KR102005237B1 - Recombinant e.coli producing equol derivatives and method for producing equol derivatives using thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 (Slackia isoflavoniconvertens) 유래의 효소 (daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, tetrahydrodaidzein reductase)를 발현시킨 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인 또는 제니스테인 (genistein)으로부터 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol)을 선택적 및 효율적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.
또한, 상기 미생물 균주와 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 발현하는 생변환 조성물은 항산화제, 항암제 등으로 사용할 수 있으며, 갱년기 질환의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.The present invention relates to a method for producing a recombinant Escherichia coli which expresses an enzyme (daidzein reductase, dihydrodaidzein racemase, dihydrodaidzein reductase, tetrahydrodaidzein reductase) derived from Slackia isoflavoniconvertens , , 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dehydroequol, in the presence of a catalyst, such as a catalyst.
In addition, the biotransformation composition expressing the microbial strain and 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydrocodeol can be used as an antioxidant, an anti-cancer agent, etc. and can be used for the prevention or treatment of menopausal diseases .
Description
본 발명은 에쿠올 유도체를 생산하는 재조합 대장균 및 이를 이용한 에쿠올 유도체 합성 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant Escherichia coli producing an equol derivative and a method for synthesizing an equol derivative using the same.
사람의 장내 미생물 중 일부 혐기성 미생물은 사람이 콩과 식물을 통해 섭취한 이소플라본을 대사하여 에쿠올로 생변환하는 것이 알려져 있다. 지금까지 발견된 에쿠올 합성 미생물은 전부 박테리아이며, 대표적으로 슬래키아 속 (Slackia sp.), 에그게르텔라 속 (Eggerthella sp.), 애들러크루찌아 속 (Adlercreutizia sp.)과 같이 대부분이 코리오박테리아속에 속해 있으며, 예외적으로 락토코커스 (Lactococcus) 유래도 존재한다. It is known that some anaerobic microorganisms in intestinal microorganisms of humans metabolize isoflavones that people ingest through soybean plants and convert them into equol. The ecological synthesized microorganisms discovered so far are all bacteria, and most of them are bacteria such as Slackia sp., Eggerthella sp., Adlercreutizia sp. , And the exception is Lactococcus .
위와 같은 장내 미생물의 효소 반응으로 만들어진 에쿠올은 S 구조의 광학이성질체만 합성되며, 이는 사람의 인체에 흡수되어 식물성 에스트로겐 (phytoestrogen) 효과를 보임이 알려져 있다. 따라서 에쿠올을 꾸준히 섭취할 경우, 유방암 유발과 같은 종래의 갱년기증상 치료제의 부작용없이 여성의 갱년기 증상, 특히 골다공증의 발병 및 증상이 완화됨이 증명되었다. 이와 같은 효과는 에쿠올의 분자 구조가 사람의 에스트로겐과 유사성을 가지며, 에스트로겐 수용체 α와 β 중 α 에 선택성이 높기 때문이다. 이 뿐만 아니라 (S)-에쿠올은 심혈관계 질환을 예방하며 전립선암을 완화시키는 효능도 밝혀져 있다(비특허문헌 1). 에쿠올의 유사체인 5-하이드록시-에쿠올은 이소플라본인 제니스테인(genistein)으로부터 유래된 물질로서 에쿠올에 비해 밝혀진 생물학적 효능은 상대적으로 적지만 에쿠올보다 뛰어난 항산화성을 보이는 식물성 에스트로겐임이 보고되었다(비특허문헌 2). 또한, 디하이드로에쿠올(dehydroequol)은 전립선암과 난소암 세포의 성장을 억제한다는 보고가 있으며, 임상 2기 시험 결과 화학 항암제에 내성이 생긴 난소암의 억제에 효과가 있음이 보고되었다(비특허문헌 3). It is known that the equol produced by the enzymatic reaction of intestinal microorganism as described above only synthesizes the optical isomer of the S structure, which is absorbed by the human body and shows a phytoestrogen effect. Thus, steady ingestion of equol has been shown to alleviate the symptoms of women's menopausal symptoms, particularly osteoporosis, without symptoms of conventional menopausal symptoms such as breast cancer induction. This is because the molecular structure of equol has a similarity with human estrogen and is highly selective for α among estrogen receptors α and β. In addition, (S) -equal has been shown to prevent cardiovascular disease and to alleviate prostate cancer (Non-Patent Document 1). It has been reported that 5-hydroxy-equol, an analogue of equol, is a plant-derived estrogen which is derived from isoflavone genistein and exhibits an antioxidative activity comparable to that of equol, though its biological efficacy is relatively small compared to equol (Non-Patent Document 2). In addition, it has been reported that dehydroequol inhibits the growth of prostate cancer and ovarian cancer cells, and it has been reported that
그러나, 장내 미생물을 이용하는 에쿠올 합성을 위한 다양한 노력과 연구와는 달리 5-하이드록시-에쿠올에 대한 합성 노력은 제한적이었다. 단지 에쿠올을 생합성하는 몇몇 장내 미생물이 5-하이드록시-에쿠올을 합성할 수 있음이 이하와 같이 보고되었다. 쥐의 장에서 동정한 코리오박테리아 Strain Mt1B8과 사람의 대변에서 동정한 슬래키아 이소플라보니컨버턴스를 이용하여 제니스테인이 다이하이드로제니스테인을 거쳐 5-하이드록시-에쿠올로 생합성 됨이 밝혀졌다(비특허문헌 4). 하지만 이러한 균주를 이용한 5-하이드록시 에쿠올 생산은 미생물을 혐기 조건에서 생장시키는 것에 대한 제한점이 있고, 미생물 접종 후부터 최소 15시간 이후부터 5-하이드록시 에쿠올이 생산되며 생산성이 낮고, 표준 물질의 부재로 인한 정확한 최종 수율 예측이 어렵다는 한계점이 존재한다.However, unlike a variety of efforts and studies for the synthesis of equol using intestinal microorganisms, synthetic efforts for 5-hydroxy-equol have been limited. It has been reported that some intestinal microbes biosynthesizing equol may synthesize 5-hydroxy-equol as follows. Genistein was found to be biosynthesized by 5-hydroxy-equol via dihydrogenentin using the Coryobacterium strain Mt1B8 identified in the rat's intestine and the slaky isois flavone converts identified in the human feces Non-Patent Document 4). However, the production of 5-hydroxy-equol using these strains is limited to the growth of microorganisms under anaerobic conditions, the production of 5-hydroxyequaurs is at least 15 hours after the microbial inoculation, the productivity is low, There is a limitation that it is difficult to accurately predict the final yield due to the absence of the material.
이소플라본 중 하나인 제니스테인(genistein)은 미생물 Coriobacteriacae Strain Mt1B8(16), 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens)(17), strain AUH-JLC159 에 의해서 5-하이드록시-에쿠올로 생전환됨이 보고된 적이 있으나 반응 및 배양 시간이 2~3일로 길며, 혐기성 반응 조건을 요구하고, 기질인 제니스테인의 양이 0.6 mmol/L 이상일 경우 전환율이 80% 이하로 떨어지는 문제점이 존재한다(특허문헌 1). One of the isoflavones, genistein, was converted to 5-hydroxy-equol by the microorganisms Coriobacteriacae Strain Mt1B8 (16), Slackia isoflavoniconvertens (17), strain AUH-JLC159 There is a problem that the conversion and the conversion time are less than 80% when the amount of the substrate is 0.6 mmol / L or more (see Patent Document 1 ).
합성된 5-하이드록시-에쿠올은 DPPH 라디칼 포착 효과가 (S)-에쿠올의 20배이며, 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 수명과 스트레스 저항성을 증가시킴이 증명되었다(비특허문헌 5). 그러나 5-하이드록시-에쿠올의 그 외의 생리적 활성은 밝혀진 바가 없다.The synthesized 5-hydroxy-equol proved that DPPH radical scavenging effect is 20 times that of (S) -equal and increases life span and stress resistance of Caenorhabditis elegans (Non-Patent Document 5) . However, other physiological activities of 5-hydroxy-equol have not been elucidated.
근래에 락토코커스 및 슬래키아 속의 박테리아에서 이소플라본 다이드제인 (daidzein)을 에쿠올로 변환시키는 역할을 하는 4개의 효소가 2013년 Annett Braune 그룹에 의해 처음으로 동정되었다(비특허문헌 6). 상기 효소는 3개의 환원효소와 1개의 이성질화 효소로 구성되어 있으며, 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)이다. Recently, four enzymes that are responsible for converting the isoflavone daidzein to the equol in bacteria of Lactococcus and Slaughter were first identified by the Annett Braune group in 2013 (Non-Patent Document 6). The enzyme is composed of three reducing enzymes and one isomerizing enzyme and is composed of a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein (dihydrodaidzein) reductase, and tetrahydrodaidzein reductase.
본 발명의 목적은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4개를 발현하는 재조합 대장균을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 신규한 화합물인 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 제공하는 것이며, 이에 대한 합성 방법은 전무하였다.It is an object of the present invention to provide a recombinant Escherichia coli expressing four enzymes derived from a slaky isoflavonikconvens.
Another object of the present invention is to provide a novel compound, 5-hydroxy-dihydro etchol, which has not been synthesized.
이에, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인 또는 제니스테인으로부터 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for synthesizing equol, dihydroequor, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroquercol from daidzein or genistein using the recombinant E. coli .
또한, 본 발명의 다른 목적은 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4 개 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합하여 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적 및 효율적으로 합성하는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a recombinant Escherichia coli expressing a combination of two or three enzymes out of four enzymes derived from a slaky isoflavonikonvirtense. The recombinant Escherichia coli expressing 5-hydroxy-equol, And a process for selectively and efficiently synthesizing 5-hydroxy-dihydrocodeol.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 사람의 장내 미생물인 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens)유래의 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균 및 상기 4 개의 효소 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합하여 발현하는 재조합 대장균을 제조하였다.In order to achieve the above object, the present inventors have found that a daidzein reductase derived from Slackia isoflavoniconvertens , which is intestinal microorganism of human, a dihydrodaidzein racemase (dihydrodaidzein racemase) ), A dihydrodaidzein reductase, a tetrahydrodaidzein reductase, and a recombinant Escherichia coli expressing a combination of two or three enzymes among the four enzymes .
또한, 본 발명의 재조합 대장균은 다이드제인(daidzein)으로부터 에쿠올(equol) 또는 디하이드로에쿠올(dehydroequol)을 생변환하는 전세포 촉매(whole cell biocatalyst)로 이용될 수 있으며, 제니스테인을 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올로 선택적으로 생전환하는 전세포 촉매로 이용될 수 있다.In addition, the recombinant E. coli of the present invention can be used as a whole cell biocatalyst for biotransformation of equol or dehydroequol from daidzein, Hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydrocourea. ≪ / RTI >
본 발명은 호기성 조건에서 기질의 농도 약 0.2 내지 약 1 mmol/L 에서 95 % 기질 전환율로 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 생합성할 수 있다.The present invention relates to a process for the biosynthesis of equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequor with a substrate concentration of from about 0.2 to about 1 mmol / can do.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.In addition, the present invention can selectively synthesize 5-hydroxy-equol, dihydroequor or 5-hydroxy-dihydroequoir.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성을 호기성 조건에서 수 시간 단위로 수행 가능하므로, 생산 비용 절감 및 생산물로 인한 고부가가치 획득이 가능하며, 효율적인 대량생산을 통해 식품, 의약품 등의 다양한 응용처에 활용이 가능하다.The present invention also provides for the selective synthesis of 5-hydroxy-equol, dihydroequol and 5-hydroxy-dihydroequccol under aerobic conditions in hours to hours, It can be used for a variety of applications such as foods and pharmaceuticals through efficient mass production.
또한, 본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 반응계에 추가적인 산화환원효소에 적용할 경우, 다양한 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있어 연구적으로 가치가 높다.In addition, when the recombinant E. coli of the present invention is applied to a reaction system using a whole cell catalyst as an additional oxidoreductase, various hydroxy-isoflavonoids can be synthesized, which is highly valuable in research.
또한, 본 발명에 의해 합성된 화합물은 갱년기 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다. 또한, 화장품 또는 식품첨가물 형태로 항산화제로 사용될 수 있다.In addition, the compound synthesized by the present invention can be used for prevention and treatment of menopausal diseases, and can be used as an anticancer agent for the treatment of prostate cancer and ovarian cancer. It can also be used as an antioxidant in the form of a cosmetic or food additive.
도 1 은 초기 다이드제인의 농도에 따른 (S)-에쿠올의 수율을 나타낸 도표이다.
도 2 는 4 개 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용한 에쿠올(equol), 디하이드로에쿠올(dehydroequol), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol) 합성 반응의 도식도이다.
도 3 은 도 2 의 합성 반응에 있어서, 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인 (dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol, 5OH-EQ), 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타낸다.
도 4 는 2 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균 1 및 2 를 이용하여 구획화된 합성 반응의 도식도이다.
도 5 는 도 4 의 합성 반응에 있어서, 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인(dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol, 5OH-EQ), 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타낸다.
도 6 는 도 2 및 4 에서 언급한 재조합 대장균의 세포 추출물에서 단백질의 양을 SDS-PAGE로 나타낸 것이다.
도 7 은 210~320 nm 파장 범위에서 원이색성 분산계를 이용하여 타원율을 측정한 도표이다.
도 8는 2개 또는 3개의 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응 시간에 따른 디하이드로에쿠올(dehydroequol)의 반응계 내 농도(μM)를 나타낸다.
도 9 은 초기 제니스테인의 농도에 따른 기질 전환율 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 수율을 나타낸 도표이다.
도 10 의 (가)는 5-하이드록시-에쿠올의 EI-MS로 분석한 질량 스펙트럼과 분자구조이고, (나)는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 질량 스펙트럼과 분자구조이다.
도 11 은 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone, 이하 PVP)을 첨가한 반응액에서의 (S)-에쿠올의 반응계 내 농도를 시간에 따라 나타낸 도표이다.1 is a chart showing the yield of (S) -equal with the concentration of initial daidzein.
FIG. 2 is a graph showing the effect of the equol, the dehydroequol, the 5-hydroxy-equol and the 5-hydroxy-dihydroxy compound, which are recombinant Escherichia coli expressing all four enzymes, (5-hydroxy-dehydroequol) synthesis reaction.
FIG. 3 is a graph showing the results of reaction of genistein (GSN), dihydrogenistein (DHG), 5-hydroxy-equol, 5OH-EQ, (ΜM) of 5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ in the reaction system.
FIG. 4 is a schematic diagram of a synthetic reaction compartmentalized using
FIG. 5 is a graph showing the results of reaction of genistein (GSN), dihydrogenistein (DHG), 5-hydroxy-equol, 5OH-EQ, (ΜM) of 5-hydroxy-dehydroequol, 5-OH-DEQ in the reaction system.
Figure 6 shows the amount of protein in the cell extract of recombinant E. coli referred to in Figures 2 and 4 by SDS-PAGE.
FIG. 7 is a chart for measuring the ellipticity using a circular dichroism dispersion system in a wavelength range of 210 to 320 nm. FIG.
Figure 8 shows the concentration (μM) of dehydroequol in the reaction system with the reaction time using recombinant E. coli expressing two or three enzymes.
FIG. 9 is a chart showing the substrate conversion and the yield of 5-hydroxy-dihydroequoir according to the concentration of the initial genistein.
Figure 10 (a) shows the mass spectrum and molecular structure of the 5-hydroxy-equol analyzed by EI-MS and (b) is the mass spectrum and molecular structure of 5-hydroxy-dihydroequour.
11 is a graph showing the concentration of (S) - equol in the reaction system with time in the reaction solution containing polyethylene glycol (PEG) or polyvinyl pyrrolidone (PVP) It is a chart.
본 발명에서 사용되는 용어는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 것으로 당업자라면 그 의미를 누구나 이해할 수 있을 것이나, 본 명세서에서 간략히 설명하면 다음과 같다:The term used in the present invention is commonly used in the art and anyone skilled in the art can understand the meaning thereof, but here is briefly described as follows:
(1) 발현: 재조합 유전자를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물에서 재조합 단백질을 생산하는 것을 의미한다.(1) Expression: means production of a recombinant protein in a microorganism containing a vector containing a recombinant gene.
(2) 벡터 - 단일가닥, 이중가닥, 원형 또는 초나선 DNA 또는 RNA로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 벡터는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 적절한 거리에 작동적으로 연결되어 있는 복제 오리진, 프로모터, 리보솜 결합부위, 핵산 카세트, 종결 등으로 구성되어 있다. 발현할 재조합 단백질에 코딩하는 유전자를 핵산 카세트 위치에 삽입한다.(2) Vector - means a polynucleotide consisting of single strand, double strand, circular or super stranded DNA or RNA. The vector consists of a cloned origin, a promoter, a ribosome binding site, a nucleic acid cassette, and a terminator operatively linked at appropriate distances to produce a recombinant protein. The gene encoding the recombinant protein to be expressed is inserted into the nucleic acid cassette.
(3) 세포 추출물 - 재조합 단백질이 발현된 미생물을 파쇄한 후, 원심분리기로 고형 세포 찌꺼기를 제거한 후의 상등액을 의미한다. 본 발명에서는 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소, 테트라하이드로다이드제인 환원효소 중 일부 또는 전부가 발현된 미생물 추출물을 의미한다.(3) Cell Extract - refers to the supernatant obtained by disrupting the microorganism expressing the recombinant protein and removing the solid cell debris with a centrifuge. The term "microorganism extract" means a microorganism extract in which some or all of a reducing enzyme such as a daidzein reductase, a dihydroididase, a racemizing enzyme, a dihydroididase reductase, or a tetrahydroididase is expressed in the present invention.
(4) 전세포 반응 - 특정 효소를 포함하는 세포를 파쇄하여 세포추출물을 이용하거나 또는 효소를 분리정제하지 않고 온전한 세포 전체를 이용한 반응을 의미한다.(4) Whole Cell Reaction - This refers to a reaction using whole cell without extracting or purifying the enzyme by using cell extract to disrupt cells containing specific enzyme.
본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균에 관한 것이다.The present invention relates to a process for the production of a pharmaceutical composition comprising a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase and a tetrahydrodaidzein reductase, Lt; RTI ID = 0.0 > E. coli. ≪ / RTI >
본 발명에서는 슬래키아 이소플라보니컨버턴스(Slackia isoflavoniconvertens) 유래의 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소, 테트라하이드로다이드제인 환원효소에 해당하는 DNA서열을 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 통해 증폭 시킨 후, pRSFDuet 또는 pCDFDuet 벡터에 각각 넣고 이를 E. coli에서 his-tag(6 histidine)과 같이 발현하였다.In the present invention, there is provided a method for producing a compound of formula (I), which is a reducing enzyme which is a sideroid derived from Slackia isoflavoniconvertens , a racemizing enzyme which is a dihydroidide, a reducing enzyme which is a dihydroidide, The DNA sequence was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and inserted into pRSFDuet or pCDFDuet vector, which was expressed in E. coli as his-tag (6 histidine).
상기 재조합 대장균은 기질인 다이드제인으로부터 에쿠올 또는 디하이드로에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.The recombinant E. coli can be used to synthesize equol or dihydrocequal from the substrate daidzein.
또한, 상기 재조합 대장균은 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.In addition, the recombinant E. coli can be used to synthesize 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydrocequal from the substrate, genistein.
상기 에쿠올 또는 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은 (S)-에쿠올 또는 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 합성하는데 이용될 수 있다.The equol or 5-hydroxy-equol synthesis method can be used to synthesize (S) -equol or 5-hydroxy- (S) -equol.
보다 구체적으로, 상기 재조합 대장균은 다이드제인(daidzein)으로부터 에쿠올(equol) 및 디하이드로에쿠올(dehydroequol)을 생변환하는 전세포 촉매(whole cell biocatalyst)로 이용될 수 있으며, 또한, 제니스테인을 5-하이드록시-에쿠올(5-hydroxy-equol) 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올(5-hydroxy-dehyroequol)로 생전환하는 전세포 촉매로 이용될 수 있다.More specifically, the recombinant E. coli can be used as a whole cell biocatalyst for biotransformation of equol and dehydroequol from daidzein, and also can be used as a whole cell biocatalyst, It can be used as a whole-cell catalyst for biotransformation into 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dehyroequol.
본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 에쿠올 합성 반응에는, 환원제를 첨가하여 생성물의 산화를 억제하며, 환원제로서, NAD(P)H, L-아스코빅산, 글루타티온(glutathione), 다이타이오트레이톨(dithiothreitol), 시스테인(cysteine) 등을 사용할 수 있다. 첨가한 환원제의 농도는 초기 기질 농도의 약 10 내지 약 100 배가 바람직하다. 반응액에는 pH 완충작용을 위해 인산칼륨 완충액이 포함되며, 인산칼륨의 농도는 약 50 내지 약 400 mM가 바람직하다. 반응 온도는 약 18 내지 약 37 ℃ 가 바람직하며, 약 25 내지 약 30 ℃ 가 더 바람직하다. 반응액의 pH는 약 5 내지 약 10이 바람직하며, 약 6 내지 약 9 가 더 바람직하고, 약 7 내지 약 8이 더욱 바람직하다. 반응기의 교반 속도는 약 50 내지 약 400 rpm이 바람직하며 약 80 내지 약 250 rpm이 더 바람직하고, 약 100 내지 약 200 rpm이 더욱 바람직하다. In the equol synthesis reaction using the recombinant Escherichia coli of the present invention as a whole cell catalyst, a reducing agent is added to inhibit the oxidation of the product, and NAD (P) H, L-ascorbic acid, glutathione, Dithiothreitol, cysteine and the like can be used. The concentration of the added reducing agent is preferably about 10 to about 100 times the initial substrate concentration. The reaction solution contains potassium phosphate buffer solution for pH buffering action, and the concentration of potassium phosphate is preferably about 50 to about 400 mM. The reaction temperature is preferably about 18 to about 37 캜, more preferably about 25 to about 30 캜. The pH of the reaction solution is preferably about 5 to about 10, more preferably about 6 to about 9, and even more preferably about 7 to about 8. The stirring speed of the reactor is preferably about 50 to about 400 rpm, more preferably about 80 to about 250 rpm, and even more preferably about 100 to about 200 rpm.
상기 에쿠올 합성 반응기 내 탄소 공급원으로는 글루코오스 및 글리세롤을 사용할 수 있고, 글루코오스 또는 글리세롤의 농도는 약 1 내지 약 5 (w/v)%가 바람직하고, 약 1.5 내지 약 4 (w/v)%가 더 바람직하며, 약 2 내지 약 3 (w/v)%가 더욱 바람직하다. 본 발명의 재조합 미생물의 농도는 광학 밀도(Optical Density, 이하 O.D.) 약 1 내지 100 이 바람직하며, 약 5 내지 약 50이 더 바람직하고, 약 10 내지 약 30이 더욱 바람직하다.The concentration of glucose or glycerol is preferably about 1 to about 5 (w / v)%, more preferably about 1.5 to about 4 (w / v)%, , More preferably from about 2 to about 3 (w / v)%. The concentration of the recombinant microorganism of the present invention is preferably about 1 to 100, more preferably about 5 to about 50, and even more preferably about 10 to about 30, in optical density (O.D.).
상기 에쿠올 합성 반응계의 기질로는 합성하고자 하는 이소플라반(isoflavan) 또는 이소플라빈(isoflavene)의 종류에 따라 제니스테인(genistein), 글리시틴(glycitein), 다이드제인(daidzein), 오르토-하이드록시-다이드제인(ortho-hydroxy-daidzein), 오르토-하이드록시-제니스테인(ortho-hydroxy-genistein) 등을 사용할 수 있다.As the substrate of the equol synthetic reaction system, depending on the kind of isoflavan or isoflavene to be synthesized, genistein, glycitein, daidzein, ortho- hydroxy-daidzein (ortho -hydroxy-daidzein), ortho-can be used genistein (ortho -hydroxy-genistein) such as -hydroxy.
상기 기질의 반응액에 대한 용해도를 향상시키기 위해 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol) 및 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 메틸 베타 사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 등을 이용할 수 있다.In order to improve the solubility of the substrate in the reaction solution, it is preferable to use polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and beta-cyclodextrin, methyl beta-cyclodextrin methyl-beta-cyclodextrin, 2- hydroxypropyl-beta-cyclodextrin, and the like.
도 1은 초기 다이드제인(daidzein)의 농도에 따른 (S)-에쿠올의 수율을 나타낸 도표이며, 도 1 에 나타난 바와 같이, 초기 다이드제인의 농도가 증가할수록 (S)-에쿠올의 수율(%)은 감소하지만, 생산되는 (S)-에쿠올(mM)은 증가하는 경향을 보인다.FIG. 1 is a graph showing the yield of (S) -equal according to the concentration of the initial daidzein. As shown in FIG. 1, as the concentration of the initial daidzein increases, the concentration of (S) The yield (%) decreases, but the (S) - equol (mM) produced tends to increase.
도 2 는 다이드제인 및 제니스테인으로부터 다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 반응의 도식도이다.FIG. 2 is a graph showing the results obtained from daidzein and genistein by using a daidzein reductase (DZNR), a dihydrodaidzein racemase (DDRC), a dihydrodaidzein reductase (DHDR) Scheme of Synthesis of Equol, Dihydroequal, 5-Hydroxy-Equol and 5-Hydroxy-Dihydrocodeol Using Recombinant Escherichia coli Expressing Tetrahydrodaidzein Reductase (THDR) to be.
상기 도 2 에 나타난 바와 같이, 다이드제인(daidzein)은 다이드제인 환원효소(DZNR)에 의해 (R)-다이하이드로다이드제인으로 전환되고, 이는 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(DDRC)에 의해 (S)-다이하이드로다이드제인으로 전환된다. (S)-다이하이드로다이드제인 은 다이하이드로다이드제인 환원효소(DHDR)에 의해 (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로다이드제인으로 전환되고, 이는 테트라하이드로다이드제인 환원효소(THDR)에 의해 에쿠올로 전환되거나, 탈수에 의해 디하이드로에쿠올로 전환된다.As shown in FIG. 2, daidzein is converted to (R) -dihydrodaidzein by a daidzein reductase (DZNR), which is a racemizing enzyme (DDRC), a dihydroidide, (S) -dihydroidide < / RTI > (S) -dihydrodaidzein is converted to (3S, 4R) -trans-tetrahydroidadein by a reductase which is a dihydroidide (DHDR), which is a tetrahydroidade reductase (THDR) , Or converted to dihydrocourea by dehydration.
또한, 상기 도 2 에 나타난 바와 같이, 제니스테인(genistein)은 다이드제인 환원효소(DZNR)에 의해 (R)-다이하이드로제니스테인으로 전환되고, 이는 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(DDRC)에 의해 (S)-다이하이드로제니스테인으로 전환된다. (S)-다이하이드로제니스테인은 다이하이드로다이드제인 환원효소(DHDR)에 의해 (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로제니스테인으로 전환되고, 이는 테트라하이드로다이드제인 환원효소(THDR)에 의해 5-하이드록시-에쿠올로 전환되거나, 탈수에 의해 5-하이드록시-디하이드로에쿠올로 전환된다.Also, as shown in FIG. 2, genistein is converted to (R) -dihydrogenentanthin by a dideoxynucleotide reductase (DZNR), which is converted by racemic dehydratase (DDRC) (S) -dihydrogenentyne. (S) -dihydrogenentanthine was converted to (3S, 4R) -trans-tetrahydrogenenustine by a reductase which is a dihydroidide (DHDR), which is converted to 5- Hydroxy-equol, or converted to 5-hydroxy-dihydrocourea by dehydration.
본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하고, 상기 4 개의 효소 중 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)가 나머지 3 개의 효소에 비해 5 배 이상 과발현된 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다. The present invention relates to a process for the production of a pharmaceutical composition comprising a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase and a tetrahydrodaidzein reductase, , And 5-hydroxy-equol was selectively produced from the substrate, genistein, by using recombinant E. coli having a tetrahydrodaidzein reductase, which is over-expressed 5 times more than the other three enzymes, Lt; / RTI >
구체적으로, 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 나머지 3 개의 효소에 비해 5 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 과발현된 재조합 대장균을 이용하면 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.Specifically, 5-hydroxy-equol can be selectively synthesized by using a recombinant E. coli overexpressing 5-fold or more, preferably 10-fold or more over the other three enzymes of the reductase, which is a tetrahydrolide.
이는, 도 2 에 나타난 바와 같이, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량을 증가시키면, 테트라하이드로제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 합성하는 속도가 증가되어, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 생성이 경쟁적으로 저해되기 때문이다.This is because, as shown in FIG. 2, when the amount of expression of the reducing enzyme, a tetrahydroidide, is increased, the rate of synthesizing 5-hydroxy-equol from tetrahydrogenidyne is increased and 5-hydroxy-dihydro This is because the production of Kuol is competitive.
상기 재조합 대장균의 발현 방법 및 이를 이용한 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 대장균의 제조 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.The method of expression of the recombinant E. coli and the method of synthesizing 5-hydroxy-equol using the same are a method for producing recombinant Escherichia coli expressing all four of the enzymes derived from the slaky iso flavonicona vector, This is the same as the synthesis method.
도 6 은 도 2 및 도 4에서 언급한 재조합 대장균의 세포 추출물에서 단백질의 양을 SDS-PAGE로 나타낸 것이며, 4개 효소의 발현량에 있어서, 4개의 재조합 효소를 하나의 대장균에서 발현했을 때보다, 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균 및 다이하이드로다이드제인 환원효소와 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균에서 효소의 발현량이 증가하였다. 도 6에서 1: DDDT는 도2에서 언급한 4개의 재조합 효소를 하나의 대장균에서 발현했을 때의 경우이며, 2: DD는 도4에서 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균의 세포 추출물에 해당하고, 3: DT는 도4에서 다이하이드로다이드제인 환원효소와 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균의 세포 추출물에 해당한다.FIG. 6 is a graph showing the amount of protein in the cell extract of recombinant E. coli mentioned in FIGS. 2 and 4 by SDS-PAGE and showing the expression levels of four enzymes when the four recombinant enzymes were expressed in a single E. coli , A recombinant Escherichia coli expressing a daidzein reductase and a dihydroididase as a single vector, and a recombinant Escherichia coli expressing a reductase which is a dihydroidide, a reductase, which is a tetrahydrolide, as a single vector The expression level of the enzyme was increased. In FIG. 6, 1: DDDT represents the case where the four recombinant enzymes mentioned in FIG. 2 are expressed in one E. coli, and 2: DD represents the case of the redox enzyme, which is a diiodine reducing enzyme and a dihydroidide, 3: DT corresponds to a cell extract of a recombinant Escherichia coli expressing a recombinant Escherichia coli, which is a dihydroidide, and a reducing enzyme, which is a tetrahydrolide, as a single vector. .
도 5는 반응 시간에 따른 제니스테인, 다이하이드로제니스테인 (dihydrogenistein), 5-하이드록시-에쿠올의 반응계 내 농도 (μM)를 나타내며, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량이 나머지 3 개의 효소에 비해 5배 이상 증가한 재조합 대장균을 발현한 시스템(도 6 의 2 및 3)을 이용하면, 4 개의 효소를 모두 발현한 재조합 대장균에 관한 도 2 에 비해 5-하이드록시-에쿠올의 수율 및 생산성과 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 대비 5-하이드록시-에쿠올에 대한 선택성이 증대될 수 있음을 나타낸다.FIG. 5 shows the concentration (μM) of the reaction system in the reaction system of the reaction time with respect to the reaction time of the genistein, dihydrogenistein and 5-hydroxy-equol, and the expression amount of the reducing enzyme, tetrahydroidide, Using the system (FIG. 6, 2 and 3) expressing recombinant E. coli increased more than twice, the yield and productivity of 5-hydroxy-equol and 5- Indicating that the selectivity to 5-hydroxy-equol versus hydroxy-dihydroequ ateol can be increased.
또한, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase) 및 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase)를 발현하는 재조합 대장균 1 과 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase) 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하는 재조합 대장균 2 를 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant Escherichia coli 1 expressing a daidzein reductase and a dihydrodaidase (dihydrodaidzein racemase), a tetrahydrodaidzein reductase and a tetrahydroidide The present invention relates to a method for selectively synthesizing 5-hydroxy-equol from a substrate, genistein, using recombinant Escherichia coli 2 expressing tetrahydrodaidzein reductase.
상기 재조합 대장균 1 및 2 를 전세포 촉매로 혼합하는 생전환 반응계에 의해 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.5-hydroxy-equol can be selectively synthesized from genistein by a biotransformation system in which the recombinant Escherichia coli 1 and 2 are mixed with a whole-cell catalyst.
본 발명의 재조합 대장균 1 및 2 의 발현 방법 및 이를 이용한 5-하이드록시-에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 효소의 발현 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.The expression method of recombinant Escherichia coli 1 and 2 of the present invention and the method of synthesizing 5-hydroxy-equol using the same according to the present invention are characterized by a method of expressing recombinant enzyme expressing all four of the enzymes derived from slaky iso flavonicona And equol synthesis method using the same.
상기 재조합 대장균 1 및 2 의 혼합 반응계는 5-하이드록시-에쿠올의 선택적 생산뿐만 아니라 에쿠올, 6-메톡시-에쿠올(6-Methoxy-equol) 및 다양한 하이드록시-에쿠올(Hydroxy-equol) 등의 생산에 적용할 수 있다.The mixed reaction system of recombinant Escherichia coli 1 and 2 is not limited to the selective production of 5-hydroxy-equol but also to the production of 6-methoxy-equol and various hydroxy- ) And the like.
도 4 는 다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC)를 하나의 벡터로 발현하는 재조합 대장균과 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)를 하나의 벡터로 발현하는 다른 재조합 대장균으로 반응이 구획화된 전세포 반응계를 나타낸다.FIG. 4 is a graph showing the relationship between a recombinant E. coli expressing a daidzein reductase (DZNR) and a dihydrodaidzein racemase (DDRC) as a single vector and a dihydrodaidzein reductase (DHDR), and tetrahydrodaidzein reductase (THDR) as one vector, into a recombinant E. coli.
상기 도 4 에 의하면, 상기 재조합 대장균 1 에 의해 제니스테인이 (S)-다이하이드로제니스테인으로 전환되고, (S)-다이하이드로제니스테인은 상기 재조합 대장균 2 에 의해 5-하이드록시-(S)-에쿠올로 전환되므로, 재조합 대장균 1 및 2 에 의해 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있음을 나타낸다.According to FIG. 4, the recombinant Escherichia coli 1 converts genistein to (S) -dihydrogenentanthine and the (S) -dihydrogenentanthin is converted to 5-hydroxy- (S) , Indicating that selective recombination of 5-hydroxy-equol from genistein by
상이한 재조합 대장균으로 반응이 구획화된 전세포 반응계는 5-하이드록시-(S)-에쿠올의 생산성 및 최종 수율이 향상되는 점에서 유리하고, 부산물인 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 생성을 줄임으로써 5-하이드록시-(S)-에쿠올에 대한 선택성이 증가하는 점에서 우수하다.The whole cell reaction system in which the reaction is compartmentalized with different recombinant E. coli is advantageous in that the productivity and final yield of 5-hydroxy- (S) -equal is improved and the production of 5-hydroxy-dihydroequ ~ (S) -equol is increased by reducing the selectivity to 5-hydroxy- (S) -equol.
상기 5-하이드록시-에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법은 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.The selective synthesis of the 5-hydroxy-equol can selectively synthesize 5-hydroxy- (S) -equoir.
구체적으로, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)가 5 배 이상 과발현된 재조합 대장균, 또는 상기 재조합 대장균 1 및 2 를 이용하여 5-하이드록시-(S)-에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.Specifically, 5-hydroxy- (S) -equol can be selectively synthesized using recombinant Escherichia coli overexpressing 5-fold or more of a tetrahydrodaidzein reductase, or recombinant Escherichia coli 1 and 2 have.
이와 관련하여, 도 7은 상기 재조합 대장균을 이용하여 합성한 5-하이드록시-에쿠올의 광학 구조를 알기 위해 210~320 nm 파장 범위에서 원이색성 분산계를 이용하여 타원율을 측정한 도표이고, 본 발명의 재조합 대장균에 의해 생합성된 5-하이드록시-에쿠올은 3번 탄소에서 S-형태를 가짐을 확인할 수 있다.In this regard, FIG. 7 is a chart for measuring the ellipticity using a circular dichroism dispersion system in a wavelength range of 210 to 320 nm in order to determine the optical structure of 5-hydroxy-equol synthesized using the recombinant E. coli. The 5-hydroxy-equol biosynthesized by recombinant E. coli of the invention has an S-form at the 3-carbon.
나아가, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.Furthermore, the present invention provides a method for producing a recombinant vector comprising the steps of expressing a daidzein reductase, a dihydrodaidase, a dihydrodaidzein racemase, and a dihydrodaidze reductase, the present invention relates to a method for selectively synthesizing dihydroquercol from a substrate zidene using recombinant E. coli that does not express a tetrahydrodaidzein reductase.
구체적으로, 상기 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하여 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다,Specifically, the dihydroquercol can be selectively synthesized from daidzein using the recombinant E. coli as a whole cell catalyst.
상기 디하이드로에쿠올을 합성하는 반응액에 붕산을 첨가하면, (3S,4R)-트랜스-테트라하이드로다이드제인의 탈수 반응을 촉진하므로, 디하이드로에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있다. 첨가되는 붕산의 양은 약 50 mM 내지 약 200 mM 이 바람직하다.Addition of boric acid to the reaction solution for synthesizing the dihydrocoureth promotes the dehydration reaction of (3S, 4R) -trans-tetrahydroidadein, so that dihydroquercol can be synthesized with high yield. The amount of boric acid added is preferably about 50 mM to about 200 mM.
또한, 본 발명은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase) 및 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase)를 발현하고, 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase)를 발현하지 않는 재조합 대장균을 이용하여 기질인 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성하는 방법에 관한 것이다.The present invention also provides a method for producing a recombinant vector comprising the steps of expressing a daidzein reductase, a dihydrodaidase, a dihydrodaidzein racemase and a dihydrodaidzein reductase, dihydroquinol is selectively synthesized from a substrate, genistein, using recombinant E. coli that does not express a tetrahydrodaidzein reductase.
구체적으로, 상기 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.Specifically, 5-hydroxy-dihydroquercol can be selectively synthesized from genistein using the recombinant E. coli as a whole cell catalyst.
상기 발명의 재조합 대장균의 발현 방법 및 이를 이용한 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은, 상기 서술한, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래 효소 4 개를 모두 발현하는 재조합 효소의 발현 방법 및 이를 이용한 에쿠올 합성 방법과 동일하다.The method of expression of the recombinant E. coli of the present invention and the method of synthesizing dihydrococcal or 5-hydroxy-dihydroequaucol using the same are characterized in that the recombinant Escherichia coli expressing all four of the enzymes derived from the slaky iso flavonicona The expression of the enzyme and the method of synthesizing equol using the same.
도 8은 다이드제인 환원효소(daidzein reductase, DZNR), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase, DHDR)를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DHDR)과 다이드제인 환원효소(daidzein reductase, DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase, DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase, DHDR)를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DRDR+DHDR)를 이용하여 다이드제인에 대하여 전세포 반응을 했을 때, 반응 시간에 따른 디하이드로에쿠올의 반응계 내의 농도를 나타낸 도표이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인으로부터 디하이드로에쿠올을 에쿠올 생성없이 선택적으로 합성할 수 있으며, 3 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DRDR+DHDR)을 이용하였을 경우, 2 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균(DZNR+DHDR)보다 생성되는 디하이드로에쿠올의 농도가 높다.FIG. 8 is a graph showing the relationship between recombinant E. coli (DZNR + DHDR) and daidzein reductase (DZNR) expressing daidzein reductase (DZNR), dihydrodaidzein reductase (DHDR) (DZNR + DRDR + DHDR) expressing a dihydrodaidzein racemase (DDRC) and a dihydrodaidzein reductase (DHDR) were used to express the dideoxynucleotides And the concentration of dihydroequaol in the reaction system according to the reaction time when the cell reaction is performed. As shown in FIG. 8, the recombinant Escherichia coli can be used to selectively synthesize dihydrocourea from daidzein without generating an equol, and to utilize recombinant Escherichia coli (DZNR + DRDR + DHDR) expressing three enzymes , The concentration of dihydrocourea produced from recombinant E. coli (DZNR + DHDR) expressing two enzymes is high.
도 9은 다이드제인 환원효소, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소, 다이하이드로다이드제인 환원효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인에 대하여 전세포 반응을 했을 때, 초기 제니스테인의 농도에 따른 기질 전환율 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 수율을 나타낸 도표이며, 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 선택적으로 합성할 수 있다.FIG. 9 is a graph showing the results obtained when a whole cell reaction was performed on genistein using a daidzein reductase, a racemizing enzyme as a dihydroidide, and a recombinant Escherichia coli expressing a reductase as a dihydroidide, As shown in FIG. 9, the recombinant E. coli can be used to selectively synthesize 5-hydroxy-dihydroquercol from genistein, which is a chart showing the conversion rate and the yield of 5-hydroxy-dihydroequor.
본 발명의 재조합 대장균은 전세포 촉매로 이용될 수 있다. 전세포 촉매는 많은 생촉매 반응에 이용되고 있으며, 상온 상압의 온화한 조건에서 반응을 진행시키고, 반응특이성이 우수하다는 장점이 있다. 조효소가 꼭 필요하거나 여러 단계의 반응을 수반하는 공정 혹은 정제 시 효소의 활성이 현저히 감소하는 경우 등에서는 전세포를 이용하여 생촉매 공정을 수행하는 것이 더 유리하다. 또한, 반응 종료 후 생성물의 정제 시에도 전세포로 이용된 재조합 대장균을 원심분리기를 이용하여 선택적으로 분리할 수 있기 때문에 유리하다.The recombinant E. coli of the present invention can be used as a whole-cell catalyst. The whole cell catalyst is used for many biocatalytic reactions and has an advantage of promoting the reaction under mild conditions of normal temperature and normal pressure and excellent in reaction specificity. It is more advantageous to carry out the biocatalytic process using the whole cell in the case that coenzyme is necessary or the activity accompanied by the reaction of several stages or the activity of the enzyme is remarkably decreased upon purification. In addition, it is advantageous that the recombinant E. coli used as the host cell can be selectively separated using a centrifuge even when the product is purified after completion of the reaction.
상기 합성된 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 호기성 조건에서 진행될 수 있으므로, 혐기성 조건에서 에쿠올을 합성하는 종래 기술에 비하여 온화한 조건에서 에쿠올을 합성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 합성 방법은 종래 기술에서 혐기성 조건을 제공하기 위한 사용한 장치나 기술이 필요하지 않다.The method of synthesizing the above-synthesized equol, dihydroequoir, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequaucol can be carried out under aerobic conditions, so that, compared to the prior art of synthesizing equol in anaerobic conditions Equol can be synthesized under mild conditions. Therefore, the synthesis method of the present invention does not require the devices or techniques used to provide anaerobic conditions in the prior art.
상기 합성된 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 약 0.2 내지 약 5 mmol/L 의 기질을 사용할 수 있다.The synthesized equol, dihydroequoir, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequaucol synthesis method may employ a substrate of about 0.2 to about 5 mmol / L.
기질인 다이드제인 또는 제니스테인의 농도가 0.2 mmol/L 미만일 경우에는 합성되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 양이 충분하지 않거나 정제 비용도 높아질 수 있으며, 5 mmol/L 를 초과할 경우에는 기질의 전환율이 감소하여 추가 정제 비용이 발생할 수 있다. When the concentration of the substrate zidene or genistein is less than 0.2 mmol / L, the amount of equol, dihydroequoir, 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequaol synthesized is insufficient The purification cost may be increased, and if it exceeds 5 mmol / L, the conversion rate of the substrate may decrease, resulting in further purification costs.
바람직하게는, 기질의 농도가 약 0.2 내지 1 mmol/L 이고, 보다 바람직하게는, 기질의 농도가 약 0.8 내지 약 1 mmol/L 이다. Preferably, the concentration of the substrate is about 0.2 to 1 mmol / L, more preferably the concentration of the substrate is about 0.8 to about 1 mmol / L.
다만, 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함한 경우에는, 기질의 농도가 1 mmol/L 를 초과하여도 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있으므로, 기질의 농도는 약 3 내지 5 mmol/L 가 바람직하다. However, when a water-soluble polymer is additionally contained in the reaction system, even if the concentration of the substrate is more than 1 mmol / L, the concentration of equol, dihydroequaucol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy- Can be synthesized with a high yield, the concentration of the substrate is preferably about 3 to 5 mmol / L.
상기 에쿠올 또는 디하이드로에쿠올 합성 방법은 다이드제인의 전환율이 95 % 이상이고, 상기 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 제니스테인의 전환율이 95 % 이상이다.The method for synthesizing equol or dihydroequaucol has a conversion rate of dideoxyne of 95% or more, and the method for synthesizing 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequorin has a conversion rate of genistein of 95% to be.
상기 전환율은 (감소한 기질의 농도/초기 기질의 농도) X 100(%) 를 나타낸다.The conversion rate (reduced substrate concentration / initial substrate concentration) X 100 (%).
또한, 본 발명의 합성 방법은 기질의 농도가 0.6 mmol/L 이상에서도 기질의 전환율이 95 % 이상일 수 있다.In the synthesis method of the present invention, the conversion of the substrate may be 95% or more even when the concentration of the substrate is 0.6 mmol / L or more.
도 3 및 도 5 는 반응 시간에 따른 제니스테인(genistein, GSN), 다이하이드로제니스테인(dihydrogenistein, DHG), 5-하이드록시-에쿠올(5OH-EQ)의 반응계 내 농도 (μM)를 나타내며, 반응시간 10 시간만에 기질의 전환율은 95 % 이상임이 나타나 있다.3 and 5 show the concentration (μM) of genistein (GSN), dihydrogenistein (DHG) and 5-hydroxy-equol (5OH-EQ) The conversion rate of the substrate is more than 95% in 10 hours.
상기 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성 방법은 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 수용성 고분자는 식품첨가용 수용성 고분자를 사용할 수 있다.The method for synthesizing the equol, dihydroequol, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequaucol may further comprise a water-soluble polymer in the reaction system. The water-soluble polymer may be a water-soluble polymer for food additives.
수용성 고분자로서, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol), 폴리비닐피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리비닐알콜(polyvinyl alcohol) 및 베타 사이클로덱스트린(β-cyclodextrin), 메틸 베타 사이클로덱스트린(methyl-β-cyclodextrin), 2-하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린(2-(Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알콜 또는 폴리비닐피롤리돈을 이용할 수 있다. Examples of the water-soluble polymer include polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol and beta-cyclodextrin, methyl-beta-cyclodextrin, -cyclodextrin, 2- hydroxypropyl-beta-cyclodextrin and the like can be used. Preferably, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol or polyvinyl pyrrolidone can be used.
반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함함으로써, 반응계 내 기질의 용해도가 증가하므로, 제조되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 최종 수율이 증가될 수 있다.Since the solubility of the substrate in the reaction system is increased by further including a water-soluble polymer in the reaction system, the final yield of the produced equol, dihydroequor, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy- Can be increased.
도 11 은 실시예 1 의 반응액에, 수용성 고분자인 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈을 추가로 첨가한 반응액에서의 (S)-에쿠올의 반응계 내 농도를 시간에 따라 나타낸 도표이다. 도 11 에 나타난 바와 같이, 반응액에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP) 를 추가로 포함한 경우에는 5 mmol/L 의 기질을 사용하여도 에쿠올을 높은 수율로 합성할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 언급한 본 발명의 합성 방법으로 제조되는 에쿠올, 디하이드로에쿠올, 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 합성 방법으로 제조되는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올은 종래 알려지지 않은 신규한 화합물로서, 하기 화학식으로 나타낼 수 있다.
The present invention also relates to an equol, a dihydroequor, a 5-hydroxy-equol or a 5-hydroxy-dihydroequor prepared by the above-mentioned synthesis method of the present invention.
In particular, the 5-hydroxy-dihydroequorol prepared by the synthesis method of the present invention is a novel compound not known in the prior art and can be represented by the following formula.
본 발명은 호기성 조건에서 기질의 높은 전환율로 (S)-에쿠올을 합성할 수 있고, 합성된 에쿠올은 에스트로겐과 유사한 분자 구조를 가지므로 유방암 유발과 같은 종래의 갱년기증상 치료제의 부작용없이 여성의 갱년기 증상, 특히 골다공증의 발병 및 증상을 완화시킬 수 있고, 심혈관계 질환을 예방하며 전립선암을 완화시킬 수 있다. The present invention can synthesize (S) -equal with a high substrate conversion rate under aerobic conditions, and since the synthesized equol has a molecular structure similar to that of estrogen, it can be administered to women without the side effects of conventional treatments for menopausal symptoms such as breast cancer It can alleviate menopausal symptoms, especially the onset and symptoms of osteoporosis, prevent cardiovascular disease and relieve prostate cancer.
또한, 본 발명에서 합성된 디하이드로에쿠올은 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다.In addition, the dihydroequaldehyde synthesized in the present invention can be used as an anticancer agent for the treatment of prostate cancer and ovarian cancer.
또한, 본 발명은 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성을 호기성 조건에서 수 시간 단위로 수행 가능하므로, 생산 비용 절감 및 생산물로 인한 고부가가치 획득이 가능하며, 효율적인 대량생산을 통해 식품, 의약품 등의 다양한 응용처에 활용이 가능하다.The present invention also provides for the selective synthesis of 5-hydroxy-equol, dihydroequol and 5-hydroxy-dihydroequccol under aerobic conditions in hours to hours, It can be used for a variety of applications such as foods and pharmaceuticals through efficient mass production.
또한, 본 발명의 재조합 대장균을 전세포 촉매로 이용하는 반응계에 추가적인 산화환원효소를 적용할 경우, 다양한 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있어 연구적으로 가치가 높다.Further, when an additional oxidoreductase is applied to a reaction system using the recombinant E. coli of the present invention as a whole-cell catalyst, various hydroxy-isoflavonoids can be synthesized, which is worth research.
구체적으로, 산화환원효소로서 티로시나아제, 사이토크롬 P450 또는 플라빈 모노옥시게나아제 등을 사용할 수 있으며, 3'-하이드록시-에쿠올, 6-하이드록시-에쿠올, 8-하이드록시-에쿠올, 6,3'-다이하이드록시-에쿠올과 같은 하이드록시-이소플라보노이드를 합성할 수 있다.Specifically, tyrosinase, cytochrome P450 or flavin monooxygenase can be used as an oxidoreductase, and 3'-hydroxy-equol, 6-hydroxy-equol, 8-hydroxy- Hydroxy-isoquinone, such as 6,3'-dihydroxy-equol, can be synthesized.
또한, 본 발명에 의해 합성된 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올은 갱년기 질환 예방 및 치료에 사용될 수 있으며, 전립선암, 난소암 치료를 위한 항암제로 쓰일 수 있다. 또한, 화장품 또는 식품첨가물 형태로 항산화제로 사용될 수 있다.In addition, 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydroequol synthesized by the present invention can be used for the prevention and treatment of menopausal diseases and can be used as an anticancer agent for the treatment of prostate cancer and ovarian cancer. It can also be used as an antioxidant in the form of a cosmetic or food additive.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, specific methods of the present invention will be described in detail by way of examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples.
재조합 대장균의 제조 방법Method for producing recombinant E. coli
다이드제인 환원효소(daidzein reductase: DZNR), 다이하이드로다이드제인 라세미화효소(dihydrodaidzein racemase: DDRC), 다이하이드로다이드제인 환원효소(dihydrodaidzein reductase: DHDR), 테트라하이드로다이드제인 환원효소(tetrahydrodaidzein reductase: THDR)에 해당하는 DNA서열을 PCR을 통해 증폭 시킨 후, pRSFDuet 또는 pCDFDuet 벡터에 각각 넣고 이를 E. coli에서 his-tag(6 histidine)과 같이 발현하였다.(DDR), a dihydrodaidzein reductase (DHDR), a tetrahydrodaidzein (tetrahydrodaidzein), and a tetrahydrodaidzein reductase reductase: THDR) was amplified by PCR and inserted into pRSFDuet or pCDFDuet vector, which was expressed in E. coli as his-tag (6 histidine).
구체적으로, 상기 효소의 염기 서열이 삽입된 plasmid를 BL21 competent cell에 형질전환 후 각각 plasmid에 맞는 항생제를 포함한 LB고체 배지에서 37°C 배양기에서 12시간 배양하였다. 하나의 콜로니를 항생제를 포함한 3 mL LB 액체 배지에 접종하고 12 시간 동안 37°C 배양기에서 200 rpm 속도로 배양하였다. 이 배양액의 2 v%(1mL)를 50 mL의 항생제를 포함한 새로운 LB 액체 배지에 접종하였다. 배양액의 O.D. (600nm)가 0.6~0.8에 도달하면, 0.1 mM IPTG와 0.1 mM MnSO4를 넣고 18°C 배양기에서 200 rpm으로 18시간 단백질 발현을 유도 하였다. 18시간 후 세포는 4000 rpm 으로 원심 분리 하고, 25 mL PBS로 세척하여 준비하였다.
Specifically, the plasmid containing the inserted nucleotide sequence of the enzyme was transformed into BL21 competent cells and cultured in LB solid medium containing antibiotics for 12 hours at 37 ° C. One colony was inoculated into 3 mL LB broth containing antibiotics and cultured at 37 ° C for 12 hours at 200 rpm. 2 v% (1 mL) of this culture was inoculated into fresh LB broth containing 50 mL of antibiotics. When the OD (600 nm) of the culture reached 0.6 to 0.8, 0.1 mM IPTG and 0.1 mM MnSO4 were added and protein expression was induced at 18 rpm for 18 hours at 200 rpm in an incubator. After 18 h, the cells were centrifuged at 4000 rpm and washed with 25 mL PBS.
본 발명의 재조합 대장균을 이용한 전세포 반응계에서의 에쿠올의 생산 방법 (반응법 1)The method for producing equol in the whole cell reaction system using the recombinant E. coli of the present invention (reaction method 1)
반응기로 10~1000 ml 유리 초자를 이용하며, 반응기에 하기한 농도의 재조합 대장균 및 기질을 공급한다.10 ~ 1000 ml glass beaker is used as a reactor, and the following concentrations of the recombinant E. coli and the substrate are supplied to the reactor.
반응에는 환원제로서 L-아스코르빅산을 초기 기질 농도 10배로 첨가하고, 반응액에는 pH 완충작용을 위해 농도 200 mmol/L의 인산칼륨 완충액이 포함되며, 반응 온도는 30℃ 이다. 반응액의 pH는 8이고, 반응기의 교반 속도는 150 rpm이다. 본 발명의 반응기 내 탄소 공급원으로는 글루코오스 또는 글리세롤을 이용했으며, 글루코오스 또는 글리세롤의 농도는 2(w/v)%이며, 재조합 미생물의 농도는 O.D. 10 또는 O.D. 20이다.
In the reaction, L-ascorbic acid as a reducing agent is added at an initial substrate concentration of 10 times, and the reaction solution contains potassium phosphate buffer having a concentration of 200 mmol / L for pH buffering reaction, and the reaction temperature is 30 占 폚. The pH of the reaction solution was 8, and the stirring speed of the reactor was 150 rpm. Glucose or glycerol was used as a carbon source in the reactor of the present invention, the concentration of glucose or glycerol was 2 (w / v)%, and the concentration of recombinant microorganism was
[실시예][Example]
[실시예 1]: 에쿠올 변환에 관여하는 4 개의 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 다이드제인으로부터 (S)-에쿠올 합성.[Example 1] Synthesis of (S) -equanol from dideoxyne using recombinant Escherichia coli expressing all four enzymes involved in equol conversion.
0.2 ~ 5 mM 의 다이드제인을 O.D. 10의 상기 4 개 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응법 1과 같이 반응을 진행하였다. 기질, 중간체, 생성물은 4 배수 이상의 에틸 아세테이트(ethyl acetate, 이하 EA)로 추출하였고, 원심감압기를 이용해 용매를 제거한 후, 일정량의 메탄올을 재용해하여 고성능-액체크로마토그래피로 물질의 반응성과 농도를 확인하였다. 도 1 에 나타난 (S)-에쿠올 수율과 같이 0.2 mM에서는 95% 이상, 0.4, 0.6 mM에서는 80% 이상, 2 mM에서는 50% 이상, 5 mM에서는 20% 이상의 수율을 확인할 수 있었다.0.2 to 5 mM of daidzein was prepared according to OD. The reaction was carried out according to
[실시예 2]: 에쿠올 변환에 관여하는 4개의 효소를 모두 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 합성.[Example 2] Synthesis of 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydrocodeol from genistein using recombinant Escherichia coli expressing all four enzymes involved in equol conversion.
500 μM 의 제니스테인 (도 2. genistein)을 O.D. 10의 상기 4 개의 효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용하여 반응법 1과 같이 반응을 진행하였다. 기질, 중간체, 생성물은 4 배수 이상의 에틸 아세테이트(EA)로 추출하였고, 원심감압기를 이용해 용매를 제거한 후, 일정량의 메탄올에 재용해하여 고성능-액체크로마토그래피로 물질의 반응성과 농도를 확인하였다. 반응 6시간에 500 μM의 제니스테인은 99% 이상 전환되었으며, 5-하이드록시-에쿠올 97 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 22mg/L이 생성됨을 확인하였다.500 [mu] M of genistein (Fig. The reaction was carried out according to
위와 같은 조성을 통해 1 mM 의 제니스테인을 반응법 1을 통한 반응을 진행하였으며, 도 3에서 확인할 수 있듯이 반응시간 10시간 만에 기질의 전환율은 95% 이상, 5-하이드록시-에쿠올 199 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 63 mg/L를 생산할 수 있었다.As shown in FIG. 3, the conversion of the substrate was 95% or more and the conversion rate of 5-hydroxy-equol was 199 mg / L And 63 mg / L of 5-hydroxy-dihydrocodeol.
[실시예 3]: 구획화된 반응계를 이용한 5-하이드록시-에쿠올의 선택적 합성[Example 3]: Selective synthesis of 5-hydroxy-equol using a partitioned reaction system
도 4의 모식도와 같이 다이드제인 환원효소와 다이하이드로다이드제인 라세미화 효소를 발현하는 재조합 대장균 1 과 다이하이드로다이드제인 환원효소 및 테트라하이드로다이드제인 환원효소를 발현하는 재조합 대장균 2 를 전세포 촉매로 혼합하는 생전환 반응계를 구축하였다. 1 mM 의 제니스테인을 반응법 1을 따라 반응을 진행하였을 때, 도 5와 같이 반응시간에 따른 기질, 생성물의 농도를 액체크로마토그래피로 확인하였다. 본 반응계는 반응시간 6시간 만에 기질의 전환율은 99% 이상, 5-하이드록시-에쿠올 231 mg/L, 5-하이드록시-디하이드로에쿠올 12 mg/L를 생산하였다. 생산 결과를 실시예 1의 결과와 비교했을 때, 5-하이드록시-에쿠올의 생산성은 1.6배 증가하였으며, 5-하이드록시에쿠올 농도/5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 농도로 정의되는 5-하이드록시-에쿠올에 대한 선택성은 5배 증가하였다.As shown in the schematic diagram of Fig. 4, recombinant Escherichia coli 1 expressing a daidzein reductase and a racemized enzyme, a dihydroidide, and a recombinant Escherichia coli 2 expressing a reductase, which is a dihydroidide, and a tetrahydroidide, A biocatalytic reaction system was constructed by mixing with a cell catalyst. When 1 mM of genistein was reacted according to
또한, 4 개 효소의 발현량을 비교하기 위하여 실시예 2 에서의 재조합 대장균 및 실시예 3 에서의 재조합 대장균 1 및 2 의 세포 추출물을 초음파 처리로 파쇄하여 준비하고, 세포 추출물은 30분 동안 13000 rpm으로 4°C에서 원심 분리한 후, 상등액을 얻어 도 6와 같이 SDS-PAGE로 분석하였다.In order to compare the expression amounts of the four enzymes, the recombinant E. coli in Example 2 and the cell extracts of
분석 결과, 4개 효소의 발현량에 있어서 실시예 2에서 사용한 대장균보다 실시예 3에서 사용한 두 재조합 대장균에서 모두 증가하였다. 그 중, 테트라하이드로다이드제인 환원효소의 발현량이 두드러지게 증가하였으며, 실시예 1의 대장균 파쇄액 대비 20배 이상 증가하고, 나머지 3 개 효소의 발현량에 비해 5 배 이상 과발현되었다. As a result of the analysis, the expression amounts of the four enzymes were increased in both recombinant E. coli used in Example 3 than in E. coli used in Example 2. Among them, the expression amount of a reducing enzyme such as tetrahydroidide was remarkably increased, and it was increased more than 20 times as compared with that of the Escherichia coli disruptant of Example 1, and was over 5 times more than the expression amount of the remaining three enzymes.
[실시예 4]: 5-하이드록시-에쿠올의 광학 이성질체 분석[Example 4]: Optical isomer analysis of 5-hydroxy-equol
본 발명의 재조합 대장균으로 합성한 5-하이드록시-에쿠올의 광학 구조를 결정하기 위해 원이색성 분산 스펙트럼 분석을 진행하였다. 측정 파장 범위는 210~320 nm였고, 원이색성 분산계 ChirascanTM plus CD spectrometer (Applied Photophysics, UK)를 이용하였다. 시료를 1.5 mg/ml의 농도로 순수한 메탄올에 녹인 후, 측정하였다.To determine the optical structure of the 5-hydroxy-equol synthesized in the recombinant E. coli of the present invention, the original dichroism spectrum analysis was carried out. The measurement wavelength range was from 210 to 320 nm, and a circular dichroic dispersion ChirascanTM plus CD spectrometer (Applied Photophysics, UK) was used. The sample was dissolved in pure methanol at a concentration of 1.5 mg / ml and then measured.
측정 결과는 도 7에 그래프로 나타내었으며, 238 nm에서 높은 크기의 음성 코튼(cotton) 효과를 나타냈으며 270 nm에서 높은 크기의 양성 코튼 효과를 나타냈다. 따라서 본 발명의 재조합 대장균에 의해 생합성된 5-하이드록시 에쿠올은 3번 탄소에서 S-형태를 가짐을 확인할 수 있었다.The measurement results are shown graphically in FIG. 7, showing a high negative cotton effect at 238 nm and a positive cotton effect at 270 nm. Therefore, it was confirmed that 5-hydroxyequaur biosynthesized by the recombinant E. coli of the present invention had an S-form at the
[실시예 5]: 디하이드로에쿠올 의 선택적 합성[Example 5]: Selective synthesis of dihydrocourea
디하이드로에쿠올을 생합성하기 위해서 실시예 1의 재조합 대장균에서 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 결손되고, 다이하이드로다이드제인 라세미화효소를 포함하거나(DZNR+DDRC+DHDR, 이하 DDD 균주) 포함하지 않는 재조합 대장균(DZNR+DHDR, 이하 DD 균주)을 제작하였다. 상기한 대장균을 이용하여 반응법 1을 따라 다이드제인을 기질로 하는 반응을 진행하였으며, 추가적으로 반응액에 붕산 200 mM 를 첨가하였다. 그 결과, 에쿠올 생성 없이 디하이드로에쿠올만 생성되는 것을 확인하였으며(도 8), 구체적으로, 초기 다이드제인의 농도를 0.5 mM 로 생전환 반응을 시작하여 2 시간 반응하였을 때, DD 균주에서는 28 μM, DDD 균주에서는 60 μM의 디하이드로에쿠올이 합성되었다.In order to biosynthesize dihydroquercol, the reductase, which is a tetrahydroidide, in the recombinant E. coli of Example 1 is deficient and contains a racemizing enzyme (DZNR + DDRC + DHDR, hereinafter referred to as DDD strain) Recombinant Escherichia coli (DZNR + DHDR, hereinafter referred to as DD strain). The E. coli was reacted with dideazine as a substrate according to
[실시예 6]: 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 선택적 합성[Example 6]: Selective synthesis of 5-hydroxy-dihydrocodeol
5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 생합성하기 위해서 실시예 2의 재조합 대장균에서 테트라하이드로다이드제인 환원효소가 플라스미드에서 결손된 재조합 대장균을 제작하였다. 상기한 대장균을 이용하여 반응법 1을 따라 제니스테인을 기질로 하는 반응을 진행하였으며, 5-하이드록시-에쿠올 생성 없이 5-하이드록시-디하이드로에쿠올만 생성되는 것을 확인하였다(도 9). 초기 제니스테인의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 1.0 mM 로 생전환 반응을 시작하여 36 시간 반응하였을 때, 제니스테인의 전환율은 0.6 mM 이하에서는 99% 이상이었고, 1.0 mM 에서는 97%였다. 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 전환 수율은 각각 44, 35, 27, 39%였다.In order to biosynthesize 5-hydroxy-dihydrocodeol, a recombinant Escherichia coli in which a reducing enzyme, a tetrahydroidide, was deleted in the plasmid in the recombinant Escherichia coli of Example 2 was prepared. Using the above-mentioned Escherichia coli, the reaction was carried out according to the
[실시예 7]: 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올의 질량 분석[Example 7] Mass spectrometry of 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequor
실시예 3와 6에서 합성한 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 가스크로마토그래피-질량분석기(GC-MS)를 통해 동정하였으며, 그 결과는 도 10에 명시하였다.The 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroequoir synthesized in Examples 3 and 6 were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) .
상기 재조합 미생물로 합성한 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로-에쿠올을 EI-MS로 분석하였다. EI-MS는 Thermo 사의 TRACE GC Ultra gas chromatograph/ITQ1100 를 이용하였다. 양성모드에서 무극성 캐필러리 컬럼 (TR-5 ms)을 이용하였으며, 헬륨 가스 유속은 1 ml/min로 하였고, inlet, mass transfer line, ion source 온도는 각각 250, 275, 230°C로 하였다. 가스 크로마토그래프의 오븐 온도는 65°C에서 5분간 유지된 후, 3°C/min의 속도로 250°C까지 증가한다. 이온화 전압은 70 eV였으며, 측정 질량 범위는 50~600 amu였다.The 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydro-equol synthesized from the recombinant microorganism were analyzed by EI-MS. The EI-MS was a TRACE GC Ultra gas chromatograph / ITQ1100 from Thermo. In the positive mode, a non-polar capillary column (TR-5 ms) was used. The helium gas flow rate was 1 ml / min and the inlet, mass transfer line and ion source temperatures were 250, 275 and 230 ° C, respectively. The oven temperature of the gas chromatograph is maintained at 65 ° C for 5 minutes and then increases to 250 ° C at a rate of 3 ° C / min. The ionization voltage was 70 eV and the measured mass range was 50 to 600 amu.
EI-MS 분석 결과는 이전에 보고 된 DHD의 스펙트럼과 동일한 것으로 나타났다(Chang, Y. C., and M. G. Nair. J. Natr. Proc. 58:1892-1896, 1995; Wahala, K., A. Salakka, and H. Adlercreutz. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 217:293-29, 1998). 합성된 화합물의 EI-MS는 예상한 바와 같이 m/z 256에서 C15H12O4 (DHD)와 일치하는 [M+H] +의 분자 이온 피크를 나타냈다. 합성된 화합물의 다른 이온 피크는 137(100), 120(52), 91(36), 65(16)이였다.The results of the EI-MS analysis were the same as those of the previously reported DHD (Chang, YC, and MG Nair. J. Natr. Proc. 58: 1892-1896, 1995; Wahala, K., A. Salakka, and H. Adlercreutz, Proc. Soc. Exp Biol., 217: 293-29, 1998). EI-MS of the synthesized compound showed a molecular ion peak of [M + H] < + > consistent with C15H12O4 (DHD) at m / z 256 as expected. The other ion peaks of the synthesized compounds were 137 (100), 120 (52), 91 (36) and 65 (16).
[실시예 8]: 수용성 고분자를 추가로 포함한 반응계에서 에쿠올의 합성[Example 8] Synthesis of equol in a reaction system further containing a water-soluble polymer
다이드제인의 반응액에 대한 용해도를 향상시키기 위해 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, 이하 DMSO)를 포함하고, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)를 추가로 포함한 점 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 반응을 진행하였다Except that it contains dimethyl sulfoxide (DMSO) and further contains polyethylene glycol (PEG) or polyvinylpyrrolidone (PVP) in order to improve the solubility in the reaction solution of the daidzein, The reaction was carried out in the same manner as in Example 1
구체적으로, 다이드제인 5 mM 에서의 에쿠올 수율을 증가시키기 위해 수용성 고분자 PEG 또는 PVP 5% (w/v)를 추가로 포함하는 반응기에서 반응을 진행하였으며, PVP를 첨가한 반응의 경우, 반응시간 12시간만에 5 mM의 에쿠올이 합성되었으며(수율 99% 이상, 1.16 g/L), PEG을 첨가한 반응의 경우, 반응시간 24시간만에 3.7 mM의 에쿠올이 합성되었다(수율 74% 이상, 0.9 g/L).Specifically, in order to increase the equol yield at 5 mM of daidzein, the reaction proceeded in a reactor further comprising water-soluble polymer PEG or
상기 실시예 1 및 2 에 따르면, 슬래키아 이소플라보니컨버턴스 유래의 효소 4 개를 발현하는 재조합 대장균에 의해, 호기성 조건에서 수 시간내에 높은 수율로 다이드제인으로부터 (S)-에쿠올을 합성하거나, 제니스테인으로부터 5-하이드록시-에쿠올 및 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성할 수 있었다.According to the above Examples 1 and 2, the recombinant Escherichia coli expressing four enzymes derived from Slaqia isoflavonik konvartens was able to produce (S) -equanol from daidzein in a high yield within a few hours under aerobic conditions Or synthesized 5-hydroxy-equol and 5-hydroxy-dihydroquercol from genistein.
상기 실시예 3, 5 및 6 에서는, 효소 4 개의 효소 중 2 개 또는 3 개의 효소를 조합한 재조합 대장균을 이용하여 5-하이드록시-에쿠올, 디하이드로에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 각각 선택적으로 합성할 수 있었다.In Examples 3, 5 and 6, recombinant E. coli combined with two or three enzymes among the four enzymes was used to synthesize 5-hydroxy-equol, dihydroequor or 5-hydroxy-dihydro Respectively.
또한, 상기 실시예 4 및 7 을 통해서, 실시예 2, 3 및 6 에 따른 재조합 대장균이 5-하이드록시-(S)-에쿠올 또는 5-하이드록시-디하이드로에쿠올을 합성하는 것을 확인할 수 있었다.Also, it can be seen from Examples 4 and 7 that the recombinant Escherichia coli according to Examples 2, 3 and 6 synthesized 5-hydroxy- (S) -equol or 5-hydroxy-dihydrocodeol there was.
또한, 상기 실시예 8 에서는, 반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함함으로써, 수용성 고분자를 포함하지 않은 반응계(실시예 1)에 비하여 에쿠올의 수율이 우수함을 확인할 수 있었다.Further, in Example 8, it was confirmed that the yield of equol was superior to the reaction system not containing a water-soluble polymer (Example 1) by further containing a water-soluble polymer in the reaction system.
Claims (16)
반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하고,
상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.A recombinant yeast that expresses a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase, and a tetrahydrodaidzein reductase, As a method for synthesizing equol from a substrate zidene using E. coli,
Further comprising a water-soluble polymer in the reaction system,
Wherein the water-soluble polymer is a water-soluble polymer for food addition, and is polyethylene glycol or polyvinyl pyrrolidone.
반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하고,
상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.A recombinant yeast that expresses a daidzein reductase, a dihydrodaidzein racemase, a dihydrodaidzein reductase, and a tetrahydrodaidzein reductase, As a method for synthesizing 5-hydroxy-equol or 5-hydroxy-dihydrocodeol from a substrate, genistein, using E. coli,
Further comprising a water-soluble polymer in the reaction system,
Wherein the water-soluble polymer is a water-soluble polymer for food addition, and is polyethylene glycol or polyvinyl pyrrolidone.
상기 5-하이드록시-에쿠올은 5-하이드록시-(S)-에쿠올인 것을 특징으로 하는 방법.The method according to claim 4 or 5,
Wherein the 5-hydroxy-equol is 5-hydroxy- (S) -equoir.
상기 재조합 대장균이 전세포 촉매로 이용되는 방법. 8. The method according to any one of claims 2 to 7,
Wherein said recombinant E. coli is used as a whole-cell catalyst.
호기성 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 방법.8. The method according to any one of claims 2 to 7,
Lt; RTI ID = 0.0 > aerobic < / RTI > condition.
0.2~1 mmol/L 의 기질을 사용하여 합성하는 방법.8. The method according to any one of claims 2 to 7,
A method of synthesizing using a substrate of 0.2 to 1 mmol / L.
기질의 전환율이 95 % 이상인 것을 특징으로 하는 방법.8. The method according to any one of claims 2 to 7,
Wherein the conversion of the substrate is 95% or more.
반응계에 수용성 고분자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.8. The method according to any one of claims 4 to 7,
Characterized in that the reaction system further comprises a water-soluble polymer.
상기 수용성 고분자가 식품첨가용 수용성 고분자로서, 폴리에틸렌글리콜 또는 폴리비닐피롤리돈인 것을 특징으로 하는 방법.14. The method of claim 13,
Wherein the water-soluble polymer is a water-soluble polymer for food addition, and is polyethylene glycol or polyvinyl pyrrolidone.
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