaidzein reductase (reductase and tetrahydrodaidzein reductase). The present invention relates to a method for selectively synthesizing 5-hydroxy-equol from a substrate, genistein, using a recombinant Escherichia coli 2 to be expressed.
前記組換え大腸菌１および２を全細胞触媒として混合する生転換反応系により、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができる。 By a biotransformation reaction system in which the recombinant Escherichia coli 1 and 2 are mixed as a whole cell catalyst, 5-hydroxy-equol can be selectively synthesized from genistein.
本発明の組換え大腸菌１および２の発現方法およびこれを利用した５‐ヒドロキシ‐エクオールの合成方法は、前述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え酵素の発現方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。 The method for expressing the recombinant Escherichia coli 1 and 2 of the present invention and the method for synthesizing 5-hydroxy-equol using the same are described above. The expression of the recombinant enzyme which expresses all four enzymes derived from Slackia isoflavonivertens is described above. The method is the same as the method for synthesizing equol using the same.
前記組換え大腸菌１および２の混合反応系は、５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択的生産だけでなく、エクオール、６‐メトキシ‐エクオール（６‐Ｍｅｔｈｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）、および多様なヒドロキシ‐エクオール（Ｈｙｄｒｏｘｙ‐ｅｑｕｏｌ）などの生産に適用することができる。 The mixed reaction system of the recombinant Escherichia coli 1 and 2 not only selectively produces 5-hydroxy-equol but also equol, 6-methoxy-equol, and various hydroxy-equols. (equol).
図４は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）を一つのベクターで発現する組換え大腸菌と、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）を一つのベクターで発現する他の組換え大腸菌とに反応が区画化された全細胞反応系を示す。 FIG. 4 shows recombinant Escherichia coli expressing daidzein reductase (daidzein reductase: DZNR), dihydrodaidzein racemase (DDRC) in one vector, and dihydrodaidzein reductase (dihydrodizedzein hydrozide). 1 shows a whole cell reaction system in which a reaction is compartmentalized with another recombinant Escherichia coli that expresses a reductase (tetrahydrodaidzein reductase: THDR) in one vector.
前記図４によれば、前記組換え大腸菌１によってゲニステインが（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインに転換され、（Ｓ）‐ジヒドロゲニステインは、前記組換え大腸菌２によって５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールに転換されるため、組換え大腸菌１および２によってゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成することができることを示す。 According to FIG. 4, genistein is converted to (S) -dihydrogenistein by the recombinant Escherichia coli 1, and (S) -dihydrogenistein is converted to 5-hydroxy- (S) -equol by the recombinant Escherichia coli 2. Thus, it shows that 5-hydroxy-equol can be selectively synthesized from genistein by recombinant Escherichia coli 1 and 2.
異なる組換え大腸菌により反応が区画化された全細胞反応系は、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールの生産性および最終収率が向上するという点で有利であり、副産物である５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの生成を減らすことにより、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールの選択性が増加するという点で優れる。 A whole-cell reaction system in which the reaction is compartmentalized by different recombinant E. coli is advantageous in that the productivity and final yield of 5-hydroxy- (S) -equol are improved, and the by-product 5-hydroxy-equol is improved. The advantage of reducing the production of dihydroequol is that the selectivity for 5-hydroxy- (S) -equol is increased.
前記５‐ヒドロキシ‐エクオールを選択的に合成する方法は、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを選択的に合成することができる。 The method for selectively synthesizing 5-hydroxy-equol may selectively synthesize 5-hydroxy- (S) -equol.
具体的に、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）が５倍以上過発現された組換え大腸菌、または前記組換え大腸菌１および２を利用して、５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールを選択的に合成することができる。 Specifically, 5-hydroxy- (S) -equol is selectively used by using a recombinant Escherichia coli in which tetrahydrodaidzein reductase is overexpressed 5 times or more, or by using the recombinant Escherichia coli 1 and 2 described above. Can be synthesized.
これと関連して、図７は、前記組換え大腸菌を利用して合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学構造を知るために、２１０〜３２０ｎｍの波長範囲において、円二色性分散系を利用して楕円率を測定した図表であり、本発明の組換え大腸菌により生合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールは、３番の炭素においてＳ‐形態を有することを確認することができる。 In this regard, FIG. 7 shows the use of a circular dichroic dispersion in the wavelength range of 210-320 nm to determine the optical structure of 5-hydroxy-equol synthesized using the recombinant E. coli. 5 is a table showing the measured ellipticity, and it can be confirmed that 5-hydroxy-equol biosynthesized by the recombinant Escherichia coli of the present invention has an S-form at carbon number 3.
さらに、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるダイゼインからジヒドロエクオールを選択的に合成する方法に関するものである。 In addition, the present invention expresses daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, and dihydrodaidzein reductase, and expresses the enzyme that does not express the recombination enzyme that expresses the enzyme that does not reduce the expression of dihydrodaidzein reductase and dihydrodaidzein reductase. The present invention relates to a method for selectively synthesizing dihydroequol from daidzein, which is a substrate, using the method.
具体的に、前記組換え大腸菌を全細胞触媒として利用して、ダイゼインからジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。 Specifically, dihydroequol can be selectively synthesized from daidzein using the recombinant Escherichia coli as a whole-cell catalyst.
前記ジヒドロエクオールを合成する反応液にホウ酸を添加すると、（３Ｓ，４Ｒ）‐トランス‐テトラヒドロダイゼインの脱水反応を促進するため、ジヒドロエクオールを高い収率で合成することができる。添加されるホウ酸の量は、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭが好ましい。 When boric acid is added to the reaction solution for synthesizing dihydroequol, the dehydration reaction of (3S, 4R) -trans-tetrahydrodaidzein is promoted, so that dihydroequol can be synthesized in high yield. Preferably, the amount of boric acid added is from about 50 mM to about 200 mM.
また、本発明は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ）およびジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現し、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を発現しない組換え大腸菌を利用して、基質であるゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成する方法に関するものである。 In addition, the present invention expresses daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase (dihydrodaidizein reductase), and expresses the enzyme that does not express the zeidase reductase, which expresses the enzyme that does not express the reductase, which does not express the dihydrodaidizein reductase. The present invention relates to a method for selectively synthesizing 5-hydroxy-dihydroequol from a substrate, genistein, using the above method.
具体的に、前記組換え大腸菌を全細胞触媒として利用して、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。 Specifically, 5-hydroxy-dihydroequol can be selectively synthesized from genistein using the recombinant Escherichia coli as a whole cell catalyst.
前記発明の組換え大腸菌の発現方法およびこれを利用したジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、上述した、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つをすべて発現する組換え酵素の発現方法およびこれを利用したエクオールの合成方法と同一である。 The method for expressing recombinant Escherichia coli and the method for synthesizing dihydroequol or 5-hydroxy-dihydroequol using the same according to the present invention comprise the above-described recombinant enzyme expressing all four enzymes derived from Slackia isoflavonivertens. It is the same as the expression method and the equol synthesis method using the same.
図８は、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ）と、ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ、ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＤＲ）を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ ＤＤＲＣ ＋ＤＨＤＲ）とを利用して、ダイゼインに対し全細胞反応を行ったときの、反応時間によるジヒドロエクオールの反応系内濃度を示した図表である。図８に示されているように、前記組換え大腸菌を利用して、ダイゼインからジヒドロエクオールをエクオールの生成なしに選択的に合成することができ、３つの酵素を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ ＤＤＲＣ ＋ＤＨＤＲ）を利用した場合、２つの酵素を発現する組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ）よりも生成されるジヒドロエクオールの濃度が高い。 FIG. 8 shows recombinant Escherichia coli (DZNR + DHDR) expressing daidzein reductase (daidzein reductase, DZNR), dihydrodaidzein reductase (DHDR), and daidzein reductases (daidzein NRase, daidzein reductase). (Dihydrodaidzein racemase, DDRC) and dihydrodaidzein reductase (DHDR) expressing recombinant Escherichia coli (DZNR + DDRC + DHDR) were used to react the daidzein with hydrocells by a time-dependent reaction. 4 is a table showing the concentration of equol in a reaction system. As shown in FIG. 8, dihydroequol can be selectively synthesized from daidzein without producing equol using the recombinant E. coli, and recombinant E. coli expressing three enzymes (DZNR + DDRC) can be synthesized. + DHDR) produces higher concentrations of dihydroequol than recombinant E. coli expressing two enzymes (DZNR + DHDR).
図９は、ダイゼイン還元酵素、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素、ジヒドロダイゼイン還元酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、ゲニステインに対し全細胞反応を行ったときの、初期ゲニステインの濃度による基質転換率および５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの収率を示した図表であり、図９に示されているように、前記組換え大腸菌を利用して、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを選択的に合成することができる。 FIG. 9 shows the substrate conversion rate depending on the initial genistein concentration when performing a whole cell reaction on genistein using a recombinant Escherichia coli expressing daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, and dihydrodaidzein reductase. FIG. 10 is a chart showing the yield of 5-hydroxy-dihydroequol, as shown in FIG. 9, using the recombinant E. coli to selectively synthesize 5-hydroxy-dihydroequol from genistein. Can be.
本発明の組換え大腸菌は、全細胞触媒として利用され得る。全細胞触媒は、多くの生触媒反応に利用されており、常温常圧の温和な条件で反応を進行させ、反応特異性に優れるという長所がある。補酵素が必ず必要であったり、複数段階の反応を伴う工程、あるいは精製時に酵素の活性が顕著に減少する場合などにおいては、全細胞を利用して生触媒工程を遂行することがより有利である。また、反応終了後、生成物の精製の際にも、全細胞として利用された組換え大腸菌を、遠心分離器を利用して選択的に分離することができるため有利である。 The recombinant Escherichia coli of the present invention can be used as a whole cell catalyst. Whole cell catalysts are used in many biocatalytic reactions, and have the advantage of allowing the reaction to proceed under mild conditions of normal temperature and normal pressure, and having excellent reaction specificity. In cases where a coenzyme is absolutely necessary, in a process involving multiple reactions, or when the activity of the enzyme is significantly reduced during purification, it is more advantageous to perform the biocatalytic process using whole cells. is there. In addition, after the reaction is completed, the recombinant Escherichia coli used as whole cells can be selectively separated using a centrifugal separator when the product is purified, which is advantageous.
前記合成されたエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、好気性条件で進行され得るため、嫌気性条件でエクオールを合成する従来技術に比べ、温和な条件でエクオールを合成することができる。したがって、本発明の合成方法は、従来技術において嫌気性条件を提供するために使用していた装置や技術を必要としない。 Since the method of synthesizing the synthesized equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol can be carried out under aerobic conditions, it is milder than the conventional technique of synthesizing equol under anaerobic conditions. Equol can be synthesized under the conditions. Thus, the synthesis method of the present invention does not require the equipment and techniques used in the prior art to provide anaerobic conditions.
前記合成されたエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、約０．２〜約５ｍｍｏｌ／Ｌの基質を使用することができる。 The method for synthesizing the synthesized equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol may use about 0.2 to about 5 mmol / L of the substrate.
基質であるダイゼインまたはゲニステインの濃度が０．２ｍｍｏｌ／Ｌ未満である場合には、合成されるエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの量が十分でなかったり、または精製費用も高くなり得、５ｍｍｏｌ／Ｌを超過する場合には、基質の転換率が減少して、追加の精製費用が発生し得る。 When the concentration of the substrate daidzein or genistein is less than 0.2 mmol / L, the amount of equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequol synthesized is not sufficient, or Purification costs can also be high, and if it exceeds 5 mmol / L, the conversion rate of the substrate may decrease and additional purification costs may be incurred.
好ましくは、基質の濃度が約０．２〜１ｍｍｏｌ／Ｌであり、より好ましくは、基質の濃度が約０．８〜約１ｍｍｏｌ／Ｌである。 Preferably, the concentration of the substrate is from about 0.2 to 1 mmol / L, more preferably, the concentration of the substrate is from about 0.8 to about 1 mmol / L.
ただし、反応系に水溶性高分子をさらに含む場合には、基質の濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌを超えても、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを高い収率で合成することができるため、基質の濃度は約３〜５ｍｍｏｌ／Ｌが好ましい。 However, when the reaction system further contains a water-soluble polymer, even if the concentration of the substrate exceeds 1 mmol / L, equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol can be obtained in high yield. Since the substrate can be synthesized, the concentration of the substrate is preferably about 3 to 5 mmol / L.
前記エクオールまたはジヒドロエクオールの合成方法は、ダイゼインの転換率が９５％以上であり、前記５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、ゲニステインの転換率が９５％以上である。 The method for synthesizing equol or dihydroequol has a conversion of daidzein of 95% or more, and the method for synthesizing 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol has a conversion of genistein of 95% or more.
前記転換率は、（減少した基質の濃度／初期の基質の濃度）×１００（％）を示す。 The conversion rate is (decreased substrate concentration / initial substrate concentration) × 100 (%).
また、本発明の合成方法は、基質の濃度が０．６ｍｍｏｌ／Ｌ以上においても、基質の転換率が９５％以上であり得る。 Further, in the synthesis method of the present invention, even when the substrate concentration is 0.6 mmol / L or more, the conversion rate of the substrate may be 95% or more.
図３および図５は、反応時間による、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＧＳＮ）、ジヒドロゲニステイン（ｄｉｈｙｄｒｏｇｅｎｉｓｔｅｉｎ，ＤＨＧ）、５‐ヒドロキシ‐エクオール（５ＯＨ‐ＥＱ）の反応系内濃度（μＭ）を示し、反応時間１０時間だけで、基質の転換率は９５％以上であることが示されている。 3 and 5 show the concentrations (μM) of genistein (genistin, GSN), dihydrogenistein (DHG), and 5-hydroxy-equol (5OH-EQ) in the reaction system according to the reaction time. In time alone, substrate conversion has been shown to be greater than 95%.
前記エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成方法は、反応系に水溶性高分子をさらに含むことができる。また、前記水溶性高分子は、食品添加用水溶性高分子を使用することができる。 The method for synthesizing equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol, or 5-hydroxy-dihydroequol may further include a water-soluble polymer in the reaction system. Further, as the water-soluble polymer, a water-soluble polymer for food addition can be used.
水溶性高分子としては、たとえば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅ）、ポリビニルアルコール（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ）、および、β‐シクロデキストリン（β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、メチル‐β‐シクロデキストリン（ｍｅｔｈｙｌ‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、２‐ヒドロキシプロピル‐β‐シクロデキストリン（２‐（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）‐β‐ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）などを利用することができる。好ましくは、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンを利用することができる。 Examples of the water-soluble polymer include polyethylene glycol (polyethylene glycol), polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol (polyvinyl alcohol), β-cyclodextrin, and methyl-β-cyclodextrin, methyl-β-cyclodextrin. -Β-cyclodextrin), 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin (2- (hydroxypropyl) -β-cyclodextrin) and the like can be used. Preferably, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or polyvinylpyrrolidone can be used.
反応系に水溶性高分子をさらに含むことにより、反応系内の基質の溶解度が増加するため、製造されるエクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの最終収率が増加し得る。 By further including a water-soluble polymer in the reaction system, the solubility of the substrate in the reaction system is increased, so that the final yield of equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol produced is reduced. May increase.
図１１は、実施例１の反応液に、水溶性高分子であるポリエチレングリコールまたはポリビニルピロリドンをさらに添加した反応液における（Ｓ）‐エクオールの反応系内濃度を時間により示した図表である。図１１に示されているように、反応液にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）をさらに含む場合には、５ｍｍｏｌ／Ｌの基質を使用してもエクオールを高い収率で合成することができる。 FIG. 11 is a table showing the concentration of (S) -equol in a reaction solution obtained by further adding a water-soluble polymer, polyethylene glycol or polyvinylpyrrolidone, to the reaction solution of Example 1 over time. As shown in FIG. 11, when the reaction solution further contains polyethylene glycol (PEG) or polyvinylpyrrolidone (PVP), equol can be synthesized in a high yield even when a 5 mmol / L substrate is used. Can be.
また、本発明は、前記言及した本発明の合成方法により製造される、エクオール、ジヒドロエクオール、５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールに関するものである。 The present invention also relates to equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol produced by the above-mentioned synthesis method of the present invention.
特に、本発明の合成方法により製造される５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールは、従来知られていなかった新規な化合物であって、下記化学式で表すことができる。 In particular, 5-hydroxy-dihydroequol produced by the synthesis method of the present invention is a novel compound that has not been known so far, and can be represented by the following chemical formula.
本発明は、好気性条件における基質の高い転換率により（Ｓ）‐エクオールを合成することができ、合成されたエクオールはエストロゲンと類似した分子構造を有するため、乳がんの誘発といった従来の更年期症状治療剤の副作用なしに、女性の更年期症状、特に、骨粗しょう症の発病および症状を緩和させることができ、心血管系疾患を予防し、前立腺がんを緩和させることができる。 The present invention is capable of synthesizing (S) -equol with a high conversion rate of a substrate under aerobic conditions, and the synthesized equol has a molecular structure similar to estrogen, so that conventional climacteric treatment such as induction of breast cancer can be achieved. Without the side effects of the drug, it can alleviate the onset and symptoms of climacteric symptoms in women, especially osteoporosis, prevent cardiovascular diseases and alleviate prostate cancer.
また、本発明において合成されたジヒドロエクオールは、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。 Further, the dihydroequol synthesized in the present invention can be used as an anticancer agent for treating prostate cancer and ovarian cancer.
また、本発明は、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成を、好気性条件において数時間単位で遂行可能であるため、生産費用の節減および生産物による高付加価値の獲得が可能であり、効率的な大量生産を通じて、食品、医薬品などの多様な応用先への活用が可能である。 In addition, the present invention allows the selective synthesis of 5-hydroxy-equol, dihydroequol and 5-hydroxy-dihydroequol to be performed in aerobic conditions in a matter of hours, thereby reducing production costs and increasing product yield. It can acquire added value and can be used for various applications such as foods and pharmaceuticals through efficient mass production.
また、本発明の組換え大腸菌を全細胞触媒として利用する反応系への追加的な酸化還元酵素に適用する場合、多様なヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができることから、研究的に価値が高い。 In addition, when the recombinant Escherichia coli of the present invention is applied to an additional oxidoreductase in a reaction system using as a whole-cell catalyst, various hydroxy-isoflavonoids can be synthesized, which is of high research value. .
具体的に、酸化還元酵素として、チロシナーゼ、シトクロムＰ４５０またはフラビンモノオキシゲナーゼなどを使用することができ、３’‐ヒドロキシ‐エクオール、６‐ヒドロキシ‐エクオール、８‐ヒドロキシ‐エクオール、６，３’‐ジヒドロキシ‐エクオールといったヒドロキシ‐イソフラボノイドを合成することができる。 Specifically, tyrosinase, cytochrome P450, flavin monooxygenase, or the like can be used as the oxidoreductase, and 3'-hydroxy-equol, 6-hydroxy-equol, 8-hydroxy-equol, 6,3'-dihydroxyl can be used. Hydroxy-isoflavonoids such as -equol can be synthesized.
また、本発明により合成された５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールは、更年期疾患の予防および治療に使用され得、前立腺がん、卵巣がんの治療のための抗がん剤として用いられ得る。また、化粧品または食品添加物の形態で抗酸化剤として使用され得る。 Also, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol synthesized according to the present invention can be used for prevention and treatment of climacteric diseases, and as an anticancer agent for treatment of prostate cancer and ovarian cancer. Can be used. It can also be used as an antioxidant in the form of cosmetics or food additives.
以下、本発明の具体的な方法を実施例として詳細に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the specific method of the present invention will be described in detail with reference to examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
組換え大腸菌の製造方法 Method for producing recombinant E. coli
ダイゼイン還元酵素（ｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＺＮＲ）、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒａｃｅｍａｓｅ：ＤＤＲＣ）、ジヒドロダイゼイン還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＤＨＤＲ）、テトラヒドロダイゼイン還元酵素（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｄａｉｄｚｅｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：ＴＨＤＲ）に該当するＤＮＡ配列を、ＰＣＲを通じて増幅させた後、ｐＲＳＦＤｕｅｔまたはｐＣＤＦＤｕｅｔベクターにそれぞれ入れ、これをＥ．ｃｏｌｉにおいてｈｉｓ‐ｔａｇ（６ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）のように発現した。 Daidzein reductase (DZNR), dihydrodaidzein racemase (DDRC), dihydrodaidzein reductase (DhidroZdreductase: DHDRase) After amplification through PCR, they were placed in pRSFDuet or pCDFDuet vectors, respectively, which were It was expressed in Escherichia coli as a his-tag (6 histidine).
具体的に、前記酵素の塩基配列が挿入されたｐｌａｓｍｉｄをＢＬ２１ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌに形質転換後、それぞれｐｌａｓｍｉｄに合った抗生剤を含むＬＢ固体培地において３７℃の培養器で１２時間培養した。一つのコロニーを、抗生剤を含む３ｍＬ ＬＢ液体培地に接種し、１２時間の間、３７℃の培養器で２００ｒｐｍの速度で培養した。この培養液の２ｖ％（１ｍＬ）を、５０ｍＬの抗生剤を含む新しいＬＢ液体培地に接種した。培養液のＯ．Ｄ．（６００ｎｍ）が０．６〜０．８に達すると、０．１ｍＭのＩＰＴＧと０．１ｍＭのＭｎＳＯ４を入れ、１８℃の培養器において２００ｒｐｍで１８時間、タンパク質の発現を誘導した。１８時間後、細胞は４０００ｒｐｍで遠心分離し、２５ｍＬのＰＢＳで洗浄して準備した。 Specifically, the plasmid into which the base sequence of the enzyme was inserted was transformed into BL21 competent cells, and then cultured in an incubator at 37 ° C. for 12 hours in an LB solid medium containing an antibiotic matching the plasmid. One colony was inoculated into a 3 mL LB liquid medium containing an antibiotic, and cultured in a 37 ° C incubator at a speed of 200 rpm for 12 hours. 2 v% (1 mL) of this culture was inoculated into a fresh LB broth containing 50 mL of antibiotic. O. of the culture solution D. (600 nm) when reaches 0.6-0.8, putting MnSO 4 of 0.1mM of IPTG and 0.1mM, 18 hours at 200rpm at 18 ° C. incubator, to induce expression of proteins. After 18 hours, cells were prepared by centrifugation at 4000 rpm and washing with 25 mL of PBS.
本発明の組換え大腸菌を利用した、全細胞反応系におけるエクオールの生産方法（反応法１） Production method of equol in a whole cell reaction system using the recombinant Escherichia coli of the present invention (reaction method 1)
反応器として１０〜１０００ｍｌのガラス器具を利用し、反応器に下記の濃度の組換え大腸菌および基質を供給する。 Using a 10-1000 ml glassware as a reactor, the following concentrations of recombinant E. coli and substrate are supplied to the reactor.
反応には、還元剤としてＬ‐アスコルビン酸を初期基質濃度１０倍で添加し、反応液にはｐＨ緩衝作用のために濃度２００ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウム緩衝液が含まれ、反応温度は３０℃である。反応液のｐＨは８であり、反応器の攪拌速度は１５０ｒｐｍである。本発明の反応器内の炭素供給源としてはグルコースまたはグリセロールを利用し、グルコースまたはグリセロールの濃度は２（ｗ／ｖ）％であり、組換え微生物の濃度はＯ．Ｄ．１０またはＯ．Ｄ．２０である。 In the reaction, L-ascorbic acid was added as a reducing agent at an initial substrate concentration of 10 times, and the reaction solution contained a potassium phosphate buffer having a concentration of 200 mmol / L for pH buffering, and the reaction temperature was 30 ° C. It is. The pH of the reaction solution is 8, and the stirring speed of the reactor is 150 rpm. Glucose or glycerol is used as a carbon source in the reactor of the present invention, the concentration of glucose or glycerol is 2 (w / v)%, and the concentration of recombinant microorganism is O. D. 10 or O.D. D. 20.
［実施例１］：エクオールの変換に関与する４つの酵素をすべて発現する組換え大腸菌を利用しての、ダイゼインから（Ｓ）‐エクオールの合成 [Example 1]: Synthesis of (S) -equol from daidzein using recombinant Escherichia coli expressing all four enzymes involved in equol conversion
０．２〜５ｍＭのダイゼインを、Ｏ．Ｄ．１０の前記４つの酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、反応法１のとおりに反応を進行させた。基質、中間体、生成物は、４倍数以上のエチルアセテート（ｅｔｈｙｌ ａｃｅｔａｔｅ、以下、ＥＡ）で抽出し、遠心減圧器を利用して溶媒を除去した後、一定量のメタノールに再溶解して、高性能‐液体クロマトグラフィーで物質の反応性と濃度を確認した。図１に示されている（Ｓ）‐エクオールの収率のとおり、０．２ｍＭでは９５％以上、０．４、０．６ｍＭでは８０％以上、２ｍＭでは５０％以上、５ｍＭでは２０％以上の収率を確認することができた。 0.2-5 mM daidzein was added to O.D. D. The reaction was allowed to proceed as in Reaction Method 1 using 10 recombinant E. coli expressing the above four enzymes. Substrates, intermediates, and products were extracted with 4-fold or more ethyl acetate (hereinafter, referred to as EA), the solvent was removed using a centrifugal vacuum, and then redissolved in a certain amount of methanol. The reactivity and concentration of the substance were confirmed by high performance-liquid chromatography. As shown in FIG. 1, the yield of (S) -equol is 95% or more at 0.2 mM, 80% or more at 0.4 and 0.6 mM, 50% or more at 2 mM, and 20% or more at 5 mM. The yield could be confirmed.
［実施例２］：エクオールの変換に関与する４つの酵素をすべて発現する組換え大腸菌を利用しての、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの合成 Example 2: Synthesis of 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol from genistein using recombinant E. coli expressing all four enzymes involved in equol conversion
５００μＭのゲニステイン（図２．ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）を、Ｏ．Ｄ．１０の前記４つの酵素を発現する組換え大腸菌を利用して、反応法１のとおりに反応を進行させた。基質、中間体、生成物は、４倍数以上のエチルアセテート（ＥＡ）で抽出し、遠心減圧器を利用して溶媒を除去した後、一定量のメタノールに再溶解して、高性能‐液体クロマトグラフィーで物質の反応性と濃度を確認した。反応６時間で、５００μＭのゲニステインは９９％以上転換され、５‐ヒドロキシ‐エクオール９７ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール２２ｍｇ／Ｌが生成されることを確認した。 500 μM of genistein (FIG. 2. genstein) was added to O.D. D. The reaction was allowed to proceed as in Reaction Method 1 using 10 recombinant E. coli expressing the above four enzymes. Substrates, intermediates, and products are extracted with 4 times or more of ethyl acetate (EA), the solvent is removed using a centrifugal vacuum, and then redissolved in a certain amount of methanol to obtain high performance liquid chromatography. The reactivity and concentration of the substance were confirmed by chromatography. At 6 hours after the reaction, it was confirmed that 500 μM of genistein was converted by 99% or more, and 5-hydroxy-equol 97 mg / L and 5-hydroxy-dihydroequol 22 mg / L were produced.
前記のような組成を通じて、１ｍＭのゲニステインを、反応法１を通じた反応を進行させ、図３から確認できるように、反応時間１０時間だけで基質転換率は９５％以上、５‐ヒドロキシ‐エクオール１９９ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール６３ｍｇ／Ｌを生産することができた。 Through the above composition, 1 mM of genistein was allowed to progress through the reaction method 1, and as can be seen from FIG. 3, the substrate conversion rate was 95% or more in only 10 hours of reaction and 199 mg of 5-hydroxy-equol. / L, 5-mg / L of 5-hydroxy-dihydroequol could be produced.
［実施例３］：区画化された反応系を利用した、５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択的合成 [Example 3]: Selective synthesis of 5-hydroxy-equol using a compartmentalized reaction system
図４の模式図のように、ダイゼイン還元酵素とジヒドロダイゼインラセミ化酵素を発現する組換え大腸菌１と、ジヒドロダイゼイン還元酵素とテトラヒドロダイゼイン還元酵素を発現する組換え大腸菌２とを全細胞触媒として混合する生転換反応系を構築した。１ｍＭのゲニステインを、反応法１に従って反応を進行させた場合、図５のように、反応時間による基質、生成物の濃度を液体クロマトグラフィーで確認した。本反応系は、反応時間６時間だけで、基質転換率は９９％以上、５‐ヒドロキシ‐エクオール２３１ｍｇ／Ｌ、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオール１２ｍｇ／Ｌを生産した。生産結果を、実施例１の結果と比較した場合、５‐ヒドロキシ‐エクオールの生産性は１．６倍増加し、５‐ヒドロキシ‐エクオールの濃度／５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの濃度で定義される５‐ヒドロキシ‐エクオールの選択性は５倍増加した。 As shown in the schematic diagram of FIG. 4, a recombinant Escherichia coli 1 expressing daidzein reductase and dihydrodaidzein racemase and a recombinant Escherichia coli 2 expressing dihydrodaidzein reductase and tetrahydrodaidzein reductase were mixed as whole cell catalysts. A biotransformation reaction system was constructed. When the reaction was allowed to proceed with 1 mM genistein according to Reaction Method 1, as shown in FIG. 5, the concentrations of the substrate and the product depending on the reaction time were confirmed by liquid chromatography. This reaction system produced a substrate conversion rate of 99% or more and 5-hydroxy-equol 231 mg / L and 5-hydroxy-dihydroequol 12 mg / L in only 6 hours. When the production results are compared with those of Example 1, the productivity of 5-hydroxy-equol is increased by a factor of 1.6, defined by the concentration of 5-hydroxy-equol / 5-hydroxy-dihydroequol. The selectivity for 5-hydroxy-equol was increased 5-fold.
また、４つの酵素の発現量を比較するために、実施例２における組換え大腸菌ならびに実施例３における組換え大腸菌１および２の細胞抽出物を、超音波処理により破砕して準備し、細胞抽出物は、３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した後、上澄み液を得て、図６のとおり、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分析した。 In order to compare the expression levels of the four enzymes, the cell extracts of the recombinant Escherichia coli in Example 2 and the recombinant Escherichia coli 1 and 2 in Example 3 were prepared by crushing by sonication. The product was centrifuged at 13000 rpm and 4 ° C. for 30 minutes to obtain a supernatant, which was analyzed by SDS-PAGE as shown in FIG.
分析の結果、４つの酵素の発現量において、実施例２で使用した大腸菌よりも、実施例３で使用した２つの組換え大腸菌においてすべて増加した。そのうち、テトラヒドロダイゼイン還元酵素の発現量が顕著に増加し、実施例１の大腸菌破砕液と対比して２０倍以上増加し、残りの３つの酵素の発現量に比べて５倍以上過発現された。 As a result of the analysis, the expression levels of the four enzymes all increased in the two recombinant Escherichia coli used in Example 3 compared to the Escherichia coli used in Example 2. Among them, the expression level of tetrahydrodaidzein reductase was remarkably increased, increased 20 times or more as compared with the disrupted Escherichia coli of Example 1, and overexpressed 5 times or more compared to the expression levels of the remaining three enzymes. .
［実施例４］：５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学異性体の分析 [Example 4]: Analysis of optical isomers of 5-hydroxy-equol
本発明の組換え大腸菌で合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールの光学構造を決定するために、円二色性分散スペクトル分析を進行させた。測定波長範囲は２１０〜３２０ｎｍであり、円二色性分散計ＣｈｉｒａｓｃａｎＴＭ ｐｌｕｓ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＵＫ）を利用した。試料を、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度で、純粋なメタノールに溶かした後、測定した。 In order to determine the optical structure of 5-hydroxy-equol synthesized in the recombinant E. coli of the present invention, circular dichroism dispersion spectrum analysis was proceeded. The measurement wavelength range was 210 to 320 nm, and a circular dichroism dispersometer Chirascan ™ plus CD spectrometer (Applied Photophysics, UK) was used. Samples were measured after dissolving in pure methanol at a concentration of 1.5 mg / ml.
測定結果は、図７にグラフで示し、２３８ｎｍにおいて高い大きさの陰性のコットン（ｃｏｔｔｏｎ）効果を示し、２７０ｎｍにおいて高い大きさの陽性のコットン効果を示した。したがって、本発明の組換え大腸菌により生合成された５‐ヒドロキシエクオールは３番の炭素においてＳ‐形態を有することを確認することができた。 The measurement results are shown graphically in FIG. 7 and showed a high magnitude negative cotton effect at 238 nm and a high magnitude positive cotton effect at 270 nm. Therefore, it was confirmed that 5-hydroxyequol biosynthesized by the recombinant Escherichia coli of the present invention has an S-form at the third carbon.
［実施例５］：ジヒドロエクオールの選択的合成 [Example 5]: Selective synthesis of dihydroequol
ジヒドロエクオールを生合成するために、実施例１の組換え大腸菌においてテトラヒドロダイゼイン還元酵素が欠損し、ジヒドロダイゼインラセミ化酵素を含むか（ＤＺＮＲ＋ＤＤＲＣ＋ＤＨＤＲ、以下、ＤＤＤ菌株）、または含まない組換え大腸菌（ＤＺＮＲ＋ＤＨＤＲ、以下、ＤＤ菌株）を作製した。前記大腸菌を利用して、反応法１に従ってダイゼインを基質とする反応を進行させ、さらに反応液にホウ酸２００ｍＭを添加した。その結果、エクオールを生成することなく、ジヒドロエクオールのみが生成されることを確認し（図８）、具体的に、初期ダイゼインの濃度を０．５ｍＭとして生転換反応を開始して２時間反応させた場合、ＤＤ菌株においては２８μＭ、ＤＤＤ菌株においては６０μＭのジヒドロエクオールが合成された。 In order to biosynthesize dihydroequol, the recombinant Escherichia coli of Example 1 lacks tetrahydrodaidzein reductase and contains dihydrodaidzein racemase (DZNR + DDRC + DHDR; hereinafter, DDD strain) or does not contain recombinant E. coli (DZNR + DHDR) , Hereinafter referred to as DD strain). Using Escherichia coli, a reaction using daidzein as a substrate was allowed to proceed according to Reaction Method 1, and 200 mM boric acid was further added to the reaction solution. As a result, it was confirmed that only dihydroequol was produced without producing equol (FIG. 8). Specifically, the biotransformation reaction was started at an initial daidzein concentration of 0.5 mM and reacted for 2 hours. In this case, 28 μM of dihydroequol was synthesized in the DD strain and 60 μM in the DDD strain.
［実施例６］：５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの選択的合成 Example 6: Selective synthesis of 5-hydroxy-dihydroequol
５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを生合成するために、実施例２の組換え大腸菌においてテトラヒドロダイゼイン還元酵素がプラスミドから欠損した組換え大腸菌を作製した。前記大腸菌を利用して、反応法１に従ってゲニステインを基質とする反応を進行させ、５‐ヒドロキシ‐エクオールを生成することなく、５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールのみ生成されることを確認した（図９）。初期ゲニステインの濃度を０．２、０．４、０．６、１．０ｍＭとして生転換反応を開始して３６時間反応させた場合、ゲニステインの転換率は、０．６ｍＭ以下では９９％以上であり、１．０ｍＭで９７％であった。５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの転換収率は、それぞれ４４、３５、２７、３９％であった。 For biosynthesis of 5-hydroxy-dihydroequol, a recombinant E. coli in which the tetrahydrodaidzein reductase was deleted from the plasmid in the recombinant E. coli of Example 2 was prepared. Using Escherichia coli, a reaction using genistein as a substrate was allowed to proceed according to Reaction Method 1, and it was confirmed that only 5-hydroxy-dihydroequol was produced without producing 5-hydroxy-equol (FIG. 9). . When the biotransformation reaction was started at an initial genistein concentration of 0.2, 0.4, 0.6, or 1.0 mM and reacted for 36 hours, the conversion rate of genistein was 99% or more at 0.6 mM or less. And 97% at 1.0 mM. The conversion yields of 5-hydroxy-dihydroequol were 44, 35, 27 and 39%, respectively.
［実施例７］：５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールの質量分析 [Example 7]: Mass spectrometry of 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequol
実施例３と６において合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを、ガスクロマトグラフィー‐質量分析器（ＧＣ‐ＭＳ）を通じて同定し、その結果は図１０に明示した。 5-Hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequol synthesized in Examples 3 and 6 were identified through gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the results are shown in FIG.
前記組換え微生物で合成した５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロ‐エクオールをＥＩ‐ＭＳで分析した。ＥＩ‐ＭＳは、Ｔｈｅｒｍｏ社のＴＲＡＣＥ ＧＣ Ｕｌｔｒａ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ／ＩＴＱ１１００を利用した。陽性モードで無極性のキャピラリーカラム（ＴＲ‐５ ｍｓ）を利用し、ヘリウムガス流速は１ｍｌ／ｍｉｎとし、ｉｎｌｅｔ、ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｌｉｎｅ、ｉｏｎ ｓｏｕｒｃｅの温度はそれぞれ２５０、２７５、２３０℃とした。ガスクロマトグラフのオーブン温度は、６５℃で５分間維持した後、３℃／ｍｉｎの速度で２５０℃まで増加する。イオン化電圧は７０ｅＶであり、測定質量範囲は５０〜６００ａｍｕであった。 5-Hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydro-equol synthesized by the recombinant microorganism were analyzed by EI-MS. The EI-MS used was a TRACE GC Ultra gas chromatograph / ITQ1100 from Thermo. The helium gas flow rate was 1 ml / min using a nonpolar capillary column (TR-5 ms) in the positive mode, and the temperatures of the inlet, mass transfer line, and ion source were 250, 275, and 230 ° C., respectively. The oven temperature of the gas chromatograph is maintained at 65 ° C. for 5 minutes and then increases at a rate of 3 ° C./min to 250 ° C. The ionization voltage was 70 eV and the measured mass range was 50-600 amu.
ＥＩ‐ＭＳ分析の結果は、以前に報告されたＤＨＤのスペクトルと同一であるものと示された（Ｃｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．，ａｎｄ Ｍ．Ｇ．Ｎａｉｒ．Ｊ．Ｎａｔｒ．Ｐｒｏｃ．５８：１８９２‐１８９６，１９９５；Ｗａｈａｌａ，Ｋ．，Ａ．Ｓａｌａｋｋａ，ａｎｄ Ｈ．Ａｄｌｅｒｃｒｅｕｔｚ．Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２１７：２９３‐２９，１９９８）。合成された化合物のＥＩ‐ＭＳは、予想のとおり、ｍ／ｚ２５６においてＣ１５Ｈ１２Ｏ４（ＤＨＤ）と一致する［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンピークを示した。合成された化合物の他のイオンピークは、１３７（１００）、１２０（５２）、９１（３６）、６５（１６）であった。 The result of the EI-MS analysis was shown to be identical to the previously reported DHD spectrum (Chang, YC, and MG Nair. J. Natr. Proc. 58: 1892-). Wahala, K., A. Salakka, and H. Adlercreutz. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217: 293-29, 1998). EI-MS of the synthesized compound showed a [M + H] + molecular ion peak at m / z 256, consistent with C 15 H 12 O 4 (DHD), as expected. The other ion peaks of the synthesized compound were 137 (100), 120 (52), 91 (36), and 65 (16).
［実施例８］：水溶性高分子をさらに含む反応系におけるエクオールの合成 [Example 8]: Synthesis of equol in a reaction system further containing a water-soluble polymer
ダイゼインの反応液に対する溶解度を向上させるために、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下、ＤＭＳＯ）を含み、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）をさらに含むこと以外には、実施例１と同一に反応を進行させた。 In order to improve the solubility of daidzein in the reaction solution, the same as in Example 1 except that it contains dimethyl sulfoxide (hereinafter, DMSO) and further contains polyethylene glycol (PEG) or polyvinylpyrrolidone (PVP). The reaction was allowed to proceed.
具体的に、ダイゼイン５ｍＭにおけるエクオールの収率を増加させるために、水溶性高分子ＰＥＧまたはＰＶＰ５％（ｗ／ｖ）をさらに含む反応器において反応を進行させ、ＰＶＰを添加した反応の場合、反応時間１２時間だけで５ｍＭのエクオールが合成され（収率９９％以上、１．１６ｇ／Ｌ）、ＰＥＧを添加した反応の場合、反応時間２４時間だけで３．７ｍＭのエクオールが合成された（収率７４％以上、０．９ｇ／Ｌ）。 Specifically, in order to increase the yield of equol at 5 mM daidzein, the reaction was allowed to proceed in a reactor further containing 5% (w / v) of a water-soluble polymer PEG or PVP. 5 mM equol was synthesized only in 12 hours (yield 99% or more, 1.16 g / L). In the case of the reaction to which PEG was added, 3.7 mM equol was synthesized only in 24 hours of reaction (yield). Rate of at least 74%, 0.9 g / L).
前記実施例１および２によれば、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス由来の酵素４つを発現する組換え大腸菌により、好気性条件において、数時間内に、高収率で、ダイゼインから（Ｓ）‐エクオールを合成したり、ゲニステインから５‐ヒドロキシ‐エクオールおよび５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成することができた。 According to Examples 1 and 2, the recombinant Escherichia coli expressing the four enzymes derived from Slackia isoflavoni transformants produced a large yield of daidzein from daidzein within several hours under aerobic conditions. Equol could be synthesized and 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequol could be synthesized from genistein.
前記実施例３、５および６においては、酵素４つの酵素のうち２つまたは３つの酵素を組み合わせた組換え大腸菌を利用して、５‐ヒドロキシ‐エクオール、ジヒドロエクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールをそれぞれ選択的に合成することができた。 In Examples 3, 5 and 6, 5-hydroxy-equol, dihydroequol or 5-hydroxy-dihydroequol was prepared using recombinant Escherichia coli combining two or three of the four enzymes. Each of them could be selectively synthesized.
また、前記実施例４および７を通じて、実施例２、３および６による組換え大腸菌が５‐ヒドロキシ‐（Ｓ）‐エクオールまたは５‐ヒドロキシ‐ジヒドロエクオールを合成することを確認することができた。 In addition, through Examples 4 and 7, it was confirmed that the recombinant Escherichia coli according to Examples 2, 3, and 6 synthesized 5-hydroxy- (S) -equol or 5-hydroxy-dihydroequol.
また、前記実施例８においては、反応系に水溶性高分子をさらに含むことにより、水溶性高分子を含んでいない反応系（実施例１）に比べて、エクオールの収率に優れることを確認することができた。 Further, in Example 8, it was confirmed that by further including the water-soluble polymer in the reaction system, the yield of equol was superior to that of the reaction system not including the water-soluble polymer (Example 1). We were able to.
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