KR101018797B1

KR101018797B1 - 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염치료용 조성물

Info

Publication number: KR101018797B1
Application number: KR1020080053288A
Authority: KR
Inventors: 이행우; 신현철; 김성호; 박용주
Original assignee: 라이브켐 주식회사
Priority date: 2008-06-05
Filing date: 2008-06-05
Publication date: 2011-03-03
Also published as: CN102056604A; WO2009148218A3; US20130084330A1; US8673965B2; WO2009148218A2; US20110091532A1; KR20090126925A

Abstract

본 발명은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 NF-kB 및 AP-1 활성 억제 효과가 매우 우수하고, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염에 대하여 피부 자극이나 부작용 없이 증상완화 뿐만 아니라 치료 중단 후에도 상당기간 지속적인 개선 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 리포좀에 함유시킴으로써 피부 흡수를 통한 관절염 치료에 더욱 우수한 효과를 나타내어, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물 {Composition for the treatment of arthritis containing dibenzo-p-dioxine derivative}

본 발명은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.

관절염은 크게 퇴행성 관절염(골관절염, osteoarthritis)과 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)으로 구분된다. 퇴행성 관절염은 골관절염이라고도 불리우는 가장 흔히 볼 수 있는 관절염으로서 중년 또는 노년에 주로 발생하고, 무릎 관절 및 엉덩이 관절과 같이 체중을 많이 받는 관절에 통증, 경직감 및 운동장애 등을 초래하는 질환이다. 과거에는 단순히 노화현상으로 생각하였으나, 현재는 연령, 유전적 요소, 비만, 관절의 모양, 호르몬 등의 여러 가지 원인이 복합적으로 이루어짐으로써 증상이 다르게 나타나는 것으로 생각되고 있다. 퇴행성 관절염은 주로 관절연골의 점진적 손상에 따라 만성 염증이 형성되고, 이에 따라 주변 조직의 퇴행화 과정을 수반하는 것으로 알려져 있다. 좀더 구체적으로, 물리적인 스트레스의 누적에 의하여 연골조직에 NF-kB 및 AP-1과 같은 전사인자들이 활성화되어 만성염증이 일어나게 되면 COX-2, LOX 등의 염증반응을 매개, 증폭시키는 인자들이 발현되고, 주변의 혈행이 억제되며, 매트릭스 메탈로프로테이나제(matrix metalloproteinases, MMPs), 히알루로니다제(hyaluronidase), iNOS 등 조직 파괴인자들이 과발현되어 연골조직을 파괴하게 되며, 이로 인하여 주변의 근육, 건, 인대 등과 같은 조직에도 영향을 끼쳐 심한 통증을 일으킨다.

반면, 류마티스성 관절염은 여러 관절에 다발성으로 나타나는 염증성 자가면역질환이다. 류마티스성 관절염 증상을 가진 환자의 활막조직과 활액은 염증성 세포들(대식세포, T-세포, B 세포, 수지상 세포(dendritic cells) 등)이 과도하게 작용하여 만성염증을 일으키고, 관절 및 연골 손상을 야기시키고 통증을 유발하는 것을 특징으로 한다.

상기한 바와 같이, 퇴행성 및 류마티스성 관절염에 걸린 조직에는 COX, LOX, iNOS 등의 염증 매개인자들이 만성적으로 상승되어 있으며, 조직을 분해하는 MMP 효소들이 과활성화 되어 있다. 따라서, 종래에는 이러한 인자들을 억제하는 약물을 사용하거나, 염증반응의 결과로서 나타나는 조직분해효소의 활성을 억제하는 방법을 사용하여 왔다. 현재 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염의 치료에 많이 사용되는 약물은 비스테로이드성 소염제(NSAID; non-steroidal anti-inflammatory drug)로서, 이들 NSAID 약물들은 증세를 약간 호전시키기는 하지만 관절부위 연골 손실이나 질병의 진행을 막을 수는 없으며, 부작용이 심하게 나타나 이 약물 치료법을 사용하는 환자의 절반 가량이 1년 이내에 치료를 중단해야만 한다. 이와 같이, 상기 NSAID 약물 치료법은 근본 원인의 제거와는 무관하게 그 과정 및 결과에 해당하는 생화학적 단계들의 일부만 억제하여 효과는 적고 부작용이 심하게 나타나는 문제점이 있다.

상기와 같은 COX, LOX, iNOS 등의 염증 매개인자들의 만성적 활성을 일으키는 보다 근본적 원인인자로는 NF-kB 및 AP-1가 있다. 이들 전사인자들은 퇴행성 및 류마티스성 관절염의 근본적이며 공통적인 원인인자로서, 조직 손상시 비정상화된 세포가 제거되고 새로운 세포로 대체되는 과정을 억제함으로써 조직의 치유과정을 방해한다(Simmonds, R.E. & Foxwell, B.M. Rheumatology Advance Access published Januray 29, 2008).

기존 치료제의 문제점은 염증성 반응의 억제를 통한 통증억제에만 촛점이 맞추어져 있어서, 조직이 만성적으로 염증 및 퇴행화에 시달리는 근본적 원인의 치료가 되지 않는다. 또한 염증 및 통증 억제에 있어서도 경구 투여의 경우, 위장 출혈이나 혈전 생성 등의 부작용이 심각하여 국소치료를 위한 패취제가 대중화되어 있으나, 이 또한 임시방편으로서 실질적인 호전 효과가 없어 환자의 삶의 질을 크게 개선시키지 못하고 있다.

따라서, 퇴행성 및 류마티스성 관절염의 원인인자인 NF-kB 및 AP-1의 과발현을 효과적으로 억제하여 근본적인 치료효과를 가지면서 독성과 부작용이 최소화된 안전성을 동시에 만족시킬 수 있는 약물의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 퇴행성 및 류마티스성 관절염의 원인인자인 NF-kB 및 AP-1의 과발현을 효과적으로 억제할 수 있는 약물에 대해 연구하던 중, 디벤조-ｐ-디옥신 유도체가 NF-kB 및 AP-1의 과발현을 효과적으로 억제하며, 치료 중단 후에도 상당기간 지속적 호전 반응을 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 하기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물을 제공한다.

상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소, C₁~C₄ 알킬, C₂~C₁₀ 알케닐, 페닐, 히드록시페닐, 디히드록시페닐, 페닐-C₁~C₄ 알킬 또는 R'(C=O)이며, 여기서 R'는 C₁~C₄ 알킬 또는 C₂~C₂₀ 알케닐이다.

바람직하게는 상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소, 메틸, 아세틸 또는 올레오일이다.

더욱 바람직하게는 상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소이다.

본 발명의 조성물은 상기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 2종 이상 조합하여 포함할 수 있다. 예를 들어, 화학식 1의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 2의 화합물 1~60 중량%, 화학식 3의 화합물 1~20 중량%, 화학식 4의 화합물 0.2~20 중량%, 화학식 5의 화합물 0.3~30 중량%, 화학식 6의 화합물 0.3~30 중량%, 화학식 7의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 8의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 9의 화합물 0.1~10 중량% 및 화학식 10의 화합물 0.2~20 중량%로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 조합하여 포함할 수 있다.

상기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 아이세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 아이세니아 아르보레아(Eisenia arborea), 아이세니아 데스마레스티오데스(Eisenia desmarestioides), 아이세니아 갈라파제니스(Eisenia galapagensis), 아이세니아 매소니(Eisenia masonii), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome), 에클로니아 카바 (Ecklonia cava), 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 에클로니아 라디아타 (Ecklonia radiata), 에클로니아 바이시클리스(Ecklonia bicyclis), 에클로니아 바이런시네이트(Ecklonia biruncinate), 에클로니아 부시날리스(Ecklonia buccinalis), 에클로니아 카에파에스팁스 (Ecklonia caepaestipes), 에클로니아 엑사스퍼타(Ecklonia exasperta), 에클로니아 파스티기아타(Ecklonia fastigiata), 에클로니아 브레빕스(Ecklonia brevipes), 에클로니아 아라보레아(Ecklonia arborea), 에클로니아 라티폴리아(Ecklonia latifolia), 에클로니아 무라티 (Ecklonia muratii), 에클로니아 라디코사(Ecklonia radicosa), 에클로니아 리타디아나(Ecklonia richardiana) 및 에클로니아 라이티 (Ecklonia wrightii)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 해조류로부터 추출 및 분리하여 얻을 수 있다. 바람직하게는, 상기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 아이세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 에클로니아 카바(Ecklonia cava), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome) 및 에클로니아 스톨로니페라 (Ecklonia stolonifera)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 해조류로부터 추출 및 분리하여 얻을 수 있다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 통상적인 모든 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 시약을 사용할 수 있으며, 해조류로부터 추출 및 분리하여 얻을 수 있다. 본 발명에서는 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 하기와 같은 방법으로 추출·분리하여 제조한다.

구체적으로, 해조류를 증류수로 세척하여 이물질을 제거하고 음지에서 건조한 후 파쇄한다. 상기 해조류를 20배량의 물, C₁~C₄의 저급알콜 또는 이의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올을 사용하여 환류 추출한다(2회 반복). 추출액을 감압 농축한 후 20배량의 증류수에 현탁시키고, 동일 량의 에틸아세테이트 용매를 사용하여, 3회 추출하여 에틸아세테이트 분획을 모은 후 감압 농축한다. 에틸아세테이트 분획 농축액을 실리카겔 컬럼크로마토그래피 및 고속 액체 크로마토그래피로 10개 의 활성물질을 분리한다. 각 화합물들은 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체로 확인하였다.

상기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 통상의 방법에 의해 제조되는 모든 염, 에스터 유도체, 수화물 및 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성되는 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레인산, 우마린산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콘산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 트리플루오로아세트산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 NF-kB 및 AP-1 활성 억제 효과가 매우 우수하며, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염에 대하여 피부 자극이나 부작용 없이 증상완화 뿐만 아니라 치료 중단 후에도 상당기간 지속적인 개선 효과를 나타낸다. 특히, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 외용제 조성물보다 처치기간 중 최대효과, 총 치료효과, 및 치료 중단시 회복효과가 더 우수하며, 그 중에서도 특히 SUV 타입의 리포좀 조성물의 경우 다른 리포좀 조성물(MLV, LUV) 및 리포좀을 사용하지 않은 외용제 조성물에 비해 가장 우수한 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 리포좀에 함유시킴으로써 피부 흡수를 통한 관절염 치료에 더욱 우수한 효과를 나타내어, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염 치료에 유용하 게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 조성물 총 중량에 대해 약 0.2~2 중량%, 바람직하게는 약 0.5~1.5 중량% 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체를 1종 이상 포함하여 국소제제로 제조할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로오스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 통상적인 방법에 따라 연고, 로션, 크림, 겔, 피부 유화액, 피부 현탁액, 패취제 또는 분무제 등의 국소제제로 제형화하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 리포좀에 적용시켜 리포좀 제제로 제형화하여 사용할 수 있다. 더 나아가 당분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 일일 도포량은 1~1000㎍/㎠ 일 수 있으며, 바람직하게는 5~500㎍/㎠ 이고, 하루 1 내지 5회 도포하여 1개월 이상 지속하는 것이 더욱 바람직하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 해조류로부터 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체의 분리

1. 해조류 추출물의 제조

감태(Ecklonia cava)와 대황(Eisenia bicyclis)을 먼저 증류수로 세척하여 이물질을 제거하고 음지에서 건조한 후, 이를 파쇄하였다. 상기 감태 및 대황의 혼합물 500g(감태 350g, 대황 150g)을 함량 대비 20배량의 10% 에틸알콜을 사용하여 2시간 동안 환류 추출하였다. 이러한 추출과정을 2회 반복하였다. 그 다음, 잔사를 걸러내어 제거하고 회전 증발농축기를 사용하여 에틸알콜 추출액을 감압 농축하였다. 농축액을 20배량의 증류수에 현탁시키고, 동일 량의 에틸아세테이트 용매를 사용하여, 3회 추출하여 에틸아세테이트 분획을 모은 후 감압 농축하였다. 에틸아세테이트 분획 농축액을 15배량의 실리카겔에 로딩한 후 에틸아세테이트/아세톤(부피비 9/1)의 혼합용매를 사용하여 활성성분이 녹아있는 분획들을 모아 농축하여 해조류 추출물을 얻었다.

2. 해조류 추출물로부터 활성물질의 분리

상기 1에서 얻은 해조류 추출물을 0.2㎛ 막여과지로 여과하여 고속 액체 크로마토그래피에 로딩(loading)하였다. 고속 액체 크로마토그래피에서, 컬럼은 HP ODS Hypersil 컬럼을, 용매로는 증류수와 메탄올을 사용하였으며, 용매의 공급은 1.0㎖/분의 유속으로 메탄올 15%에서 70%까지 30분간에 걸쳐 선형구배(linear gradient)를 걸어 10개의 활성물질을 분리하였다. 각 화합물은 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체로 확인하였다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

<화학식 9>

<화학식 10>

상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소, 메틸, 아세틸 또는 올레오일이다.

실험예 1 : 본 발명의 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체의 NF - kB 및 AP -1 활성 억제 효과 실험

본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체의 NF-kB 및 AP-1 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1에서 분리한 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 1종 또는 2종 이상 조합하여 실험에 사용하였다. 각 시료의 조성은 하기 표 1에 나타내었다. 비교군으로는 관절염에 가장 많이 적용되는 소염진통제들인 아스피린, 디클로페낙, 이부프로펜, 셀렉콕시브, 인도메타신, 케토프로펜을 사용하였다.

시료	시료의 조성
1	화학식 1(R=H) 100%
2	화학식 2(R=H) 100%
3	화학식 3(R=H) 100%
4	화학식 4(R=H) 100%
5	화학식 5(R=H) 100%
6	화학식 6(R=H) 100%
7	화학식 7(R=H) 100%
8	화학식 8(R=H) 100%
9	화학식 9(R=H) 100%
10	화학식 10(R=H) 100%
11	화학식 2(R=H) 60% + 화학식 3(R=H) 25% + 화학식 4(R=H) 15%
12	화학식 4(R=H) 70% + 화학식 5(R=H) 8% + 화학식 6(R=H) 22%
13	화학식 4(R=H) 10% + 화학식 10(R=H) 80% + 화학식 7(R=H) 10%
14	화학식 1(R=H) 3% + 화학식 2(R=H) 37% + 화학식 3(R=H) 4% + 화학식 4(R=H) 6% + 화학식 5(R=H) 25% + 화학식 6(R=H) 25%
15	화학식 2(R=H) 60% + 화학식 (R=H) 20% + 화학식 6(R=H) 15% + 화학식 7(R=H) 5%
16	화학식 4(R=아세틸, H (3:7)) 100%
17	화학식 2(R=올레오일, H (1:9)) 100%
18	화학식 6(R=메틸, H (2:8)) 100%

5주령된 토끼를 희생시킨 후에 관절(hock joint)로부터 관절연골을 채취하였다. 멸균 조건 하에서 관절면(200~220 ㎎/joint)을 완전배지(DMEM, supplemented with heat inactivated 5% FBS; penicillin 100 U/mL; streptomycin 100 ㎍/mL)에 넣었다. 3~4번 세척한 후, 37℃에서 1~2일 정도 무균조건과 5% CO₂/95% 공기 조건 하에서 배양한 후, 배양조직에 AP-1-루시퍼라제 또는 NFkB-루시퍼라제 수용체 플라스미드 DNA(각각 0.5㎍: Stratagene)를 리포펙타민 트랜스펙션 시약(Lipofectamin transfection reagent; Invitrogen, Carlsbad, CA, U.S.A.)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 24시간 후, 완전배지를 기본배지((DMEM, supplemented with heat inactivated 1% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin 100 U/mL streptomycin 100 ㎍/mL)로 교환하였다. 배양된 연골 조직(50~60㎎)을 96-웰 플레이트에 분주하고, 상기 시료 1~18, 및 비교군(아스피린, 디클로페낙, 이부프로펜, 셀렉콕시브, 인도메타신, 케토프로펜)을 10㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 1시간 후에 rhIL-1α(R&D systems, Minneapolis, USA)를 5ng/㎖의 농도로 각 처리군의 배양액에 처리하였다. 7℃에서 5% CO₂/95% 공기 조건 하에서 60시간을 배양한 후, 세포용해 완충액(lysis buffer, 0.1M potassium phosphate buffer, pH 7.8/1% Triton X-100/1mM DTT/2mM EDTA)을 이용하여 배양액을 처리한 후 배양액 내의 루시퍼라제 활성을 루미노미터 (luminometer, Monolight 2010)를 이용하여 측정하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.

시료	NF-kB 활성 억제율(%)	AP-1 활성 억제율(%)
1	53	65
2	73	57
3	75	78
4	65	72
5	61	75
6	66	66
7	62	60
8	67	57
9	75	60
10	64	71
11	70	69
12	73	80
13	71	74
14	82	77
15	76	52
16	55	52
17	64	51
18	69	55
아스피린	48	46
디클로페낙	32	34
이부프로펜	23	27
셀렉콕시브	10	23
인도메타신	18	34
케토프로펜	12	22

표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체의 NF-kB 및 AP-1 활성 억제율은 각각 53~82% 및 51~80%를 나타낸 반면, 비교군들은 각각 10~48% 및 22~46%를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 NF-kB 및 AP-1 활성 억제 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

실험예 2 : 관절염 유발된 토끼에서 본 발명의 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체를 함유하는 외용제 조성물의 관절염에 대한 효과 실험 ( in vivo )

관절염 유발된 토끼에서 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 외용제 조성물의 관절염에 대한 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실험예 1에서 NF-kB 및 AP-1 활성 억제율이 가장 우수한 시료 12 및 14와, 비교군에서 우수한 효과를 나타낸 아스피린 및 디클로페낙을 선정하여 외용제 조성물을 제조하였다. 활성성분을 피부로 흡수시키기 위해 사용된 용액(carrier) 조성은 Bookman et al(Can. Med. Assoc. J. 171(4) 333-338 (2004))를 참조하였다. 각 외용제 조성물의 조성은 표 3에 나타내었다.

	carrier	아스피린	디클로페낙 나트륨	시료 12	시료 14
DMSO	45.5%	45.5%	45.5%	45.5%	45.5%
프로필렌 글리콜	5.0%	5.0%	5.0%	5.0%	5.0%
글리세린	5.0%	5.0%	5.0%	5.0%	5.0%
에틸알콜	8.0%	8.0%	8.0%	8.0%	8.0%
증류수	36.5%	35.0%	35.0%	35.0%	35.0%
해당 활성성분	0%	1.5%	1.5%	1.5%	1.5%
합계	100.0%	100.0%	100.0%	100.0%	100.0%

토끼에게 관절염을 유발시키기 위하여, 실험군을 6개 군으로 나누고 한 군당 토끼 5마리씩을 무작위로 할당하였다. 콜라겐분해효소(collagenase) 용액(4㎎/mL, 식염수)을 0.22㎛ 막으로 여과하였다. 6개의 실험군에 배정된 2.5~3.0㎏의 토끼에게 tiletamine-zolazepam(Zoletil 50®, Virbac, France)을 주사하여 마취시켰다. 토끼의 오른쪽 무릎 관절 부위를 면도하고 소독한 후, 관절강 내로 한 개의 실험군에는 0.25mL의 식염수를 주입하였고, 다섯 개의 실험군에는 0.25mL의 콜라겐분해효소 용액을 주입하였다(Choi, et al. Osteoarthritis and Cartilage 10, 471-478 (2002)). 7일 경과 후, 식염수를 주입한 실험군은 무릎 관절염 증상이 전혀 나타나지 않았으며, 콜라겐분해효소 용액을 주입한 실험군은 무릎 관절염 증상이 최고조에 달하였다. 이 모델은 인간의 퇴행성 관절염에서 나타나는 연골조직의 퇴행화 현상과 유사함으로 실험 목적상 적합하다.

7일째부터 콜라겐분해효소 용액을 주입한 다섯 개의 실험군에 상기 표 3의 외용제 조성물 용액을 각각 0.3mL씩 매일 2회, 7일간 환부에 충분히 발라 주고, 이후 7일간은 근본적인 치료효과를 평가하기 위하여 아무런 처치를 하지 않았다. 관절부위의 붓기, 붉기, 열기 및 절름거리는 정도를 0(정상), 1(경증), 2(보통), 3(중증)으로 구분하여 콜라겐분해효소 처리 직전(0일), 7일, 14일 및 21일이 되는 날 정량적으로 평가하였다. 각 처치 용액의 효과를 객관적으로 평가하기 위해서 평가 시기별 총점을 비교하였으며, "처치기간 중 최대효과", "총 치료효과", "치료 중단시 회복효과"를 하기 식으로 계산하였다. 결과는 표 4에 나타내었다.

(1) 처치기간 중 최대효과 = (7일차의 총점 - 14일차의 총점)/7일차의 총점,

(2) 총 치료효과 = (7일차의 총점 - 21일차의 총점)/7일차의 총점,

(3) 치료 중단시 회복효과 = (14일차의 총점 - 21일차의 총점)/14일차의 총점.

평가항목		carrier	아스피린	디클로페낙 나트륨	시료 12	시료 14
붓기	7일 14일 21일	2.8±0.45 2.4±0.55 1.6±0.55	3.0±0.00 1.6±0.55 1.2±0.45	2.8±0.45 1.4±0.55 1.4±0.55	2.8±0.45 1.2±0.45 0.6±0.55	2.8±0.45 1.0±0.00 0.6±0.55
붉기	7일 14일 21일	3.0±0.00 2.4±0.55 1.6±0.55	2.8±0.45 1.6±0.55 1.4±0.55	2.8±0.45 1.4±0.55 1.4±0.55	3.0±0.00 1.4±0.55 0.8±0.45	3.0±0.00 1.2±0.45 0.4±0.55
열기	7일 14일 21일	2.8±0.45 2.2±0.45 1.6±0.55	3.0±0.00 1.4±0.55 1.2±0.45	2.8±0.45 1.4±0.55 1.2±0.45	2.8±0.45 1.0±0.71 0.6±0.55	3.0±0.00 1.0±0.71 0.6±0.55
절름거림	7일 14일 21일	3.0±0.00 2.6±0.55 1.8±0.45	2.8±0.45 1.4±0.55 1.2±0.45	3.0±0.00 1.6±0.55 1.4±0.55	3.0±0.00 0.6±0.55 0.4±0.55	2.8±0.45 0.6±0.55 0.2±0.45
총점	7일 14일 21일	11.6±0.55 9.6±0.55 6.6±0.89	11.6±0.89 6.0±0.71 5.0±1.0	11.4±1.34 5.8±1.3 5.4±0.55	11.6±0.89 4.2±1.3 2.4±1.14	11.6±0.55 3.8±0.84 1.8±1.48
처치 기간 중 최대효과		17.2%	48.3%	49.1%	63.8%	67.2%
총 치료효과		43.1%	56.9%	52.6%	79.3%	84.5%
치료 중단시 회복효과		31.3%	16.7%	6.9%	42.9%	52.6%

표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 외용제 조성물은 아스피린 및 디클로페낙 나트륨을 함유하는 외용제 조성물보다 처치기간 중 최대효과, 총 치료효과, 및 치료 중단시 회복효과가 매우 우수하였으며, 특히 치료 중단시 회복효과에 있어서 약 3~7배 정도 더 우수한 효과를 나타내었다.

실험예 3 : 관절염 유발된 토끼에서 본 발명의 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물의 관절염에 대한 효과 실험 ( in vivo )

관절염 유발된 토끼에서 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물의 관절염에 대한 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 리포좀 조성물의 제조

본 발명의 조성물이 피부 흡수를 통하여 관절염 환부에 보다 효과적으로 도달하여 더욱 효과적인 치료제 조성을 개발하기 위하여, 상기 실험예 1 및 2에서 가장 우수한 효과를 보인 시료 14에 대하여 다양한 리포좀을 제조하였다.

72g의 지질(난황 레시틴 또는 대두 레시틴 : 콜레스테롤 = 15:3)을 2L의 증류수에 넣고 75℃에서 30분 동안 교반하여 고르게 분산시킨 후, 2L의 수용액(0.5 중량%의 시료 14 포함)을 75℃에서 혼합하여 4000rpm으로 75℃에서 5분 동안 교반하고 상온으로 냉각하였다. 이렇게 하여 다중층 리포좀(multi-lamella vesicles; MLV)을 일차적으로 형성하였다. 이를 얼음에 넣고 일정시간 초음파 분해하여 작은 단일막 리포좀(small unilamella vesicles; SUV)을 제조하였다. 또한 이를 반복적으로 동결건조하여 큰 단일막 리포좀(large unilamella vesicles; LUV)을 제조하였다. 제조된 리포좀의 크기를 광산란법으로 측정(ZetaPALS Particle Sizing Analyzer, Brookhaven instrument corporation)하였으며, 결과는 표 5에 나타내었다.

리포좀 종류	난황 레시틴	대두 레시틴
MLV	850 ㎚	1850 ㎚
SUV	60 ㎚	30 ㎚
LUV	840 ㎚	500 ㎚

2. 리포좀 조성물의 in vivo 효과 실험

상기 1에서 제조한 각 대두 레시틴 리포좀 조성물(0.5 중량%의 시료 14 포함)로 관절염에 대한 치료효과를 평가하였다. 비교 조성물로 0.5 중량%의 시료 14를 사용하여 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 외용제 조성물을 제조하였다. 평가방법은 상기 실험예 2와 동일한 방법을 사용하였다. 결과는 표 6에 나타내었다.

평가항목		리포좀 조성물			외용제 조성물 (시료 14)
평가항목		MLV	SUV	LUV	외용제 조성물 (시료 14)
붓기	7일 14일 21일	3.0±0.00 2.2±0.45 0.6±0.55	2.8±0.45 1.0±0.00 0.4±0.55	2.8±0.45 1.4±0.55 0.6±0.55	2.8±0.45 1.6±0.55 1.0±0.00
붉기	7일 14일 21일	2.8±0.45 1.6±0.55 1.2±0.45	3.0±0.00 0.8±0.45 0.2±0.45	3.0±0.00 1.4±0.55 0.8±0.45	3.0±0.00 1.6±0.55 1.2±0.45
열기	7일 14일 21일	3.0±0.00 1.4±0.55 0.6±0.55	3.0±0.00 1.0±0.71 0.4±0.55	2.8±0.45 1.0±0.71 0.6±0.55	3.0±0.00 1.2±0.45 0.6±0.55
절름거림	7일 14일 21일	2.8±0.45 1.4±0.55 0.8±0.45	2.8±0.45 0.6±0.55 0.2±0.45	3.0±0.00 1.2±0.45 0.6±0.55	2.8±0.45 1.3±0.55 0.6±0.55
총점	7일 14일 21일	11.6±0.89 5.6±0.55 3.2±0.45	11.6±0.89 3.4±0.55 1.2±0.84	11.6±0.89 5.0±1.22 2.6±1.14	11.6±0.55 5.8±1.1 3.4±0.55
처치 기간 중 최대효과		51.7%	70.7%	56.9%	50.0%
총 치료효과		72.4%	89.7%	77.6%	70.7%
치료 중단시 회복효과		42.9%	64.7%	48.0%	41.4%

표 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 외용제 조성물보다 처치기간 중 최대효과, 총 치료효과, 및 치료 중단시 회복효과가 모두 우수하였으며, 특히 SUV 타입의 리포좀 조성물의 경우 다른 리포좀 조성물(MLV, LUV) 및 리포좀을 사용하지 않은 외용제 조성물에 비해 가장 우수한 효과를 나타내었다. 또한, 0.5 중량%의 시료 14를 함유한 리포좀 조성물과 1.5 중량%의 시료 14를 함유한 외용제 조성물을 비교하였을 때, 1/3의 유효성분 농도를 함유한 리포좀 조성물에서 더 우수한 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 조성물은 리포좀을 사용함으로써 피부흡수를 통한 관절염 치료에 더욱 우수한 효과를 발휘함을 알 수 있다.

실험예 4 : 본 발명의 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물의 퇴행성 관절염에 대한 임상 효과 실험

상기 실험예 3의 1에서 제조한 대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물(0.5 중량%의 시료 14 포함)을 사용하여 퇴행성 관절염 환자에 있어서 효과를 평가하였다. 비교군(비히클)으로는 상기 실험예 3의 1의 대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물의 제조방법에서 시료 14를 포함하지 않은 것을 제외하고는 실험예 3의 1의 대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물의 제조방법과 동일하게 하여 제조하였다.

퇴행성 무릎 골관절염으로 진단된 환자 74명을 선정하였으며, 무작위로 두 집단(리포좀-조성물군 (n=37); 비히클 군 (n=37))으로 나누고, 4주간 하루 2회(아침, 저녁)로 환자의 환부 피부에 충분한 양(0.5~2mL)을 바르도록 하였다. 4주 및 8주 후에 "WOMAC 관절염 지수"를 사용하여 관절염 상태를 평가하였다. WOMAC (Western Ontario and McMaster Universities) 관절염 지수는 24가지 항목에 대하여 각 0~4점씩 평가하는 것으로, 통증 항목에 5문항, 경직도 항목에 2문항, 신체기능에 관한 항목에 17문항이 배정되어 있다.

선정된 총 74명 중 70명이 실험에 끝까지 참여하였으며, 연령은 32~81세의 범위를 나타내었고, 여성(n=47)이 64%, 남성(n=27)이 36% 이었다. 비히클 군은 효과 없음으로 인하여 4명이 중도에 탈락하였으며, 대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물 군은 탈락없이 끝까지 실험에 참여하였다. 실험 시작 전(0주), 4주, 8주 및 각 집단별 점수와 변화율의 평균값을 표 7에 나타내었다.

WOMAC 지수		비히클 (n=33)	대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물(n=37)
통증 (pain)	0주	10.6	10.5
	4주	8.3	5.7
	8주	10.5	4.8
	4주 변화율(%)	-21.7	-45.7
	8주 변화율(%)	-0.9	-54.3
	치료 중단 후 변화율(%)	26.5	-15.8
경직도 (Stiffness)	0주	4.0	4.9
	4주	3.2	2.4
	8주	4.1	2.0
	4주 변화율(%)	-20.0	-51.0
	8주 변화율(%)	2.5	-59.2
	치료 중단 후 변화율(%)	28.1	-16.7
신체기능 (Physical Function)	0주	45.2	45.1
	4주	38.3	25.6
	8주	43.3	19.3
	4주 변화율(%)	-15.3	-43.2
	8주 변화율(%)	-4.2	-57.2
	치료 중단 후 변화율(%)	13.1	-24.6
총점 (Total Score)	0주	59.8	60.5
	4주	49.8	33.7
	8주	57.9	26.1
	4주 변화율(%)	-16.7	-44.3
	8주 변화율(%)	-3.2	-56.9
	치료 중단 후 변화율(%)	16.3	-22.6

표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물은 퇴행성 관절염 치료효과에 있어서 문헌에 보고된 약물에 비하여 우수한 효과를 나타내었을 뿐만 아니라(Can. Med. Assoc. J. 171, 333-338 (2004); Scand J. Rheumatol 30, 11-18 (2001)), 특히 치료 중단 후 4주 후의 평가에서 비히클 군은 원래의 상태로 되돌아간 반면, 본 발명의 조성물을 사용한 군은 지속적인 개선 효과를 나타내어, 본 발명의 조성물이 증상완화뿐만 아니라 근본적인 회복효과가 우수함을 보여주었다. 또한 본 발명의 조성물 사용으로 인한 피부 자극이나 기타 부작용도 나타나지 않았다.

현재 관절염 치료에 가장 널리 사용되고 있는 소염진통제의 경우, 경구 투여 혹은 피부적용에 관계없이, 치료를 중단할 경우에 증세가 개선되는 현상이 보고된 바 없다. 따라서 본 발명의 조성물은 기존 약물에 비하여 관절염에 의해 파괴되고 있는 조직의 증상뿐만 아니라, 관절염 진행과정 자체를 역전시키는 획기적인 효과를 제공할 수 있다. 뿐만 아니라, 복용약물의 부작용인 위장출혈, 심혈관 질환의 염려가 전혀 없으며, 패취제 등이 나타내는 피부 자극 등의 부작용이 전혀 없다.

실험예 5 : 본 발명의 디벤조 -ｐ- 디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물의 류마티스성 관절염 및 기타 관절통에 대한 임상 효과 실험

상기 실험예 3의 1에서 제조한 대두 레시틴 SUV 리포좀 조성물(0.5 중량%의 시료 14 포함)을 사용하여 류마티스성 관절염 및 기타 관절통을 호소하는 환자에 있어서 효과를 평가하였다.

류마티스성 관절염으로 진단된 환자 22명, 및 류마티스성 관절염은 아니나 무릎관절을 제외한 손마디, 엉덩이 관절 등의 통증을 호소하는 환자(기타 관절통 환자) 27명을 별도의 집단으로 선정하여, 4주간 하루 2회(아침, 저녁)로 환자의 환부 피부에 충분한 양(0.5~2mL)을 바르도록 하였다. 실험 전, 4주 및 8주 후에 VAS (Visual Analogue Scale; 100㎜ 자를 최대 증세에 해당되는 길이로 하였을 때 현재의 증세를 상대적 길이로 표현)로 통증 및 PGA(Patient's Global Assessment; 환자가 느끼는 질환에 대한 전반적 평가)를 평가하였다.

선정된 총 49명 중 모두 실험에 끝까지 참여하였으며, 그 중 22명의 류마티스성 관절염 환자의 연령은 23~56세의 범위를 나타내었고, 성별은 여성이 n=10, 남성이 n=12 이었다. 27명의 기타 관절통 환자의 연령은 43~77세의 범위를 나타내었으며, 성별은 여성이 n=18, 남성이 n=9 이었다. 실험 시작 전(0주), 4주, 8주에 있어서의 VAS 값 및 변화율의 평균치를 표 8에 나타내었다.

VAS		류마티스성 관절염 (n=22)	기타 관절통 (n=27)
통증 (㎜)	0주	63.3	52.2
	4주	49.1	36.3
	8주	42.3	29.5
	4주 변화율(%)	-22.4	-30.5
	8주 변화율(%)	-33.2	-43.5
	치료 중단 후 변화율(%)	-13.8	-18.7
PGA (㎜)	0주	60.8	54.3
	4주	46.7	33.7
	8주	40.1	27.5
	4주 변화율(%)	-23.2	-37.9
	8주 변화율(%)	-34.0	-49.4
	치료 중단 후 변화율(%)	-14.1	-18.4

표 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 함유하는 리포좀 조성물은 류마티스성 관절염 치료효과에 있어서도 우수한 효과를 나타내었을 뿐만 아니라, 치료 중단 후 4주 후의 평가에서도 지속적인 개선 효과를 나타내었다. 또한 손마디, 엉덩이 어깨 등 기타 관절통 증상의 완화 및 회복 효과도 우수하게 나타났다. 실험 진행 중, 본 발명의 조성물 적용을 통한 피부 자극이나 기타 부작용도 나타나지 않았다.

본 발명의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 NF-kB 및 AP-1 활성 억제 효과가 매우 우수하고, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염에 대하여 피부 자극이나 부작용 없이 증상완화 뿐만 아니라 치료 중단 후에도 상당기간 지속적인 개선 효과를 나타낸다. 또한, 본 발명의 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 리포좀에 함유시킴으로써 피부 흡수를 통한 관절염 치료에 더욱 우수한 효과를 나타내어, 퇴행성 관절염 및 류마티스성 관절염 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

하기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

<화학식 4>

<화학식 5>

<화학식 6>

<화학식 7>

<화학식 8>

<화학식 9>

<화학식 10>

상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소, C₁~C₄ 알킬, C₂~C₁₀ 알케닐, 페닐, 히드록시페닐, 디히드록시페닐, 페닐-C₁~C₄ 알킬 또는 R'(C=O)이며, 여기서 R'는 C₁~C₄ 알킬 또는 C₂~C₂₀ 알케닐이다. 단, 화학식 1, 2 및 4에서 각 R이 모두 수소인 경우는 제외한다.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소, 메틸, 아세틸 또는 올레오일인 것을 포함하나, 화학식 1, 2 및 4에서 각 R이 모두 수소인 경우는 제외하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 3, 및 5 내지 10에서, 각 R은 독립적으로 수소인 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 화학식 1의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 2의 화합물 1~60 중량%, 화학식 3의 화합물 1~20 중량%, 화학식 4의 화합물 0.2~20 중량%, 화학식 5의 화합물 0.3~30 중량%, 화학식 6의 화합물 0.3~30 중량%, 화학식 7의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 8의 화합물 0.1~10 중량%, 화학식 9의 화합물 0.1~10 중량% 및 화학식 10의 화합물 0.2~20 중량%로 이루어진 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물을 조합하여 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 10의 디벤조-ｐ-디옥신 유도체는 아이 세니아 바이시클리스(Eisenia bicyclis), 아이세니아 아르보레아(Eisenia arborea), 아이세니아 데스마레스티오데스(Eisenia desmarestioides), 아이세니아 갈라파제니스(Eisenia galapagensis), 아이세니아 매소니(Eisenia masonii), 에클로니아 쿠로메(Ecklonia kurome), 에클로니아 카바 (Ecklonia cava), 에클로니아 스톨로니페라(Ecklonia stolonifera), 에클로니아 맥시마(Ecklonia maxima), 에클로니아 라디아타(Ecklonia radiata), 에클로니아 바이시클리스(Ecklonia bicyclis), 에클로니아 바이런시네이트(Ecklonia biruncinate), 에클로니아 부시날리스(Ecklonia buccinalis), 에클로니아 카에파에스팁스 (Ecklonia caepaestipes), 에클로니아 엑사스퍼타(Ecklonia exasperta), 에클로니아 파스티기아타(Ecklonia fastigiata), 에클로니아 브레빕스(Ecklonia brevipes), 에클로니아 아라보레아 (Ecklonia arborea), 에클로니아 라티폴리아(Ecklonia latifolia), 에클로니아 무라티(Ecklonia muratii), 에클로니아 라디코사(Ecklonia radicosa), 에클로니아 리타디아나(Ecklonia richardiana) 및 에클로니아 라이티 (Ecklonia wrightii)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상으로부터 추출 및 분리된 것임을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 조성물은 디벤조-ｐ-디옥신 유도체를 조성물 총 중량에 대해 0.2~2 중량% 포함하는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 관절염은 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 연고, 로션, 크림, 겔, 피부 유화액, 피부 현탁액, 패취제 또는 분무제의 피부 외용제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.
제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 리포좀에 적용시켜 리포좀 제제로 제형화되는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물.