JP6850287B2 - ティッシュエンジニアリング - Google Patents
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Description
本発明は、概して、インプラント、特に管腔組織インプラントの作製に用いられる方法及び材料に関し、このインプラントは、無細胞足場又はマトリックスに筋細胞前駆体及び線維芽細胞を播種することによって操作(engineer)される。本発明は、改善された細胞の生着及び分化のために本明細書に記載される新規播種方法を利用することができる、対象への植え込み(implantation)のためのティッシュエンジニアリングコンストラクトを作製する方法を提供する。加えて、本発明は、本発明のエンジニアリングコンストラクト又は組織を植え込むことによって個体を治療する方法を記載する。
組織又は臓器損傷、機能不全又は欠損は、様々な医学的状態の特徴である。かかる状態の一部では、損傷組織又は臓器の置換が最良の選択肢であり、又は唯一の選択肢となることさえある。
意外にも、本発明者らは、本発明の方法に従って筋細胞前駆体と線維芽細胞との組み合わせを組織足場又はマトリックスに播種して、臓器の修復又は置換のためのコンストラクトを操作すると、三次元マトリックスの細胞生着及びコロニー形成が改善され得ることを実証した。
(i)足場又はマトリックスを提供する工程と、
(ii)マトリックス内及び/又はその上に中胚葉性血管芽細胞と線維芽細胞との組み合わせを播種する工程であって、前記中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞が、別々に、同時に又は逐次的に播種される、工程と、
(iii)播種された足場を培養して植え込み可能なコンストラクトを作製する工程と
を含む方法を提供する。
中胚葉性血管芽細胞の単離及び特徴付け
在胎9〜12週齢のヒト胎児の筋組織から胎性中胚葉性血管芽細胞(fMAB)を単離した。標本を希釈マトリゲルでコーティングしたプレートに播き、8日間培養下に置いた。筋組織から移動した細胞を回収し、培養拡大して特徴付けた。細胞は、培養4、5、6及び7代継代で免疫蛍光法、FACS並びに平滑筋及び骨格筋への分化能によって特徴付けた。FACS分析について、細胞をCD31、CD34、CD44、CD45、CD56、CD90及びCD146に対する抗体と共にインキュベートした。分化能について、細胞を低血清培地と共に(骨格筋分化)、及びTGFβを添加して(平滑筋分化用)インキュベートした。
調達前に患者の同意を得た上で、6つのドナー筋生検(1つは成人患者、5つは小児患者)を入手した。これらの6つの生検のうち、3つの初代中胚葉性血管芽細胞株の樹立に成功し、7代継代までかかって骨格筋及び平滑筋の両方に分化させた。細胞継代毎に中胚葉性血管芽細胞株を凍結保存して、後の特徴付け研究及び再培養のためのバンクを樹立した。中胚葉性血管芽細胞株はコラーゲン(胎盤由来)をコーティングしたT25フラスコに樹立して、マトリゲルをコーティングしたペトリ皿を使用した手順との直接比較を可能にした。継代毎に中胚葉性血管芽細胞株の表現型を特徴付けるためにMACSQuantフローサイトメーターを使用して8カラーフローサイトメトリーパネルを樹立した。全ての抗体は力価測定し、パネルは中胚葉性血管芽細胞の特徴付けに関してバリデートした。
筋肉由来線維芽細胞の単離及び拡大を中胚葉性血管芽細胞単離に使用したのと同じ生検から樹立した。
照射線維芽細胞のフィーダー層上で培養したECで、EC及び線維芽細胞培養(MRC5線維芽細胞を使用する)を実施した。
連続流の脱イオン水を4℃で24時間、4%デオキシコール酸ナトリウムを室温(RT)で4時間、及び1M NaCl中50kU/mL DNアーゼIをRTで3時間送達することによる管腔灌流からなる洗剤酵素処理(DET)により、ラット食道を脱細胞化した。無細胞足場は1%P/S含有PBS中4℃で最長1ヵ月保存した。
無細胞足場における細胞播種のため、fMAB及びマウス線維芽細胞(共播種実験についてのみ)を両方ともに5〜7代継代間でトリプシン処理し、マトリゲル低成長因子(GFR)1:2希釈物又は培地のみに懸濁して氷上に保管した。足場にNGチューブを挿管して、播種のためのより容易なアクセス及び操作を可能にした。細胞の注入にはインスリンシリンジを使用し、食道足場の可能な限り多くの範囲が覆われるように各約5μLの注入を複数回実施した。細胞は、無菌フードに置いた実体顕微鏡を使用して、106細胞/5mm長の密度でマトリックスの筋層に直接注入した(図1)。或いは、マトリゲルGFR1:2希釈物又は培地に懸濁した細胞を足場の表面上に播種した。
− 増殖用又は分化用培地を有するマルチウェルプレートにおいて管状マトリックスとして静置条件で培養し、
− 長手方向に開き、増殖用又は分化用培地を有するマルチウェルプレートにおいて平らなマトリックスとして静置条件で培養し(図2)、
− 管状マトリックスとしてプラスチック又はガラスアーバに縫合糸で固定し、バイオリアクターに置いて24時間静置培養し、続いて6〜7日間動的培養した。
動的培養は、典型的には、好適に適合させたApplikon(登録商標)Biotechnologyによって供給されるバイオリアクターを使用して実施した。このバイオリアクターは、2つの構成要素:センサ及びスターラを備えたオートクレーブ処理可能なリザーバ;pH、温度、撹拌速度、泡の程度をモニタし、且つチュービングポンプを補助するコントローラからなった。加えて、インターフェースとしてPCを設置した。
細胞の播種後、麻酔下で5mmの管状足場をヌードマウスの腹腔内に植え込み、吸収性縫合糸を使用して大網で包み込んだ。足場には管腔内にNGチューブを植え込んでマトリックスが潰れるのを防ぎ、食道の構造を維持した(図5)。植え込み後2及び4週間で動物を犠牲にし、足場を回収して、組織学用に固定した。
組織試料及び細胞培養物をPBS中10%中性緩衝ホルマリン溶液に4℃で24時間(組織)又は10分間(細胞)固定し、次に蒸留水(dH2O)で洗浄した。組織をスクロース溶液で脱水し、凍結切片化のため液体窒素で凍結した。プレートに固定した7μm切片及び細胞をヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色するか、又はアルカリホスファターゼ(AP)、NG2、PDGFRβ、ミオシン重鎖(MyHC)、ミオゲニン、α平滑筋アクチン(aSMA)、SM22、ヒト核、Ki67、CD68及びMyoDに関して免疫染色した。次に試料を蛍光二次抗体と共にインキュベートし、DAPIで対比染色し、水性封入剤でマウントした。
胎性MABは、成人MABと同等の形態、特徴及びマーカー発現を示した。FACS分析から、低レベルのCD31、CD34、CD45、CD90(0〜1%)、高レベルのCD44(97〜100%)及び様々なレベルのCD56及びCD146(0〜25%)が検出された。増殖用培地での培養では、fMABは、MABの2つの古典的マーカーであるAP反応及びNG2染色が陽性であった(図6)。骨格筋分化用培地とインキュベートすると、細胞は融合して、MF20陽性の、核マーカーミオゲニン(MyoG)を発現する成熟筋管を形成することが可能であった。fMABはまた、高濃度化TGFβサイトカインを添加した低血清培地で培養したとき、平滑筋表現型への分化能も実証した。平滑筋分化用培地において6日後、細胞はSM22及びaSMAなどの典型的な平滑筋マーカーを発現した。
細胞生存及び生着に対する媒体の効果を理解するため、マトリゲル又は培地中での細胞送達を比較して食道無細胞マトリックス播種を実施した。加えて、静置培養24及び48時間後の足場への細胞接着及び移動を分析して、マイクロインジェクションと表面播種の比較を評価した。ラット無細胞食道足場にマイクロインジェクション及び表面播種のいずれかによってマトリゲル中で送達された胎性MABは、24及び48時間後に細胞接着及び生存を示した。マイクロインジェクション試料では、マトリックスの表面上への細胞接着がマトリックス内の細胞生着よりも効率的であった。しかしながらマイクロインジェクションしたマトリックスの場合、時間と共に細胞数が増加し、より高い細胞増殖が明らかになった(図7)。培地によってのみ播種された細胞は、より低い生着及び増殖を示し、静置培養の24〜48時間にわたり実質的な変化はなかった。これらのデータは、マトリゲルと培地との比較並びに細胞生存及び無細胞マトリックスへの増殖に対する播種技法の効果の理解の向上に役立った。
共播種実験を実施して、fMABと共に播種したときのマトリックス内部での細胞生存及び移動に対する線維芽細胞(FB)の効果を確立した。本発明者らは、fMABをマウスFBと85:15及び70:30の比で併せて、又は対照としてfMAB単独で、1×106/5mm足場長さの総細胞密度となるようにマイクロインジェクションした。次に、試料を静置条件で5日間培養した。DAPIで染色した播種足場の低温切片は、fMAB単独播種試料と比較して共播種足場において相当数の細胞及びより良好な細胞分布を示し、ECMにおけるfMAB生着に対するFBの正の効果が示唆された(図8)。更に、fMABとmFBとの最良の比は85:15であるように見え、明らかに多いマトリックス内部の細胞数を呈した。これらのデータは、共培養において6日後の播種試料におけるfMAB及びmFB並びにそれらのマーカー発現の仕様を特定する追加の分析によって補完されるであろう。加えて、面積当たりの細胞の正確な数が無作為写真において決定されるであろう。
共播種実験と並行して、バイオリアクター及び中空臓器用の2つの異なる培養チャンバを使用して動的培養実験を実施した。チャンバは、同様の特徴:オートクレーブ処理可能であり、シリコン滅菌チュービング及びコネクタを介して培地リザーバと接続可能である、別個のフローを有する内側及び外側チャンバによって特徴付けられた。それにも関わらず、予備実験から、足場の汚染、チャンバ内部における一定の調節可能な培地レベルの維持、及びハーバへの管状足場の縫合糸による固定に関する幾つかの問題が浮かび上がった。このような理由で、最初の試行後、動的培養実験は上記に記載するカスタムメイドのガラスチャンバを使用して行った。
インビボでの無細胞足場の血管新生及びリモデリングを研究するため、後の同所性移植前の前血管新生工程として、MABを播種した管状足場を免疫不全マウスの大網に植え込んだ。
中胚葉性血管芽細胞(MAB)をラット食道無細胞足場に注入し、増殖用培地で24時間、続いて(骨格筋への)分化培地で5日間培養した。培養した足場から得た低温切片の予備的分析(DAPI染色)から、マトリックス内部に明白な細胞生着及び増殖があった(図11A、図11B)。更に深く分析すると、動的培養条件によって刺激及び改善された細胞分布及び移動が明らかになった(H&E、図11C、図11D)。細胞はまた、骨格筋前駆細胞の特異的マーカーであるMyoD染色で決定したとき、骨格筋分化への初期のコミットメントも示した(図11E、図11F)。
最良の共播種条件のhMAB:mFB(85:15)を用いて、hMAB単独との比較で培養条件を最適化した。85:15共播種又は単独hMABを注入したラット足場を増殖用培地で2又は4日間、続いてTGFβを含有する分化用培地で7日間(それぞれ2+7及び4+7日間)培養して平滑筋分化を誘導した。足場は静置及び動的セッティングで培養した。静置培養試料のDAPI染色から、2+7及び4+7培養条件間の特別な違いは明らかにならなかった(図13)。
hMAB単独を脱細胞化ウサギ食道足場に播種し、静置培養及び動的培養で7日間培養した。並行実験で平滑筋細胞(イヌ由来)を対照として使用した(図15)。ウサギ足場播種により、動的培養を静置培養と比較したとき、hMAB単独の播種であったにも関わらずより良好な細胞分布及び移動が確認された。SMC播種試料は高い細胞生着率及び生存率を示したが、注入部位からの細胞移動性は低かった(図16)。hMABは全足場層における均一な分布及び既存の筋繊維に沿った配向を示した(H&E、図16)。
無細胞食道足場の同所性移植手順を更に最適化した。事前の細胞播種なしに脱細胞化マトリックスの断片をラット及びウサギに植え込み、後のインビボでのエンジニアリングコンストラクト移植のための工程及び条件を定義した。この手順は、ラット及びウサギ動物モデルの両方について開発した。これは、甲状腺葉及び筋肉を反転させて元の食道を露出させ、食道の一部分(1〜2.5cm、動物モデルに依存する)を除去し、NGチューブを通して吻合中の食道の安定化及び識別を助けることからなる(図17A)。次に、遠位及び近位吻合を実施して(図17B)、足場の両方の端部を既存の食道につないだ(ラット、図17C;ウサギ、図17D、図17E)。
生着の成功を達成するために必要な細胞の量を確立するため、生着した細胞の可視化及びそれらの間接的な定量化を可能にするMTT生存アッセイ及びイメージングを用いて種々のヒト中胚葉性血管芽細胞(hMAB)密度を試験した。生細胞は、供給される基質(MTT)を代謝して目に見える色が変化した生成物(ホルマザン)を生じ、これを抽出して、吸光度の読み取りにより定量化することができる。足場断片に播種し、24時間インキュベートしてからアッセイを始めた。
足場内の細胞生着及び分布を増進させるため、動的培養手法を用いて連続培地フローを可能にし、栄養素及び酸素交換に有利となるようにした。既に決定されたとおり、hMAb播種及び共培養播種(hMAB及び線維芽細胞)食道を成長培地で2日間及び平滑筋分化培地で7日間培養した。TGFβを2ng/mlの濃度で毎日新鮮供給した。図19A〜図19Bに示されるとおり、合計9日間の培養後、hMAB播種足場の筋層には共播種対応物と比較して有意に多い数の細胞が集まった。粘膜下層は逆の傾向を示し、共播種足場においてhMAB単独よりも有意に多く集密した。
分析から、新生児ヒトドナー組織の供給は需要に対して不足し得ることが示された。従って、人造ヒト細胞由来足場と並行して脱細胞化動物由来足場を試験した。
1.ブタ食道を摘出し、保存溶液に入れ、GMP製造所に輸送する。
2.2サイクルのDETプロトコル(RTで24時間の水、RTで4時間のデオキシコール酸ナトリウム及びRTで3時間のDNアーゼ)を用いて脱細胞化し、足場を照射して(滅菌し)、緩衝液中に保存する。
3.脱細胞化足場に中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞を注入する。中胚葉性血管芽細胞は患者の筋生検、線維芽細胞は皮膚生検に由来する − 新生児については、胃瘻造設手技の際に両方を腹壁からまとめて採取してもよい。
4.チャンバ内においてチャンバ条件をバイオリアクターコントローラで外部制御しながら、加湿37℃、5%CO2に維持した限定増殖培地で2日間及び限定分化培地で9日間播種足場を培養する。
5.上皮細胞を食道足場の管腔側面に送達する(患者の既存の痕跡的食道の生検に由来する初代細胞)。
6.更なる培養後、チャンバに入れて手術室に輸送し、取り出して患者に移植する。
以下に記載する全ての共播種実験で使用するマウス線維芽細胞(mFB)は、酵素消化によって野生型マウス後肢骨格筋(長趾伸筋 − EDL)及び横隔膜から単離し、プレーティングして拡大した。細胞は古典的な細長い形態及びサイズを示し、培養下で拡大したときにKi67陽性で、数継代にわたる増殖能を呈した(図23)。線維芽細胞はまた、ビメンチン及びTCF−4などの古典的マーカーも陽性であった。
hMAB又はhMAB+mFB(85:15比)を播種して静置条件で培養した脱細胞化ラット足場を先述のとおり固定し、凍結切片化して、ヒト核及びDAPIに関して染色した。切片をスキャンして足場に存在する全ての細胞を検出及びカウントし、細胞の図式的分布を作成した(図24A)。図式的分布及び極座標分布(完全な円形の切片を仮定して補正した細胞分布、図24A、図24B)の集合から、本発明者らは、hMAB単独と比較して、hMAB+mFB播種足場における組織切片に関して細胞生着及び分布の均一性の明らかな改善を見出した。面積当たりの総細胞数のカウントから、この傾向が確認された(n≧3、図24C)。
ラット脱細胞化足場におけるmFBと共に又は無しに播種したhMABの移動能力を評価するため、本発明者らは、ルシフェラーゼZSグリーンレンチウイルスで形質導入したhMAB(ZsGreen+Luc+hMAB)を播種した。細胞の形質導入はフローサイトメトリーを用いて確認し、及び形質導入細胞の純粋集団はFACS選別を用いて得た。生物発光イメージング(BLI)を用いて、インビボイメージングシステム(IVIS)を使用して足場上の細胞をトラッキングした。細胞は移動に関して24時間毎に非侵襲的にトラッキングした(図25A)。播種細胞からのBLIの検出に成功し、24時間毎に画像を分析して発光の放射輝度を定量化した(図25B)。細胞の移動を計算するため、注入点の中心から位置決めした8つの異なる関心領域(ROI)からBLIを決定した(図25C)。培養1日後にROI3〜6(中心ROI)で計測された放射輝度から、hMAB単独を播種した足場でBLIがより高いことが明らかになった(三角、図25D)。hMABのみがLuc+であり、その開始時の数は共播種条件(85:15比)と比べて多かったため、これは実験セットアップと完全に一致した。それにも関わらず、その後の数日で細胞数が予想どおり減少した後、培養3及び5日目には、hMAB+mFB足場(四角)から検出された総放射輝度は、hMAB単独による総放射輝度と同等か又はそれより高く、培養全体を通じた種々のROIにおける明らかな細胞成長及び移動が示された。5日目、共播種足場は、hMAB単独と比較したとき、詳細には注入点(ROI4〜5)からより離れたROI3及び6においてより高い放射輝度を示し、足場に沿って移動する細胞がより多数存在することが明らかになった(図25D)。
hMAB+mFBを共播種し、静置条件又は動的条件で培養した脱細胞化ラット食道の切片を先述のとおり染色及びスキャンして、足場に存在する全ての細胞を検出し、カウントした。細胞の図式的分布(図27A)及び極座標分布(完全な円形の切片を仮定して補正した細胞分布、図27B)から、静置条件と比較してバイオリアクターで培養した足場における組織切片に関して全体的な組織成長及びより良好な分布均一性が示された。面積当たりの総細胞数のカウントにより、この有意な差が確認された(n≧3、*p<0.05、図27C)。DAPI及びヒト核に関して染色した無作為切片における細胞カウントから、動的条件で培養した足場におけるhMABとmFBとの比率を決定して、線維芽細胞の最終的な過成長を評価した。培養11日後、mFbは総細胞数の14%のみ存在し、足場内におけるこれらの細胞の制御されない拡大がないことが示された(n≧3、図27D)。
hMAB+mFBを共播種して静置条件又は動的条件で培養した脱細胞化ラット食道の切片を、先述のとおりヒト核、SM22(平滑筋分化マーカー)及びDAPIに関して染色し、スキャンすることにより、足場に存在する全ての細胞を検出し、カウントした(黒色の範囲、図29A)。図29Aにおける細胞の代表的な図式的分布は、分化細胞型間:SM22+hMAB;SM22+mFB;SM22−hMAB;SM22−mFBの自動化された識別を示す(全てグレースケール)。これらのマップから、静置条件と比較してバイオリアクターで培養した足場における分化した細胞の分布が明らかになった。バイオリアクターが機械的刺激及び分化培地へのより良好なアクセスを提供したとき、足場の全ての層にSM22+細胞が存在して均一に分布し、一方、静置条件で培養したコンストラクトはマトリックスの表面上にのみ平滑筋細胞を示した(図29A、図29C)。種々の切片の無作為画像でカウントした静置及び動的培養後のSM22+細胞の割合の計算から(n≧3)、バイオリアクターで成長させた足場において平滑筋分化細胞の割合が有意に高いことが確認された(**p<0.001、図29B)。興味深いことに、SM22+細胞の約10%は線維芽細胞であり、その寄与はこれらの2つの培養条件で同等であった。hMAB+mFBを共播種した動的培養試料では、αSMA及びカルポニンに関する免疫染色によって平滑筋への成熟分化が更に確認された(図30)。細胞は足場の全ての層においてSM22とαSMA及びカルポニンの両方との共発現を示し、成熟レベルの分化が実証された。
Claims (16)
- 対象への植え込みに好適な組織コンストラクトを作製する方法であって、
(i)無細胞足場を提供する工程と、
(ii)前記足場内又はその上に中胚葉性血管芽細胞と線維芽細胞との組み合わせを播種する工程と、
(iii)前記播種足場を培養する工程であって、前記コンストラクトを作製する、工程と
を含む方法。 - 前記組織コンストラクトが、食道又は腸などの管腔臓器における植え込み又は前記臓器の置換に好適である、請求項1に記載の方法。
- 前記対象がヒトであり、前記組織コンストラクトが食道コンストラクトである、請求項1又は2に記載の方法。
- 播種に用いられる中胚葉性血管芽細胞:線維芽細胞の比が50:50〜99:1、65:35〜90:10、70:30〜90:10、80:20〜90:10、又は83:17〜87:13である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 播種が、前記足場、好ましくは前記足場の筋層への、同時又は逐次的な細胞の注入による、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中胚葉性血管芽細胞及び線維芽細胞が自家性である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記中胚葉性血管芽細胞が以下のマーカー:AP、NG2を発現する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記足場が脱細胞化され、かつ、管腔臓器に由来する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記足場がブタ由来などの非ヒト起源であり、好ましくは脱細胞化子ブタ食道である、請求項8に記載の方法。
- 前記足場が播種された後、バイオリアクター中で前記中胚葉性血管芽細胞の成長及び分化に好適な1つ以上の培地中で、前記コンストラクトが無菌条件下において培養される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記足場が静置培養条件下で培養され、続いて動的培養条件下で培養される、請求項10に記載の方法。
- 前記コンストラクトが、前記中胚葉性血管芽細胞が分化して少なくとも以下のマーカー:NG2、アルカリホスファターゼを発現するまで培養される、請求項10又は11に記載の方法。
- 工程(iii)の後、前記組織コンストラクトが血管新生のために非ヒト対象の異所性部位に植え込まれる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記コンストラクトが管腔形状を有し、
前記組織コンストラクトを少なくとも非ヒト対象の管腔内表面上で上皮化させる更なる工程を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記コンストラクトが管腔形状を有し、
前記組織コンストラクトをインビトロにおいて、少なくとも管腔内表面上で上皮化させる更なる工程を含む、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。 - 脱細胞化生体足場の中胚葉性血管芽細胞による細胞分布、生着及びコロニー形成を改善するための線維芽細胞の使用であって、前記線維芽細胞が、以下の比率の範囲50:50〜99:1、65:35〜90:10、70:30〜90:10、80:20〜90:10、83:17〜88:12内の中胚葉性血管芽細胞:線維芽細胞の比で使用される、使用。
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