KR100893788B1

KR100893788B1 - 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을고순도로 정제하는 방법

Info

Publication number: KR100893788B1
Application number: KR1020070102603A
Authority: KR
Inventors: 김복희; 이상화; 이근복
Original assignee: 서원대학교산학협력단; (주)미모아
Priority date: 2007-10-11
Filing date: 2007-10-11
Publication date: 2009-04-20
Also published as: KR20090037132A

Abstract

본 발명은 레스베라트롤을 함유하는 포도 송이 가지의 추출액을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 획득하는 단계(a); 상기 분획물을 실리카겔에 흡착시키고 건조시키는 단계(b); 및, 건조 후, 실리카겔에 n-헥산과 에틸아세테이트로 조성되는 용출 용매를 흘리면서 흡착되어 있는 레스베라트롤을 용출시키는 단계(c);를 포함하는 것을 특징으로 하는 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것으로, 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 99%이상의 순도로 정제할 수 있다.

포도 송이 가지, 레스베라트롤, 고순도, 정제

Description

포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 고순도로 정제하는 방법{Method for purification of resveratrol from extract of grape twig}

본 발명은 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다.

레스베라트롤(resveratrol; trans-3,5,4-trihydroxystilbene; 도 1 참조)은 스틸벤 계열의 물질로서 야채 및 과일류 식물(소나무, 땅콩, 포도나무 등)에서 합성되는 물질이며, 식물체가 악천 후나 곤충 및 짐승으로부터의 공격, 미생물에 의한 감염 등의 다양한 환경적 스트레스에 대응하여 생성하는 식물 면역물질 일종으로서 포도, 오디, 땅콩, 전나무, 소나무, 유칼립투스, 백합, 작약 등의 다양한 식물에 존재한다.

레스베라트롤은 지방 과산화 억제 및 자유라디칼(free radical) 소거 기능과 같은 항산화 작용, 시클로옥시지나아제(cyclooxygenase) 저해 등의 항염증작용, 암세포에 직결되는 자유 라디칼(free radical)에 의한 피해를 완충시켜 암세포 성장 억제 및 암 예방에 효능을 발휘하는 등의 다양한 생리 활성을 지니고 있으며, 저밀도 지방단백질 콜레스테롤(LDL-cholesterol)을 감소시키는 효과도 탁월한 것으로 알려져 있다. 또한, 최근 트랜스-레스베라트롤은 여성호르몬 에스트로겐 유사작용을 하는 것으로 밝혀져 피토에스트로겐으로서 각광받고 있다.

항산화 물질로 알려진 레스베라트롤은 암 예방물질로 적포도주가 콜레스테롤 수치를 낮추어 주는데 기여한다고 알려져 있고, 이를 분리 정제하여 고부가가치의 기능성 식품 및 향장용품 재료로 사용하고자 하는 노력이 많이 있어 왔다.

한편, 포도는 건강에 미치는 유익한 물질 즉, 전화당을 비롯한 유기산과 미네랄, 탄닌, 각종 비타민 등을 함유하고 있다. 또한, 인체에 기능성을 주는 물질로 포도 과피에 플라보노이드계 식물화학 성분인 안토시아닌류를 함유하고 있다.

우리나라에서 포도는 충북의 남부권(영동, 옥천 등) 특산물로 널리 재배되고 있는 과실로 포도 재배면적은 2,466 ha로 전국 재배 면적의 10% 이상을 차지하고 있다. 재배되는 포도의 종류로는 캠벨(Campbell)종이 대부분이며, 레스베라트롤의 함량은 과육에 비하여 버려지는 포도의 부산물인 포도 송이가지에 가장 많이 함유되어 있다고 알려져 있다.

포도 송이 가지는 포도알이 달려있는 가지 부분으로 포도나무와 직접 연결되어 있는 포도 가지와는 다른 부위이며, 포도 송이 가지에 함유되어 있는 레스베라트롤의 함량은 과피에 비해 34~55배나 많고, 씨에 비해서는 43~73배나 많다.

이에 포도 송이 가지로부터 레스베라트롤을 추출하기 위한 노력이 종래에 많이 있어 왔는데, 이와 관련된 특허기술로는 포도 송이 가지로부터의 초음파를 가한 에탄올 추출에 의해 레스베라트롤을 대량 추출하는 방법(대한민국 특허등록 10-0511802)이 있다.

그러나, 상기의 특허에 기재된 방법은 레스베라트롤을 대량 추출하기 위한 방법에 관한 것으로, 레스베라트롤 함유 추출물로부터 레스베라트롤을 고순도로 정제하는 방법에 대해서는 개시된 바 없다.

이에 본 발명은 포도 송이 가지의 추출액으로부터 고순도로 레스베라트롤을 정제할 수 있는 방법을 제공하는데 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 80~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 사용하여, 35~45℃에서 초음파를 가하여 추출한 포도 송이 가지의 추출액을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 획득하는 단계(a); 상기 분획물을 농축하고, 메탄올에 녹인 후, 실리카겔에 코팅시키고, 건조시키는 단계(b); 및, 건조된 실리카겔을 오픈 컬럼에 로딩하고, n-헥산과 에틸아세테이트의 비율이 8:3의 부피비로 이루어진 용매를 흘려 보내 비극성도가 레스베라트롤보다 높은 불순물을 먼저 용출시켜 제거하고, 그 후 n-헥산과 에틸아세테이트의 비율이 8:5의 부피비로 이루어진 용매를 흘려 레스베라트롤이 포함된 용출물을 수득하는 단계(c); 상기 레스베라트롤이 포함된 용출물을 농축한 후, 메탄올을 가하여 녹이고, 실리카겔에 코팅시키는 단계(c-1); 코팅된 실리카겔을 오픈 컬럼에 충진하고, 35% 에틸아세테이트-헥산용액(35% EtOAc in Hexane)을 30분 동안 먼저 흘려주고, 이어 40% 에틸아세테이트-헥산용액(40% EtOAc in Hexane)를 1시간 흘려줌으로써 레스베라트롤보다 비극성도가 높은 불순물을 제거하고, 57% 에틸아세테이트-헥산용액(57% EtOAc in Hexane)를 흘려 레스베라트롤이 함유된 용출물을 수득하는 단계(c-2);를 포함하는 것을 특징으로 하는 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 정제하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 수단을 각 단계별로 상세히 설명하고자 한다.

단계 (a); 포도 송이 가지의 추출액으로부터 에틸아세테이트 분획물의 획득

단계 (a)는 레스베라트롤을 함유하는 포도 송이 가지의 추출액을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 획득하는 단계이다.

본 발명은 추출액에 함유되어 있는 레스베라트롤을 고순도로 정제하는데 목적이 있기 때문에 포도 송이 가지의 추출액은 공지의 추출방법을 통해 회수된 추출액이라면 어느 것을 사용하여도 무방하며 특정의 추출방법에 의해 추출된 추출물로 만 한정되는 것은 아니다. 다만, 바람직하게 상기 추출액은 에탄올 추출물인 것이 좋은데, 레스베라트롤을 포도 송이 가지로부터 고농도로 추출할 수 있기 때문이다. 더욱 바람직하게 상기 에탄올 추출은 80~100%(v/v) 에탄올-수용액(다만, 에탄올이 100%인 경우는 수용액이 아님)을 사용하여 35~45℃의 온도에서 초음파를 가하여 추출하는 것이 좋다.

한편, 본 단계 (a)에서는 분획물을 획득하기 위해 용매로 에틸아세테이트(ethylacetate)를 사용한다. 에틸아세테이트는 화학식이 C₄H₈O₂ 이며, 물, 알코올, 유기용매에 녹고 용해도는 높은 온도보다 낮은 온도에서 높은 약한 비극성의 용매로, 본 발명에서는 포도에 함유된 레스베라트롤을 포함한 비극성 물질들을 분획하는 역할을 한다.

단계 (b); 단계 (a) 분획물을 실리카켈에 흡착, 건조

단계 (b)는 상기 (a)에서 수득된 분획물을 실리카겔에 흡착시키고 건조시키는 단계이다.

본 발명에서 사용되는 실리카겔은 SiO₂·nH₂O의 화학식을 가지며, 규산 나트륨(sodium silicate)과 황산과의 반응에서 유도된 무정형(amorphous form)물질로 반응성이 적고 극성을 띠며 흡수성이 강하다. 본 발명에서는 실리카겔에 단계 (a)의 분획물을 흡착시키고 건조시키는데, 레스베라트롤을 포함한 비극성 물질들은 실리카겔에 단순 흡착되어 있고, 본 발명의 정제 과정에서 제거되어야 할 극성물질들 은 극성을 띠는 실리카겔에 극성결합되어 있다.

한편, 바람직하게 상기 단계 (a)에서 획득한 분획물은 실리카겔에 흡착시키기 전에 농축을 하고 메탄올에 녹인 후, 실리카겔에 흡착시키는 것이 좋다. 휘발성이 높은 메탄올에 녹임으로써 실리카겔에 대한 흡착성을 증대시킬 수 있기 때문이다.

단계 (c); 단계 (b)에 용출 용매를 흘려 레스베라트롤을 용출

단계 (c)는 건조 후, 실리카겔에 n-헥산과 에틸아세테이트로 조성되는 용출 용매를 흘리면서 흡착되어 있는 레스베라트롤을 용출시키는 단계이다.

n-헥산(n-hexane)은 탄소수 6개의 알케인 탄화수소로 5종의 이성질체가 있으며 분자량 86.2, 녹는점 －94℃, 끓는점 69℃이다. 물에는 녹지 않고 에테르·클로로포름에 녹는 강한 비극성으로 무색·투명하고 안정한 휘발성 액체로 약한 냄새가 난다.

에틸아세테이트는 상기 단계 (a)에서 이미 설명하였으므로, 그 설명은 생략하기로 한다.

한편, 본 단계에서 사용되는 용출 수단(device)은 용출 용매를 흘리면서 레스베라트롤을 용출시킬 수 있는 것이라면 어느 수단을 사용하여도 무방하나, 바람직하게 오픈컬럼(open column)을 사용하는 것이 좋다. 오픈컬럼에 실리카겔을 충진한 후, n-헥산과 에틸아세테이트로 조성된 용출 용매를 흘리면 실리카겔에 흡착되어 있는 레스베라트롤이 용출된다.

한편, 바람직하게 비극성도를 다양하게 하기 위해 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합 비율을 변화하면서 사용하는 것이 좋다. 강한 비극성 용매인 n-헥산(n-hexane)과 상기 단계 (a)에서 언급한 약한 비극성 용매인 에틸아세테이트의 혼합 비율을 변화하면서 단계 (b)의 실리카켈이 충진된 오픈컬럼에 흘려 보내면, 비극성인 레스베라트롤은 두 비극성 용매의 혼합 비율이 적정한 분획을 통해 그 조성의 용매와 함께 용출되어 고순도로 정제된다.

이상 상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 포도 송이 가지로부터 고순도 레스베라트롤을 정제하는 방법은 레스베라트롤을 99% 이상의 고순도로 정제할 수 있다.

본 발명에서의 방법을 통해 고순도로 정제된 레스베라트롤은 식품에 기능성 성분으로 첨가할 경우, 고순도 및 고농도로 농축되었기 때문에 레스베라트롤 첨가의 효능(레스베라트롤의 기능성)을 극대화할 수 있으며, 레스베라트롤 외의 부산물이 존재하지 않음으로 말미암아 대상 식품의 고유 적성을 해치지 않으면서 레스베라트롤을 많이 첨가할 수 있는 특징이 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 이와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

< 제조예 1> 포도 송이 가지로부터 레스베라트롤 함유 추출액 제조

80% 에탄올 2.4 L에 포도 송이 가지 파쇄물 240 g을 혼합한 후, 초음파 추출(40℃, 1 h)을 2회 실시하여 포도 송이 가지로부터 레스베라트롤을 함유한 추출액을 제조하였다.

< 실시예 1> 제조예 1에서 제조한 레스베라트롤 함유 추출액으로부터 고순도 레스베라트롤 정제

제조예 1에서 제조한 레스베라트롤을 함유하는 포도 송이 가지의 추출액을 4000rpm에서 15분 원심분리한 후, 상등액을 취했다. 취한 상등액에서 물과 에탄올을 완전 휘발하고 얻어진 분말을 증류수에 녹여 에틸아세테이트(ethylacetate)로 분획한 후 농축하였다. 이 농축물에 메탄올을 가하여 녹인 후, 실리카겔에 코팅하였고, 코팅양은 로딩할 시료양의 1.2배에서 1.5배로 하였으며, 농축기에는 압을 가하지 않고 80℃에서 메탄올을 증발시켰다. 그 후 코팅된 실리카겔 19.39g을 오픈컬럼(open column)에 분말형태로 로딩하고, 헥산(Hexane)과 에틸아세테이트(EtOAc)의 비율이 8:3(v/v)로 이루어진 용매를 3시간 정도(4L 정도) 흘려 보내 비극성도가 레스베라트롤보다 높은 불순물들을 용출시켜 제거하였다. 그 후, 헥산과 에틸아세테이트의 비율이 8:5(v/v)로 이루어진 용매를 흘려 레스베라트롤이 포함된 용출물 250mL을 회수하였다.

레스베라트롤이 포함된 이 용출물을 농축한 후, 메탄올을 가하여 녹이고, 이를 이용하여 실리카겔을 코팅시켰다. 코팅된 실리카겔을 오픈컬럼에 충진하고 prep-HPLC로 레스베라트롤이 포함된 용출물을 수득하였다. 이때, 유속(Flow rate)은 5mL/min으로 하였고, 먼저 35%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(35% EtOAc in Hexane)을 30분 동안 흘려주고, 이어 40%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(40% EtOAc in Hexane)를 1시간 흘려줌으로써 레스베라트롤보다 비극성도가 비교적 높은 불순물을 제거하고, 57%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(57% EtOAc in Hexane)를 흘려 레스베라트롤이 고순도로 함유된 용출물 25mL을 수득하였다.

이렇게 수득된 용출물 중 레스베라트롤의 함량은 HPLC로 분석한 결과, 순도 99% 이상을 나타냈다.

이상의 결과는 본 발명의 방법에 의해 포도 송이 가지 추출액으로부터 레스베라트롤을 고순도로 정제할 수 있음을 의미한다.

< 제품예 1> 실시예 1에서 정제한 레스베라트롤을 첨가한 포도즙의 제조

상기 실시예 1에서 정제된 고순도 레스베라트롤 1ppm, 5ppm, 10ppm을 첨가한포도즙과 정제하지 않은 80% 에탄올 포도 송이 가지 추출물 1ppm 첨가한 포도즙을 일반 포도즙(대조군)과의 유의적 차이를 검정하기 위해 비 훈련된 패널 21명을 대상으로 관능평가 후, SAS프로그램을 통해 통계 분석하였다.

고순도 레스베라트롤 1ppm, 5ppm, 10ppm 첨가한 제품과 정제하지 않은 80% 에탄올 포도 송이 가지 추출물 1ppm을 첨가한 제품을 레스베라트롤을 첨가하지 않 은 일반 포도즙(대조군)을 비교하여 색도와 당도를 측정하였다. 색도는 색차계를 이용하여 각각의 명도(L) 값, 적색도(a) 값, 황색도(b) 값을 확인하였다(표 1).

레스베라트롤의 농도 (ppm)		당도 (Brix)	색도
레스베라트롤의 농도 (ppm)		당도 (Brix)	명도(L)	적색도(a)	황색도(b)
정제된 레스베라트롤	1	13.5	7.26	18.94	-3.32
	5		6.77	18.51	-4.73
	10		6.16	18.91	-4.73
정제되지 않은 레스베라트롤	1		7.26	18.94	-3.32
일반 포도즙	-		6.60	18.91	-4.74

일반포도즙에 비해 정제된 레스베라트롤을 첨가한 제품의 명도(L) 값은 증가하였지만 적색도(a) 값과 황색도(b) 값은 미미한 차이를 보였다.

따라서 본 발명으로부터 정제된 고순도 레스베라트롤을 첨가하였을 경우, 포도즙의 색도와 당도에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.

본 발명으로부터 정제된 고순도 레스베라트롤 1ppm, 5ppm, 10ppm를 첨가한 포도즙과 80% 에탄올만으로 추출한 추출물 1ppm을 첨가한 포도즙, 그리고 추출물을 포함하지 않은 일반포도즙(대조군)의 관능평가 결과는 하기 표2 같았다.

	1ppm	5ppm	10ppm	일반포도즙	정제되지 않은 레스베라트롤	F-Value
색	4.90±1.00	4.86±1.24	5.00±1.10	4.62±1.40	4.48±1.44	0.64
냄새	4.67±1.39	5.10±1.34	4.48±1.40	4.14±1.42	4.38±1.47	1.36
맛	5.00±1.48	5.05±1.43	4.81±1.33	4.86±1.46	1.86±1.39	19.78
전반적 기호도	5.48±1.29	5.48±1.29	5.57±1.12	3.81±1.33	2.43±1.57	23.29

상기 표 2에서와 같이, 정제된 고순도 레스베라트롤을 첨가한 포도즙은 색과 냄새항목에 있어서 다른 시료들과의 유의적 차이가 없었다.

맛 항목에 있어서 정제되지 않은 레스베라트롤 추출물 1ppm을 첨가한 포도즙은 쓴맛이 강조되어 가장 낮은 점수를 받은 것과는 달리, 본 발명으로부터 정제된 고순도 레스베라트롤 5ppm을 첨가한 포도즙은 가장 높은 점수를 보였다. 또한, 전반적인 기호도에 있어서 에탄올 추출 레스베라트롤 1ppm을 첨가한 포도즙이 가장 낮은 점수를 보인 것에 반해, 본 발명에서 정제된 고순도 레스베라트롤 1ppm, 5ppm, 10ppm을 첨가한 포도즙은 모두 높은 점수를 보였다. 특히, 10ppm을 첨가한 포도즙이 5.57로 가장 높은 기호도를 보였다.

따라서 표 1과 표 2를 살펴본 결과, 본 발명에서 고순도로 정제된 레스베라트롤을 식품에 첨가할 경우, 제품의 물성을 훼손하지 않으면서 식품의 품질 적성을 유지하고, 맛을 좋게 한다.

도 1은 레스베라트롤의 구조이다.

Claims

80~100%(v/v) 에탄올을 추출용매로 사용하여, 35~45℃에서 초음파를 가하여 추출한 포도 송이 가지의 추출액을 에틸아세테이트로 분획하여 분획물을 획득하는 단계(a);

상기 분획물을 농축하고, 메탄올에 녹인 후, 실리카겔에 코팅시키고, 건조시키는 단계(b); 및,

건조된 실리카겔을 오픈 컬럼에 로딩하고, n-헥산과 에틸아세테이트의 비율이 8:3의 부피비로 이루어진 용매를 흘려 보내 비극성도가 레스베라트롤보다 높은 불순물을 먼저 용출시켜 제거하고, 그 후 n-헥산과 에틸아세테이트의 비율이 8:5의 부피비로 이루어진 용매를 흘려 레스베라트롤이 포함된 용출물을 수득하는 단계(c);

상기 레스베라트롤이 포함된 용출물을 농축한 후, 메탄올을 가하여 녹이고, 실리카겔에 코팅시키는 단계(c-1);

코팅된 실리카겔을 오픈 컬럼에 충진하고, 35%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(35% EtOAc in Hexane)을 30분 동안 먼저 흘려주고, 이어 40%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(40% EtOAc in Hexane)를 1시간 흘려줌으로써 레스베라트롤보다 비극성도가 높은 불순물을 제거하고, 57%(v/v) 에틸아세테이트-헥산용액(57% EtOAc in Hexane)를 흘려 레스베라트롤이 함유된 용출물을 수득하는 단계(c-2);를 포함하는 것을 특징으로 하는 포도 송이 가지의 추출액으로부터 레스베라트롤을 정제하는 방법
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