KR100906237B1

KR100906237B1 - 지황의 Ｃｉｎｎａｍａｔｅ４－Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ을코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR100906237B1
Application number: KR1020070091005A
Authority: KR
Inventors: 윤성중; 최경구; 이화; 박명렬
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2007-09-07
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2009-07-07
Also published as: KR20090025853A

Abstract

본 발명은 제초제 파라콰트(paraquat) 활성 소거 물질인 acteoside의 구성성분인 카페익산(caffeic acid)의 생합성 직전단계를 촉매하는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 cinnamate-4-hydroxylase (C4H)을 코딩하는 유전자에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 본 발명은 지황으로부터 C4H 유전자 2종을 분리하여 효모용 유전자 발현 운반체인 p520에 각각 삽입시켜 발현 재조합체인 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 를 구축하고, 이 두 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 으로 각각 야생형 효모균주인 K804 세포를 형질전환시켜 C4H 유전자 2종의 발현과 그 단백질의 기능을 확인한 내용에 관한 것이다.

지황의 cinnamate-4-hydroxylase 유전자, RgC4H-1, RgC4H-2

Description

지황의 Ｃｉｎｎａｍａｔｅ４－Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ을 코딩하는 유전자{Cinnamate 4-Hydroxylase cDNA Clones from Rehmannia glutinosa}

본 발명은 제초제 파라콰트(paraquat) 활성 소거 물질인 acteoside의 구성성분인 caffeic acid의 생합성 직전단계를 촉매하는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 cinnamate-4-hydroxylase (C4H)을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

제초제의 일종인 파라콰트(paraquat)에 대한 잦은 노출 등의 원인에 의해 식물이 생리적 적응 및 유전적 변화를 통하여 후천적으로 파라콰트(paraquat)의 제초활성에 견디는 성질을 획득하였을 경우 보통 이를 파라콰트(paraquat) 저항성(resistance)이라고 한다. 그러나 파라콰트(paraquat)에 대한 노출 전력이 없는 국내외 지황 수집종 모두는 파라콰트(paraquat) 저항성을 나타내는 식물보다 더 높은 수준의 파라콰트(paraquat)에 대해 견디는 성질을 나타내므로 이를 구분하여 파라콰트(paraquat) 내성(tolerance)이라고 명명하고 있다. 파라콰트(paraquat)은 엽록체나 미토콘드리아에서 활성산소종을 다량으로 생성시키고 생성된 활성산소종이 생체 지질막을 과산화시킴으로서 세포의 괴사를 초래하는 것으로 알려져 있다. 지항에서 분리된 acetoside는 파라콰트(paraquat) 활성 소거 물질로 알려졌다. Acetoside의 주요구성성분은 caffeic acid이고 페닐프로파노이드 경로에서 합성된다. 따라서 지황에서 페닐프로파노이드 경로가 파라콰트(paraquat) 내성 기작에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다.

Cinnamate 4-hydroxylase (C4H, EC 1.14.13.11)는 페닐프로파노이드 경로에서 2번째 단계에 관여하며 trans-cinnamic aicd 가 p-coumaric acid로의 전환을 촉매한다. 생성된 p-coumaic acid는 caffeic acid의 전구물질이며 caffeic acid는 파라콰트(paraquat) 활성 소거 물질인 acteoside의 주요구성성분이다. 따라서 C4H 유전자에 대한 연구는 파라콰트(paraquat) 내성 기작을 밝히는데 있어서 아주 중요하며 제초제 저항성 작물품종의 육성에 아주 유용한 것으로 대두되고 있다.

본 발명은 제초제 파라콰트(paraquat)에 대한 저항성을 나타내는데 관여하는 유전자를 개발하고자 한다.

본 발명은 애기장대의 C4H cDNA를 탐침으로 사용하여 지황의 Cinnamate 4-hydroxylase을 코딩하는 유전자 RgC4H - 1와 RgC4H -2를 분리하고, RgC4H -1 과 RgC4H - 2 를 각각 삽입시킨 재조합 벡터 pYRgC4H-1 과 pYRgC4H -2를 형질전환시킨 효모균주는 RgC4H -1 과 RgC4H -2이 발현되어 trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid로의 전환을 촉진함으로써 C4H 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명의 Cinnamate 4-hydroxylase을 코딩하는 유전자 RgC4H-1 과 RgC4H-2가 trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid으로 전환시켜 다음 단계의 진행에 필요한 기질을 제공하는 역할을 수행하는데 관여하는 것을 확인함으로써 파라콰트(paraquat) 저항성 기작에 참여할 가능성을 제시하였고, 이는 제초제 저항성 작물육종에 매우 유용한 정보를 제공할 수 있다.

본 발명은 제초제 파라콰트(paraquat) 활성 소거 물질인 acteoside의 구성성분인 카페익산(caffeic acid)의 생합성 직전단계를 촉매하는 지황 (Rehmannia glutinosa)의 cinnamate-4-hydroxylase (C4H)을 코딩하는 유전자에 관한 것으로써, 더욱 상세하게는 본 발명은 지황으로부터 C4H 유전자 2종을 분리하여 효모용 유전자 발현 운반체인 p520에 각각 삽입시켜 발현 재조합체인 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H -2 를 구축하고, 이 두 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 으로 각각 야생형 효모균주인 K804 세포를 형질전환시켜 C4H 유전자 2종의 발현과 그 단백질의 기능을 확인한 내용에 관한 것이다.

본 발명인 지황 C4H 유전자는 우리나라에서 재배되고 있는 지황품종인 ‘고려지황’으로부터 분리 되었으며 이 두 종의 C4H 유전자를 기존의 분리된 버베나의 C4H 유전자와 비교해 본 결과, 전체 염기서열에 있어서 각각 73.6%와 74.2% 가 유사함을 알 수 있었다.

본 발명은 지황의 C4H 유전자를 분리하기 위하여 애기장대의 C4H cDNA를 탐침으로 사용하여 지황의 C4H 유전자 cDNA인 RgC4H -1 과 RgC4H - 2 를 분리하는 단계; 상기 분리한 지황의 C4H 유전자 RgC4H -1과 RgC4H-2 의 염기서열과 그로부터 연역된 아미노산의 서열 특성을 분석하는 단계; 상기 지황의 C4H 유전자 RgC4H-1 과 RgC4H - 2 를 효모용 유전자 발현 운반체인 p520에 삽입시켜 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H-2 을 구축하는 단계; 상기 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H -2 을 야생형 효모계통인 K804에 도입하여 형질전환시키는 단계; K804 형질전환체가 생산하는 C4H 활성을 알아보기 위하여 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H -2 을 야생형 효모계통인 K804에 각각 도입하여 형질전환시킨 두 균주를 Chen 등의 방법 [Chen et al., Enzy. Microb. Technol., 38:760-764 (2006)]으로 C4H 활성을 측정하는 단계로 구성 되었다.

본 발명에 따른 C4H 단백질의 범위는 지황으로부터 분리된 서열번호3과 서열번호4로 각각 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호3과 서열번호4로 각각 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호3과 서열번호4로 각각 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid로의 전환을 촉진하여 제초제 내성에 관여하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 C4H 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 C4H 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1과 서열번호2로 각각 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다.

또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1과 서열번호2로 각각의 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(포스피노트리신)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같 은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

상기 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알고 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명 을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법

1. 지황 cDNA 라이브러리(cDNA library) 스크리닝

기본적으로 uni-ZAP cDNA 라이브러리(library) 생합성 키트 (kit) (Stratagene, California, USA)을 사용하여 지황 잎(품종, 고려지황)에서 추출한 mRNA를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 애기장대의 cinnamate 4-hydroxylase cDNA clone(AtC4H)를 탐침으로 사용하여 지황 cDNA 라이브러리 (4x106 pfu)를 검색하여 지황의 cinnamate 4-hydroxylase cDNA clone RgC4H -1 과 RgC4H -2 을 분리하였다.

2 . 지황의 C4H 유전자 RgC4H -1 과 RgC4H -2 염기서열 결정

상기 제1단계에서 분리된 cinnamate 4-hydroxylase cDNA 클론 RgC4H -1과 RgC4H -2 을 lambda Zap II 벡터의 고유 특성을 활용하여 플라스미드 벡터 (pBluscript SK(+)) 클론으로 전환하였다. 염기서열은 벡터에 존재하는 T7 (AATACGACTCACTATAG, 서열번호5) 과 T3 (AATTAACCCTCACTAAAGGG, 서열번호6) 염기서열 결정 프라이머를 이용하여 양쪽 가닥의 염기서열을 염기서열 자동분석기(모델 ABI 3730xl, Macrogen사)로 결정하였다. 결정된 염기서열과 판독틀에 맞는 아미노산 서열을 도 1과 도 2에 표시하였다.

서열의 상동관계는 GenBank에서 DNA 서열에 근거하여 프로그램 BLAST [Altschul et al., Nucleic Acid Res, 25:3389-3402 (1997)]을 사용하여 실행하였고 염기서열과 아미노산 서열 분석은 DNASIS (Hitachi, Yokohama, Japan) 프로그램에 의하여 실행 되였다. 소수성 폴리펩티드, 번역후의 변이 자리, 단백질 2차 구조 등을 예측하기 위하여SIGFIND [Reczko et al., Version 2.10, Leture Note in Computer Science, 2452:60-67 (2002)], SignalP 3.0 [Bendtsen et al., Proteomics, 4:1633-1649 (2004)], NetPhos 2.0 [Chen et al., J. Mol. Biol. 40:247-260 (2007)], NetNGlyc 1.0 [Blom et al., Proteomics, 4:1633-1649 (2004)], WoLFPSORT (http://wolfpsort.seq.cbrc.jp), PREDATOR [Frishman and Argos, Protein Engineering, 9:133-142 (1996)], 그리고 SOPMA [Geourjon and Deleage, Comput. Appl. Biosci., 11:681-684 (1995)] 등 프로그램을 사용하였다. 여러 C4H 서열간의 상동성 분석은 AliBee [Brodsky et al., Biosystems, 30:65-79 (1993)] 프로그램을 사용하여 실행 하였다.

3. RgC4H 발현 재조합체와 효모 세포내로의 형질전환

효모에서 RgC4H-1 과 RgC4H-2의 발현을 위하여 2종의 C4H 유전자의 ORF 서열을 각각 효모용 유전자 발현 운반체인 벡터 p520 [Anamnart et al., Gene, 184:299-306 (1997)]에 삽입하였다. 우선 제한효소 자리를 맞추기 위하여 RgC4H -1 과 RgC4H - 2 의 ORF 서열은 Extaq (Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 PCR로 증폭 되였다. RgC4H -1 유전자에 대하여 사용된 프라이머의 서열은 5’-CGAGGTACCGCTCTTCCAAT-3’(서열번호7)과 5’-CGCAACAAAGTCGACACAAA-3’(서열번호8) 이고 RgC4H -2 유전자에 대하여 사용된 프라이머의 서열은 5’-ATCTGAGGTACCCGACT ACC-3’(서열번호9)과 5’-GAATCACTTGGGATCCCCAT-3’(서열번호10)이다. 증폭된 PCR 산물은 pGEM T-Easy 백터 (Promega, Madison, USA) 에 클로닝하여 서열분석을 의뢰하였다. 확인된 2종의 재조합된 RgC4H 유전자는 각각 Kpn I-Sal I (RgC4H -1) 제한효소 자리와 Kpn I-BamH I (RgC4H -2) 제한효소 자리로 p520 백터에 삽입 되였고 지황 C4H 유전자 재조합 운반체인 pYRgC4H -1, pYRgC4H - 2 를 구축 하였다. pYRgC4H-1, pYRgC4H -2를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 야생형 효모균주 K804 계통에 도입하여 형질전환하여 C4H 활성분석에 제공 하였고 이때 사용한 선택배지는 SD 배지 (0.17 % Yeast nitrogen base without amino acid and ammonium sulfate (AS), 5 % AS, 0.01 % L-leucine, 0.02 % L-tryptophan, 0.02 % L-histidine HCl, 0.02 % uracil, 5 ml 20x Drop-out medium mix를 함유) 에서 트립토판(triptophan)을 제거하여 사용하였다.

4. K804 형질전환체가 생산하는 단백질의 C4H 활성 확인

C4H의 활성 분석은 Chen 등의 방법 [Chen et al., Enzy. Microb. Technol., 38:760-764 (2006)]에 의하여 실시하였다. trans-cinnamic acid 의 최고 흡광도는 278 nm에서 나타나고 p-coumaric acid의 최고 흡광도는 314 nm에서 나타난다. 파장이 320 nm일 때 trans-cinnamic acid는 거의 흡광을 하지 않으며 p-coumaric acid는 높은 흡광을 나타내므로 흡광량 측정을 이용하여 C4H활성을 검출할 수 있다.

야생형 효모균주 K804 계통에 형질전환된 클론 YRgC4H -1 , YRgC4H -2 와 대조구인 K804 계통을 각각 5 ml YPD 배지 (1 % Bacto yeast extract, 2 % Bacto peptone, 0.0075 % adenine hemisulfate, 2 % glucose를 함유)에 접종하여 30C에서 250 rpm으로 24시간 배양하여 OD₆₀₀에서의 측정치가 1.0-1.8이 되도록 하였다. 잘 자란 배양액을 모두 50 ml SD 배지에 다시 접종하여 OD₆₀₀ 측정치가 0.02가 되게 하였다. 250 mM 의 trans-cinnamic acid를 0.5 mM이 되도록 각 배양액에 모두 첨가한 후 30C에서 250 rpm으로 배양하였다. 다음, 시간별로 OD₃₂₀에서 흡광도를 측정하여 C4H 활성을 비교하였다. 시간기준은 2, 10, 20, 25, 그리고 35 시간으로 정하였고 흡광도는 UV-Visible 분광광도계(Shimadzu UV-1601, Japan)로 측정하였다.

실시예 1 : 지황 C4H 유전자의 분리 및 분석

제1단계 : 지황 cDNA library 스크리닝 ( screening )

기본적으로 uni-ZAP cDNA library 생합성 키트 (kit) (Straragene, USA)을 사용하여 지황 잎(품종, 고려지황)에서 추출한 mRNA를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 애기장대의 cinnamate 4-hydroxylase cDNA 클론 인 AtC4H 을 탐침으로 지황 cDNA 라이브러리 (4x10⁶ pfu)를 검색하여 지황의 cinnamate 4-hydroxylase cDNA 클론 RgC4H -1 과 RgC4H -2 을 분리하였다.

제2단계 : 지황의 C4H 유전자 RgC4H -1 과 RgC4H -2 염기서열 결정

상기 제1단계에서 분리된 cinnamate 4-hydroxylase cDNA 클론 RgC4H -1과 RgC4H -2 을 lambda Zap II 벡터의 고유 특성을 활용하여 플라스미드 벡터(pBluscript SK(+)) 클론으로 전환하였다. 염기서열은 벡터에 존재하는 T7과 T3 염기서열 결정 프라이머를 이용하여 양쪽 가닥의 염기서열을 염기서열 자동분석기 (모델 ABI 3730xl, Macrogen사)로 결정하였다. 결정된 염기서열과 판독틀에 맞는 아미노산 서열을 도 1과 도 2에 표시하였다.

지황에서 분리한 C4H 유전자 RgC4H-1 의 염기서열은 1757개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는데, 유전자의 상류와 하류에 각각 31개와 211개로 구성되어 있는 비번역 부위가 있고, 염기서열의 32번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 1515개의 뉴클레티드로 구성된 판독틀(open reading frame, ORF) 부분은 505개의 아미노산으로 구성된 C4H 단백질을 암호화하는 서열로 구성되어 있다. RgC4H-2 의 염기서열은 1773개의 뉴클레오티드로 구성되어 있는데, 유전자의 상류와 하류에 각각 86개와 172개로 구성되어 있는 비번역 부위가 있고, 염기서열의 87번째 뉴클레오티드로부터 시작되는 1515개의 뉴클레티드로 구성된 판독틀 부분은 505개의 아미노산으로 구성된 C4H 단백질을 암호화하는 서열로서 구성되어 있다.

제3단계 : 상기 지황의 C4H 유전자로부터 연역된 아미노산 서열 특성 분석

RgC4H -1 과 RgC4H -2의 염기서열에서 연역된 RgC4H-1 과 RgC4H-2 아미노산 서열은 모두 C4H 에서 전형적으로 발견되는 N-말단측에 존재하는 막관통 α-helix (박스로 표시된 이탤릭체 부분) 과 C-말단측에 존재하는 heme 결합 cysteine (밑줄 친 부분) 영역을 보유하고 있으며 아미노산잔기 306과 307(A₃₀₆-A₃₀₇, 굵은 선 박스) 서열은 지금까지 분리된 모든 C4H 에서 존재하는 영역이다 (도 1, 도 2). RgC4H-1 과 RgC4H-2 의 N-말단측에는 소수성 폴리펩티드를 포함하고 있다. RgC4H-1에서 가상의 신호펩티드 절단자리는 아미노산잔기 28번과 29번 사이, RgC4H-2에서 가상의 신호펩티드 절단자리는 아미노산잔기 24번과 25번 사이에 존재한다. 단백질 구조분석 프로그램 ConPred II[Arai et al., Nucleic Acids Res., 32:390-393 (2004)]를 이용하여 예측한 RgC4H-1 과 RgC4H-2 폴리펩티드의 위상구조(토폴로지)는 양쪽 말단측에 막관통 구역이 존재함을 나타낸다. RgC4H-1 과 RgC4H-2에서 막관통 구역 위치와 아미노산잔기 서열은 완전히 일치하였다. 두 개의 예견된 막관통 영역은 전형적인 나선형 구조로 존재 한다. N-말단측 막관통 나선구조는 대부분 예견된 N-말단측 소수성 폴리펩티드와 겹쳐진다. 하나 혹은 두개의 이런 영역은 닻과 같이 RgC4H-1 과 RgC4H-2 를 소포체에 배치한다. 이와 같이, 두 RgC4H는 다른 C4H처럼 소포체 막에 결합된 단백질임을 알 수 있다 (도 3, 도 4).

실시예 2 : 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H -2 가 도입된 형질전환체의 생산 및 그로부터 발현된 단백질의 C4H 활성 기능의 확인

제1단계 : 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H -2 가 도입된 형질전환체의 생산

지황에서 분리된 2종의 C4H 유전자를 야생형 효모균주 K804에 도입하여 발현시킴으 로서 C4H 활성을 확인하였다.

지황의 C4H 유전자인 RgC4H -1 과 RgC4H -2 을 효모용 유전자 발현 운반체인 벡터 p520 [Anamnart et al., Gene, 184:299-306 (1997)]에 삽입시켜 구축한 지황 C4H 유전자 재조합 운반체 pYRgC4H-1, pYRgC4H-2를 전기천공법(electroporation)을 이용하여 야생형 효모균주 K804 계통에 도입하여 형질전환시킨 후 효모 배양액 YPD배지에 접종하고 trans-cinnamic acid를 첨가 후 시간별로 배양액의 상청액 흡광도를 측정하는 것으로 C4H 활성을 측정하였다.

제2단계 : K804 형질전환체가 생산하는 단백질의 C4H 활성 확인

재조합 벡터 pYRgC4H -1, pYRgC4H - 2 으로 형질전환된 효모세포와 야생형 효모균주 K804 계통을 5 ml YPD배지에 접종하여 30℃에서 OD₆₀₀의 값이 1.0에서 1.8이 되도록 24시간동안 배양하였다. SD 배지 50 ml에 OD₆₀₀의값이 0.02되도록 균을 첨가한 후 trans-cinnamic acid의 농도가 0.5 mM 되도록 첨가하여 시간별로 OD₃₂₀에서 흡광도를 측정하여 C4H 활성을 비교하였다.

pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 로 각각 형질전환된 YRgC4H -1 과 YRgC4H -2 세포는 야생형 효모균 K804 세포보다 본 발명의 DNA 단편에서 발현된 C4H 단백질에 의해 배양 2, 10, 20, 25, 35 시간 후의 p-coumaric acid 농도가 약 5배에서 10배 이상 높게 나타났으며 (도 5) C4H 활성 역시 야생형 효모균 K804 세포보다 현저히 높게 나타났다(도 6).

이러한 형질전환체의 배양 산물에서의 p-coumaric acid 농도의 증가 효과와 그에 따라 C4H 활성이 증가한 결과는 지황에서 분리된 C4H 유전자가 C4H 활성을 나타내며 trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid 로 전환하는 촉매작용을 하는 효소임을 입증하는 증거이다. 따라서 RgC4H-1 과 RgC4H-2는 지황의 C4H 유전자 클론이라 할 수 있다.

도 1은 지황의 C4H -1 유전자의 염기서열과 염기서열부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 2는 지황의 C4H -2 유전자의 염기서열과 염기서열부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3은 지황의 C4H -1 유전자의 염기서열에서 번역된 아미노산 서열의 소수성 폴리펩티드와 막의 토폴로지 결과를 나타낸다.

도 4는 지황의 C4H -2 유전자의 염기서열에서 번역된 아미노산 서열의 소수성 폴리펩티드와 막의 토폴로지 결과를 나타낸다.

도 5는 지황 C4H 유전자 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 로 각각 형질전환된 효모 K804 세포의 유도시간에 따른 p-coumaric acid의 농도를 나타낸다.

도 6은 지황 C4H 유전자 재조합 벡터 pYRgC4H -1 과 pYRgC4H - 2 로 각각 형질전환된 효모 K804 세포의 유도시간에 따른 C4H 활성을 나타낸다.

<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Cinnamate 4-Hydroxylase cDNA Clones from Rehmannia glutinosa <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1757 <212> DNA <213> Rehmannia glutinosa <400> 1 gaattcggca cgaggaacag ctcttccaat catggatctt ctcctcctcg agaagactct 60 tctcggactc ttcttcgcca tagtcatcgc cacactagta tcgaagctac gcggcaaaaa 120 attcaagctt cctccaggcc caatccccgt tccgatattc ggaaattggc tccaggtcgg 180 cgatgatcta aaccaccgca atctcaccga tttcgccaaa aaattcggcg atattttgct 240 cctccgtatg gggcaacgca atttggtcgt cgtctcctcc cccgacctcg ccaaggatgt 300 tctccacact cagggagtcg aattcgggtc ccggacccga aacgtagtgt tcgatatttt 360 caccggaaag gggcaggata tggtgttcac ggtgtacggt gagcactggc gtaagatgcg 420 tcggatcatg acggtgccgt ttttcaccaa caaggtggtt cagaggaacc gcctcggatg 480 ggaggcggag gcctccgccg tggtggagga cgtgaagaag aacccagagg cggcgacgaa 540 tggaattgtg ctgaggagga gattgcagtt gatgatgtac aataatatgt accggattat 600 gttcgacaga aggtttgaga gtgaagatga tcctttgttt ttgaagttaa aggcgttgaa 660 tggagagagg agtcgattgg ctcagagctt tgagtataat tatggtgatt ttattccaat 720 tttgaggccc tttttgagag ggtatctcaa gatctgcaag gaggtgaagg agaagaggtt 780 acagctgttc aaggactatt ttgttgatga gagaaagaag cttgcaagca caaaggcaac 840 cgacaacgat agcctaaaat gtgctattga tcacattctt gaagcccaac agaagggaga 900 gatcaatgag gacaatgttc tttacattgt tgagaacatc aatgttgctg caatcgaaac 960 tactctttgg tcaatcgaat ggggcatcgc ggaattagtc aaccacccgg agatccaaaa 1020 gaagcttaga gacgagatgg acaccatcct cggcccggga gtacaaataa cggagcccga 1080 tacctacaaa ctcccatacc ttcaggcagt gatcaaagaa actcttcgtc ttagaattgc 1140 tatccctctt ttggttcccc acatgaacct ccacgacgcc aagctcggcg gctatgacat 1200 tcccgccgag agcaagatct tggtcaatgc atggtggctc gctaacaacc ctgcaaactg 1260 gaaaaagccc gaggagttca ggcccgagag attcttggaa gaggagtcga aggttgaggc 1320 caatgggaat gacttccgtt atcttccgtt tggcgttggc cggaggagct gccctgggat 1380 tattcttgct ttgccgattc ttggtatcac tttgggacgc ctcgtgcaga atttcgagct 1440 attgcctcct ccgggacagt cgaagatcga cacaactgag aaaggtgggc agttcagtct 1500 gcacattttg aagcactcca ccattgtatt aaagccaagg tctttttgag aaatttcaca 1560 tatttgttga tgatgtaata atgcttttat aggattcagt attttgtttt gtttccactt 1620 tgttgcgact gaatctttgg atttgctgga aaaatctcta tttgtatctc ttgctttttt 1680 ttttcttttc ttttatatga aatataattg acctatgaaa ttggggtgat tgttcaaaaa 1740 aaaaaaaaaa aaaaaaa 1757 <210> 2 <211> 1773 <212> DNA <213> Rehmannia glutinosa <400> 2 gaattcggca cgaggccaac caccatttac ccaacatctc tccgccttca accaccgcca 60 tttccatctg agtggcccga ctaccgatgg atcttctcct tgtcgagaag acccttattg 120 gtctcttcct cgccatcgtt gtcgccaccg ttgtttctaa gctacgcggc aaaaaattca 180 agctcccccc gggaccaatt cctgttccga tattcgggaa ctggctccaa gtcggtgatg 240 acttgaacca ccgcaatctc accgattacg cgaagaaatt cggtgacata ttgctgctcc 300 gaatggggca gcgcaacctc gtcgtcgtct cctcgccgga cctcgccaag gaagtgctcc 360 acacgcaggg ggtggagttc gggtcccgca cacggaacgt cgtgttcgat attttcaccg 420 gaaaagggca ggatatggtg ttcacggttt acggagagca ctggcggaag atgcgccgga 480 tcatgacggt gccgtttttc accaataagg tggttcagca gtaccgccac gggtgggagg 540 ctgaggccgc cgccgtggtg gaggatgtga agaaaaatcc tgaatcggca accaatggga 600 ttgtgctgag gaggagactg cagctgatga tgtacaataa tatgtacagg attatgtttg 660 ataaaaggtt tgagagtgag gatgatcccc tgtttgtgaa gctcagggct ttgaatgggg 720 agaggagcag gttggcgcag agctttgaat ataattatgg tgattttatc cccattttga 780 ggcctttctt aaaagggtat ctcaagatct gcaaagaggt gaaagataag aggctacaac 840 tgttcaagga ttattttgtc gatgagagaa agaagcttgc aagcacaaag ccaatggaca 900 atgatggcct aaaatgtgcc atcgatcaca ttcttgaagc ccagcaaaag ggagagatca 960 atgaggacaa tgtcctatac attgttgaga acattaatgt tgcagcaatt gaaacaacac 1020 tttggtcaat cgagtggggt attgccgaac tagtcaacca cccgaagatc cagaaaaagc 1080 tccgagcgga gatcgacaca gttcttggcg tgggagtacc aataacagag cctgataccc 1140 acaagctccc ataccttcaa gcagtgatca aagaaactct tcgccttaga atggccattc 1200 cgcttttagt gccccacatg aacctccacg atgccaagct aggcagctat gacattcccg 1260 cggagagcaa gatcttggtc aacgcgtggt ggttggctaa caatccttca cactggaaga 1320 aacctgagga gttcagaccg gagagattct tggaagagga gtctaaggtt gaggccaatg 1380 gcaacgactt ccgatatctg ccgtttggtg tcggcaggag aagctgtccc ggaattattc 1440 ttgcgttgcc gattcttggt atcacgttgg ggcggttggt gcagaatttt gagatgttgc 1500 cgcctcctgg gcaatcaaag ctggacacta ccgagaaagg cgggcaattc agtctgcata 1560 ttttgaagca ctccaccatt gtgttgaagc cacgatctgt ttgagatttt atttatttgg 1620 tgactttata atggggatgt caagtgattc catgtttttt tactacgtgt gtgattgaat 1680 cttaggattt tacttaaaac atctctttgt aaatctgttt ctcgggtttg tatcaaatat 1740 gaaagttaag tggtatttca aacaagaaaa aaa 1773 <210> 3 <211> 505 <212> PRT <213> Rehmannia glutinosa <400> 3 Met Asp Leu Leu Leu Leu Glu Lys Thr Leu Leu Gly Leu Phe Phe Ala 1 5 10 15 Ile Val Ile Ala Thr Leu Val Ser Lys Leu Arg Gly Lys Lys Phe Lys 20 25 30 Leu Pro Pro Gly Pro Ile Pro Val Pro Ile Phe Gly Asn Trp Leu Gln 35 40 45 Val Gly Asp Asp Leu Asn His Arg Asn Leu Thr Asp Phe Ala Lys Lys 50 55 60 Phe Gly Asp Ile Leu Leu Leu Arg Met Gly Gln Arg Asn Leu Val Val 65 70 75 80 Val Ser Ser Pro Asp Leu Ala Lys Asp Val Leu His Thr Gln Gly Val 85 90 95 Glu Phe Gly Ser Arg Thr Arg Asn Val Val Phe Asp Ile Phe Thr Gly 100 105 110 Lys Gly Gln Asp Met Val Phe Thr Val Tyr Gly Glu His Trp Arg Lys 115 120 125 Met Arg Arg Ile Met Thr Val Pro Phe Phe Thr Asn Lys Val Val Gln 130 135 140 Arg Asn Arg Leu Gly Trp Glu Ala Glu Ala Ser Ala Val Val Glu Asp 145 150 155 160 Val Lys Lys Asn Pro Glu Ala Ala Thr Asn Gly Ile Val Leu Arg Arg 165 170 175 Arg Leu Gln Leu Met Met Tyr Asn Asn Met Tyr Arg Ile Met Phe Asp 180 185 190 Arg Arg Phe Glu Ser Glu Asp Asp Pro Leu Phe Leu Lys Leu Lys Ala 195 200 205 Leu Asn Gly Glu Arg Ser Arg Leu Ala Gln Ser Phe Glu Tyr Asn Tyr 210 215 220 Gly Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Pro Phe Leu Arg Gly Tyr Leu Lys 225 230 235 240 Ile Cys Lys Glu Val Lys Glu Lys Arg Leu Gln Leu Phe Lys Asp Tyr 245 250 255 Phe Val Asp Glu Arg Lys Lys Leu Ala Ser Thr Lys Ala Thr Asp Asn 260 265 270 Asp Ser Leu Lys Cys Ala Ile Asp His Ile Leu Glu Ala Gln Gln Lys 275 280 285 Gly Glu Ile Asn Glu Asp Asn Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn 290 295 300 Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr Leu Trp Ser Ile Glu Trp Gly Ile Ala 305 310 315 320 Glu Leu Val Asn His Pro Glu Ile Gln Lys Lys Leu Arg Asp Glu Met 325 330 335 Asp Thr Ile Leu Gly Pro Gly Val Gln Ile Thr Glu Pro Asp Thr Tyr 340 345 350 Lys Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Arg 355 360 365 Ile Ala Ile Pro Leu Leu Val Pro His Met Asn Leu His Asp Ala Lys 370 375 380 Leu Gly Gly Tyr Asp Ile Pro Ala Glu Ser Lys Ile Leu Val Asn Ala 385 390 395 400 Trp Trp Leu Ala Asn Asn Pro Ala Asn Trp Lys Lys Pro Glu Glu Phe 405 410 415 Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Glu Ser Lys Val Glu Ala Asn Gly 420 425 430 Asn Asp Phe Arg Tyr Leu Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro 435 440 445 Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro Ile Leu Gly Ile Thr Leu Gly Arg Leu 450 455 460 Val Gln Asn Phe Glu Leu Leu Pro Pro Pro Gly Gln Ser Lys Ile Asp 465 470 475 480 Thr Thr Glu Lys Gly Gly Gln Phe Ser Leu His Ile Leu Lys His Ser 485 490 495 Thr Ile Val Leu Lys Pro Arg Ser Phe 500 505 <210> 4 <211> 505 <212> PRT <213> Rehmannia glutinosa <400> 4 Met Asp Leu Leu Leu 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Ser Phe Glu Tyr Asn Tyr 210 215 220 Gly Asp Phe Ile Pro Ile Leu Arg Pro Phe Leu Lys Gly Tyr Leu Lys 225 230 235 240 Ile Cys Lys Glu Val Lys Asp Lys Arg Leu Gln Leu Phe Lys Asp Tyr 245 250 255 Phe Val Asp Glu Arg Lys Lys Leu Ala Ser Thr Lys Pro Met Asp Asn 260 265 270 Asp Gly Leu Lys Cys Ala Ile Asp His Ile Leu Glu Ala Gln Gln Lys 275 280 285 Gly Glu Ile Asn Glu Asp Asn Val Leu Tyr Ile Val Glu Asn Ile Asn 290 295 300 Val Ala Ala Ile Glu Thr Thr Leu Trp Ser Ile Glu Trp Gly Ile Ala 305 310 315 320 Glu Leu Val Asn His Pro Lys Ile Gln Lys Lys Leu Arg Ala Glu Ile 325 330 335 Asp Thr Val Leu Gly Val Gly Val Pro Ile Thr Glu Pro Asp Thr His 340 345 350 Lys Leu Pro Tyr Leu Gln Ala Val Ile Lys Glu Thr Leu Arg Leu Arg 355 360 365 Met Ala Ile Pro Leu Leu Val Pro His Met Asn Leu His Asp Ala Lys 370 375 380 Leu Gly Ser Tyr Asp Ile Pro Ala Glu Ser Lys Ile Leu Val Asn Ala 385 390 395 400 Trp Trp Leu Ala Asn Asn Pro Ser His Trp Lys Lys Pro Glu Glu Phe 405 410 415 Arg Pro Glu Arg Phe Leu Glu Glu Glu Ser Lys Val Glu Ala Asn Gly 420 425 430 Asn Asp Phe Arg Tyr Leu Pro Phe Gly Val Gly Arg Arg Ser Cys Pro 435 440 445 Gly Ile Ile Leu Ala Leu Pro Ile Leu Gly Ile Thr Leu Gly Arg Leu 450 455 460 Val Gln Asn Phe Glu Met Leu Pro Pro Pro Gly Gln Ser Lys Leu Asp 465 470 475 480 Thr Thr Glu Lys Gly Gly Gln Phe Ser Leu His Ile Leu Lys His Ser 485 490 495 Thr Ile Val Leu Lys Pro Arg Ser Val 500 505 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aatacgactc actatag 17 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 aattaaccct cactaaaggg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgaggtaccg ctcttccaat 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cgcaacaaag tcgacacaaa 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atctgaggta cccgactacc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gaatcacttg ggatccccat 20

Claims

서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid로의 전환을 촉진하여 제초제 내성에 관여하는 지황 유래의 RgC4H(Rehmannia glutinosa Cinnamate 4-Hydroxylase)-1 단백질.
서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진, trans-cinnamic acid를 p-coumaric acid로의 전환을 촉진하여 제초제 내성에 관여하는 지황 유래의 RgC4H(Rehmannia glutinosa Cinnamate 4-Hydroxylase)-2 단백질.
제1항의 RgC4H-1 단백질을 코딩하는 유전자.
제2항의 RgC4H-2 단백질을 코딩하는 유전자.
제3항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제4항에 있어서, 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제6항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제7항의 재조합 벡터로 형질전환된 효모.
제8항의 재조합 벡터로 형질전환된 효모.