KR100992399B1 - 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체의 제2형 당뇨병 치료제로서의 용도 - Google Patents

Abstract

니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산, 그리고 이의 유도체는 제2형 당뇨병의 치료에 유용하다.

니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산, 제2형 당뇨병, 인슐린

Description

니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체의 제2형 당뇨병 치료제로서의 용도 {Use of nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate and it's derivatives as agent for treating non-insulin dependent diabetes mellitus}

본 발명은 인슐린 분비에 대한 포도당 역치 (threshold)를 감소시키게 되는, 제2형 당뇨병 질환 또는 의료적 증상의 치료 또는 예방에 유용한 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체를 포함하는 약학적 조성물, 및 상기 화합물을 사용하여 제2형 당뇨병을 치료하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체를 정상 마우스 (C57BL/6)에서 분리한 췌장 베타-소도세포 (β-islet cells)의 인슐린 분비 능을 향상시키고, 제2형 당뇨병 마우스 (C57BL/KsJ-db/db Jcl)에 복강 투여했을 때 혈당의 저하와 인슐린의 분비를 촉진시키는 뛰어난 효과가 있으므로 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체의 제2형 당뇨병 (NIDDM, non-insulin dependent diabetes mellitus) 치료제로서의 이용에 관한 것이다.

췌장 베타세포질내의 칼슘 농도의 증가는 세포외의 칼슘의 유입으로 인해 촉매되고, 세포 내부의 칼슘저장고로부터 급속히 세포질로 유입됨으로서 일어나며, 인슐린의 분비를 유도한다 (Wollheim CB et al., J Biol Chem 250:1354-1360, 1975., Rojas E. et al., Endocrinology 134:1771-1781, 1994., Cancela JM et al., Diabetes Suppl 3:S349-S357, 2002., Rutter GA., Mol Aspects Med 22:247-284, 2001).

혈당농도의 상승은 베타세포에서 미토콘드리아 ATP 합성의 증가에 따른 ATP-sensitive K+ channel의 차단과 세포의 탈분극, 그리고 세포외 칼슘의 유입을 수반하는 기전을 통해 인슐린을 분비하도록 촉진한다 (Hinke SA et al., J Physiol 558:369-380, 2004). 더구나 글루코오스에 의한 칼슘의 상승은 칼슘을 분비하도록 하는 endoplasmic reticulum에 존재하는 두 개의 수용체인 inositol 1,4,5-triphosphate (IP₃)에 의해 자극되는 IP₃ 수용체와 cyclic ADP ribose (cADPR)에 의하여 자극되는 ryanodine 수용체에 의해 조절된다 (Ammala C et al., Nature 353:849-852, 1991, Okamoto H., Mol Cell Biochem 193:115-118, 1999). 최근의 연구에 의하면 cADPR도 세포외 칼슘의 유입을 촉매하는 것으로 알려져 있다 (Rah SY et al., J Biol Chem 280:2888-2895, 2005; Togashi K. et al., EMBO J 25:1804-1815, 2006). 세포질로의 칼슘 분비 채널에 대한 추가적인 경로로서 산성 라이소좀류 과립에 존재하는 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산-sensitive 수송체 채널로 보고되고 있다 (Churchill GC et al., J Biol Chem 275:38687-38692, 2000). 이러한 cADPR과 NAADP는 CD38에 의해 합성된다 (Aarhus R et al., J Biol Chem 270:30327-30333, 1995; Chini EN et al., Biochem J 362:125-130, 2002). CD38을 과발현 시키게 되면 글루코오스에 의한 칼슘의 증가와 인슐린의 분비가 증가하지만 (Kato I et al., J Biol Chem 270:30045-30050, 1995) CD38 분자를 유전적으로 결핍시킨 경우에는 감소되는 것으로 보고되고 있다 (Kato I et al., J Biol Chem 274:1869-1872, 1999).

비만 마우스 모델 (ob/ob)에서 분리된 췌장의 당뇨병성 베타세포와 글루코오스에 의한 인슐린 분비량이 적은 췌장암 세포주 (RINm5F)에서는 CD38의 발현이 낮은 것으로 알려져 있다 (Takasawa S et al., J Biol Chem 273:2497-2500, 1998). 최근의 연구에 의하면 NAADP에 의해 칼슘 신호가 시작되고 널리 퍼지게 되는 것은 인슐린에 대한 반응성과 인슐린 형성에 관여하는 것으로 보고되고 있다 (Johnson JD et al., Proc Natl Acad Sci U S A 99: 14566-14571, 2002).

이와 동일한 선상에서 NAADP에 민감한 칼슘 저장고에 의해 좌우되는 칼슘 신호와 베타세포에서 글루코오스에 의한 NAADP의 형성을 설명하고 있다 (Masgrau R et al., Curr Biol 13:247-251, 2003; Yamasaki M et al., J Biol Chem 279:7234-7240, 2004). Glucose-like peptide-1 (GLP-1)은 위장의 L 세포에서 분비되는 펩타이드 호르몬으로서 글루코오스에 의해 유도되는 인슐린의 분비에 생리학적으로 중요한 강화제이다 (Kieffer TJ and Habener JF: Endocr Rev 20:876-913, 1999; Holz GG and Chepurny OG, Sci STKE 2005(268):pe2, 2005). GLP-1은 세포내 cAMP 농도를 증가시키며 PKA와 cAMP에 의해 조절되는 guanine nucleotide exchange factor II (cAMP-GEFII 또는 Epac)를 활성화시킨다 (Delmeire D et al., Diabetologia 46:1383-1393, 2003; Kang G et al., J Physiol 566:173-188, 2005). 비록 cAMP가 결합하는 단백질이 GLP-1에 의해 증가되는 높고 지속적인 칼슘의 증가에 역할을 담당하고 있지만 (Holz GG, Horm Metab Res 36:787-794, 2004), 어떻게 칼슘의 증가가 칼슘통로의 직접적인 활성화나 PKA와 Epac에 의한 칼슘을 이동시키는 NAADP의 역할에 대해 알려진 바는 없었으며, 당뇨병 치료제로서의 이용은 전혀 알려져 있지 않고 있다.

또한 Johnson JD 등은 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산이 베타세포에서 칼슘을 증가시키고 세포내 인슐린 발현을 증가시키기는 하나 인슐린 분비는 증가시키지 않는다고 보고하였다 (Johnson JD and Misler S., PNAS (2002) 99(22), 14566-14571).

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이에 본 발명자들은 베타세포에서 칼슘 신호 조절 분자로서 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산이 마우스에서 분리한 췌장 베타-소도세포 (β-islet cells)의 인슐린 분비능을 향상시키고, 제2형 당뇨병 마우스로 알려진 C57BL/KsJ-db/db Jcl에 직접 투여했을 때 혈당의 강하와 인슐린의 분비를 촉진시키는 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명의 목적은 췌장 베타 소도세포의 인슐린 분비능을 향상시키고 혈당 강하능이 있는 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 또는 그 유도체의 신규 당뇨병 치료제로서의 용도를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산 (이하, NAADP라 한다) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하여 제2형 당뇨병을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.

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또한, 본 발명은 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체의 용도를 제공하는 것을 특징으로 한다.

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또한, 본 발명은 유효량의 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를, 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 포유동물에게 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.

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또한, 본 발명에 있어, 상기 유효량은 1일당 체중 kg당 0.1-1mg 범위내인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어, 상기 투여는 복강 투여에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용된 NAADP (nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate)는 세포내에서 CD38을 포함한 ADP-ribosyl cyclase에 의해 형성되며 (Chini EN. et al., Biochem J 362:125-130, 2002; BERRIDGE G. et al., Biochem. J., 365: 295-301, 2002; Aarhus R. et al., J Biol Chem., 270(51): 30327-30333, 1995), NAADP는 모든 생명체의 세포 내에서 칼슘의 농도를 조절하는데 이용되고 있는 물질로서 세포의 생명현상의 유지를 위하여 중요하다.

또한, 하기 실시예에서 보듯이, 상기 NAADP를 사용하여 제2형 당뇨병 질환에 대한 효과 규명은 Lacy와 Kotianovsky (Diabetes, 16, 35-39, 1967) 등의 방법에 준한 ICR계 마우스로부터 췌장 소도 (islet)를 분리한 다음 2.8 ~ 12 mM 글루코스와 0.5nM ~ 5μM NAADP를 단독 또는 복합적으로 처리하고 37℃에서 60분 동안 방치한 후 췌장 베타 소도세포를 제거한 상층액으로 인슐린을 방사면역 측정법으로 측정하는 단계; 생후 7주령 제2형 당뇨병 마우스에 NAADP를 3주간 장기 투여에 따른 혈중 당농도 강하에 미치는 영향을 조사하는 단계; 7주된 제2형 당뇨병 마우스에 NAADP를 3주간 복강투여에 따른 인슐린의 분비능력을 측정하는 단계; 대조군과 NAADP가 3주간 투여된 제2형 당뇨병 마우스를 대상으로 췌장 소도세포의 인슐린 분비능력을 항-인슐린 항체로 면역조직화학염색방법으로 확인하는 단계;로 구성된다.

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본 발명에서 사용한 ICR계 마우스와 C57BL/6 마우스는 오리엔트바이오 (성남, 한국)에서, 제2형 당뇨병 마우스인 C57BL/KsJ-db/db Jcl은 잭슨 래버리토리(미국)으로부터 구입하였다. 본 발명 실험재료인 NAADP와 글루코스는 시그마사 제품을 사용하였다. 상기 단계에서 인슐린 측정 키트는 린고 리서치사(미국)의 제품을 사용하였다.

상기 단계에 있어서 NAADP를 당뇨병 마우스 (C57BL/KsJ-db/db Jcl) kg당 0.1~1 mg/d로 4주간 연속적으로 약물이 복강내에 용출되도록 설계된 알젯사의 초소형 삼투압 펌프 (미국)를 투입하였다.

본 발명에 따르면, NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함하여 제2형 당뇨병 질환을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공한다. 또한, 상기 NAADP 또는 그 유도체가 비용매화 형태, 예를 들어 수화된 형태뿐만 아니라 용매화된 형태로 존재할 수 있음도 이해해야 한다.

본 발명의 화합물의 적당한 약학적으로 허용가능한 유도체는 하기식 1과 같다.

(여기서, R₁, R₂ 는 H 혹은 CH₂-COCH₃,

W 는 NH₂, OH 혹은 SH,

X 는 OH, SH, 혹은 NH 이거나 Br,

Y 는 OH, H, 혹은 NH₂ 이거나 Br 중 각각 독립적으로 선택된다.)

또한, 본 발명에 따라, 제2형 당뇨병의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의, NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체의 용도가 제공된다.

화합물은 이러한 방식으로 사용하기 위한 약학적 조성물로서 적당히 제형된다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 유효량의 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를, 제2형 당뇨병의 치료가 필요한 포유동물에게 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 본 발명의 화합물 또는 조성물에 의해 치료될 수 있는 구체적 질환에는 심각한 저혈당증 위험이 없는 (또한 1형 당뇨병을 치료할 수 있는 잠재성이 있는) 제2형 당뇨병에 있어서의 혈당 저하, 이상지혈증 (dyslipidemia), 비만, 인슐린 내성, 대사 증후군 및 손상된 포도당 내인성(impaired glucose tolerance)이 포함된다.

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본 발명의 또 다른 측면에 따라, 비만의 치료 또는 예방, 특히 치료에 사용하기 위한 의약의 제조에 있어서의, NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따라, 비만의 치료 또는 예방, 특히 치료를 위한 의약으로 사용하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체가 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따라, 유효량의 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 비만 및 당뇨병의 병행 치료가 필요한 포유동물에게 투여함으로써 상기 질환을 병행 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 추가 측면에 따라, 유효량의 NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체를 비만의 치료가 필요한 포유동물에게 투여함으로써 상기 질환을 치료하는 방법이 제공된다.

본 발명의 화합물은, 유리한 물리적 및/또는 약동학적 성질 및/또는 바람직한 독성 프로파일 및/또는 바람직한 대사 프로파일로 인해 약제로서 사용하기에 특히 적당할 수 있다.

바람직한 독성 프로파일은 아메스(Ames) 시험 검정의 이용 및/또는 hERG 이온 통로에 대한 시험에 의해 입증될 수 있다. 또한 바람직한 대사 프로파일은 예를 들어 신체로부터의 화합물 소거량의 감소를 초래하고 이에 따라 화합물에 대한 노출을 증가시키게 되는, 감소된 대사 속도를 의미할 수 있거나, 혹은 예를 들어 (일부 환경 하에서는 바람직하지 않은 것으로 고려될 수 있는) 활성 대사물을 형성하지 않음을 의미할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구용으로서 적당한 형태(예컨대, 정제, 로젠지, 경질 또는 연질 캡슐제, 수성 또는 유성 현탁액, 유화액, 분산가능한 분말 또는 과립제, 시럽제 또는 엘릭시르), 국소용으로 적당한 형태(예컨대, 크림, 연고, 젤, 또는 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액), 흡입 투여용으로서 적당한 형태(예컨대, 미분 분 말 또는 액상 에어로졸), 주입 (insufflation)에 의한 투여용으로서 적당한 형태(예컨대, 미분 분말) 또는 비경구 투여용으로서 적당한 형태(예컨대, 정맥내, 피하, 근육내 또는 근육내 투약을 위한 멸균 수성 또는 유성 용액, 또는 직장 투약용 좌약제)일 수 있다. 경구용에 적당한 투약 형태가 바람직하다.

본 발명의 조성물은 당업계에 공지되어 있는 통상적 약학적 부형제를 사용하여 통상적 방법에 의해 수득될 수 있다. 따라서, 경구용으로 사용하기 위한 조성물은, 예를 들어 하나 이상의 착색제, 감미제, 방향제 및/또는 보존제를 함유할 수 있다.

정제 제형물에 적당한 약학적으로 허용가능한 부형제에는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 락토스, 탄산나트륨, 인산칼슘 또는 탄산칼슘; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분; 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크; 보존제, 예컨대 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트 및 항산화제, 예컨대 아스코르브산이 포함된다. 정제 제형물은 코팅되지 않거나, 정제의 붕해 후 위장관 내에서의 활성 성분의 흡수를 변화시키거나, 그것의 안정성 및/또는 외관을 개선시키기 위해, 이 중 어느 경우에서도 통상의 코팅제 및 당업계에 공지되어 있는 절차를 이용하여 코팅될 수 있다.

경구용 조성물은, 활성 성분이 불활성 고형 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되어 있는 경질 젤라틴 캡슐의 형태일 수 있거나, 또는 활성 성분이 물 또는 오일, 예컨대 땅콩유, 액상 파라핀 또는 올리브유와 혼합되어 있는 연질 젤라틴 캡슐일 수 있다.

수성 현탁액은 일반적으로 하나 이상의 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐-피롤리돈, 검 트라가칸트 및 검 아카시아; 분산제 또는 습윤제, 예컨대 레시틴 또는 산화알킬렌과 지방산의 축합 생성물(예컨대, 폴리옥세틸렌 스테아레이트), 또는 산화에틸렌과 헵타데카에틸렌옥시세탄올과 같은 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 산화에틸렌의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 산화에틸렌과 헵타데카에틸렌옥시세탄올과 같은 장쇄 지방족 알코올의 축합 생성물, 또는 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르와 산화에틸렌의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르와 산화에틸렌의 축합 생성물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트와 함께 미분 형태의 활성 성분을 함유한다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제(예컨대, 에틸 또는 프로필 p-히드록시벤조에이트, 항산화제(예컨대, 아스코르브산), 착색제, 방향제 및/또는 감미제(예컨대, 수크로스, 사카린 또는 아스파르탐)를 함유할 수도 있다.

유성 현탁액은 활성 성분을 식물성 오일(예컨대, 아라키스유, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유) 또는 광유(예컨대, 액상 파라핀)에 현탁시켜 제형될 수 있다. 유성 현탁액은 또한 밀랍, 경질 파라핀 또는 세틸 알코올과 같은 증점제를 함유할 수도 있다. 상술된 것과 같은 감미제, 및 방향제를 첨가하여 맛좋은 경구 제제를 제공할 수 있다. 이들 조성물은 아스코르브산과 같은 항산화제의 첨가에 의해 보존 될 수 있다.

물을 첨가하여 수성 현탁액을 제조하는데 적당한 분산성 분말 및 과립제는 일반적으로 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와 함께 활성 성분을 함유한다. 적당한 분산제 또는 습윤제와 현탁화제는 이미 상술된 것들로 예시된다. 부가적 부형제, 예컨대 감미제, 방향제 및 착색제 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 수중유형 유화액의 형태로 존재할 수도 있다. 유상은 식물성 오일, 예컨대 올리브유 또는 아라키스유, 또는 광유, 예컨대 액상 파라핀 또는 이들 중 임의의 오일들의 혼합물일 수 있다. 적당한 유화제는, 예를 들어 천연-발생 검, 예컨대 검 아카시아 또는 검 트라가칸트, 천연-발생 포스파티드, 예컨대 대두, 레시틴, 지방산과 헥시톨 무수물로부터 유도된 에스테르 또는 부분 에스테르(예컨대, 소르비탄 모노올레에이트), 및 상기 부분 에스테르와 산화에틸렌의 축합 생성물, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 유화액은 감미제, 방향제 및 보존제 또한 함유할 수 있다.

시럽 및 엘릭시르는 감미제, 예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 아스파탐 또는 수크로스를 사용하여 제형될 수 있고, 점활제(demulcent), 보존제, 방향제 및/또는 착색제를 또한 함유할 수 있다.

약학적 조성물은 또한 상술되어 있는 적당한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제 중 하나 이상을 사용하여 공지된 절차에 따라 제형될 수 있는 주사가능한 멸균 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수도 있다. 주사가능한 멸균 제제는 또한 비경구적으로 허용가능한 무독성 희석제 또는 용매 중의 주사가능한 멸균 용액 또는 현탁 액, 예컨대 1,3-부탄디올 중의 용액일 수도 있다.

흡입 투여용 조성물은 액체 소적 또는 미분 고체를 함유하는 에어로졸로서 활성 성분을 분배시키도록 배치된 통상의 가압 에어로졸의 형태일 수 있다. 통상의 에어로졸 추진제, 예컨대 휘발성 불화 탄화수소 또는 탄화수소를 사용할 수 있고, 에어로졸 장치는 편리하게는 계량된 양의 활성 성분을 분배하도록 배치된다.

단일 투약 형태를 생성하도록 하나 이상의 부형제와 조합되는 활성 성분의 양은 반드시 처리 숙주 및 구체적인 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 인간에게 경구 투여하기 위한 제형물은 일반적으로 예를 들면, 총 조성물의 중량을 기준으로 약 5% 내지 약 98%일 수 있는 적절하고 편리한 양의 부형제와 혼합된 0.5 ㎎ 내지 2g의 활성 성분을 함유할 것이다. 투약 단위 형태는 일반적으로 약 1 mg 내지 약 500 mg의 활성 성분을 함유한다.

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NAADP 또는 이의 약학적으로 허용가능한 유도체의 치료 또는 예방 목적을 위한 투여량 규모는 공지되어 있는 10) 항-이상지질증, 예컨대 HMG-CoA 리덕타제 억제제(예컨대, 스타틴); PPARα 작용자(피브레이트, 예컨대 젬피브로질); 담즙산 격리제(콜레스티라민); 콜레스테롤 흡수 억제제(식물 스타놀, 합성 억제제); 담즙산 흡수 억제제(IBATi) 및 니코틴산 및 유사체(니아신 및 서방성 제형물); 11) 항고혈압제, 예컨대 β 차단제(예컨대, 아테놀롤, 인데랄); ACE 억제제(예컨대, 리시노프 릴); 칼슘 길항제(예컨대, 니페디핀); 안지오텐신 수용체 길항제(예컨대, 칸데사르탄), α 길항제 및 이뇨제(예컨대, 푸로세미드, 벤즈티아지드); 12)지혈 조절제, 예컨대 항혈전제, 섬유소용해 활성화제 및 항혈소판제; 트롬빈 길항제; 인자 Xa 억제제; 인자 VIIa 억제제; 항혈소판제(예컨대, 아스피린, 클로피도그렐); 항응고제(헤파린 및 저분자량 유사체, 히루딘) 및 와파린;　13) 글루카곤의 작용을 길항하는 제제; 및 14) 소염제, 예컨대 비스테로이드성 소염 약물(예컨대, 아스피린) 및 스테로이드성 소염제(예컨대, 코르티손) 등을 참조하여 결정될 수 있으며, kg당 0.1-1mg 범위내이면 효과를 보기에 충분하다.

후술하는 실시예를 통하여 보듯이, 본 발명은 NAADP 또는 그 유도체는 마우스에서 분리한 췌장 베타-소도세포 (β-cells)의 인슐린 분비 능을 향상시키고, 제2형 당뇨병 마우스 (C57BL/KsJ-db/db Jcl)에 투여했을 때 혈당의 저하와 인슐린의 분비를 촉진시키는 뛰어난 효과가 있고 특히, NAADP는 생체 체중 kg당 0.1 ~ 1 mg의 농도로 복강 투여했을 때, 인슐린의 분비 능을 촉진하고 혈당 조절능이 우수하여 제2형 당뇨병 (NIDDM, non-insulin dependent diabetes mellitus)을 치료하는 뛰어난 효과가 있으므로 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

실시예 1: 마우스로부터 췌장 소도의 분리 및 NAADP 처리에 따른 인슐린 분비능개선

체중 25~30 g에 해당하는 6~8주령 ICR계 마우스(오리엔트바이오, 성남)로부터 췌장 소도 (islet)의 분리는 Lacy와 Kotianovsky (Diabetes, 16, 35-39, 1967) 등의 방법에 준하여 다음과 같이 분리하였다. 마우스를 경추 탈골을 통해 희생시키고 복강을 절개하여 담관으로 냉장 1 mg/mL의 콜라겐나제 (collagenase, 시그마사, 미국)가 포함된 Hank's balanced salt solution (HBSS, 기브코사, 미국)을 주입하여 췌장을 팽창시킨 후 분리하였다. 분리된 췌장을 37℃에서 20분간 반응시킨 후 균등하게 교반하고 반응액을 HBSS로 세척하여 아시나 세포 (acinar cell)를 제거한 다음 쌍안 해부현미경하에서 일정한 크기의 췌장 소도를 분리하였다. 분리된 췌장 소도 10개를 10 mM Hepes가 함유된 100 μl의 크렙스 링거 중탄산 (Krebs Ringer bicarbonate, 시그마, 미국) 완충용액 상태에서 2.8 ~ 12 mM 글루코스 (시그마사, 미국)를 37℃에서 60분 동안 방치한 후 0 ~ 5μM NAADP (시그마, 미국)를 처리하여 췌장 베타 소도세포를 제거한 상층액으로 인슐린을 측정하였다. 인슐린의 농도 측정은 인슐린 측정 키트 (다이아그노스틱 프로덕트사, 미국)를 이용하여 방사면역측정법에 의하여 측정하였다.

글루코스 2.8 mM과 12 mM 존재하에서 0 nM과 50 nM의 NAADP가 마우스에서 분리한 췌장 베타-소도세포의 인슐린 분비능을 측정한 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다.

마우스에서 분리된 췌장 베타 소도세포에 2.8-12 mM까지 글루코스를 단독으로 처리했을 때 저농도의 글루코스 (2.8 mM)는 인슐린 분비에 영향을 주지 못했으나, 고농도의 글루코스 (12 mM) 처리군에서는 매우 높은 인슐린이 분비되었다 (도 1). 그러므로 본 발명에서는 글루코스가 적정한 인슐린 분비를 유도하는 농도인 12 mM를 선택하였고, 0.5 nM ~ 5.0 μM 까지 여러 가지 NAADP 농도를 달리하여 췌장 소도의 베타세포에서 인슐린 분비의 증가를 조사하였다. 그 결과 50 nM의 NAADP 처리군은 글루코스 (12 mM) 존재 하에서 인슐린의 분비 능을 크게 향상시키는 명백한 결과를 나타내었다 (도 1).

이상의 결과를 토대로, 췌장 베타-소도세포의 인슐린 분비를 촉진하기 위한 필수 조건은 글루코스 존재 하에서 NAADP의 유효 농도는 5 ~ 500 nM임을 확인하였다.

실시예 2: NAADP의 장기 투여에 따른 혈중 당농도 강하에 미치는 영향

본 실시예는 NAADP의 장기 투여에 따른 혈중 당농도 강하에 미치는 영향을 조사하기 위한 것이다.

7주된 제2형 당뇨병 마우스를 실시예 2에서와 같은 사육조건으로 대조군(5 마리)과 시험군에 초소형 삼투압 펌프를 이용하여 시험을 실시하였다. 멸균 인산완충생리식염수액에 0, 1 mg/kg/d에 해당하는 양의 NAADP를 90 μl에 용해시켜 동봉된 바늘과 일회용 멸균주사기를 이용하여 펌프에 주입하고 공급자의 매뉴얼에 제시된 방법을 이용하여 마우스의 복강에 투입하였다. 실험결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보듯이, 0 또는 1 mg/kg/d의 NAADP를 제2형 당뇨병 마우스에 3주간 복강투여하면서 2주(생후 9주령), 3주(생후 10주령)에 체중을 측정한 결과 주령이 경과 될수록 체중은 증가하였으나, 각 실험군당 체중의 유의한 차이는 없었다. 그러나 1 mg/kg/d의 NAADP 투여군은 명백한 혈중 당농도 강하 효과가 있었다.

이와 같은 NAADP의 혈중 당농도의 강하 효과는 하기에서 상세히 설명된다. 1 mg/kg/d의 NAADP가 함유된 삼투압 펌프를 투여한 후 2주와 3주일이 경과된 제2형 당뇨병 마우스에서 글루코스로 당부하한 후 혈중 당농도를 측정한 결과는 도 2와 같다.

NAADP를 초소형 삼투압펌프로 투여중인 제2형 당뇨병 마우스의 공복시 (시험직전 13시간 전부터 금식) 당부하 후 15-120분간 일정 간격으로 혈중 당농도를 측정한 결과 NAADP를 투여중인 마우스 그룹은 혈중 당농도가 30분을 정점으로 감소하기 시작하여 120분에 이르러 공복시 혈당으로 복귀하는 것을 확인하였다.

한편, 제2형 당뇨병 마우스의 대조군은 공복 시 혈당에서 당부하 후 120분까지도 공복시 혈당에 돌아오지 못하는 것으로 보아 혈당을 조절하는 능력이 상실된 것으로 나타났다.

이상에서 제2형 당뇨병 마우스 생체에서 1 mg/kg/d 까지 NAADP의 3주간 복강투여는 혈중 당농도를 명백히 강하시키는 뚜렷한 효과가 있었다.

실시예 3 : NAADP의 투여에 따른 혈중 인슐린 분비에 미치는 영향

본 실시예는 NAADP의 투여에 따른 혈중 인슐린 농도의 변화에 미치는 영향을 조사하기 위한 것이다.

실시예 2에서 열거한 바와 동일한 실험방법을 사용하였고, 공복시 당부하 직전 꼬리 정맥으로부터 50 ul의 혈액을 채취하고 당부하후 최고혈당치를 나타내는 30분과 최저 혈당치를 나타내는 120분에서 각각 동량의 혈액을 채취하여 응고시키고 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청은 린코리서치사 (미국)에서 구입한 인슐린방사면역측정키트를 사용하여 인슐린 농도를 측정하였다. 실험결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보듯이, 0, 1 mg/kg/d의 NAADP를 제2형 당뇨병 마우스에 3주간 복강투여하면서 3주(생후 10주령)차에 NAADP 투여군은 명백한 혈중 인슐린 분비량 증가 효과가 있었다.

이와 같은 NAADP의 인슐린 분비량의 증가 효과는 하기에서 상세히 설명된다. 1 mg/kg/d의 NAADP가 함유된 삼투압 펌프을 투여한 후 3주일이 경과된 제2형 당뇨병 마우스에서 글루코스로 당부하한 후 혈중 인슐린을 측정한 결과는 도 3과 같다.

NAADP를 초소형 삼투압펌프로 투여중인 제2형 당뇨병 마우스의 공복시 (시험직전 13시간 전부터 금식) 당부하 후 0, 30, 120분에 채취한 혈청으로부터 인슐린을 측정한 결과 NAADP를 투여중인 마우스 그룹은 혈중 인슐린농도가 30분에 정점에 달해 120분까지 일정 농도를 유지하는 것을 확인하였다.

한편, 제2형 당뇨병 마우스의 대조군은 공복시의 인슐린 농도에서 당부하 후 120분에 이르러서야 일부 인슐린 농도가 상승하는 것을 확인하였으나 실시예 2에서 확인하였던 것을 볼 때 혈당의 조절에는 충분하지 못한 것으로 나타났다.

실시예 4 : 면역조직화학염색방법에 의한 인슐린 분비능력 조사

본 실시예는 실시예 6과 같이 대조군과 1 mg/kg/d의 NAADP가 3주간 투여된 제2형 당뇨병 마우스를 대상으로 췌장 소도세포의 인슐린 분비능력을 항-인슐린 항체로 면역조직화학염색방법으로 증명하여 본 약물이 인슐린 분비 능력을 향상시키는 뛰어난 효과를 제공하기 위하여 실시하였다.

NAADP 또는 인산완충생리식염수만 투여된 마우스 각 3마리를 대상으로 공복시 1g/kg의 글루코스를 복강에 주사하고 120분이 경과된 후 경추탈골에 의해 희생시키고 즉시 복강을 절개한 후 장과 췌장 결합물을 제거하여 4% 파라포름알데하이드 액 (용매-인산완충액; pH 7.4; 시그마사, 미국)에 12시간 이상 고정한 후 췌장을 장 또는 지방조직으로부터 분리하였으며, 신선한 고정액으로 3번 이상 세척한 다음 통상적인 방법으로 파라핀 매몰조직을 제작하였다.

조직절편은 파라핀 매몰조직으로부터 5 μm간격으로 마이크로톰 (산돈사, 독일)을 이용하여 잘라 폴리-L-라이신 (시그마사, 미국)이 코팅된 슬라이드에 접착하여 면역조직화학염색에 사용하였다. 췌장조직이 코팅된 슬라이드에 파라핀을 제거하기 위해서 자일렌 (준세이사, 일본)에 5분간 반복 침습시켜 파라핀을 제거한 다음 100 - 70% 알콜 시리즈에 함수시킨 후 인산완충액 (pH 7.4)으로 5분간 방치한 후 내인성 퍼록시데이스를 제거하기 위해서 3% 과산화수소로 처리한 다음 항-인슐린 항체 (Anti-insulin antibody, 다코사, 미국)를 4℃에서 12시간 동안 결합시킨 후 슈퍼시그날 증폭 면역조직화학염색키트 (에이ㆍ비ㆍ아이사, 전주, 한국)를 이용하여 일련의 과정으로 항-인슐린 항체 면역조직화학염색을 실시하였다.

제작된 조직표본의 대비염색은 헤마톡실린으로 시행하였으며, 광학현미경 (라이카사, 미국) 100배 시야에서 검경한 후 200배로 췌장의 소도를 촬영하였다. 또한 췌장의 조직을 확인하기 위해서 헤마톡실린-에오진 (시그마사, 미국)으로 비교 염색하였다.

실험 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 인산완충액을 4주간 투여한 대조군의 헤마톡실린-에오진 염색상에서 췌장 소도를 감싸는 캡슐이 파괴되어있을 뿐만 아니라 췌장 베타-소도세포의 밀도가 낮았던 반면, 1 mg/kg/d의 NAADP를 3주간 투여한 실험 군에서는 췌장소도를 감싸고 있는 켑슐과 켑슐안의 베타-소도세포가 밀집되어 있었다.

한편 면역조직화학염색에 의한 췌장 베타-소도세포의 인슐린 염색상에 있어서, 인산완충액을 3주간 투여한 대조군은 췌장 베타-소도세포의 항-인슐린 항체에 대한 양성 반응이 현저히 줄어든 반면, 1 mg/kg/d의 NAADP를 3주간 투여한 실험군에서는 췌장 베타-소도세포의 항-인슐린 항체에 대한 양성 반응이 대조군에 비해 명백히 증가되어 NAADP가 인슐린 분비 능력을 촉진하는 뛰어난 효과가 있음을 증명하였다 (도 4).

이상의 결과는 제2형 당뇨병 마우스에 대한 NAADP 투여에 따른 실시예 2에서 발견한 혈중 당농도의 강하효과는 이 약물이 인슐린의 분비를 촉진시키는 뛰어난 효과가 있기 때문인 것으로 나타났다.

본 발명의 NAADP 또는 그 유도체는 마우스에서 분리한 췌장 베타-소도세포 (β-cells)에서 인슐린 분비능을 향상시키고, 제2형 당뇨병 마우스 (C57BL/KsJ-db/db Jcl)에 투여했을 때 혈당의 저하와 인슐린의 분비를 촉진시키는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 마우스의 췌장 소도세포를 분리하여 세포외 글루코오스 농도를 2.8 mM과 12 mM로 유지시킨 조건에서 0 nM과 50 nM의 NAADP를 처리한 후 세포외로 분비된 인슐린의 농도를 측정한 그래프이다.

도 2는 NAADP 0, 1 mg/kg/d의 농도를 유지하도록 제작된 초소형 삼투압펌프를 마우스에 투여한 후 2주차 (생후 9주령)와 3주차 (생후 10주령)때 당부하 검사를 통해 효과를 검증한 그래프이다.

도 3은 NAADP를 0, 1 mg/kg/d의 농도를 유지하도록 제작된 초소형 삼투압펌프를 마우스에 투여한 후 3주차 (생후 10주령)때 당부하 검사를 통해 시간별로 혈청내 인슐린 분비 효과를 검증한 그래프이다.

도 4는 정상 마우스와 NAADP 0, 1 mg/kg/d의 농도를 유지하도록 제작된 초소형 삼투압펌프를 제2형 당뇨 마우스에 3주간 투여한 후 췌장소도세포에 존재하는 인슐린을 면역조직화학염색법으로 비교한 사진이다. (A) 정상 C57BL/6 마우스, (B) 생리식염수 투여 제2형 당뇨 마우스군, (C) 1 mg/kg/d NAADP 투여 제2형 당뇨 마우스군.

Claims (8)

1. 니코틴산 아데닌 디뉴클레오티드 인산을 유효성분으로 포함하고, 상기 유효성분의 유효량은 0.1~1mg/kg/day인 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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