KR100984376B1

KR100984376B1 - 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용세포 전달체

Info

Publication number: KR100984376B1
Application number: KR1020070092551A
Authority: KR
Inventors: 정형민; 문성환; 김주미
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단; (주)차바이오앤디오스텍
Priority date: 2007-09-12
Filing date: 2007-09-12
Publication date: 2010-09-30
Also published as: KR20090027376A; WO2009035216A1

Abstract

본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체를 제공한다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다. 본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 질환 부위에 직접적으로 접근하지 않은 상태에서 상기 세포가 분비하는 사이토카인 등의 물질만으로 세포 치료 목적을 달성함으로써 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 체내에 직접 이식되어 발생될 수 있는 암이나, 종양의 생성에 대한 문제를 배제할 수 있다.

세포 전달체, 배아 줄기 세포, 혈관 내피 세포

Description

배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체{Cell delivery system for the cell therapy comprising cells derived from embryonic stem cells}

본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체에 관한 것이다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다.

인간 배아 줄기 세포는 무한한 자가 증식 능력과 인체를 구성하는 삼배엽성 세포로 분화할 수 있는 전분화능을 가진 세포로서(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM, Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science (1998) 282:1145-1147), 신경, 혈관, 근육, 췌장 세포 등으로 분화를 유도한 연구들이 발표됨에 따라 오늘날 난치병 치료를 위한 연구에 중요한 세포로 인식되고 있다.

인간 배아 줄기 세포의 특정 세포로의 분화 유도 방법 및 고순도의 효율적 분리 방법을 통한 세포 치료제의 개발은 약물이나 수술적 요법에 의존하는 기존의 치료 방법을 뛰어넘을 수 있는 새로운 치료법으로 난치병 치료의 핵심적 기술을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 이러한 세포치료제로서의 적용에 있어서, 특히 혈관 내피 전구 세포를 이용한 세포치료는 급증하고 있는 혈관 관련 질환들(심혈관질환, 뇌손상질환, 당뇨성 궤양 등)의 치료에 직접적 혹은 간접적으로 그 응용 범위가 클 것으로 기대된다.

한편, 혈관신생(angiogenesis) 손상된 기존 혈관 주변에서 새로운 혈관이 발아하는 형태로 발생되어, 발아한 혈관은 자신을 늘리고, 다시 분지하고, 주변의 다른 혈관과 접촉하여 의사소통하는 네트워크를 형성시키는 과정으로서, 허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환의 치료는 신속한 신생 혈관의 형성 여부에 의존한다. 혈관신생 부전-연관 질환으로는 당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈, 허혈성 심근경색 등을 포함하는 허혈성 질환, 폐색성 혈관 질환, 또는 심혈관 질환을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환의 치료방법으로는 약물요법, 경피적 동맥성형술, 동맥우회술 등이 이용되고 있으며, 최근에는 새로운 혈관의 생성을 촉진하는 단백질 또는 유전자를 허혈 부위에 투여하여 측부 혈관의 형성을 증진시킴으로써 허혈성 혈관질환을 극복하고자 하는 혈관신생 치료법 (therapeutic angiogenesis)이 새롭게 시도되고 있다. 상기 유전자 치료에 이용되고 있는 대표적인 성장인자가 VEGF이다. 또한, 상기 단백질 투여에 의한 치료로서 안지오포이에틴-1의 단밸질 구조 변형체를 족부 궤양, 심장병(심근경색과 심장 허혈증)과 뇌졸중 등의 심혈관계 질환의 치료에 사용한 예가 보고된 바 있다(Chung-Hyun Cho, Richard A. Kammerer, Hyuek jong Lee and Gou Young Koh, COMP-Ang1: a designed angiopoietin-1 variant with nonleaky angiogenec activity, PNAS(2004) 101 5547-5552). 이외에도, 혈관신생 촉진인자로는 FGF, TGF, PDGF 등이 알려져 있다. 그러나 상기 혈관신생 촉진 인자는 인간의 세포나 조직에서 얻어진 것이 아니라 E.coli 나 CHO 세포에서 배양된 것이 주로 사용되므로, 배양 시 수반될 수 있는 감염 물질 등에 대한 문제점 해결이 선행되어야 할 것이다.

허혈성 혈관 질환 등의 혈관신생 부전-연관 질환 치료를 위한 다른 방법 중, 세포 자체를 이용하는 치료법은 1997년 Asahara 등이 말초 혈액으로부터 혈관 내피 전구 세포의 분리와 그 특성을 보고한 바 있으며(Takayuki Asahara, Toyoaki Murohara, Alison Sullivan, Jeffrey M. Isner, Isolation of Putative Progenitor Endothelial Cells for Angiogenesis, SCIENCE (1997), 275, 964-967), 혈관 내피 전구 세포를 이용한 혈관신생 부전-연관 질환의 치료 가능성이 연구되고 있다. 예를 들어, 허 등은 Asahara 등이 분리한 혈관내피 전구세포가 두 가지의 서로 다른 특성을 가진 세포로 존재하고 있으며, 이를 초기와 후기로 구분지어 명명하였으며, 초기 혈관내피전구세포는 혈관신생시 혈관생성 촉진인자를 분비하는 특성을 가지고 있으며, 후기 혈관내피전구세포는 혈관신생시 직접 혈관형성에 관여하는 세포역할을 한다는 것을 규명한 바 있다(Jin Hur, Chang-Hwan Yoon, Hyo-Soo Kim, Young-Bae Park, Characterization of Two Types of Endothelial Progenitor Cells and Their Different Contributions to Neovasculogenesis (ATVB) 2004,24,288). 현재는 말초 혈액 뿐만 아니라 제대 혈이나, 골수에서 분리한 단핵구 세포를 배양하여 얻어진 혈관 내피 전구세포에 대해서도 세포치료제로의 사용가능성에 대한 연구가 진행되고 있으나, 환자에게 투여될 충분한 세포수의 확보가 새로운 문제점으로 제기되고 있다.

1998년 인간 배아 줄기 세포가 최초로 확립된 이후, 인간 배아 줄기 세포를 이용하여 혈관내피세포로 분화시키는 방법들이 연구되어 왔으며, 2002년 Levenberg S 는 인간 배아 줄기 세포로부터 배상체를 형성한 후 자연분화 방법을 통해 분화시켜, 유세포 분석기(fluorescence activated cell sorter, FACS)를 이용하여 분화된 배상체에 존재하는 혈관 내피 세포만을 얻었으며(Levenberg S, Golub JS, Amit M, Itskovitz-Eldor J, Langer R. PNAS (2002) 99, 4391-4396), 김 등은 배상체 내에서 혈관내피세포만을 특이적으로 분리하여 많은 수의 혈관내피 세포수를 확보하는 방법을 보고한 바 있다(Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DR, Koh GY, Chung HM. Stem Cells Dev. 2007 Apr;16(2):269-80.). 또한, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포가 혈관질환의 세포치료제로서 사용될 수 있음이 보고된 바 있다(Lino S. Ferreira, Sharon Gerecht, Hester F. Shieh, Robert Langer, Vascular Progenitor Cells Isolated From Human Embryonic Stem Cells Give Rise to Endothelial and Smooth Muscle-Like Cells and From Vascular Networks In Vivo, Circulation Research, 2007 Aug 3;101(3):286-94). 그러나, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포를 세포치료제로 사용하기에는 여전히 인간 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있는 악성 종양이나 기타 확인되지 아니한 부작용에 대한 안전성 문제가 아직 완전히 검증된 것은 아니다.

본 발명자들은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포(예를 들어, 혈관 내피 전구 세포 또는 혈관 내피 세포)를 사용한 세포 치료제로서, 배아 줄기 세포로부터 생성될 수 있는 악성 종양이나 기타 확인되지 아니한 부작용에 대한 안전성 문제를 회피할 수 있는 세포 전달체(cell delivery system)를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 배아 줄기 세포로부터 유래된 혈관 내피 세포 등의 세포를 특정 담체에 삽입시켜 세포 전달체를 형성시키고, 이를 생체에 이식하였을 때, 상기 세포의 생체 내 이동이 상기 담체에 의해 억제됨과 동시에 상기 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 물질에 의해 원하는 치료효과를 얻을 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 상기 치료 목적이 종료한 후 이식된 세포전달체를 외과적 수술 등에 의해 제거함으로써, 생체 내에서 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포에 의해 생성될 수 있는 악성 종양 등의 부작용을 회피할 수 있다.

따라서, 본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료 용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 종양 발생 등의 부작용을 회피할 수 있는 세포 전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체가 제공된다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다.

상기 담체의 내부에 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 삽입은 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 배아 줄기 세포는 인간 배아 줄기 세포인 것이 바람직하며, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질, 바람직하게는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트로 표지되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 태양에 따라, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 함유하는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성된 세포 전달체가 제공된다. 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 분화된 혈관 내피 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거된다.

상기 담체의 내부에 상기 분화된 혈관 내피 세포의 삽입은 상기 분화된 혈관 내피 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 바람직하다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 혈관신생 부전-연관 질환은 당뇨병성 궤양; 괴저; 치유를 위해 혈관신생이 요구되는 상처; 뷰르그병; 고혈압; 뇌혈관 허혈, 신장 허혈, 폐 허혈, 지절 허혈 및 허혈성 심근경색을 포함하는 허혈성 질환; 폐색성 혈관 질환; 및 심혈관 질환으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질, 바람직하게는 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트로 표지되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 혈관 내피 세포 등의 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 담체로 감싸줌(enveloping)으로써, 상기 배아 줄 기 세포로부터 유래된 세포가 상기 담체 외부로 이동하는 것을 방지함과 동시에 상기 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 물질은 효과적으로 방출하도록 설계되어 있다. 따라서, 본 발명의 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 질환 부위에 직접적으로 접근하지 않은 상태에서 상기 세포가 분비하는 사이토카인 등의 물질만으로 세포 치료 목적을 달성함으로써 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 체내에 직접 이식되어 발생될 수 있는 암이나, 종양의 생성에 대한 문제를 배제할 수 있다.

본 발명은 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성되고; 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거되는, 세포 전달체를 포함한다.

상기 배아 줄기 세포는 포유동물 유래의 모든 배아 줄기 세포를 포함하며, 바람직하게는 인간에서 유래된 배아 줄기 세포를 사용할 수 있다. 상기 인간 배아 줄기세포는 인간 상실배의 내부 세포 괴로부터 유래된 전능 세포를 말한다. 상기 인간 배아 줄기세포는 예를 들어 CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006 10;340(2):403-408) 등이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 배아 줄기세포는 당업자에 의하여 용이하게 구축될 수 있다.

상기 배아 줄기 세포(바람직하게는 인간 배아 줄기 세포)로부터 유래된 세포는 세포 치료(cell therapy)의 목적으로 사용되는 미성숙 또는 성숙 세포를 모두 포함하며, 특별히 제한되는 것은 아니다. 상기 미성숙 또는 성숙 세포는 공지의 방법에 따라 배아 줄기 세포(바람직하게는 인간 배아 줄기 세포)로부터 분화(부분 분화 또는 완전 분화)시킴으로써 얻을 수 있으며, 그 종류 및 방법은 제한되지 아니한다. 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포는 공지의 방법, 예를 들어, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280 에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 세포 전달체는 마트리겔(matrigel) 담체를 포함한다. 상기 담체는 그 내부에 삽입된 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 이식 부위에서 다른 곳으로 이동하는 것을 차단함과 동시에 삽입된 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 다양한 물질이 효과적으로 방출되도록 기능한다. 따라서, 상기 담체의 사용은 본 발명에 따른 세포 전달체가 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되는 것을 가능하게 한다.

상기 담체로는 마트리겔을 바람직하게 사용할 수 있다. "마트리겔(matrigel)"은 종양세포주로부터 분리된 분비된 세포외 매트릭스 물질의 일종으로서 Engelbreth-Holm-Swarm 종양 분비 매트릭스이다. 마트리겔은 라미닌, 콜라겐 4형, 헤파린, 알려지지 않은 다양한 종류의 성장 인자들을 함유한다. 마트리겔은 세포성장에 탁월한 기질을 제공하므로(예, Vukicevic 등, Exp. Cell Res, 202(1), 1-8(1992)), 세포의 배양이나 증식에 기질로서 사용되고 있다. 된다. 또한, 마트리겔은 상온에서 겔 형태를 유지하며, 4 ℃에서는 액체로 존재하고, -20 ℃에서는 고체를 형성한다. 여러 가지 성장인자가 혼합된 마트리겔에서 혈관 내피 세포 혹은 혈관 내피 전구 세포를 배양하게 되면 다양한 성장인자가 혈관신생을 위한 기질로 작용하기 때문에 혈관 코드 또는 혈관 튜브가 형성된다고 알려져 있다. 상기 성장인자로는 Engelbreth-Holm-Swarm 종양에서 분비되는 TGF-beta, fibroblast growth factor 등이 있다. 본 발명의 세포전달체는 담체로서, 상기 성장인자들이 제거된 마트리겔(예를 들어, 상업적으로 구입가능한 성장인자들이 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사(미국))을 더욱 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 세포 전달체는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 상기 담체의 내부에 삽입시켜 형성되며, 상기 담체의 내부에 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 삽입은 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 보다 효율적인 이동 방지 효과를 달성할 수 있으므로 바람직하다.

상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포 및 담체의 사용량은 세포 치료의 목적을 달성하기 위하여 필요한 함량으로 사용될 수 있으며, 당업자는 어려움 없이 상기 세포 및 담체의 사용량을 정할 수 있다. 예를 들어, 허혈성 혈관에 대한 세포치료를 목적으로 혈관 내피 세포를 사용하는 경우, 상기 혈관 내피 세포는 5.0 X 10⁶ cells를 9-11개 정도의 세포군으로 준비하여 상기 세포군 모두를 약 400∼500 ul의 마트리겔 내부에 삽입시킬 수 있다. 물론, 상기 세포 및 담체의 사용량은 필요에 따라 변경될 수 있다.

상기 세포 전달체에 세포 치료를 위한 세포로서 함유되는 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포는 형광물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 상기 형광물질로는 DiA [4-(4-디테트라데실아미노스티릴)-N-메틸피리디니움 아이오다이드(4-(4-ditetradecylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18(5) 즉 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술포네이트 염], DiI (DiIC18(3) 즉, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)], DiO [DiOC18(3) 즉, 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 퍼클로레이트], DiO-C14(3) [히드록시에탄술포네이트 (3,3'-디헥사 데실옥사카르보시아닌, 히드록시에탄술포네이트], DiR [DiIC18(7), 즉 1,1'-디옥타데실테트라메틸 인도트리카르보시아닌 아이오다이드(1,1'-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine Iodide)] 등을 사용할 수 있다. 이 중 약 533nm 파장대의 DiI 또는 488nm 파장대인 Dio를 바람직하게 사용할 수 있으며, 약 533nm 파장대의 DiI를 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 형광물질을 통하여, 본 발명의 세포 전달체의 생체 내 거동을 실시간으로 모니터하는 것이 가능하다. 예를 들어, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사) 등을 이용하여 체내에 이식된 세포의 위치를 실시간으로 모니터할 수 있다.

본 발명에 따른 세포 전달체는 최종적으로 즉 치료목적을 달성한 후, 외과적 수술 등의 방법으로 이식 부위로부터 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세포 전달체는 치료 목적으로 이식된 내포로부터 발생할 수 있는 암, 종양 등의 발생 위험을 완전히 배제할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따라, 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 함유하는 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서, 상기 세포 전달체가 상기 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성되고; 상기 세포 전달체는 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 분화된 혈관 내피 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거되는, 세포 전달체가 제공된다.

상기 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포는 공지의 방법, 예를 들어, Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280 에 개시된 방법에 따라 얻을 수 있다. 상기 분화된 세포 중 배상체로부터 분화된 혈관 내피 세포군만을 분리 증식하여 유세포 분석기로 혈관내피세포 표지인자(PECAM, CD34, KDR/Flk-1, CD133, Tie-2, VE-cadherin, vWF 등)에 양성인 세포를 분리하여 사용하는 것이 더욱 바람직하다.

상기 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체는 마트리겔(matrigel) 담체를 포함한다. 상기 담체는 그 내부에 삽입된 분화된 혈관 내피 세포가 이식 부위에서 다른 곳으로 이동하는 것을 차단함과 동시에 삽입된 혈관 내피 세포로부터 분비되는 사이토카인 등의 다양한 물질이 효과적으로 방출되도록 기능한다. 따라서, 상기 담체의 사용은 본 발명에 따른 세포 전달체가 질환 부위가 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되는 것을 가능하게 한다. 상기 담체로는 성장인자를 함유하지 않는 마트리겔(예를 들어, 상업적으로 구입가능한 성장인자들이 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사(미국))을 바람직하게 사용할 수 있다.

상기 세포 전달체는 분화된 혈관 내피 세포를 마트리겔(matrigel) 등의 담체의 내부에 삽입시켜 형성되며, 상기 담체의 내부에 분화된 혈관 내피 세포의 삽입은 상기 분화된 혈관 내피 세포의 응집 세포군(aggregated cell clusters)을 상기 담체의 내부에 삽입함으로써 수행되는 것이 보다 효율적인 이동 방지 효과를 달성할 수 있으므로 바람직하다. 예를 들어, 혈관 내피 세포 5.0 X 10⁶ cells를 9-11개 정도의 세포군으로 준비하여 상기 세포군 모두를 약 400∼500 ul의 마트리겔 내부에 삽입시켜 혈관신생 부전-연관 질환 치료용 세포 전달체를 형성시킬 수 있다. 물 론, 상기 혈관 내피 세포 및 담체의 사용량은 필요에 따라 변경될 수 있다.

상기 세포 전달체에 세포 치료를 위한 세포로서 함유되는 분화된 혈관 내피 세포는 형광물질로 표지되어 있는 것이 바람직하다. 상기 형광물질로는 DiA [4-(4-디테트라데실아미노스티릴)-N-메틸피리디니움 아이오다이드(4-(4-ditetradecylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide)], DiD [DiIC18(5) 즉 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도디카르보시아닌, 4-클로로벤젠술포네이트 염], DiI (DiIC18(3) 즉, 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)], DiO [DiOC18(3) 즉, 3,3'-디옥타데실옥사카르보시아닌 퍼클로레이트], DiO-C14(3) [히드록시에탄술포네이트 (3,3'-디헥사 데실옥사카르보시아닌, 히드록시에탄술포네이트], DiR [DiIC18(7), 즉 1,1'-디옥타데실테트라메틸 인도트리카르보시아닌 아이오다이드(1,1'-dioctadecyltetramethyl indotricarbocyanine Iodide)] 등을 사용할 수 있다. 이 중 약 533nm 파장대의 DiI 또는 488nm 파장대인 Dio를 바람직하게 사용할 수 있으며, 약 533nm 파장대의 DiI를 더욱 바람직하게 사용할 수 있다. 상기 형광물질을 통하여, 본 발명의 세포 전달체의 생체 내 거동을 실시간으로 모니터하는 것이 가능하다. 예를 들어, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사) 등을 이용하여 체내에 이식된 세포의 위치를 실시간으로 모니터할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. DiI (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트)로 염색된 혈관 내피 세포

인간 배아 줄기세포 CHA-hES3 (Ahn SE, Kim S, Park KH, Moon SH, Lee HJ, Kim GJ, Lee YJ, Park KH, Cha KY, Chung HM. Primary bone-derived cells induce osteogenic differentiation without exogenous factors in human embryonic stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2006 10;340(2):403-408)를 Kim 등의 방법(Kim J, Moon SH, Lee SH, Lee DY, Koh GY and Chung HM, "Effective Isolation and Culture of Endothelial Cells in Embryoid Body Differentiated from Human Embryonic Stem Cells" Stem cell and Development (2007) 16:269.280)에 따라 자연분화시켜 얻은 혈관 내피세포로부터 유세포 분석기로 vWF 양성 세포만을 분리하였다.

혈청이 배제된 DMEM 고 글루코오즈(high glucose) 배지에 DiI (1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트) 용액(10 ul)을 1:200으로 희석하여, 세포-표지 용액을 제조한 후, 상기에서 분리한 혈관 내피세포와 혼합한 후, 37 ℃ 배양기에서 약 15-20 분 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 인산완충식염수(PBS)로 3회 세척한 후, 형광 현미경으로 DiI가 제대로 염색되었는지 확인하였다.

실시예 2. 마트리겔(matrigel)을 사용한 세포 전달체의 제조

실시예 1에서 준비한 Dil로 염색된 혈관 내피 세포 5 X 10⁵ cells를 EGM-2/MV 배양액(Cambrex사, 미국)에 넣어 배양 접시 바닥에 방울의 형태로 만든 후, 배양접시를 뒤집어 24 시간 동안 배양기에서 배양하여 세포가 응집하여 공과 같은 형태를 이룬 응집된 세포군(sorted cells 또는 aggregated cell clusters)를 얻었다. 겔 형태의 성장인자가 제거된 마트리겔(BD Bioscience 사, 미국)을 지름 50-70 mm, 높이 50-70mm의 원통형으로 자르고, 상기 응집된 세포군을 상기 원통형 마트리겔의 내부에 삽입한 후, 37 ℃ 배양기에 30 분 동안 배양하여, 세포가 마트리겔로 감싸여진 형태의 세포 전달체를 얻었다 (도 1의 C-E 참조).

성장인자가 포함된 마트리겔(BD Bioscience 사, 미국)을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 세포 전달체를 제조하였다. 그러나, 얻어진 세포 전달체로부터 빠른 시간(24 시간) 내에 응집된 세포군으로부터 세포가 뻗어나옴으로써(도 1의 F 참조 ), 생체 내에서 세포의 이동을 억제시키는데 있어서는 한계가 있음을 알 수 있다.

시험예 1.

(1) 하지 허혈 마우스 모델의 제작

6-7 주령의 면역 결핍 누드 마우스(Balb/C Nude, Charles River Laboratories 사)에 케타민(ketamine)과 럼푼(Rumpun)을 4:1의 비율로 조제한 마취제를 마리당 50 ul의 양으로 복강 주사하였다. 마취된 마우스를 고정하여 배와 대퇴부 경계면의 피부를 1cm 정도 세로로 절개한 후, 배와 대퇴부 경계면의 지방을 제거하였다. 외장골 동맥(Iliac artery)를 따라 배쪽의 총 외장 동맥(common illiac artery)를 4-0 black silk 봉합사로 두 번 묶어 주었다. 외장골 동맥을 따라 발목 부분에서 두 갈래로 나뉘는 혈관 바로 위를 한번 묶어 주었다. 발목 혈관 매듭 위에서부터 대퇴부 매듭 아래까지 혈관을 잘 잡아서 근육이 최대한 손상되지 않게 혈관만 박리하였다. 조직을 정리한 후 피부를 봉합하였다.

(2) 세포 전달체의 투여에 의한 혈관신생의 평가

상기 (1)에서 제조한 하지 허열 마우스를 각각 2 군(n=5)으로 나누고, 제1군은 성장인자가 제거된 마트리겔을 이식하고, 제2군은 실시예 2에서 제조한 세포 전달체(성장인자가 제거된 마트리겔을 사용하여 얻어진 세포 전달체)를 각각 상기 마우스의 등 부위에 이식하였다. 상기 마트리겔 또는 세포전달체의 이식은 하지 허혈 마우스의 등 피부를 약 1 cm 정도 세포로 절개한 후, 상기 마트리겔 또는 세포전달체를 약제 스푼으로 떠서 형태의 변화 없이 마우스의 등에 이식한 후, 피부를 봉합함으로써, 이식하였다. 상기 이식된 마트리겔 또는 세포전달체의 제거는 이식 부위 주변의 피부와 함께 수술용 가위로 제거함으로써 수행하였으며, 상기 제거 후 봉합하였다.

도 2의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 2 주 경과한 후에 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 또한 도 2의 C 및 D는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 3 주 경과한 후에 상기 마트리겔 및 세포 전달체를 제거한 후 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. 도 2의 B에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 제작된 세포 전달체를 투여한 경우, 효과적인 혈관신생에 의해 괴사가 발생하지 않았으며, 상기 세포 전달체가 이식 부위에 그대로 머물러 있음을 알 수 있다. 또한, 상기 마트리겔 또는 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스(도 2의 C 및 D)의 왼쪽 하지 조직을 채취하여 혈관신생 인자인 VEGF와 Ang-1의 발현을 RT-PCR로 측정한 결과, VEGF와 Ang-1이 특이적으로 발현됨을 알 수 있다 (도 2의 E 참조).

도 3의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 12 주 경과한 후에(세포 전달체의 제거 및 봉합 수술은 세포 전달체를 투여하고 3 주 경과한 후에 실시하였다) 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 또한 도 3의 C 및 D는 괴사가 발생하지 않은 마우스(도 3의 B)의 하지를 해부한 결과를 나타낸다. 상기 도 3의 B로부터 알 수 있는 바와 같이, 일정기간 치료효과가 진행된 후에는 이식된 세포를 제거하더라도 치료효과가 지속적으로 유지됨을 확인할 수 있다. 또한, 도 3의 D로부터, 검은색 화살표 부분의 혈관이 제거된 부위에 파란색 화살표 부분에서 새로운 혈관이 생성된 것을 알 수 있다.

시험예 2. 마트리겔과 혈관 내피 세포와의 혼합물 이식

실시예 2와 동일한 방법으로 얻은 혈관 내피 세포의 응집된 세포군을 성장인자가 배제된 마트리겔 약 450 g과 혼합한 후, 얻어진 혼합물을 하지 허혈 마우스의 등 및 엉덩이 부위에 이식하였다. 1 주 후, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 결과는 도 4와 같다. 도 4에서 알 수 있는 바와 같이, 세포를 마트리겔로 감싸지 않고, 단순히 혼합한 경우에는 세포가 이식 부위 주변으로 이동하므로, 이식되는 세포로부터 발생할 수 있는 종양 생성 등의 부작용을 배제할 수 없다.

시험예 3. 혈관신생 인자의 직접 투여와의 비교

혈관신생 인자로 알려져 있는 VEGF 100 ng를 하지 허열 마우스의 꼬리 정맥을 통하여 2 주간 2일 간격으로 주입하였다. 또한, VEGF 100 ng를 하지 허열 마우스의 하지 허열 부위 주변에 2 주간 2일 간격으로 주입하였다. 그 결과는 도 5와 같다. 도 5의 A(꼬리 정맥에 주입) 및 B(하지 허열 부위 주변에 주입) 모두 괴사가 진행되었다. 이는 본 발명의 세포 전달체를 투여하였을 때 괴사가 발생하지 않은 것은 세포 전달체 내부에 삽입된 분화된 혈관 내피세포가 분비하는 혈관신생과 관련된 인자에 의한 것임을 반증한다.

도 1은 본 발명의 세포 전달체이 제작 과정을 도식화한 것으로, A는 인간 배아 줄기 세포로부터 분화된 혈관 내피 세포를 분리한 후, 이를 배양한 세포의 사진이며, B는 상기 배양된 세포를 DiI로 염색한 사진이다. C-E는 DiI로 염색된 혈관 내피 세포를 성장인자가 제거된 마트리겔 내부에 삽입시켜 제조한 세포 전달체의 모식도 및 72 시간이 경과한 후에 측정한 사진이며, F는 성장인자가 포함된 마트리겔로 DiI로 염색된 혈관 내피 세포를 감싼 전달체로서, 24 시간이 경과한 후에 측정한 사진이다.

도 2는 하지 허혈 마우스에 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 이식한 후 2 주 또는 3 주 경과한 후에 측정한 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 2 주 경과한 후에 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, C 및 D는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 3 주 경과한 후에 상기 마트리겔 및 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이다. E는 상기 마트리겔 또는 세포 전달체를 제거한 후 측정한 하지 허혈 마우스(도 2의 C 및 D)의 왼쪽 하지 조직을 채취하여 혈관신생 인자인 VEGF와 Ang-1의 발현을 RT-PCR(역전사 중합 효소 연쇄반응)로 측정한 결과를 나타낸다.

도 3의 A 및 B는 마트리겔 또는 본 발명의 세포 전달체를 각각 투여한 후 12 주 경과한 후에 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 하지 허혈 마우스의 사진이며, 도 3의 C 및 D는 괴사가 발생하지 않은 마우스(도 3의 B) 의 하지를 해부한 결과를 나타낸다.

도 4는 혈관 내피 세포 및 성장인자가 배제된 마트리겔의 혼합물을 하지 허혈 마우스의 등 및 엉덩이 부위에 이식한 후, 형광 분석 이미지 장치(Xenogen 사, 미국)를 사용하여 측정한 결과를 나타낸다.

도 5는 혈관신생 인자로 알려져 있는 VEGF 하지 허열 마우스의 꼬리 정맥 도는 하지 허열 부위 주변에 2 주간 2일 간격으로 주입하였을 때의 결과를 나타낸다.

Claims

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배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 함유하는 세포치료용 세포 전달체(cell delivery system)로서,

상기 세포 전달체가 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포를 마트리겔(matrigel)로 이루어진 담체의 내부에 삽입시켜 형성되고; 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포가 형광물질로 표지되어 있고; 상기 세포 전달체는 질환 부위와 직접 접촉하지 않는 생체 내의 다른 부위에 이식되며; 상기 세포 전달체가 생체에 이식되었을 때, 상기 담체에 의하여 상기 이식 부위로부터의 상기 배아 줄기 세포로부터 유래된 세포의 생체 내 이동이 억제되고; 최종적으로 상기 이식 부위로부터 제거되는, 세포 전달체.
제5항에 있어서, 상기 형광물질이 1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카르보시아닌 퍼클로레이트인 것을 특징으로 하는 세포 전달체.
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