KR100950244B1

KR100950244B1 - 바실루스 서브틸리스 광명 바이오 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR100950244B1
Application number: KR1020090001350A
Authority: KR
Inventors: 이인식
Original assignee: 이인식
Priority date: 2009-01-08
Filing date: 2009-01-08
Publication date: 2010-03-31

Abstract

본 발명은 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P)에 관한 것으로, 특히 고추 탄저병을 발병시키는 병원균인 코레토트리쿰(Colletotrichum sp.)에 대하여 강력한 생육 억제 활성을 가지는 대사산물을 생산함으로써 친환경 농자재로 사용하여 고추에 발병하는 탄저병을 감소시킬 수 있으며, 동시에 현재 사용되고 있는 유기합성 농약의 폐해성을 감소시키고, 고추의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 항진균 활성을 가지는 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P) 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

바실루스 서브틸리스 광명 바이오 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis Goung Myoung Bio and uses thereof}

바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(이하, 영문으로 표기함)에 관한 것으로, 특히 고추 탄저병을 발병시키는 병원균인 코레토트리쿰 글레로스포리오디스(Colletotrichum gloeosporioides)에 대하여 강력한 생육 억제 활성을 가지는 대사산물을 생산함으로써 친환경 농자재로 사용하여 고추에 발병하는 탄저병을 감소시킬 수 있으며, 동시에 현재 사용되고 있는 유기합성 농약의 폐해성을 감소시키고, 고추의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 항진균 활성을 가지는 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

고추 탄저병은 고추 역병과 더불어 우리나라 고추 생산에 커다란 저해요인 중의 하나로 5 종의 탄저병이 잎, 줄기, 및 과일에 병을 일으키는데, 주로 성숙한 과일에 발생하는 과일 탄저병에 의한 피해가 95 % 이상으로 가장 피해가 직접적이고 치명적이다.

탄저병은 근래 고추 재배에서 크게 문제가 되고 있으며, 푸른 과실과 붉은 과실에 모두 병을 일으키는 탄저와 주로 붉은 과실에 검은 점이 겹무늬로 생기면서 썩는 흑색 탄저가 있다.

고추 과실에는 몇 가지 다른 탄저병 곰팡이가 병을 일으킨다. 그 중에서도 풋과일과 붉은 과실을 동시에 침해하는 것이 가장 피해가 심하다. 6 월 하순 내지 7 월에 장마가 시작되면 발생하기 시작한다. 처음 과실에 암록색의 오목하게 들어간 점이 생겨 점차 타원형으로 커지면서 병반에 겹무늬 모양으로 황색 내지 등황색의 곱 같은 것(분생포자퇴)이 생긴다. 풋과실에 생기면 병반 주위가 퇴색하고 병반은 회백색으로 되어 점차 검은 색을 띠면서 썩게 된다. 병반이 커지면서 병반 주위는 퇴색하고 과실은 뒤틀려 매우 보기 흉하게 된다. 심한 경우는 풋고추는 물론 붉은 고추가 모두 썩어 내려앉아 큰 피해를 낸다. 흑색탄저는 주로 붉은 과실에 발생하며 붉게 익어가는 과실에 타원형의 검은 점이 오목하게 생기면서 진전되면 병반에 작고 검은 점이 겹무늬를 그리며 형성된다. 이 점은 흑색탄저병균의 분생포자퇴이며 검게 보이는 것은 포자와 함께 형성되는 강모이다. 흑색탄저병은 주로 과실 성숙기에 비와 함께 발생하며 수확 후 후숙과정에 급속도로 번져 희나리가 되게 한다.

탄저병은 Colletotrichum gloeosporioides라는 곰팡이의 침입으로 일어나는데, 이 곰팡이는 불완전 세대로서 자낭을 형성하는 완전세대는 Glomerella cingulate에 편입된다. 이 병균은 풋고추형(strain G)과 붉은고추형(strain R)이 있는 것으로 보고되었으며, 이 중 피해가 큰 것은 풋고추형인 것으로 알려져 있다. 붉은고추형은 병반에 조금의 털이 나기도 하지만, 풋고추형은 없으며 다만 표피조 직을 일으키면서 분생포자퇴가 형성된다.

분생포자는 무색이며, 15∼17×4.5 ㎛ 크기의 긴 타원형이다. 또한, 흑색탄저병은 Colletotrichum dimatium이라는 곰팡이의 침입으로 일어난다. 이 균은 병반에 암갈색의 억세게 생긴 강모와 함께 초생달 모양의 분생포자로 된 포자퇴를 형성하며, 검게 보이는 것은 포자퇴의 강모가 모여 검게 보인다.

상기와 같은 두 가지 탄저병균2모두 종자전염을 할 수 있으며 병든 과실 등에 붙어서 균사와 포자의 형태로 포장하여 월동하여 다음해의 전염원이 된다.

또한, 연작할 경우 전염원의 밀도가 높아져 탄저병이 발생하기 쉽다. 탄저병 발생은 특히 비와 밀접한 관계를 갖고 있는데, 이는 탄저병균의 포자가 비바람을 타고 전파되며 전파된 포자가 발아하여 병을 일으키는데도 수분이 필요하기 때문이다. 그 외에, 밀식하여 통풍이 잘 되지 않을 때 심하게 발생한다.

따라서, 상기 탄저병을 막기 위하여는 예방적 약제 살포가 매우 중요하다. 예방적 약제살포는 장마가 오기 전, 특히 비오기 전에 약제를 분무기의 노즐을 위로 향하게 하여 약이 과실 표면에 골고루 묻도록 살포할 수 있다.

현재, 탄저병을 예방하기 위한 약제로는 프로피수화제 500 배액, 만코지수화제 500 배액, 타로닐수화제 600 배액, 디치수화제 1,000 배액 등이 알려져 있다. 이와같이 대부분 현재 사용되고 있는 농약은 유기합성농약으로 사용량의 증가로 농업생산비 증가는 물론 농약에 의한 환경오염 역시 큰 사회문제로 대두되고 있다.

탄저병은 일단 방제 시기를 놓쳐 온 밭에 퍼지면 방제가 매우 어렵고, 약제를 살포하여 어느 정도 방제를 하였다 하여도 이미 병에 걸린 과실은 품질이 많이 떨어지므로 장마가 오기 전에 약제를 살포하여 과실을 보호하는 것이 매우 중요하다. 특히, 최근에 발생한 탄저병은 어린 풋과실과 붉은과실을 모두 썩게 하므로 일단 방제 시기를 놓치면 결정적인 피해를 입게 된다.

최근 국내에서는 품종에 따라 차이가 있기는 하지만, 평균 30∼40 %의 탄저병 이병율이 나타나며, 심한 경우 발생율이 60∼70 %에 이르러 상품성을 저하시키고 농가 소득에 큰 피해를 입히고 있어, 건전 고추 생산 및 수량감소를 초래하는 피해를 주고 있는 실정이다. 이에 따른 유기합성농약 사용의 증가로 농업생산비의 증가는 물론, 농약에 의한 환경오염 역시 큰 사회문제로 대두되고 있어, 친환경 농자재의 개발은 매우 시급한 실정이다.

한편, 현재 많이 사용되고 있는 유기합성계 농약은 잔류 농약이 토양으로 유입되고 있고, 농약중독증 등의 부작용이 발생되고 있는 실정이다. 특히, 농약 중독의 경우에는 해마다 많은 사람이 생명을 잃고 있으며, 생태계 파괴까지도 유발되고 있어서 환경오염 문제와 더불어 농약의 잔류 독성 문제는 커다란 사회문제로 부각되고 있다.

그러나, 생물체로부터 생산되는 대사산물은 병원균에 대하여만 항균 활성을 나타내고 인간, 가축, 식물 등에는 거의 영향을 끼치지 않으며, 환경에 잔류되지 않는다. 따라서, 미생물을 환경친화적인 친환경 농자재로서의 사용한다면 유기합성계 농약의 대안으로 사용할 수 있을 것이다.

본 발명은 상기한 바와 같은 제반 문제점을 해결하기 위하여 제안된 것으로, 그 목적은 고추 탄저병을 발병시키는 병원균인 Colletotrichum gloeosporioides에 대하여 강력한 생육 억제 활성을 가지는 대사산물을 생산함으로써 친환경 농자재로 사용하여 고추에 발병하는 탄저병을 감소시킬 수 있으며, 동시에 현재 사용되고 있는 유기합성 농약의 폐해성을 감소시키고, 고추의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주를 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 많은 농작물의 성장을 저해하는 탄저균에 대하여 항진균 활성을 가지는 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 또는 이로부터 생산되는 대사산물을 농작물이나 농작재배지에 처리하는 것을 특징으로 한다.

이상에서와 같이 본 발명에 따르면 고추 탄저병을 발병시키는 병원균인 Colletotrichum gloeosporioides에 대하여 강력한 생육 억제 활성을 가지는 대사산물을 생산함으로써 친환경 농자재로 사용하여 고추에 발병하는 탄저병을 감소시킬 수 있으며, 동시에 현재 사용되고 있는 유기합성 농약의 폐해성을 감소시키고, 고추의 상품성 및 생산성을 증대시킬 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 또는 이로부터 생산되는 대사산물을 농작물이나 농작재배지에 처리하는 것을 특징으로 하는 탄저병 방제방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자는 농작물에 탄저병을 발병시키는 병원균, 특히 코레토트리쿰 글레로스포리오디스(Colletotrichum gloeosporioides)의 생육을 억제하는 효과를 나타내는 대사산물을 생산하는 미생물을 찾기 위해 노력한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주는 도 1에 도시된 바와 같이, 농작물에 탄저병을 유발시키는 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 억제하여 탄저병을 방제할 수 있다.

본 발명의 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주는 전국의 산림 및 과수원 재배지에서 채취한 토양으로부터 수집한 시료를 계단 희석하여 pH 6 내지 7로 조정된 육즙한천평판배지에 배양하여 균주를 분리한 후, 상기 분리한 균주들 중 Colletotrichum gloeosporioides에 대한 항균 활성이 가장 좋은 균주를 선별하여 동정한 결과, 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 미생물임을 확인하고, 이 균주를 'Bacillus subtilis Goung Myoung Bio'라 명명하고, 이를 2008년 10월 21일자로 한국미생물보존센터에 기탁하였다(기탁번호: KFCC11431P).

또한, 본 발명은 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 또는 이로부터 생산되는 대사산물을 이용한 농작물 탄저병 방제방법을 제공하는 바, 상기 방제방법은 본 발명의 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 또는 이로부터 생산되는 대사산물을 농작물 재배시 친환경 농자재로 사용하여 농작물이나 농작물 재배지에 살포하면 농작물이 탄저균으로부터 피해를 감소시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 선정 및 분리

전국의 산림 및 과수원 재배지에서 채취한 토양으로부터 수집한 시료를 계단 희석하여 pH 6 내지 7로 조정된 육즙한천평판배지에 도말하여 30℃에서 일정기간 배향한 후, 단일 콜로니(colonies)들을 순수분리하였다.

그 다음, 순수분리된 균주들을 감자도포당평판배지에 접종하여 대치배양에 의하여 Colletotrichum gloeosporioides의 생육을 저해하는 균주를 선별한 후, 그 중 생육저해능력이 가장 큰 균주를 선정하였다.

[실시예 2] Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 동정

선정된 균주의 동정은 형태학적 특성, 16S rDNA 염기서열, API kit 를 조사 하여 실시하였다.

선정된 균주의 형태학적 특성은 nurtrient 평판배지를 이용하여 30℃에서 배양하여 조사하였으며, 그 결과 도 2에 도시된 바와 같이, 콜로니(colonies)는 흰색이며, 표면이 거친(rough) 원형의 형상이었다.

선정된 균주에 대하여 16S rDNA 염기서열에 의한 분석한 결과는 <표-1>에 나타난 바와 같이, Bacillus velezensis의 미생물과 가장 유사성이 높은 것으로 분석되었다.(99%의 상동성을 보임)

<표-1> API Kit 분석결과

선정된 균주의 생리학적 특성은 자동동정 시스템인 API 50CHB kit 를 사용하여 분석한 결과는 <표-2>에 나타난 바와 같이, Bacillus velezensis CR-502 AY603658 의 미생물과 가장 유사성이 높은 것으로 분석되었다.

<표-2> API 50CHB kit 분석결과

상기 <표 1>과 <표-2>에 기재된 광명은 선정된 균주를 나타내는 명칭이다.

상기 생물학적 특성 및 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 선정된 균주는 신규한 미생물임을 확인하였다.

상기 선정된 균주(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio)는 한국미생물보존센터에 기탁하여 미생물 기탁번호 : KFCC11431P, 미생물 명칭 : Bacillus subtilis Goung Myoung Bio를 부여받았다.

[실시예 3] Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 생육

선전된 균주의 적극적 활용을 위하여, 최적의 배양온도 및 pH를 조사하기 위하여 YMB(Yeast extract Malt extract Broth)를 이용하였으며, 실험온도는 20℃ ~ 40℃ 범위 내에서 5℃간격으로 설정하였으며, pH는 4 ~ 8 범위 내에서 1간격으로 설정하여 실험하였다. 생육정도는 스펙트로메터를 이용하였으며, 흡광도 A640에서 실험하였다.

<표-3> 온도 및 pH에 따른 생육

상기 표 3을 통하여, 상기 선정된 균주의 최적 생육온도는 30℃이고, 최적 생육 pH 범위는 6~7임을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 탄저균에 대한 항균활성 및 식물체 생육 촉진 검정

ⅰ) Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 1차 항균활성을 측정을 위해 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

효모추출물 0.3%, malt추출물 0.3%, 포도당 1%를 함유하며, pH 6.8이 되도록 조절한 배지를 사용하였다. 28℃에서 7일간 진탕배양 후 동결건조하여 조추출물을 제조하여 검정하였다.

대상 병원균 배양 배지 내 최종 함유는 1%와 0.5%로 조절하여 수행하였다.

<표-4> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주 추출물의 탄저균에 대한 항균활성

그 결과, 탄저병균에 대한 최종 항균활성은 조추출물 함유량에 따라 최종 방제가는 각각 40.0%와 86.9%로 나타났다.

ⅱ) Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 2차 항균활성을 측정을 위해 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

효모 추출물 0.3%, malt추출물 0.3%, peptone 0.5% 및 포도당 1% 함유하며, pH 6.8로 조절된 배지를 사용하였다. 28℃에서 7일간 진탕배양 후, 대상 병원균의 포자(유주자)를 수확하여 배양 균주와 1:1로 혼합하여 고추 열매에 접종하여 병원 균에 의한 감염을 검정하였으며, 고추 열매는 구입 후 에탄올을 이용하여 표면소독 후 사용하였다. 접종 고추는 25℃에서 7일간 배양 후 이병 여부를 관찰하였다.

그 결과, <표-5>에 나타난 바와 같이, 병원균 단독 처리구의 경우 고추열매에 전체적으로 감염 증상이 나타났으나, 혼용 처리구의 경우 처리 열매 중 15개 열매에 발병이 형성되어 74.1의 억제율을 보였다.

<표-5> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 고추 탄저균 발생 억제 효과

ⅲ) Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 식물체 생육 촉진 효과 검정을 다음과 같은 방법으로 실시하였다.

검정을 위한 균주 배양은 효모 추출물 0.3%, malt 추출물 0.3%, peptone 0.5% 및 포도당 1% 함유하며, pH 6.8로 조절된 배지를 이용하여 균주를 배양하였다. 배양조건은 28℃에서 7일간 진탕배양 후, 고추 정식 1주일후부터 1주일 간격으로 3회 처리하여 조사하였다. 처리방법은 100ml 관주, 2배 및 50배 희석액의 3회 처리로 하였다. 최종 처리 7일 후부터 3회 고추의 초장, 마디 수, 줄기 직경 및 2회에 걸친 착과수를 조사하여 측정하였다. 착과수의 경우 1차 조사 시 모두 수확하여 계수 하였으며, 2차 및 3차 조사도 같은 방법으로 하여 열매의 중복 계수를 배 제하였다. 초장의 경우 관주 처리구에서 가장 긴 것으로 나타났으며, 마디 수 및 줄기직경에 있어서는 처리구간 유의성이 인정되지 않았다. 관주 처리구에서 최종 초장 신장율은 무처리구 대비 약 10%였다.

<표-6> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 고추 생육촉진 효과

<표-7> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주가 고추 착과량에 미치는 효과

<표-7>에 나타난 바와 같이, 착과량의 경우 50배 희석액이 엽면시비 처리구에서 가장 많은 것으로 나타났으며, 3차 조사에서 대조구 대비 약 48%의 착과량이 많은 것으로 나타났다.

상기와 같은 구성을 가진 본 발명의 실시예에 따른 Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주의 사용 실시예로 다음과 같이 제조하여 사용한다.

Bacillus subtilis Goung Myoung Bio 균주가 포함된 부엽토 14 내지 16 중량%, 깻묵 42 내지 46 중량%, 참숯분말 4 내지 6 중량%, 미강 중량%, 물 15중량%, 생우유 4 내지 6 중량%를 각각 분쇄하여 미분화하고 미분화된 분쇄물은 상기 비율로 혼합기에 넣어서 혼합한 다음 상기 혼합물을 28∼30℃되는 미생물 배양실에 넣고 공기를 공급하면서 7일간 퇴적발효하고, 상기 발효물을 직물포대에 20Kg 단위로 담아서 물 500ℓ속에 넣고 25℃에서 15일간 증식시키면서 침전시켜 상등액을 취하여 관수 및 엽면살포용 미생물제제를 얻을 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것으로 상술한 실시예에 한정되지 않으며, 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시예가 가능하다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 사상을 해치지 않는 범위 내에서 당업자에 의한 변형이 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명에서 권리를 청구하는 범위는 상세한 설명의 범위 내로 정해지는 것이 아니라 후술되는 청구범위와 이의 기술적 사상에 의해 한정될 것이다.

도 1은 선정된 균주의 Collectotrichum gloeosporioides에 대한 항진균능 사진

도 2는 선정된 균주의 콜로니 사진

<110> LEE, In Sik <120> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio and uses thereof <130> 001 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 720 <212> DNA <213> Bacillus subtilis Goung Myoung Bio <400> 1 gggcggcgtg ctatacatgc aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60 cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120 accggggcta ataccggatg gttgtctgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180 ggctaccact tacagatcca cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240 aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360 agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420 caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540 aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600 gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660 tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720 720

Claims

고추 탄저균에 대하여 항진균 활성을 가지며, 고추의 초기 생육 및 착과량을 증진시키며, pH 6 내지 7에서 성장 가능한 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P).
제 1 항에 있어서,

상기 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P) 및 허용가능한 부형제를 함유하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P)를 포함하는 토양처리 미생물제제.
제 1 항에 있어서,

상기 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P)의 배양액을 포함한 엽면살포제.
제 1 항에 있어서,

상기 바실루스 서브틸리스 광명 바이오(Bacillus subtilis Goung Myoung Bio) 균주(기탁번호: KFCC11431P)를 포함한 고추 탄저병의 억제 및 방제를 위한 액상살포제.