CN103961748A

CN103961748A - 一种动态构建ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的方法

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Publication number: CN103961748A
Application number: CN201410200954.7A
Authority: CN
Inventors: 宋克东; 李文芳; 刘天庆; 李丽颖; 王兆民
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2014-05-13
Filing date: 2014-05-13
Publication date: 2014-08-06

Abstract

本发明属于生物技术与组织工程领域，涉及一种动态构建ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的方法。制备4％壳聚糖/明胶水凝胶，作为组织工程软骨的支架，配制软骨诱导基；根据转瓶直径及搅拌棒高度制作圆形三角不锈钢架的尺寸，将惰性金属丝固定于圆形三脚不锈钢架上。将支架经75％酒精浸泡至少3次，再用PBS浸泡，然后在DMEM培养基中浸润，风干，灭菌后移入孔板中，将培养代数不高于第八代的脂肪干细胞以10⁵～10⁷cells/ml密度接种于支架中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养不少于2h，得到ADSCs-水凝胶复合物。本发明构建的工程软骨比传统静态培养有诸多优势，为动物体内修复软骨缺损打下基础。

Description

一种动态构建ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的方法

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及动态稳定构建组织工程软骨的方法。

背景技术

由关节退行性疾病和创伤等原因引起的骨软骨缺损病例日益增多，给众多患者带来了极大痛苦。软骨组织结构简单，无血管神经及淋巴组织，因此自身修复能力有限。临床现有的修复软骨缺损及创伤的方法虽多，但效果并不理想，不能完全恢复软骨组织的功能。软骨组织工程研究的快速发展为临床软骨缺损的修复带来了新希望。

组织工程技术是,将体外培养扩增细胞接种于一种具有生物相容性好,并可被机体降解吸收的生物材料中形成复合物,然后将复合物植入人体组织、器官的病损部位,在逐渐被机体降解吸收的同时,细胞不断增殖、分化,形成新的、且形态和功能与相应组织、器官一致的组织,从而达到修复创伤和重建功能的目的。软骨组织工程的核心是构建软骨细胞与适宜支架的复合体，种子细胞和支架材料在生产人造组织的过程中起着举足轻重的作用。其中，人源脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)因具有多向分化潜能，可体外大量增殖，获取量大、痛苦小，且免疫排斥最低等优点，是近年来较骨髓间充质干细胞更有应用前景的一种组织工程细胞，诸多研究者已将其用于构建组织工程软骨，所以，本实验选其作为软骨组织的种子细胞。

作为组织工程软骨的基本构架，软骨支架材料的选择和设计对软骨组织损伤修复的成功与否至关重要。当前本领域研究所涉及的支架材料众多，虽然它们在应用时表现出一定的优势，但同时也表现出各种缺点。现有对支架材料的改进方法，主要是利用材料的复合或表面修饰来改善其自身的不足。壳聚糖是天然的高分子聚合物，结构与软骨基质糖氨多糖(Glycosaminoglycans，GAG)相似，降解产物为氨基葡萄糖单体，对人体无不良反应，具有良好的生物相容性和可降解性，无毒性和免疫原性及抑制炎症和抗菌等作用。明胶是胶原的降解产物，为一种天然多肽聚合物，具有生物活性强，可促进软骨细胞在支架上黏附、增殖、分化和分泌细胞外基质等优点。因此，本研究通过调整组分比例对材料的性能进行调节和控制，从而在保留其优点同时，克服各自缺点，通过冷冻干燥致孔法，选取最佳含量壳聚糖/明胶水凝胶作为构建工程软骨的支架材料。

组织工程软骨的构建，除了优选适宜的细胞及生物支架外，其体外培养环境也至关重要。相比传统工程软骨的静态培养，生物反应器动态环境带来的优势逐渐引起学者的关注。其中，转瓶反应器因结构简单，动态搅拌引起的液体的流动为支架中细胞提供了动态微环境，提高了传质能力，有利于细胞增殖及分化，在组织工程领域得到广泛应用。2001年，Gooch等人将软骨细胞接种于PLLA支架后，置于转瓶培养，结果表明反应器的搅拌混合提高了胶原和糖胺聚糖分泌。2010年，Zhu等人研究表明，与静态培养皿环境比较，转瓶培养促进了支架中脂肪来源干细胞的存活率，增殖及特定基因的表达。基于此，考虑到转瓶结构的简单及其动态环境为细胞-支架复合物的构建带来的优势，是本实验较好的选择。

发明内容

本发明的目的是动态转瓶中稳定构建组织工程软骨。将脂肪干细胞接种于壳聚糖/明胶水凝胶中，然后将其固定于自制的铂丝不锈钢架上，于转瓶中动态培养，这样设计避免了细胞-支架复合物悬浮于培养液中与搅拌棒发生碰撞，可以为细胞创造一个稳定的动态环境。另外，转瓶的搅拌混合可以促进培养液的对流作用，提高了传质能力，使细胞在支架相互连通的孔道中产生一个动态的微环境，促进粘附在支架内部细胞的功能发挥及细胞基质的分泌，有利于体外组织工程软骨的快速构建。

一种动态构建ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的方法，具体方法是：

(1)冷冻干燥法制备4％壳聚糖/明胶水凝胶，作为组织工程软骨的支架，并进行相关物理性能的检测。

(2)对脂肪干细胞进行分离、原代培养和传代培养；配制软骨诱导基，用于诱导传代培养的脂肪干细胞向软骨细胞分化。

(3)根据生物反应器转瓶的直径及其搅拌棒高度，设计固定水凝胶的三角不锈钢架，并确定钢架结构及尺寸：三角不锈钢架由圆环及支撑圆环的三个圆柱组成，圆柱位于圆环的三等分点上；然后将5～10根惰性金属丝缠绕在三角不锈钢架的圆环上，用于固定4％壳聚糖/明胶水凝胶；将固定了水凝胶的三角不锈钢架置于转瓶中，惰性金属丝的直径不大于20微米。

(4)将步骤(1)得到的4％壳聚糖/明胶水凝胶经75％酒精浸泡至少3次，再用磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡，然后在DMEM培养基中浸润，风干，灭菌。

(5)灭菌后4％壳聚糖/明胶水凝胶移入孔板中，将培养代数不高于第八代的脂肪干细胞以10⁵～10⁷cells/ml密度接种于4％壳聚糖/明胶水凝胶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养不少于2h，得到ADSCs-水凝胶复合物。

(6)然后在步骤(5)的孔板中添加将ADSCs-水凝胶复合物覆盖的软骨诱导基，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h后，将其中一半的ADSCs-水凝胶复合物转移到大于75cm²的培养瓶中作为静态对照组，另外一半ADSCs-水凝胶复合物转移至圆形三脚不锈钢架的惰性金属丝上，然后置于转瓶中培养，作为动态实验组；所述的转瓶中加入40～60mL软骨诱导基，以15～30rpm间歇搅拌3～6h，然后补加软骨诱导基至100mL，40rpm。

(7)静态对照组和动态实验组的样品置入37℃、5％的CO₂培养箱培养3天以上。

所述的4％壳聚糖/明胶水凝胶厚度为1～2mm。

所述的4％壳聚糖/明胶水凝胶中明胶与壳聚糖的质量比为3:1。

所述的惰性金属丝为铂丝、铜丝、银丝或金丝，且直径低于20微米。

本发明的有益效果是制备了固定细胞-水凝胶复合物的铂丝不锈钢架，构建载支架-转瓶装置，避免了支架因悬浮于培养液而带来的与搅拌棒的碰撞，消除了对支架完整性及对细胞伤害的影响。另外，转瓶的搅拌混合可以促进培养液的对流作用，提高了传质能力，使细胞在支架相互连通的孔道中产生一个动态的微环境，促进粘附在支架内部细胞的功能发挥及细胞基质的分泌。转瓶内液体的流动使支架内的氧及营养物质的供给达到远超过被动扩散的深度，这使得支架中细胞分布更加均匀，从而有利于体外组织工程软骨的快速构建。

具体实施方式

以下结合技术方案具体说明本发明的具体实施方案。

实施例1：4％壳聚糖/明胶水凝胶的制备

2％壳聚糖醋酸溶液与明胶溶液置于烘箱中高温溶解并离心去泡后，缓慢混合均匀，混合溶液中明胶与壳聚糖的质量比为3:1。冷冻干燥后的支架置于碳化二亚胺/羟基琥珀酰胺/吗啉乙烷磺酸(EDC/NHS/MES)交联液中交联6h，加入0.1mol/L的Na₂HPO₄溶液中和支架中的醋酸2h，40％乙醇清洗4次，每次30min。-20℃冰箱中预冻后转移至超低温冰箱冷冻后再次冷冻干燥得到交联后的壳聚糖/明胶水凝胶。

实施例2：脂肪干细胞的分离培养及软骨诱导

用本实验室改进的方法自外科手术患者的皮下正常脂肪组织中分离脂肪干细胞。0.25％胰蛋白酶和0.1％胶原酶联合消化，吸出下层含单个核细胞的液体，加入含胎牛血清的高糖DMEM终止消化，剩余脂肪组织重复消化2～3次，将收集的细胞沉淀加入含10％胎牛血清的DMEM重悬细胞，移入培养瓶中，37℃、5％CO₂培养箱孵育，每3d换液一次。

取第7代hADSCs，以1.0×10⁵cells/mL接种于24孔板中，37℃培养箱中孵育3h，待细胞贴壁完全后，更换成软骨诱导培养基(成分为：完全培养基，10ng/mL TGF-β1，40ng/mL地塞米松，50μg/mL抗坏血酸，1％ITS，1％FBS)培养，每3天换一次培养液。

实施例3：细胞-水凝胶复合物的构建

交联制得的水凝胶移至24孔板中，经75％酒精浸泡3次，换用PBS浸泡3次及DMEM培养基中浸润，风干，紫外灭菌后，用100μL微量移液枪将P7-hADSCs以10⁷cells/ml密度接种于40个水凝胶内部，自正反两面中心各注入20μL，然后将细胞-水凝胶复合物置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，在孔板中添加1mL软骨诱导基，继续培养，培养24h后，将其中20个复合物转移到75cm²的培养瓶中作为静态对照组，另外20个细胞-水凝胶复合物固定在自制的不锈钢架上的铂丝上，然后置于转瓶中培养，作为动态实验组。其中，转瓶中先加入50mL培养基，以20rpm的速率间歇搅拌3h，然后补加培养基至100mL，速率调整至40rpm，置入37℃、5％的CO₂培养箱中，连续培养一周，2周取出样品进行相关检测。

实施例4：动静态环境下细胞在水凝胶支架中生长粘附及渗透情况

将在转瓶及孔板中培养2周的细胞-水凝胶复合物用手术镊取出，移至2个24孔板中，其中一部分加入Calcein-AM，PI及Hochest33258的PBS染液，培养箱中孵育30min，PBS清洗后，Dead/Live荧光染色观察动静态环境下细胞在水凝胶中的生长情况，同时考察水凝胶支架的生物相容性。另外一部分仅加入Calcein-AM的PBS混合染液，置于共聚焦小皿中，激光共聚焦显微镜下观察细胞在水凝胶中粘附及其渗透情况。

实施例5动静态环境中水凝胶支架内细胞软骨诱导及其代谢分析

取动静态环境下培养14d的细胞-水凝胶复合物，10％的甲醛溶液固定24h，常规苏木精-伊红染色，观察细胞形态，分布及基质分泌情况。应用蕃红花O染色和甲苯胺蓝染色等定性观察细胞外基质中蛋白聚糖的合成和分泌。

待细胞-水凝胶复合物于转瓶及培养瓶中培养开始，前两周内隔天收集培养上清液，按照葡萄糖及乳酸检测试剂盒上的步骤，使用半自动生化分析测量葡萄糖和乳酸浓度变化。

实施例6：动静态环境下支架内细胞及胞外基质分泌情况

细胞-水凝胶于转瓶及培养瓶中动静态培养二周后，倒置显微镜下观察细胞在支架上的生长增殖情况。取出标本，2.5％戊二醛4℃固定3h，然后用pH7.4的磷酸盐缓冲液冲洗两次后，梯度酒精脱水，真空干燥后，复合物表面喷金，置于扫描电镜下，观察水凝胶支架上细胞贴附及胞外基质分泌情况。

尽管本发明是以转瓶反应器提供的动态环境来描述的，但这并不意味着对本发明构成限制。基于本发明能够对于较轻较小的细胞-支架复合物起到固定作用，避免了其悬浮在培养液中，与反应器壁或者其它支架发生碰撞，影响支架的形状及细胞在其中的生长，所以本发明也可用于其它反应器中，为复合物提供了稳定的动态环境。因此，这样的变化并不会脱离所属权利要求限定的范围，细胞及支架材料也不仅受限于此，也可以实施其它变形。

Claims

1.一种动态构建ADSCs-壳聚糖/明胶水凝胶工程化软骨的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)冷冻干燥法制备4％壳聚糖/明胶水凝胶，作为工程化软骨的支架；

(2)对脂肪干细胞进行分离、原代培养和传代培养；配制软骨诱导基，用于诱导传代培养的脂肪干细胞向软骨细胞分化；

(3)根据生物反应器转瓶的直径及其搅拌棒高度，设计固定水凝胶的三角不锈钢架，并确定钢架结构及尺寸：三角不锈钢架由圆环及支撑圆环的三个圆柱组成，圆柱位于圆环的三等分点上；然后将5～10根惰性金属丝缠绕在三角不锈钢架的圆环上，用于固定4％壳聚糖/明胶水凝胶；将固定了水凝胶的三角不锈钢架置于转瓶中，惰性金属丝的直径不大于20微米；

(4)将步骤(1)得到的4％壳聚糖/明胶水凝胶经75％酒精浸泡至少3次，再用磷酸盐缓冲液浸泡，然后在DMEM培养基中浸润，风干，灭菌；

(5)灭菌后4％壳聚糖/明胶水凝胶移入孔板中，将培养代数不高于第八代的脂肪干细胞以10⁵～10⁷cells/ml密度接种于4％壳聚糖/明胶水凝胶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养不少于2h，得到ADSCs-水凝胶复合物；

(6)然后在步骤(5)的孔板中添加将ADSCs-水凝胶复合物覆盖的软骨诱导基，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养24h后，将其中一半的ADSCs-水凝胶复合物转移到大于75cm²的培养瓶中作为静态对照组，另外一半ADSCs-水凝胶复合物转移至圆形三角不锈钢架的惰性金属丝上，然后置于转瓶中培养，作为动态实验组；向所述的转瓶中加入40～60mL软骨诱导基，以15～30rpm间歇搅拌3～6h，然后补加软骨诱导基至100mL，40rpm；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4％壳聚糖/明胶水凝胶厚度为1～2mm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的4％壳聚糖/明胶水凝胶中明胶与壳聚糖的质量比为3:1。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的惰性金属丝为铂丝、铜丝、银丝或金丝。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的惰性金属丝为铂丝、铜丝、银丝或金丝。