KR101021425B1 - ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101021425B1
KR101021425B1 KR1020080017448A KR20080017448A KR101021425B1 KR 101021425 B1 KR101021425 B1 KR 101021425B1 KR 1020080017448 A KR1020080017448 A KR 1020080017448A KR 20080017448 A KR20080017448 A KR 20080017448A KR 101021425 B1 KR101021425 B1 KR 101021425B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
pparγ
composition
variant
variants
restenosis
Prior art date
Application number
KR1020080017448A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20090092124A (ko
Inventor
박경수
임수
정성수
Original Assignee
재단법인서울대학교산학협력재단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인서울대학교산학협력재단 filed Critical 재단법인서울대학교산학협력재단
Priority to KR1020080017448A priority Critical patent/KR101021425B1/ko
Publication of KR20090092124A publication Critical patent/KR20090092124A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101021425B1 publication Critical patent/KR101021425B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1783—Nuclear receptors, e.g. retinoic acid receptor [RAR], RXR, nuclear orphan receptors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6957—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a device or a kit, e.g. stents or microdevices
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0075—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the delivery route, e.g. oral, subcutaneous
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • High Energy & Nuclear Physics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화(SUMOylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법 및 상기 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치에 관한 것이다.
PPARγ, 동맥경화, 수모화(SUMOylation)

Description

ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물 {Composition comprising PPARγ sumoylation mutant for the prevention or treatment of atherosclerosis and restenosis}
본 발명은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화(SUMOylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법 및 상기 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치에 관한 것이다.
동맥경화증, 특히 아테롬성 동맥경화증이란 콜레스테롤, 인지질, 칼슘 등을 함유한 지방성 물질(plaque)이 혈관 내막에 축적되어 동맥은 단단해져 탄력성을 잃고 좁아져서 혈액공급이 저해되거나 압력이 높아져 동맥이 파열, 박리 등이 일어나는 상태를 말한다. 특히, 아테롬성 동맥경화에 의하여 동맥의 협착(혈관의 좁아짐)이 발생하며 이에 따라 혈액 공급이 감소되어 영양분과 산소가 부족하게 되어 심혈 관계 질환의 주요 원인이 된다(Libby P, et al., Circulation, 86(6), 47-52, 1992; Lundgren CH, et al., Circulation, 90(4), 1927-1934, 1994; Harker, et al., Ann. NY Acad. Sci., 275, 321-329, 1976). 상기 심혈관계 질환은 일반적 동맥경화증, 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함하는 질환으로서, 광범위하게는 허혈성 심혈관 질환이 있다.
현재 동맥경화가 원인이 되는 심혈관 질환의 치료는 혈관 신생(Angiogenesis)을 위한 치료와 혈관평활근세포의 증식억제를 통한 혈관 협착 및 재협착 방지(prevention for restenosis) 치료로 나누어 생각할 수 있다.
경피적 관상동맥 성형술은 좁아진 관상동맥을 수술에 의하지 않고 확장시켜주는 방법으로 시술 방법으로는 경피적 관상동맥 풍선 확장술, 경피적 관상동맥 스텐트 삽입술 등이 있다. 경피적 관상동맥 풍선 확장술은 대퇴부나 팔의 동맥을 통하여 가이드용 도관을 삽입하여 대동맥을 통하여 병변이 있는 관상동맥의 입구에 위치시키고, 이 도관의 내부를 통하여 끝에 풍선이 부착되어 있는 도관을 관상동맥의 협착 부위에 위치시킨 후, 풍선을 확장시켜 플라크 등을 압착하여 좁아진 관상동맥을 확장시킴으로써 관상동맥의 혈류개선을 가져오는 방법이다. 또한, 스텐트 삽입술은 철망이 입혀진 풍선을 협착부위에 위치시킨 후 풍선을 확장하여 관상동맥의 내벽에 철망을 입히는 것이며, 이러한 스텐트는 풍선 확장술만 시술하였을 때보다는 재협착의 발생율이 낮으며 스텐트가 혈관 내벽에 대한 지지대 역할을 하는 특성이 있으므로 풍선 확장시 발생하는 합병증의 치료에 사용되고 있다. 이러한 관상 동맥 성형술을 이용한 중재적 시술은 수술을 통한 방법보다 간편하고 전신 마취에 의한 위험 부담을 줄일 수 있으며 성공률도 높아 세계적으로 널리 이용되고 있는 추세이다.
그러나, 관상동맥 성형술의 시술에 경우 치료를 받는 환자의 10 내지 80 %에서 혈관내피의 손상, 혈관막내 혈전증(mural thrombosis), 혈관 평활근세포와 섬유아세포의 이동과 단핵세포 및 임파구의 침윤, 새로운 심내막(neointima) 형성, 세포외기질의 축적(reendothelialization) 및 세포사멸(apoptosis) 등을 통한 재협착(restenosis)이 발생한다. 재협착이 잘 생기는 경우로는 당뇨병, 고령, 최근에 시작된 협심증이나 불안정 협심증 등을 들 수 있다(Leimgruber PP et al., Circulation, vol. 73, 710, 1986).
관상동맥 재협착 방지를 위해 아테롬 제거술(atherectomy), 레이저 혈관성형술, 고속회전 아테롬 제거술(rotablator), 절단풍선을 이용한 관상혈관 성형술(cutting balloon angioplast) 및 방사선 조사 등의 새로운 PTCA(Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty) 장비가 도입된 바 있으며, 항혈소판제, 항혈전제, 혈관확장제, 세포증식 억제제, 지질대사 개선제 및 항산화제 등의 여러 가지 전신적 및 국소약물 요법 및 유전자 요법과 같은 분자 생물학적 치료가 개발되어 시도되었다. 이 중 경구 투여나 정맥 투여와 같은 전신적인 약물요법은 가장 쉽게 적용할 수 있는 치료법이나, 동물실험에서의 재협착 방지 효과가 보고되었을 뿐, PTCA를 시행한 부위에서 목적하는 약물 농도에 도달되지 않고 약물의 부작용으로 인해 대부분 임상실험에서 재협착을 방지하지 못했다. 이론적으로 재협착은 PTCA가 시술된 국소부위의 관상동맥에만 일어나므로, 재협착의 방지를 위해서는 전신적인 약물요법보다는 부위특이적(site-specific)으로 고농도의 약물투여가 가능한 국소 약물 요법(local drug therapy)이 더욱 유용하다. 최근에는 PTCA를 시행한 부위에 직접 약물을 투여하기 위해, 이중풍선카테터, 디스패치(dispatch) 또는 미세구 풍선(microporous balloon)등이 개발되어 임상에 이용되고 있으며, 장기간 PTCA시술부위에 약물을 전달하기 위해 서방성 미세입자(slow release microsphere)또는 스텐트에 약물을 입혀 치료하는 시도들이 늘고 있다.
종래에 관상동맥 재협착 예방 및 치료로 조성물로는 대한민국 공개공보 제 2001-84811호에 기재된 녹차 추출물인 카테킨에 관한 것과, 대한민국 공개공보 제 2004-8013호에 기재된 클로트리마졸에 관한 것이 있다. 또한 현재 많이 쓰이고 있는 코팅제로는 라파마이신(rapamycin), 파클리탁셀(paclitaxel), 실로리무스 (silorimus) 및 베라파밀(verapamil) 등이 있으나, 이들 약물들은 값이 비싸다. 따라서, 비용이 저렴하고, 유기용매에 대한 용해도가 높아 실제 스텐트 등에 적용이 용이하며, 세포성장 억제효과뿐만 아니라 혈관 확장 활성을 가지는 우수한 동맥경화 및 재협착 예방 및 치료용 약제가 필요한 실정이다.
한편, 퍼옥시좀 증식인자 활성화 수용체 (peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)는 스테로이드, 갑상선 및 비타민 D 수용체를 포함하는 전사 인자의 핵 수용체 거대족의 일원이다. 이들은 지질 대사를 조절하는 단백질의 발현을 제어하는 역할을 하며, 지방산 및 지방산 대사체에 의해 활성화된다. 3가지 의 PPAR 하위 유형인 PPARα, PPARβ 및 PPARγ가 알려져 있고, 이들은 각각 상이한 조직 발현 패턴을 나타내며 구조적으로 다양한 화합물에 의한 활성화 면에서 구별된다.
이 중 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)는 세포신호 경로에 중요한 요소이며 당대사와 지방세포형성과 관련된 전사인자를 조절한다고 알려져 있다. PPARγ는 지방세포에서 PPARγ1 및 PPARγ2 의 형태로 발현한다. PPARγ는 지방세포에서 가장 많이 발현되고, 골격 근육, 심장, 간, 장, 신장, 혈관 내피 및 평활근 세포 및 대식세포에서는 낮은 수치로 발현된다. PPARγ는 혈관세포증식, 이동 및 분화, 대식세포 활성화 및 염증 작용에서 다면적 역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Hsueh WA, et al., Diabetes Care 24:392, 2001; Law RE, et al., Circulation 101:1311, 2000; Ricote M, et al., Nature 391:79, 1998; Blanquart C, et al., J Steroid Biochem Mol Biol 85:267-273, 2003; Benson S, et al., Am J Hypertens 13:74-82, 2000). 따라서, PPARγ는 비만, 당뇨 및 발암 과 관련된 것으로 알려져 있으며, 이들 질환의 치료제로서 PPARγ 리간드(또는 PPARγ 작용물질)를 개발하고자 하는 노력이 있었고, 그 결과 PPARγ 리간드 치료제로서 로시글리타존(rosiglitazone) (Choi D, et al., 2004;27:2654), 피오글리타존(pioglitazone) (Dormandy JA, et al., Lancet 2005;366:1279) 등이 개발되었다. 그러나, PPARγ 리간드를 전신적으로 사용한 경우의 몇몇 유해한 영향들이 보고되었고 (Ali AA, et al., Endocrinology 146:1226, 2005; Mudaliar S, et al., Endocr Pract 9:406, 2003), 최근에는 로시타글리타존을 복용한 제2형 당뇨병 환자 에 대한 심혈관 효과에 관한 논쟁이 높아지고 있다(Home PD, et al., N Engl J Med 357:28, 2007; Nissen SE, et al., N Engl J Med 356:2457, 2007).
따라서, 목적 조직에서 PPARγ 유전자의 활성화가 필요하며, PPARγ 리간드의 조절 없이도 PPARγ 자체가 활성화될 수 있다면 PPARγ 리간드에 의한 유해한 영향 없이 안정적으로 동맥경화증을 완화시킬 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 PPARγ 자체를 목적 조직에서 활성화시켜 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킨 변이체를 목적 조직에 국소투여하면 PPARγ 리간드 존재 여부에 상관없이 활성화되어 혈관평활근 세포(VSMCs)의 증식을 저해하고, 아포토시스(apoptosis)를 유지시키고, 풍선손상(balloon injury) 이후에 새로운 심내막 형성을 감소시켜, 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 또는 치료에 효과적임을 입증하였다. 또한, PPARγ K107에서의 수모화 변이체의 동맥경화에 대한 보호작용이 PPARγ 리간드, PPARγ 야생형 및 PPARγ의 다른 수모화 변이체보다 현저하게 우수함을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화(SUMOylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화(SUMOylation)를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질를 포함하는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "수모화(SUMOylation)"란 수모 단백질(small ubiquitin-related modifier, SUMO)의 C-말단 글리신(glycin)과 목적 단백질의 라이신 잔기 간의 이소펩타이드(isopeptide) 결합에 의하여 목적 단백질과 공유결합을 형성하는 것을 말하는 것으로서, 단백질의 번역 후 수식(posttranslational modification) 의 하나이다. 수모 단백질은 다양한 단백질의 라이신 잔기에 공유결합하는 11 Kda 가량의 조절 인자로서, 수모 결합부위는 ψKEX (ψ은 소수성 아미노산)로 정의되어 있다. 수모화는 목적 단백질의 기능에 영향을 미치며, 많은 수의 전사인자가 수모화를 위한 표적으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "PPARγ의 수모화를 억제시킨 변이체" 또는 "PPARγ 수모화 변이체" 란 PPARγ의 특정 라이신 잔기가 수모와 공유결합(즉, 수모화)을 일으키지 못하도록 변형시킨 변이체를 말한다. 이러한 변이체로는 PPARγ의 수모화 부위인 특정 라이신 잔기를 결실 또는 다른 아미노산으로 치환시키는 방법 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이 때, PPARγ의 수모화를 억제하는 활성을 갖는다면 라이신 잔기를 라이신을 제외한 어떠한 아미노산으로 치환시켜도 무방하나, 바람직하게는 아르기닌으로 치환시킬 수 있다.
PPARγ의 수모화 변이체로서 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화 변이체(Ohshima T, et al., J Biol Chem 2004;279:29551-29557), 395번째 라이신에서의 수모화 변이체(Pascual G, et al., Nature 2005;437:759-763) 등이 알려져 있으며, PPARγ 의 수모화 역시 PPARγ의 전사활성 조절에 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다 (아미노산 서열은 GenBank accession No. BC021798에 따른 것이다). 그러나, PPARγ 의 수모화 변이체가 심내막 형성 또는 혈관평활근 세포 (vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 증식과 생존에 미치는 영향은 본원 발명에서 처음 발견하였으며, 특히 PPARγ K107R 수모화 변이체의 항동맥경화 효과가 PPARγ 리간드, PPARγ 야생형 및 PPARγ의 다른 수모화 변이체와 비교하여 현저하게 우수함을 최초로 입증하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신을 아르기닌으로 치환시킨 변이체를 사용하였다.
본 발명에서 용어, "PPARγ 수모화 변이유도물질" 이란 PPARγ의 특정 라이신 잔기가 수모와 공유결합(즉, 수모화)을 일으키지 못하도록 하는 모든 물질을 포함하며, 예컨대, PPARγ의 특정 라이신 잔기에서의 수모화에 관여하는 효소의 활성을 억제하거나 탈수모화에 관여하는 효소의 활성을 유도하는 방법으로 PPARγ 수모화 변이를 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명의 변이유도물질은 구체적으로 PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화에 관여하는 효소의 활성을 억제하는 물질 또는 PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 탈수모화에 관여하는 효소의 활성을 유도하는 물질을 포함한다.
PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화에 관여하는 효소는 수모 활성화 효소(SUMO activating enzyme, E1), 수모 결합 효소(SUMO conjugating enzyme, E2) 및 수모 연결 효소(SUMO ligase, E3)가 있다. 수모화는 상기 세 개의 효소가 관여하는 3단계에 걸쳐 일어나는데, 1단계는 수모 활성화 효소와 수모 사이에 고에너지의 thioester 결합이 형성되는 단계로서, 수모 활성화 효소는 SAE1 및 SAE2 서브유닛(효모에서는 Aos1 및 Uba2로 알려져 있음) 의 heterodimer으로 되어 있다. 2단계는 수모 연결 효소와 수모 사이에 thioester 결합이 형성되는 단계로서, 수모 결합 효소로는 Ubc9 가 알려져 있다. 3단계는 수모와 기질 단백질 간에 공유결합이 형성되는 단계로서, 수모 연결 효소로는 PIAS(protein inhibitor of activated STAT)패밀리로서 PIAS 1, 3, Xα, Xβ, Y 등이 있고, 이 외에도 RanBP2, Pc2(polycomb protein 2) 등이 있다. 따라서, 상기 세 단계에 관여하는 효소들을 억제시킴으로서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킬 수 있으며, 바람직하게는 기질특이성이 있다고 알려진 수모 연결 효소(E3)를 변형시켜 그 활성을 억제함으로서 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
또한, PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 탈수모화에 관여하는 효소는 SENP(SUMO-specific protease)가 있으며, 본 발명에서는 SENP 의 활성을 유도함으로써 본 발명의 목적을 달성할 수 있다.
본 발명에서는 다음과 같은 방법으로 본 발명의 조성물의 우수함을 입증하였다. 구체적으로, PPARγ 야생형(WT), PPARγ K107R(PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신을 아르기닌으로 치환) 수모화 변이체, PPARγ S112A(PPARγ 의 아미노산 서열에서 112번째 세린을 알라닌으로 치환) 인산화 변이체 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG) 유전자에 따라 네 그룹으로 구분하여 다음과 같은 비교실험을 하였다.
우선, PPARγ 수모화 변이체의 활성이 리간드에 영향을 받는지 알아보기 위하여, NIH-3T3 세포에서 PPAE-tk-luc 를 리포터 유전자로 이용하여 PPARγ 의 활성화 리간드로 알려진 로시글리타존의 존재 또는 부재 하에서 PPARγ 야생형 또는 PPARγ 변이체 (K107R, K395R 또는 S112A)의 전사활성을 각각 측정한 결과, PPARγ K107R 변이체는 로시글리타존의 부재 및 존재의 모든 경우에 야생형보다 높은 전사 활성을 보임을 입증하였다 (도 1A). 또한, 본 발명자는 로시글리타존의 부재 또는 존재 하에 PPARγ 변이체의 전사억제 작용을 조사하고자 iNOS 프로모터의 활성 억제 정도를 측정한 결과, PPARγ K107R 변이체는 로시글리타존의 부재 및 존재 하에도 야생형보다 iNOS 프로모터 활성을 보다 효율적으로 감소시킴을 입증하였다 (도 1B). 이러한 결과는 PPARγ K107R 변이체가 리간드 처리에 관계없이 PPARγ의 전사활성 및 전사억제 활성 모두를 야생형보다 효율적으로 유도할 수 있음을 나타낸다.
다음으로, PPARγ 수모화 변이체가 심내막 형성에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 본원 발명에서는 랫트에서의 풍선 손상(n=10) 후에 경동맥 조직 단편을 염색하여 심내막 형성 넓이를 측정하고, 내막-중막 비율(intima/media ratio, IMR)을 계산하였다. 그 결과, 풍선 손상 2주일 후, PPARγ K107R 변이체가 대조군인 BG 그룹 및 다른 변이체 그룹에 비하여 심내막 형성을 현저하게 저해함을 입증하였고 (도 2), 실험군 중 가장 낮은 IMR 을 가짐을 보였다 (도 3).
또한, 형질감염된 랫트 동맥에서 PPARγ 와 증식성 세포핵 항원에 대한 면역조직화학적 분석을 실시한 결과, PPARγ K107R 변이체가 VSMCs 증식을 현저하게 저해하였고, 실험군 및 대조군 중 가장 낮은 평활근 증식지수(총 유핵세포에 비하여 PCNA-양성세포의 백분율로 정의)를 나타냄을 보였다 (도 4 및 도 5).
또한, PPARγ 변이체가 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향을 알기 위하여 TUNEL 방법을 실시한 결과, 풍선 손상 2주일 후 PPARγ K107R 변이체의 세포사멸 지수(총 유핵세포에 비하여 TUNEL-양성 세포의 백분율 계산) 가 대조군 및 실험군에 비하여 월등히 높음을 보였다 (도 6 및 도 7).
또한, 티미딘 인코포레이션(thymidine incorporation) 시험 결과, PPARγ K107R 변이체는 대조군과 비교했을 때 랫트 VSMCs 에서 DNA 합성 및 PDGF-자극 VSMC 증식을 훨씬 저해하였고(도 8), VSMCs 창상치유 실험 결과, TNFα- 또는 lysoPC 자극 VSMC 이동을 가장 효율적으로 저해하였음을 보였다 (도 9).
이러한 실험 결과들을 종합해 보면, PPARγ K107에서의 수모화 변이체는 동맥경화 및 혈관 재협착 치료에 유용하게 사용될 수 있으며, PPARγ K107에서의 수모화 변이체의 동맥경화 및 혈관 재협착에 대한 보호작용이 PPARγ 야생형 및 PPARγ의 다른 수모화 변이체보다 현저하게 우수함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 동맥경화 및 혈관 재협착의 예방 및 치료에 효과적이다. 일반적으로 혈관 재협착은 동맥경화와 많은 과정 및 기전을 공유하는 것으로 이해되고 있으며(Nature, 362:801-809, 1993; Circulatinion, Res., 77:445-465, 1995), 상기 두 질병의 차이점은 동맥에 기능적으로 중요한 협착이 발생하는 속도 정도이다. 따라서 혈관 재협착은 동맥경화에 책임이 있는 기전의 많은 부분을 이해하는 효과적인 모델로도 사용된다. 따라서 본원에서 공개되는 치료방법은 재협착 뿐만 아니라 동맥경화, 특히 아테롬성 동맥경화를 치료하고 예방 또는 증상을 개선하는데 사용될 수 있다. 또한, 혈관 재협착을 치료하기 위한 목적으로 사용되는 경우에는 경피적 관동맥 성형술 이후의 재협착을 방지하기 위하여 사용될 수 있으며, 경피적 관동맥 성형술의 예로는 풍선혈관성형술, 스텐트 삽입, 관동맥 우회술 및 동맥-정맥 문합술 등이 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 혈관 협착을 억제함에 따라, 혈관 협착이 주요 원인이 되는 심혈관계 질환의 치료 또는 예방 효과가 있다. 상기 심혈관계 질환은 심부전, 고혈압성 심장질환, 부정맥, 선천성 심장질환, 심근경색증 및 협심증 등의 심장질환과, 뇌졸중 및 말초혈관질환 등의 혈관질환을 포함하는 질환으로서, 광범위하게는 허혈성 심혈관 질환이다.
본 발명에 따른 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되거나 무균성이고, 이러한 용액은 멸균되거나 무균성이고, 물, 완충제, 등장제 또는 동물 또는 사람에게 적용할 경우, 알레르기 또는 기타 유해한 반응을 일으키지 않는, 당해 기술 분야의 숙련가에게 공지된 기타 성분을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복물, 항균제, 항진균제 및 등장제 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질용으로 상기 매질 및 제제를 사용하는 것은 당해 기술 분야에 익히 알려져 있다. 활성 성분과 비혼화성인 통상적인 매질 또는 제제 이외에, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 또한, 보충성 활성 성분을 당해 조성물에 혼입시킬 수도 있다.
상기 조성물은 액제, 유제, 현탁제 또는 크림제 등의 제형으로 제조할 수 있으며, 비경구로 사용될 수 있다. 가장 바람직하게는 목적 조직, 예컨대 경동맥에 직접 국소 투여 하는 것이 좋다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 동맥경화를 치료 또는 예방하기 위한, PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치에 관한 것이다. 국소 투여용 약물 전달 장치는 바람직하게는 본 발명의 조성물을 도포한 이식가능한 스텐트이다.
본 발명에서 스텐트라 함은 상기에서 언급한 바와 같이 관내 적용(endoluminal appilcation), 예를 들면 혈관 내에 적용하기 위한 일반적인 장치를 의미하는 것으로, 혈액의 흐름이 순조로워야 되는 부위에 질환이 발생하여 그 흐름에 장애가 발생하였을 때, 외과적으로 개복 수술을 하지 않고 x-선 투시 하에서 좁아지거나 막힌 혈관부위에 삽입하여 혈액의 흐름을 정상화시키는 원통형의 의료용 재료를 의미한다. 예를 들어 혈관 내 스텐트(vascular stent)는 Eric J Topol 저 "Textbook of Interventional Cardiology", Saunders Company, 1994에 기술되어 있다. 바람직하게는 서방형 약물방출형 스텐트이다.
구체적인 일 양태로서, 본 발명에 따른 스텐트를 제조하기 위하여, 상기 조성물을 스텐트에 코팅한다. 스텐트에 조성물을 코팅하는 방법으로는 본 발명의 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 통상의 코팅방법을 적용할 수 있고, 예를 들어 침염코팅(dip-coated)과 고분자와 함께 코팅(polymer coated) 하는 방법이 있으며, 침염코팅법은 가장 간단한 코팅 방법이며, 약학 조성물만이 코팅되기 때문에 약물만의 생물학적 효과를 관찰하기에 용이하나 이에 제한되는 것은 아니 다. 바람직하게는 본 발명에 따른 조성물이 천천히 방출될 수 있도록 상기 조성물을 약물방출형 스텐트에 고분자 물질과 혼합한 후 코팅하여 본 발명의 스텐트를 제조할 수 있다. 약물방출형 스텐트에 사용될 수 있는 고분자 물질은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 폴리우레탄, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, PLLA-폴리-글라이콜산 공중합체(PLGA), 폴리카프로락톤, 폴리-(하리드록시부티레이트/하리드록시발레레이트)공중합체, 폴리비닐피롤리돈, 폴리테트라 플루오로에틸렌, 폴리(2-하리드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(에테루레탄 우레아), 실리콘, 아크릴, 에폭사이드, 폴리에스테르, 우레탄, 파알렌, 폴리포스파진 고분자, 플루오로 고분자, 폴리아마이드 및 폴리올레핀 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 혈관 협착을 제거하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 혈관 협착 제거 방법은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함한다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다. 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물 의 분비율, 치료 기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 한 양태로서, 본 발명의 치료방법은 PPARγ 의 아미노산 서열에서 107번째 라이신에서의 수모화를 억제시킨 변이체 또는 그러한 변이유도물질을 포함하는 약제학적 조성물과 함께 하나 또는 그 이상의 공지의 치료제를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
공지의 치료제로는 로시글리타존(rosiglitazone) 및 피오글리타존(pioglitazone) 등을 예시할 수 있고, 공지의 치료제의 약학적 유효량은 당업계에 공지되어 있으며 증상의 정도, 본 발명의 조성물과의 병용 투여 등의 제반 조건을 고려하여 처치의가 그 양을 조절할 수 있다. 이와 같이 공지의 치료제를 병용 투여함으로써, 본 발명의 조성물에 의해 공지의 치료제의 부작용 등을 경감시킬 수 있을 뿐만 아니라, 상승적인 치료효과도 기대할 수 있다. 이들 공지의 치료제는 경우에 따라 복합제제 또는 동시에 투여되거나, 또는 본 발명의 조성물과 시간의 간격을 두고 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여에 의해, 동맥경화나 경피적 관상동맥 성형술 후의 혈관 재협착에 기인하는 혈관의 협착 증상이 효과적으로 예방된다. 또한, 본 발명의 조성물은, 진행된 혈관의 협착 증상을 완화하기 위한 치료 용도에 있어서도 유 용하다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 의해 한정되지 않는다.
실시예 1. 실험재료 준비
1-1. PPAR γ 변이체의 제조
마우스 PPARγ2의 발현벡터인 pSG-PPARγ2 는 서울대학교 김재범 박사로부터 기증받았다. PPARγ의 DNA 단편을 pcDNA3.1에 삽입하였고, pcDNA-PPARγ2 K107R을 제작하기 위하여 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene) 에 의해 아미노산 서열의 107번째 라이신을 아르기닌으로 치환시켰다. K395R, S112A (구성적 활성 변이체; Rangwala SM, et al., Dev Cell 5:657-663, 2003) 및 L466A(우성 음성 변이체; Park Y, et al., Diabetologia 46:365-377, 2003) 변이체 역시 같은 방법으로 제조하였다. piNOS 프로모터-luc 를 제작하기 위해, iNOS 프로모터(-1588/+161)의 DNA 단편을 pGL2-basic(Promega사)으로 삽입하였다. 아데노 바이러스에 의한 인간 PPARγ1의 아데노 바이러스의 전달은 공지의 방법을 따랐고(Hong HK, et al., Diabetes Res Clin Pract 62:1-8, 2003), 주요 수모 결합부위, K77(PPARγ2 의 K107과 동일) 은 아르기닌으로 변이되었으며, 결과 바이러스 구조물은 Ad-PPARγ K107R 로 명명하였다. Ad-PPARγ S112A 에서는 주요 인산화 부위인 S82(PPARγ2 의 S112와 동일) 가 알라닌으로 변이되었다.
1-2. 형질전환 동물의 제조
생체 내(in vivo) 실험을 위하여, 300 내지 400g 의 무게를 갖는 Sprague-Dawley 랫트(rat) 수컷 성체 48마리(대한 바이오링크사)를 실험에 사용하였다. 동물은 실험동물연구을 위한 실험실, 임상실험연구소 및 서울대학교 병원으로부터 실험동물연구 가이드에 따라 다뤘다. 랫트는 도입한 유전자의 타입, 즉, PPARγ 야생형(WT), PPARγ K107R 수모화 변이체, PPARγ S112A 변이체 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG) 유전자에 따라 네 그룹으로(그룹당 12마리) 구분하였다.
이전에 확립된 랫트 경동맥 풍선 손상 모델을 본 연구에서 사용하였다(Clowes AW, et al., Lab Invest 1983;49:327-333). PPARγ-WT, K107 변이체, S112A 변이체 및 β-갈락토시데이즈를 발현하는 아데노바이러스 벡터가 유전자 전달을 위해 사용되었다. 랫트는 혼합마취제 (케타민(ketamine), 70㎎/㎏ IP; 유한 주식회사, 바이엘 코리아)를 사용하여 마취하였다. 왼쪽 외경동맥이 노출된 후, 헤파린(heparin) (35IU)은 시스템적으로 외경정맥을 통해 투여되었다. 2F 포가티 색전 카테터(Baxter Healthcare 사)는 외경동맥 절개술(external carotid artheriotomy incision)을 통해 삽입되며, 총 경동맥 쪽으로 집어넣어 생리식염수 (normal saline) 0.2 ㎖로 부풀리고 10번 순환 한 다음 다시 수거하였다. 기부의 총 경동맥과 기부의 내경동맥을 고정시킨 후, PPARγ 야생형, K107R 변이체, S112A 변이체 및 대조군 유전자를 가지는 5 x 108 pfu 의 바이러스 주입액 혼합물을 100 ㎕의 총 부피로 희석한 후 두 개의 클램프(clamp) 사이에서 동맥 부분을 통해 주입하였다. 관류는 주입 20분 후에 총인 경동맥에서 제거하였다.
실시예 2. PPAR γ의 전사활성에 수모화 부위 변이의 영향
PPARγ 야생형의 활성이 특정한 리간드들에 의해 유도된다고 알려져 있는바, PPARγ 수모화 변이체의 활성도 리간드에 영향을 받는지 알아보기 위하여, 본 발명자들은 PPAE-tk-luc 를 리포터 유전자로 이용하여 PPARγ 야생형, PPARγ K107R 수모화 변이체, PPARγ K395R 변이체 및 PPARγ S112A 변이체의 전사 활성을 조사하였다.
우선, NIH-3T3 세포를 10 % FBS(fetal bovine serum)을 첨가한 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; Invitrogen사)에서 배양하였다. 배양한 세포는 LipofectAMINE 및 Plus reagent(Invitrogen사)를 이용하여 pPPRE-tk-luc 리포터 플라스미드 0.1 ㎍, PPARγ-RXRα발현벡터 0.05 ㎍ 및 pCMV-β-갈락토시데이즈로 형질감염하였다. 각 웰에 같은 양(0.5 ㎍)의 DNA를 형질감염하기 위하여, pcDNA가 가해졌다. 트로글리타존(Troglitazone)(10μM)과 9-시스-레티노산(1μM)을 형질전환 3시간 후 가하였다. 세포는 형질전환 24시간 후에 수확하였고, 루시퍼라제(luciferase) 활성과 β-갈락토시데이즈 활성은 제조업체의 지침(Promega 사)에 따라 결정되었다. iNOS 프로모터 활성 분석을 위해 NIH-3T3 세포 는 piNOS 프로모터-luc(0.1~0.3 ㎍), PPARγ 야생형 또는 변이체 발현 벡터(0.1 ㎍) 및 pCMV-β-갈락토시데이즈(0.1 ㎍)로 형질감염하였다. 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS) 를 배지에 18시간동안 가하고 세포를 수확하였다.
실험 결과, PPARγ K107R 수모화 변이체는 로시글리타존(rosiglitazone)의 부재 및 존재의 모든 경우에 특정 리간드에 대해 야생형보다 높은 전사활성을 보였다 (도 1A). PPARγ K395R 변이체의 기본적인 전사 활성은 야생형와 비슷했지만, 로시글리타존이 활성을 유도하지는 않았다. 인산화 부위인 S112 에서의 변이는 전사활성에 어떤 주요한 변화도 일으키지 않았다.
다음으로, 본 발명자는 로시글리타존의 부재 또는 존재 하에 PPARγ 변이체의 전사억제 작용을 조사하였다. iNOS 프로모터의 활성은 NIH-3T3 세포의 LPS 존재에서 거의 1.8배 증가하였다. PPARγ 야생형의 과발현은 비유도 상태의 수준까지 프로모터 활성을 억제하였다. PPARγ K107R 수모화 변이체는 프로모터 활성을 보다 효율적으로 감소시켰다. 이와는 대조적으로, K395R 변이체는 야생형보다 낮은 억제활성을 가졌으며, PPARγ의 우성 음성 변이체인 L466A 는 유사한 효과를 나타내었다. 로시글리타존은 야생형과 K107R 변이체의 전사억제 활성을 약간 증가시켰지만, K395R 또는 L466A 에는 영향을 미치지 못하였다.
이러한 결과는 주요한 수모화 부위인 K107에서의 수모 결합이, 리간드 처리에 관계없이, PPARγ의 전사활성 및 전사억제 활성 모두를 야생형보다 효과적으로 유도할 수 있음을 나타낸다.
실시예 3. 생체 내에서 심내막 형성 저해
풍선 손상 3일(n=2) 및 2주일(n=10) 후에, 랫트는 펜토바르비탈(pentobarbital)을 치사량 사용하여 안락사시키고, 경동맥은 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 18G 정맥 캐뉼러로 120 mmHg 에서 살포하여 고정시켰다. 조직 단편은 H&E로 염색하였다. 조직 구조적인 염색 부위에서 심내막 형성 넓이는 컴퓨터화된 면역측정법으로 측정하였다. 혈관층의 총단면적, 즉, 내강, 내막 및 내측 영역은 Image Pro Plus Analyzer Version 4.5(Media Cybernetics 사)를 사용하여 3개 다른 부위(근접, 중간, 말단)로 정량하였다. 내막-중막 비율(intima/media ratio; IMR)은 측정값들의 평균으로 계산하였다.
그 결과, 풍선 손상 3일 후의 VSMC 증식 정도에 있어서, PPARγ 야생형, K107R, S112A 및 BG 그룹 간의 차이는 관찰되지 않았고, 내막이 전혀 또는 거의 검출되지 않았다 (데이타는 제시하지 않음). 그러나 풍선 손상 2주일 후, PPARγ 야생형, K107R, S112A 그룹은 대조군인 BG 그룹에 비하여 낮은 심내막 형성을 보였다 (도 2). 또한, 도 3에 나타난 바와 같이, PPARγ 변이체 전부는 대조군인 BG 보다 낮은 IMR 을 가졌다 (야생주, 1.20±0.16; K107R, 0.78±0.13; S112A, 0.86±0.10; BG 1.68±0.16, P<0.05). 또한, K107R 변이체는 야생형보다 현저하게 낮은 IMR을 가졌다 (P<0.05, 각각).
실시예 4. 생체 내에서 혈관 평활근 세포( Vascular Smooth Muscle Cell) 증식 저해
PPARγ 유전자의 발현을 확인하고 증식성 세포를 탐지하기 위해, PPARγ 와 증식성 세포핵 항원에 대한 면역조직화학적 분석을 바이러스 처리 동맥에 실시하였다. 요약하면, 파라핀으로 둘러싼 시료를 절단시키고 프로테아제 K(protease K)로 4분간 처리하였고, 내인성 과산화 효소는 메탄올/과산화 효고 용액으로 억제시켰다. 표본은 0.1% 트윈 20과 0.15 mol/L NaCl이 포함되 50mmol/L 트리스-HCl(pH7.6) 로 5분간 처리하고, PPARγ 에 대한 면역조직화학적 분석을 위하여 1:200 희석 쥐 항-PPARγ 항체(Santa Cruz Biotechnology 사) 또는 PCNA 염색을 위한 1:50 희석 항-PC-10 항체(DAKO 사)의 존재 하에서 배양하였다. 표본은 1:50 희석된 디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드(diaminobenzidine tetrahydrochloride) 기질용액(DAKO 사)에서 배양하고 마이어 헤마톡실린(Mayer hematoxylain)(DAKO 사)으로 대조염색을 하였다. 증식지수는 피부조직 당 4개 다른 부분에서 총 유핵세포에 대한 PCNA-양성세포의 백분율로 정의한다.
그 결과, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 평활근 세포 증식지수는 대조군인 BG 그룹에 비하여 PPARγ 변이체 그룹이 상당히 낮았고(31.7±9.5% 야생형, 12.1±7.6% K107R, 14.7±6.5% S112A 대 41.8±9.4%, P<0.001), K107R 가 특히 낮았다.
실시예 5. 아포토시스 ( apoptosis ) 작용의 유지
생체 내에서 아포토시스 세포의 검출은 TUNEL 방법을 약간 수정하여 실시하였다 (Ansari B, et al., J Pathol 1993;170:1-8). 요약하면, 5 ㎛ 부위를 파라핀 으로 제거하고 프로테이나제 K(proteinase K, DAKO 사) 20 ㎎/㎖ 를 가하여 상온에서 15분간 배양하였다. 아포토시스 검출 키트 (Apoptag, Intergen 사) 는 크로모젠(Chromogen) DAB 와 함께 사용하였다. 대조 염색은 마이어 헤마톡실린으로 실시하였다. 아포토시스 세포는 피부조직 당 4개의 다른 부분에서 총 유핵세포에 대한 TUNEL-양성세포의 백분율로 정의하였다 (도 6).
그 결과, 풍선 손상 3일 후에는 아포토시스 수준은 그룹 간의 유의한 차이가 없었다. 그러나, 2주일 후, 아포토시스 지수(총 유핵세포에 비하여 TUNEL-양성 세포의 백분율 계산) 는 대조군인 BG에 비하여 PPARγ 그룹에서 상당히 증가하였다 (15.6±4.3% 야생형, 23.8±6.8% K107R, 21.8±7.4% S112A 대 4.3±1.9%, P<0.01). PPARγ 그룹 중에서는 야생형에 비하여 K107R 과 S112A 에서 아포토시스가 월등히 높았으며, K107R 과 S112A 그룹 간에는 큰 차이가 없었다 (도 7).
실시예 6. VSMCs 의 증식에서 PPAR γ 변이체의 영향
배양세포 시스템에서의 증식에 대한 PPARγ 변이체의 영향을 조사하기 위하여 티미딘 인코포레이션(thymidine incorporation) 시험을 시행하였다.
그 결과, 도 8 에 나타난 바와 같이, PPARγ 변이체는 대조군인 BG 그룹 및 PPARγ 야생형 그룹에 비하여 랫트 VSMCs 에서의 DNA 합성을 더 많이 저해하였고, 또한 PDGF-자극 VSMC 증식을 저해하였다. 그러나, K107R과 S112A 변이체 간의 DNA 합성에의 영향은 큰 차이가 없었다.
실시예 7. VSMCs 의 이동에서 PPAR γ 변이체의 영향
PPARγ 변이체가 VSMCs 의 이동에 미치는 영향은 VSMCs 창상치유 실험(wound healing assay)에 의하여 정량되었다 (도 9). PPARγ 변이체는 TNFα- 또는 lysoPC 자극 VSMC 이동을 저해하였고, 자극에 상관없이 야생형보다 이동을 더 많이 저해하였다. 또한, K107R 변이체의 VSMC 이동 저해율은 S112A 변이체에 비하여 눈에 띄게 감소하였다.
도 1은 PPARγ 야생형 및 그 변이체의 전사활성을 나타낸 것이다. A) NIH-3T3 세포를 pPPRE-tk-luc, pcDNA-PPARγ 또는 PPARγ 변이체 (K107R, K395R 또는 S112A), pcDNA-RXRa 및 pCMV-β-갈락토시데이즈로 형질감염한 후 전사활성을 측정하였다. PPARγ 발현 부재 및 로시글리타존의 부재 하에서의 루시퍼레이즈 활성을 1로 두고 상대적인 활성을 측정한 결과를 막대 그래프로 나타내었으며, 각 막대는 5개의 독립적인 실험의 ±SEM으로서 나타내었다. B) NIH-3T3 세포를 pGL2-iNOS-luc, pcDNA-PPARγ 또는 변이체, 및 pCMV-β-갈락토시데이즈로 형질감염한 후 전사활성을 측정하였다. LPS 의 부재 하에서의 루시퍼레이즈 활성을 1로 두고 상대적인 활성을 측정한 결과를 막대 그래프로 나타내었으며, 각 막대는 7개의 독립적인 실험의 ±SEM으로서 나타내었다. DN 은 PPARγ 의 우성 음성 변이체(dominant negative form)인 L466A 를 나타낸다.
도 2는 PPARγ 변이체의 생체 내 심내막 형성 저해효과를 나타낸 것이다. H&E 염색된 4개의 그룹(BG, WT, K107R, 또는 S112A, 각 그룹의 n = 10)을 준비하고, 형질 전환 2주일 후 PPARγ 야생형(WT), K107R 및 S112A 그룹은 BG 대조군에 비하여 심내막 형성 정도가 낮았다 (막대 및 화살표).
도 3은 PPARγ 변이체의 생체 내 심내막 형성 저해효과를 나타낸 것으로, 네 그룹에서 내막-중막 비율(IMRs)을 나타낸 것이다. PPARγ 그룹 BG 대조군에 비하여 낮은 IMR 을 나타내었다(P < 0.05). 또한, K107R 및 S112A 그룹은 야생형에 비하여 낮은 IMR 을 나타내었다(P < 0.05).
도 4는 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 증식성 세포핵 항원(PCNA, 화살표 부분)에 대한 면역화학적염색 결과를 보여준다.
도 5는 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 평활근 세포 증식 지수(smooth muscle cell proliferative index)가 BG 대조군에 비해 PPARγ 그룹에서 현저하게 낮아졌고, K107R 및 S112A 변이체가 야생형에 비하여 낮은 증식 지수를 보이며, K107R 와 S112A 간에는 큰 차이가 없음을 나타낸다.
도 6은 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 및 대조군으로서 β-갈락토시데이즈(BG)의 생체 내 증식 효과를 나타낸 것으로서, 손상 2주 후에 로지글리타존 처리 그룹에서의 TUNEL 염색 결과를 보여준다 (화살표 부분).
도 7은 풍선 손상 및 유전자 도입 2주일 후 대조군과 비교하여 PPARγ 그룹의 아포토시스 지수(%)가 증가함을 보여준다. K107R 및 S112A 변이체의 경우 야생형보다 아포토시스 지수가 높았고, K107R 와 S112A 간에는 큰 차이가 없음을 나타낸다.
도 8은 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 의 랫트 VSMCs 에서의 DNA 합성 효과를 나타낸 것이다. DNA 합성을 촉진하기 위하여 TNFα 또는 LysoPC을 사용하였다. 수치는 ±SEM 을 나타낸다. PPARγ 변이체는 자극의 존재 또는 부재 하에서 DNA 합성을 저해하였고, K107R 및 S112A 변이체는 야생형에 비하여 DNA 합성을 더욱 저해하였다. K107R 변이체는 S112A 변이체에 비하여 DNA 합성을 현저히 감소시켰다.
도 9는 PPARγ 그룹(야생형(WT), K107R, 또는 S112A) 의 랫트 VSMCs 에서의 이동 효과를 나타낸 것이다. 이동을 촉진하기 위하여 TNFα 또는 LysoPC을 사용하였다. 수치는 ±SEM 으로 나타내었다. PPARγ 변이체는 자극의 존재 및 부재의 모든 경우에서 이동을 저해하였다.

Claims (10)

  1. PPARγ(peroxisome proliferator activated receptor γ)의 아미노산 서열에서 107번째 라이신을 다른 아미노산 잔기로 치환시킨 변이체를 포함하는, 동맥경화 및 혈관 재협착 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 PPARγ의 아미노산 서열에서 107번째 라이신을 아르기닌으로 치환시킨 변이체인 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제1항 또는 제3항의 조성물의 국소 투여용 약물 전달 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 국소 투여용 약물 전달 장치는 상기 조성물이 표면에 도포된 스텐트인 것인 장치.
KR1020080017448A 2008-02-26 2008-02-26 ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물 KR101021425B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080017448A KR101021425B1 (ko) 2008-02-26 2008-02-26 ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080017448A KR101021425B1 (ko) 2008-02-26 2008-02-26 ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090092124A KR20090092124A (ko) 2009-08-31
KR101021425B1 true KR101021425B1 (ko) 2011-03-14

Family

ID=41209292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080017448A KR101021425B1 (ko) 2008-02-26 2008-02-26 ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101021425B1 (ko)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Biol. Chem., Vol. 279, No. 28, 2004, pp. 29551-7.
Nature, Vol. 437, No. 7059, 2005, pp. 759-63.

Also Published As

Publication number Publication date
KR20090092124A (ko) 2009-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Marx et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma activators inhibit gene expression and migration in human vascular smooth muscle cells
US8507431B2 (en) Methods for accelerating wound healing by administration of a preadipocyte modulator or an adipocyte modulator
Shi et al. Adventitial remodeling after coronary arterial injury
JP3618736B2 (ja) トロンビン由来ペプチドを使用した治療法
US20060089299A1 (en) Selective treatment of endothelial somatostatin receptors
US20170313751A1 (en) Methods and Pharmaceutical Composition for the Preservation of Vascular Endothelial Cell Barrier Integrity
US6689807B1 (en) HMG CoA reductase inhibitors for promoting angiogenesis
KR20100122501A (ko) 재협착의 예방 및 치료를 위한 화합물 및 방법
Wang et al. Transplantation of EPCs overexpressing PDGFR-β promotes vascular repair in the early phase after vascular injury
Wang et al. Irisin improves myocardial performance and attenuates insulin resistance in spontaneous mutation (Leprdb) mice
US20120308522A1 (en) Therapeutic Use of Growth Factor, and Delivery Device, Especially for the Treatment of Intimal Hyperplasia
KR100983164B1 (ko) ＰＰＡＲγ 인산화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물
CA2628876A1 (en) R-ras activity in vascular regulation
Lim et al. Effect of a peroxisome proliferator-activated receptor γ sumoylation mutant on neointimal formation after balloon injury in rats
KR101021425B1 (ko) ＰＰＡＲγ 수모화 변이체를 포함하는 동맥경화 및 혈관재협착 치료 또는 예방용 조성물
JP3983271B1 (ja) エフリンｂ２を用いた新生血管抑制方法
JP4205592B2 (ja) 心臓組織修復を促進するためのトロンビン由来ペプチド
Yla-Herttuala Gene therapy for cardiovascular diseases
KR100987557B1 (ko) 혈관 재협착 치료 또는 예방용 조성물
Fishbein et al. Local delivery of mithramycin restores vascular reactivity and inhibits neointimal formation in injured arteries and vascular grafts
Baalbaki et al. Insulin resistance and thrombogenesis: recent insights and therapeutic implications
Ren et al. Subcutaneous Administration of a Nitric Oxide-Releasing Nanomatrix Gel Ameliorates Obesity and Insulin Resistance in High-Fat Diet-Induced Obese Mice
San Antonio et al. Heparin sensitive and resistant vascular smooth muscle cells: biology and role in restenosis
Mei et al. Human hepatocyte growth factor inhibits early neointima formation in rabbit abdominal aortae following ultrasound-guided balloon injury
JPWO2002100441A1 (ja) 血管再生療法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
B701 Decision to grant
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140228

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150212

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160122

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180222

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200302

Year of fee payment: 10