KR100983164B1

KR100983164B1 - ＰＰＡＲγ 인산화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물

Info

Publication number: KR100983164B1
Application number: KR1020080025827A
Authority: KR
Inventors: 박경수; 임수; 정성수
Original assignee: 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date: 2008-03-20
Filing date: 2008-03-20
Publication date: 2010-09-20
Also published as: KR20090100567A

Abstract

본 발명은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화(phosphorylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법 및 상기 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치에 관한 것이다.

PPARγ, 동맥경화, 인산화(phosphorylation)

Description

ＰＰＡＲγ 인산화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물 {Composition comprising PPARγ phosphorylation mutant for the prevention or treatment of atherosclerosis and restenosis}

동맥경화증, 특히 아테롬성 동맥경화증이란 콜레스테롤, 인지질, 칼슘 등을 함유한 지방성 물질(plaque)이 혈관 내막에 축적되어 동맥은 단단해져 탄력성을 잃고 좁아져서 혈액공급이 저해되거나 압력이 높아져 동맥이 파열, 박리 등이 일어나는 상태를 말한다. 특히, 아테롬성 동맥경화에 의하여 동맥의 협착(혈관의 좁아짐)이 발생하며 이에 따라 혈액 공급이 감소되어 영양분과 산소가 부족하게 되어 심혈 관계 질환의 주요 원인이 된다(Libby P, et al., Circulation, 86(6), 47-52, 1992; Lundgren CH, et al., Circulation, 90(4), 1927-1934, 1994; Harker, et al., Ann. NY Acad. Sci., 275, 321-329, 1976). 상기 심혈관계 질환은 일반적 동맥경화증, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함하는 질환으로서, 광범위하게는 허혈성 심혈관 질환이 있다.

현재 동맥경화가 원인이 되는 심혈관 질환의 치료는 혈관 신생(Angiogenesis)을 위한 치료와 혈관평활근세포의 증식억제를 통한 혈관 협착 및 재협착 방지(prevention for restenosis) 치료로 나누어 생각할 수 있다.

경피적 관상동맥 성형술은 좁아진 관상동맥을 수술에 의하지 않고 확장시켜주는 방법으로 시술 방법으로는 경피적 관상동맥 풍선 확장술, 경피적 관상동맥 스텐트 삽입술 등이 있다. 경피적 관상동맥 풍선 확장술은 대퇴부나 팔의 동맥을 통하여 가이드용 도관을 삽입하여 대동맥을 통하여 병변이 있는 관상동맥의 입구에 위치시키고, 이 도관의 내부를 통하여 끝에 풍선이 부착되어 있는 도관을 관상동맥의 협착 부위에 위치시킨 후, 풍선을 확장시켜 플라크 등을 압착하여 좁아진 관상동맥을 확장시킴으로써 관상동맥의 혈류개선을 가져오는 방법이다. 또한, 스텐트 삽입술은 철망이 입혀진 풍선을 협착부위에 위치시킨 후 풍선을 확장하여 관상동맥의 내벽에 철망을 입히는 것이며, 이러한 스텐트는 풍선 확장술만 시술하였을 때보다는 재협착의 발생율이 낮으며 스텐트가 혈관 내벽에 대한 지지대 역할을 하는 특성이 있으므로 풍선 확장시 발생하는 합병증의 치료에 사용되고 있다. 이러한 관상 동맥 성형술을 이용한 중재적 시술은 수술을 통한 방법보다 간편하고 전신 마취에 의한 위험 부담을 줄일 수 있으며 성공률도 높아 세계적으로 널리 이용되고 있는 추세이다.

그러나, 관상동맥 성형술의 시술에 경우 치료를 받는 환자의 10 내지 80 %에서 혈관내피의 손상, 혈관막내 혈전증(mural thrombosis), 혈관 평활근세포와 섬유아세포의 이동과 단핵세포 및 임파구의 침윤, 새로운 심내막(neointima) 형성, 세포외기질의 축적(reendothelialization) 및 세포사멸(apoptosis) 등을 통한 재협착(restenosis)이 발생한다. 재협착이 잘 생기는 경우로는 당뇨병, 고령, 최근에 시작된 협심증이나 불안정 협심증 등을 들 수 있다(Leimgruber PP et al., Circulation, vol. 73, 710, 1986).

관상동맥 재협착 방지를 위해 아테롬 제거술(atherectomy), 레이저 혈관성형술, 고속회전 아테롬 제거술(rotablator), 절단풍선을 이용한 관상혈관 성형술(cutting balloon angioplast) 및 방사선 조사 등의 새로운 PTCA(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty) 장비가 도입된 바 있으며, 항혈소판제, 항혈전제, 혈관확장제, 세포증식 억제제, 지질대사 개선제 및 항산화제 등의 여러 가지 전신적 및 국소약물 요법 및 유전자 요법과 같은 분자 생물학적 치료가 개발되어 시도되었다. 이 중 경구 투여나 정맥 투여와 같은 전신적인 약물요법은 가장 쉽게 적용할 수 있는 치료법이나, 동물실험에서의 재협착 방지 효과가 보고되었을 뿐, PTCA를 시행한 부위에서 목적하는 약물 농도에 도달되지 않고 약물의 부작용으로 인해 대부분 임상실험에서 재협착을 방지하지 못했다. 이론적으로 재협착은 PTCA가 시술된 국소부위의 관상동맥에만 일어나므로, 재협착의 방지를 위해서는 전신적인 약물요법보다는 부위특이적(site-specific)으로 고농도의 약물투여가 가능한 국소 약물 요법(local drug therapy)이 더욱 유용하다. 최근에는 PTCA를 시행한 부위에 직접 약물을 투여하기 위해, 이중풍선카테터, 디스패치(dispatch) 또는 미세구 풍선(microporous balloon)등이 개발되어 임상에 이용되고 있으며, 장기간 PTCA시술부위에 약물을 전달하기 위해 서방성 미세입자(slow release microsphere)또는 스텐트에 약물을 입혀 치료하는 시도들이 늘고 있다.

종래에 관상동맥 재협착 예방 및 치료용 조성물로는 대한민국 공개공보 제 2001-84811호에 기재된 녹차 추출물인 카테킨에 관한 것과, 대한민국 공개공보 제 2004-8013호에 기재된 클로트리마졸에 관한 것이 있다. 또한 현재 많이 쓰이고 있는 코팅제로는 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 실로리무스 (silorimus) 및 베라파밀(verapamil) 등이 있으나, 이들 약물들은 값이 비싸다. 따라서, 비용이 저렴하고, 유기용매에 대한 용해도가 높아 실제 스텐트 등에 적용이 용이하며, 세포성장 억제효과뿐만 아니라 혈관 확장 활성을 가지는 우수한 동맥경화 및 재협착 예방 및 치료용 약제가 필요한 실정이다.

한편, 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 (peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)는 스테로이드, 갑상선 및 비타민 D 수용체를 포함하는 전사 인자의 핵 수용체 거대족의 일원이다. 이들은 지질 대사를 조절하는 단백질의 발현을 제어하는 역할을 하며, 지방산 및 지방산 대사체에 의해 활성화된다. 3가지 의 PPAR 하위 유형인 PPARα, PPARβ 및 PPARγ가 알려져 있고, 이들은 각각 상이한 조직 발현 패턴을 나타내며 구조적으로 다양한 화합물에 의한 활성화 면에서 구별된다.

이 중 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)는 세포신호 경로에 중요한 요소이며 당대사와 지방세포형성과 관련된 전사인자를 조절한다고 알려져 있다. PPARγ는 지방세포에서 PPARγ1 및 PPARγ2 의 형태로 발현한다. PPARγ2 는 PPARγ1 에 비해 N-말단에 30개의 아미노산이 더 있으나 나머지 아미노산 서열은 똑같고, PPARγ1 및 PPARγ2의 발현 수준은 조직마다 차이가 있다. PPARγ는 지방세포에서 가장 많이 발현되고, 골격 근육, 심장, 간, 장, 신장, 혈관 내피 및 평활근 세포 및 대식세포에서는 낮은 수치로 발현된다. PPARγ는 혈관세포증식, 이동 및 분화, 대식세포 활성화 및 염증 작용에서 다면적 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Hsueh WA, et al., Diabetes Care 24:392, 2001; Law RE, et al., Circulation 101:1311, 2000; Ricote M, et al., Nature 391:79, 1998; Blanquart C, et al., J Steroid Biochem Mol Biol 85:267-273, 2003; Benson S, et al., Am J Hypertens 13:74-82, 2000). 따라서, PPARγ는 비만, 당뇨 및 발암 등과 관련된 것으로 알려져 있으며, 이들 질환의 치료제로서 PPARγ 리간드(또는 PPARγ 작용물질)를 개발하고자 하는 노력이 있었고, 그 결과 PPARγ 리간드 치료제로서 로시글리타존(rosiglitazone) (Choi D, et al., 2004;27:2654), 피오글리타존(pioglitazone) (Dormandy JA, et al., Lancet 2005;366:1279) 등이 개발되었다. 그러나, PPARγ 리간드를 전신적으로 사용한 경우의 몇몇 유해한 영향들이 보고되 었고 (Ali AA, et al., Endocrinology 146:1226, 2005; Mudaliar S, et al., Endocr Pract 9:406, 2003), 최근에는 로시타글리타존을 복용한 제2형 당뇨병 환자에 대한 심혈관 효과에 관한 논쟁이 높아지고 있다(Home PD, et al., N Engl J Med 357:28, 2007; Nissen SE, et al., N Engl J Med 356:2457, 2007).

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 또는 치료에 유용한 물질을 찾고자 예의 노력한 결과, PPARγ의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화를 억제시킨 변이체를 목적 조직에 국소투여하면 혈관평활근 세포(VSMCs)의 증식을 저해하고, 아포토시스(apoptosis)를 유지시키고, 풍선손상(balloon injury) 이후에 새로운 심내막 형성을 감소시켜, 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 또는 치료에 효과적임을 입증하였다. 또한, PPARγ S112에서의 인산화 변이체의 동맥경화에 대한 보호작용이 PPARγ 야생형보다 현저하게 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 하나의 목적은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화(phosphorylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치를 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화(phosphorylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "인산화(phosphorylation)"란 인산기(PO₄)가 화합물의 구성성분인 OH의 H와 치환됨으로써 화합물에 결합하는 것을 말하며, 단백질의 PTM(Post-Translational Modification)에 있어 가장 중요한 수식화 중의 하나이다. 단백질의 인산화/탈인산화 과정은 세포 내에서 일어나는 각종 효소 반응에 관여하는 단백질의 구조와 기능을 조절하는 메커니즘으로, 인산화된 단백질이 여러 단백질의 기능에 관련하고 있으며 유전자의 다양한 발현에 연관되어 있다. 인산화 단백질의 인산화와 탈인산화는 각각 키나아제(kinase)와 포스파타아제(phosphatase)에 의해 촉매되고, 인산의 주공급원은 ATP 또는 GTP 이다.

본 발명에서 용어, "PPARγ의 인산화를 억제시킨 변이체" 또는 "PPARγ 인산화 변이체" 란 PPARγ의 특정 아미노산 잔기가 인산화를 일으키지 못하도록 변형시킨 변이체를 말한다. 이러한 변이체로는 PPARγ의 인산화 부위인 특정 아미노산 잔기, 예컨대 세린을 결실 또는 다른 아미노산으로 치환시키는 방법 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이 때, PPARγ의 인산화를 억제하는 활성을 갖는다면 세린 잔기를 세린을 제외한 어떠한 아미노산으로 치환시켜도 무방하나, 바람직하게는 알라닌으로 치환시킬 수 있다.

구체적으로, 마우스에서 PPARγ의 인산화 부위로서 PPARγ1의 아미노산 서열에서 82번째 세린 (인간의 PPARγ1의 아미노산 서열에서 82번째 세린과 상응됨) 및 PPARγ2의 아미노산 서열에서 112번째 세린 (인간의 PPARγ2의 아미노산 서열에서 112번째 세린과 상응됨) 이 알려져 있으며, 이러한 PPARγ 의 인산화는 PPARγ의 전사활성 조절에 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다. 그러나, PPARγ 의 인산화 변이체가 심내막 형성 또는 혈관평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 증식과 생존에 미치는 영향은 본원 발명에서 처음 발견하였으며, 특히 PPARγ S112A 인산화 변이체의 항동맥경화 효과가 PPARγ 야생형보다 현저하게 우수함을 최초로 입증하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 인간 PPARγ2의 아미노산 서열에서 112번째 세린을 알라닌으로 치환시킨 변이체를 사용하였다. 본 발명에서, PPARγ의 아미노산 서열은 GenBank accession No. BC021798에 따른 것이다. 마우스의 PPARγ 와 인간 PPARγ는 모두 505 아미노산으로 되어 있고, 번호가 일치하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어, "PPARγ 인산화 변이유도물질" 이란 PPARγ의 특정 잔기가 인산화를 일으키지 못하도록 하는 모든 물질을 포함하며, 예컨대, PPARγ의 특정 세린 잔기에서의 인산화에 관여하는 효소의 활성을 억제하거나 인산화에 관여하는 효소의 활성을 유도하는 방법으로 PPARγ 인산화 변이를 유도할 수 있다.

구체적으로, 마우스 PPARγ1의 82번째 세린 (또는 인간 PPARγ1의 82번째 세린) 마우스 PPARγ2의 112번째 세린(또는 인간 PPARγ2의 112번째 세린) 은 모두 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 부위로서, ERK 1/2(extracellular regulated kinase 1 or 2)-MAPK 및 JNK(c-Jun N-terminal kinase)에 의해 인산화가 유도되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 변이유도물질은 ERK 1/2-MAPK 및 JNK를 억제함으로써 PPARγ의 인산화를 억제하는 물질을 포함한다.

이러한 물질은 바람직하게는 MAPK/ERK 신호전달 억제제인 PD98059 또는 U0126를 포함한다. PD98059는 2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-4H-1-Benzopyran-4-one2-(2'-Amino-3'-methoxy)-flavone2-(2-amino-3-methoxyphenyl)-chromone 이고, U0126 은 1,4-diamino-2,3-dicyano-1,4-bis[2-aminophenylthio] butadiene 로 표시 된다. 그러나, 상기 화합물 외에도 ERK 1/2-MAPK 및 JNK를 억제하는 모든 물질이 본 발명의 범주에 속하게 됨은 당업자에게 있어서 자명하다.

본 발명에서는 다음과 같은 방법으로 본 발명의 조성물의 우수함을 입증하였다. 구체적으로, PPARγ 야생형(WT), PPARγ K107R(PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신을 아르기닌으로 치환) 수모화 변이체, PPARγ S112A(PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린을 알라닌으로 치환) 인산화 변이체 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG) 유전자에 따라 네 그룹으로 구분하여 다음과 같은 비교실험을 하였다.

우선, PPARγ 인산화 변이체가 심내막 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 본원 발명에서는 랫트에서의 풍선 손상(n=10) 후에 경동맥 조직 단편을 염색하여 심내막 형성 넓이를 측정하고, 내막-중막 비율(intima/media ratio, IMR)을 계산하였다. 그 결과, 풍선 손상 2주일 후, PPARγ S112A 변이체가 대조군인 BG 그룹 및 야생형 그룹에 비하여 심내막 형성을 현저하게 저해함을 입증하였고 (도 1), 현저하게 낮은 IMR 을 가짐을 보였다 (도 2).

또한, 형질감염된 랫트 동맥에서 PPARγ 와 증식성 세포핵 항원에 대한 면역조직화학적 분석을 실시한 결과, PPARγ S112A 변이체는 VSMCs 증식을 현저하게 저해하였고, 대조군 및 야생형에 비해 낮은 평활근 증식지수(총 유핵세포에 비하여 PCNA-양성세포의 백분율로 정의)를 나타냄을 보였다 (도 3 및 도 4).

또한, PPARγ 변이체가 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 알기 위하여 TUNEL 방법을 실시한 결과, 풍선 손상 2주일 후 PPARγ S112A 변이체의 세포사멸 지수(총 유핵세포에 비하여 TUNEL-양성 세포의 백분율 계산) 가 대조군 및 야생형에 비하여 월등히 높음을 보였다 (도 5 및 도 6).

또한, 티미딘 인코포레이션(thymidine incorporation) 시험 결과, PPARγ S112A 변이체는 대조군 및 야생형과 비교했을 때 랫트 VSMCs 에서 DNA 합성 및 PDGF-자극 VSMC 증식을 훨씬 저해하였고(도 7), VSMCs 창상치유 실험 결과, TNFα- 또는 lysoPC 자극 VSMC 이동을 가장 효율적으로 저해하였음을 보였다 (도 8).

이러한 실험 결과들을 종합해 보면, PPARγ S112A 인산화 변이체는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, PPARγ S112에서의 인산화 변이체의 동맥경화 및 혈관 재협착에 대한 보호작용이 PPARγ 야생형보다 현저하게 우수함을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물은 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 및 치료에 효과적이다. 일반적으로 혈관 재협착은 동맥경화와 많은 과정 및 기전을 공유하는 것으로 이해되고 있다(Nature, 362:801-809, 1993; Circulatinion, Res., 77:445-465, 1995). 따라서 본원에서 공개되는 치료방법은 재협착 뿐만 아니라 동맥경화, 특히 아테롬성 동맥경화를 치료하고 예방 또는 증상을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 혈관 재협착을 치료하기 위한 목적으로 사용되는 경우에는 경피적 관동맥 성형술 이후의 재협착을 방지하기 위하여 사용될 수 있으며, 경피적 관동맥 성형술의 예로는 풍선혈관성형술, 스텐트 삽입, 관동맥 우회술 및 동맥-정맥 문합술 등이 있 다.

또한, 본 발명의 조성물은 혈관 협착을 억제함에 따라, 혈관 협착이 주요 원인이 되는 심혈관계 질환의 치료 또는 예방 효과가 있다. 상기 심혈관계 질환은 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함하는 질환으로서, 광범위하게는 허혈성 심혈관 질환이다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되거나 무균성이고, 이러한 용액은 멸균되거나 무균성이고, 물, 완충제, 등장제 또는 동물 또는 사람에게 적용할 경우, 알레르기 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기타 성분을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제, 항진균제 및 등장제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 상기 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 익히 알려져 있다. 활성 성분과 비혼화성인 통상적인 매질 또는 제제 이외에, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충성 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수도 있다.

상기 조성물은 액제, 유제, 현탁제 또는 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 비경구로 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 목적 조직, 예컨대 경동맥에 직접 국소 투여 하는 것이 좋다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 동맥경화를 치료 또는 예방하기 위한, PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치에 관한 것이다. 국소 투여용 약물 전달 장치는 바람직하게는 본 발명의 조성물을 도포한 이식가능한 스텐트이다.

본 발명에서 스텐트라 함은 상기에서 언급한 바와 같이 관내 적용(endoluminal appilcation), 예를 들면 혈관 내에 적용하기 위한 일반적인 장치를 의미하는 것으로, 혈액의 흐름이 순조로워야 되는 부위에 질환이 발생하여 그 흐름에 장애가 발생하였을 때, 외과적으로 개복 수술을 하지 않고 x-선 투시 하에서 좁아지거나 막힌 혈관부위에 삽입하여 혈액의 흐름을 정상화시키는 원통형의 의료용 재료를 의미한다. 예를 들어 혈관 내 스텐트(vascular stent)는 Eric J Topol 저 "Textbook of Interventional Cardiology", Saunders Company, 1994에 기술되어 있다. 바람직하게는 서방형 약물방출형 스텐트이다.

구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 스텐트를 제조하기 위하여, 상기 조성물을 스텐트에 코팅한다. 스텐트에 조성물을 코팅하는 방법으로는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 통상의 코팅방법을 적용할 수 있고, 예를 들어 침염코팅(dip-coated)과 고분자와 함께 코팅(polymer coated) 하는 방법이 있으며, 침염코팅법은 가장 간단한 코팅 방법이며, 약학 조성물만이 코팅되기 때문에 약물만의 생물학적 효과를 관찰하기에 용이하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물이 천천히 방출될 수 있도록 상기 조성물을 약물방출형 스텐트에 고분자 물질과 혼합한 후 코팅하여 본 발명의 스텐트를 제조할 수 있다. 약물방출형 스텐트에 사용될 수 있는 고분자 물질은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, PLLA-폴리-글라이콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤, 폴리-(하리드록시부티레이트/하리드록시발레레이트)공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리테트라 플루오로에틸렌, 폴리(2-하리드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(에테루레탄 우레아), 실리콘, 아크릴, 에폭사이드, 폴리에스테르, 우레탄, 파알렌, 폴리포스파진 고분자, 플루오로 고분자, 폴리아마이드 및 폴리올레핀 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 혈관 협착 제거 방법은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자 의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 바람직한 한 양태로서, 본 발명의 치료방법은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린에서의 인산화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 약제학적 조성물과 함께 하나 또는 그 이상의 공지의 치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.

공지의 치료제로는 로시글리타존(rosiglitazone) 및 피오글리타존(pioglitazone) 등을 예시할 수 있고, 공지의 치료제의 약학적 유효량은 당업계에 공지되어 있으며 증상의 정도, 본 발명의 조성물과의 병용 투여 등의 제반 조건을 고려하여 처치의가 그 양을 조절할 수 있다. 이와 같이 공지의 치료제를 병용 투여함으로써, 본 발명의 조성물에 의해 공지의 치료제의 부작용 등을 경감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 상승적인 치료효과도 기대할 수 있다. 이들 공지의 치료제는 경우에 따라 복합제제 또는 동시에 투여되거나, 또는 본 발명의 조성물과 시간의 간격을 두고 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여에 의해, 동맥경화나 경피적 관상동맥 성형술 후의 혈관 재협착에 기인하는 혈관의 협착 증상이 효과적으로 예방된다. 또한, 본 발명 의 조성물은, 진행된 혈관의 협착 증상을 완화하기 위한 치료 용도에 있어서도 유용하다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.

실시예 1. 실험재료 준비

1-1. PPARγ 변이체의 제조

마우스 PPARγ2의 발현벡터인 pSG-PPARγ2 는 서울대학교 김재범 박사로부터 기증받았다. PPARγ의 DNA 단편을 pcDNA3.1에 삽입하였고, pcDNA-PPARγ2 S112A을 제작하기 위하여 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) 에 의해 아미노산 서열의 112번째 세린을 알라닌으로 치환시켰다. K395R, K107R 및 L466A(우성 음성 변이체; Park Y, et al., Diabetologia 46:365-377, 2003) 변이체 역시 같은 방법으로 제조하였다. 아데노 바이러스에 의한 인간 PPARγ1의 아데노 바이러스의 전달은 공지의 방법을 따랐고(Hong HK, et al., Diabetes Res Clin Pract 62:1-8, 2003), 주요 인산화 부위인 S82(PPARγ2 의 S112와 동일) 를 알라닌으로 변이시켰으며, 결과 바이러스 구조물은 Ad-PPARγ S112A 로 명명하였다.

1-2. 랫트 경동맥 풍선 손상 모델의 제조

생체 내(in vivo) 실험을 위하여, 300 내지 400g 의 무게를 갖는 Sprague-Dawley 랫트(rat) 수컷 성체 48마리(대한 바이오링크사)를 실험에 사용하였다. 동물은 실험동물연구을 위한 실험실, 임상실험연구소 및 서울대학교 병원으로부터 실험동물연구 가이드에 따라 다뤘다. 랫트는 도입한 유전자의 타입, 즉, PPARγ 야생형(WT), PPARγ K107R 수모화 변이체, PPARγ S112A 변이체 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG) 유전자에 따라 네 그룹으로(그룹당 12마리) 구분하였다.

이전에 확립된 랫트 경동맥 풍선 손상 모델을 본 연구에서 사용하였다(Clowes AW, et al., Lab Invest 1983;49:327-333). PPARγ-WT, K107 변이체, S112A 변이체 및 β-갈락토시데이즈를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 유전자 전달을 위해 사용되었다. 랫트는 혼합마취제 (케타민(ketamine), 70㎎/㎏ IP; 유한 주식회사, 바이엘 코리아)를 사용하여 마취하였다. 왼쪽 외경동맥이 노출된 후, 헤파린(heparin) (35IU)은 시스템적으로 외경정맥을 통해 투여되었다. 2F 포가티 색전 카테터(Baxter Healthcare 사)는 외경동맥 절개술(external carotid artheriotomy incision)을 통해 삽입되며, 총 경동맥 쪽으로 집어넣어 생리식염수 (normal saline) 0.2 ㎖로 부풀리고 10번 순환 한 다음 다시 수거하였다. 기부의 총 경동맥과 기부의 내경동맥을 고정시킨 후, PPARγ 야생형, K107R 변이체, S112A 변이체 및 대조군 유전자를 가지는 5 x 10⁸pfu 의 바이러스 주입액 혼합물을 100 ㎕의 총 부피로 희석한 후 두 개의 클램프(clamp) 사이에서 동맥 부분을 통해 주입하였다. 관류는 주입 20분 후에 총인 경동맥에서 제거하였다.

실시예 2. 생체 내에서 심내막 형성 저해

풍선 손상 3일(n=2) 및 2주일(n=10) 후에, 랫트는 펜토바르비탈(pentobarbital)을 치사량 사용하여 안락사시키고, 경동맥은 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 18G 정맥 캐뉼러로 120 mmHg 에서 살포하여 고정시켰다. 조직 단편은 H&E로 염색하였다. 조직 구조적인 염색 부위에서 심내막 형성 넓이는 컴퓨터화된 면역측정법으로 측정하였다. 혈관층의 총단면적, 즉, 내강, 내막 및 내측 영역은 Image Pro Plus Analyzer Version 4.5(Media Cybernetics 사)를 사용하여 3개 다른 부위(근접, 중간, 말단)로 정량하였다. 내막-중막 비율(intima/media ratio; IMR)은 측정값들의 평균으로 계산하였다.

그 결과, 풍선 손상 3일 후의 VSMC 증식 정도에 있어서, PPARγ 야생형, K107R, S112A 및 BG 그룹 간의 차이는 관찰되지 않았고, 내막이 전혀 또는 거의 검출되지 않았다 (데이타는 제시하지 않음). 그러나 풍선 손상 2주일 후, K107R, S112A 그룹은 대조군인 BG 그룹 및 PPARγ 야생형에 비하여 낮은 심내막 형성을 보였다 (도 1). 또한, PPARγ 변이체 전부는 대조군인 BG 보다 낮은 IMR 을 가졌고, (야생주, 1.20±0.16; K107R, 0.78±0.13; S112A, 0.86±0.10; BG 1.68±0.16, P<0.05). 특히 S112A 변이체는 야생형보다 현저하게 낮은 IMR을 가졌다 (P<0.05, 각각)(도 2).

실시예 3. 생체 내에서 혈관 평활근 세포(Vascular Smooth Muscle Cell) 증식 저해

PPARγ 유전자의 발현을 확인하고 증식성 세포를 탐지하기 위해, PPARγ 와 증식성 세포핵 항원에 대한 면역조직화학적 분석을 바이러스 처리 동맥에 실시하였다. 요약하면, 파라핀으로 둘러싼 시료를 절단시키고 프로테아제 K(protease K)로 4분간 처리하였고, 내인성 과산화 효소는 메탄올/과산화 효고 용액으로 억제시켰다. 표본은 0.1% 트윈 20과 0.15 mol/L NaCl이 포함되 50mmol/L 트리스-HCl(pH7.6) 로 5분간 처리하고, PPARγ 에 대한 면역조직화학적 분석을 위하여 1:200 희석 쥐 항-PPARγ 항체(Santa Cruz Biotechnology 사) 또는 PCNA 염색을 위한 1:50 희석 항-PC-10 항체(DAKO 사)의 존재 하에서 배양하였다. 표본은 1:50 희석된 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diaminobenzidine tetrahydrochloride) 기질용액(DAKO 사)에서 배양하고 마이어 헤마톡실린(Mayer hematoxylain)(DAKO 사)으로 대조염색을 하였다. 증식지수는 피부조직 당 4개 다른 부분에서 총 유핵세포에 대한 PCNA-양성세포의 백분율로 정의한다.

그 결과, 도 3 및 도 4에 나타난 바와 같이, 평활근 세포 증식지수는 대조군인 BG 그룹 및 야생형 그룹에 비하여 PPARγ 변이체 그룹이 상당히 낮았고(31.7±9.5% 야생형, 12.1±7.6% K107R, 14.7±6.5% S112A 대 41.8±9.4%, P<0.001), S112A 변이체가 특히 낮았다.

실시예 4. 아포토시스(apoptosis) 작용의 유지

생체 내에서 아포토시스 세포의 검출은 TUNEL 방법을 약간 수정하여 실시하였다 (Ansari B, et al., J Pathol 1993;170:1-8). 요약하면, 5 ㎛ 부위를 파라핀 으로 제거하고 프로테이나제 K(proteinase K, DAKO 사) 20 ㎎/㎖ 를 가하여 상온에서 15분간 배양하였다. 아포토시스 검출 키트 (Apoptag, Intergen 사) 는 크로모젠(Chromogen) DAB 와 함께 사용하였다. 대조 염색은 마이어 헤마톡실린으로 실시하였다. 아포토시스 세포는 피부조직 당 4개의 다른 부분에서 총 유핵세포에 대한 TUNEL-양성세포의 백분율로 정의하였다 (도 5).

그 결과, 풍선 손상 3일 후에는 아포토시스 수준은 그룹 간의 유의한 차이가 없었다. 그러나, 2주일 후, 아포토시스 지수(총 유핵세포에 비하여 TUNEL-양성 세포의 백분율 계산) 는 대조군인 BG 및 야생형에 비하여 PPARγ 변이체 그룹에서 상당히 증가하였다 (15.6±4.3% 야생형, 23.8±6.8% K107R, 21.8±7.4% S112A 대 4.3±1.9%, P<0.01). 특히 K107R 과 S112A 에서 아포토시스가 월등히 높았으며, K107R 과 S112A 그룹 간에는 큰 차이가 없었다 (도 6).

실시예 5. VSMCs 의 증식에서 PPAR γ 변이체의 영향

배양세포 시스템에서의 증식에 대한 PPARγ 변이체의 영향을 조사하기 위하여 티미딘 인코포레이션(thymidine incorporation) 시험을 시행하였다.

그 결과, 도 7 에 나타난 바와 같이, PPARγ 변이체는 대조군인 BG 그룹 및 PPARγ 야생형 그룹에 비하여 랫트 VSMCs 에서의 DNA 합성을 더 많이 저해하였고, 또한 PDGF-자극 VSMC 증식을 저해하였다. 그러나, K107R과 S112A 변이체 간의 DNA 합성에의 영향은 큰 차이가 없었다.

실시예 6. VSMCs 의 이동에서 PPAR γ 변이체의 영향

PPARγ 변이체가 VSMCs 의 이동에 미치는 영향은 VSMCs 창상치유 실험(wound healing assay)에 의하여 정량되었다 (도 8). PPARγ 변이체는 TNFα- 또는 lysoPC 자극 VSMC 이동을 저해하였고, 자극에 상관없이 야생형보다 이동을 더 많이 저해하였다. 또한, S112A 변이체의 VSMC 이동 저해율은 대조군 및 야생형에 비하여 눈에 띄게 감소하였다.

도 1은 PPARγ 변이체의 생체 내 심내막 형성 저해효과를 나타낸 것이다. H&E 염색된 4개의 그룹(BG, WT, K107R, 또는 S112A, 각 그룹의 n = 10)을 준비하고, 형질 전환 2주일 후 K107R 및 S112A 그룹은 BG 대조군 및 PPARγ 야생형(WT)에 비하여 심내막 형성 정도가 낮았다 (막대 및 화살표).

도 2는 PPARγ 변이체의 생체 내 심내막 형성 저해효과를 나타낸 것으로, 네 그룹에서 내막-중막 비율(IMRs)을 나타낸 것이다. K107R 및 S112A 그룹은 BG 대조군 및 PPARγ 야생형(WT)에 비하여 낮은 IMR 을 나타내었다(P < 0.05).

도 3은 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 증식성 세포핵 항원(PCNA, 화살표 부분)에 대한 면역화학적염색 결과를 보여준다.

도 4는 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 평활근 세포 증식 지수(smooth muscle cell proliferative index)가 BG 대조군에 비해 PPARγ 그룹에서 현저하게 낮아졌고, K107R 및 S112A 변이체가 야생형에 비하여 낮은 증식 지수를 보였다.

도 5는 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 손상 2주 후에 로지글리타존 처리 그룹에서의 TUNEL 염색 결과를 보여준다 (화살표 부분).

도 6은 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 대조군과 비교하여 PPARγ 그룹의 아포토시스 지수(%)가 증가함을 보여준다. K107R 및 S112A 변이체의 경우 야생형보다 아포토시스 지수가 높았다.

도 7은 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 의 랫트 VSMCs 에서의 DNA 합성 효과를 나타낸 것이다. DNA 합성을 촉진하기 위하여 TNFα 또는 LysoPC을 사용하였다. 수치는 ±SEM 을 나타낸다. PPARγ 변이체는 자극의 존재 또는 부재 하에서 DNA 합성을 저해하였고, K107R 및 S112A 변이체는 야생형에 비하여 DNA 합성을 더욱 저해하였다.

도 8은 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 의 랫트 VSMCs 에서의 이동 효과를 나타낸 것이다. 이동을 촉진하기 위하여 TNFα 또는 LysoPC을 사용하였다. 수치는 ±SEM 으로 나타내었다. PPARγ 변이체는 자극의 존재 및 부재의 모든 경우에서 이동을 저해하였다.

Claims

PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 112번째 세린을 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 변이체를 포함하는, 동맥경화 및 혈관 재협착 예방 또는 치료용 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 변이체는 PPARγ의 아미노산 서열에서 112번째 세린을 알라닌으로 치환시킨 변이체인 조성물.
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제1항 또는 제3항의 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치.
제8항에 있어서, 상기 국소 투여용 약물 전달 장치는 상기 조성물이 표면에 도포된 스텐트인 것인 장치.