KR100893566B1 - Ｃｋｓ１ｂ ＲＮＡｉ를 함유하는 항암용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Cks1b 유전자의 발현이 암세포의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성에 대한 지표인 사실에 기초하여, Cks1b 유전자를 녹다운시킨 Cks1b RNAi를 함유하는 항암용 조성물 및 항암용 재조합 벡터에 관한 것이다.

Cks1b, 렌티바이러스벡터, 녹다운, IL8, OPN, 항암, RNAi, 간세포암, 간암

Description

Ｃｋｓ１ｂ ＲＮＡｉ를 함유하는 항암용 조성물 {An Anticancer Composition compriging Cks1b RNAi}

도 1은 인간 간세포암종(HCC) 조직에서 발현된 Cks1b의 노던 블럿 분석 결과이다.

도 2는 인간 HCC 세포주에서의 Cks1b 발현의 노던 블럿 분석 결과이다.

도 3a는 HCC 세포에서의 Cks1b 렌티바이러스 발현 벡터의 도식(도3a-1) 및 Cks1b 발현의 노던 블럿 분석 결과(도3a-2)이고, 도 3b는 체외(in vitro) 증식에 있어서의 Cks1b 발현 효과에 대한 그래프이다.

도 4a는 타겟 I 및 III에 대한 shRNA 서열(도4 a-1) 및 Cks1b의 녹다운에 대한 노던 블럿 분석 결과(도4a-2)이고, 도 4b는 체외(in vitro) 증식에 있어서의 Cks1b 발현 효과에 대한 그래프이며, 도 4c는 세포주기에서의 Cks1b 발현 효과에 대한 유세포 분석 그래프이다.

도 5a는 Chang liver 세포에서 Cks1b의 렌티바이러스 RNAi(RNA 간섭 또는 RNA 녹다운)에 의한 웨스턴 블럿 분석 결과이고, 도 5b는 Huh7 세포에서 Cks1b의 RNA 간섭에 의한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 6은 p27의 프로테오좀 분해에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 7은 노코다졸 처리에 의한 세포주기 진행 그래프이다.

도 8a는 HOE 33342로 염색한 Chang liver의 염색체 응축 분석 사진이고, 도 8b는 PI 염색 후 세포주기에 대한 유세포 분석 그래프이다.

도 9a는 Cks1b가 과발현된 Huh7의 염색체 응축 분석 사진(HOE 33342로 염색)이고, 도 9b는 Cks1b가 녹다운된 Huh7의 염색체 응축 분석 사진(HOE 33342로 염색)이다.

도 10은 Cks1b 녹다운에 의한 소염색체(microchromosome) 형성 사진이다.

도 11a는 비부착성 성장에 대한 Cks1b 녹다운의 소프트 아가 분석 결과이고, 도 11b는 Cks1b 과발현의 소프트 아가 분석 결과이다.

도 12는 체내 고형 종양 성장에 대한 부피 그래프 및 중량 그래프이다(모크 및 Cks1b-shRNA에 대하여).

도 13는 모크 및 Cks1b 녹다운시킨 Huh7으로 형성된 체내 고형 종양의 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸다.

도 14는 Cks1b RNA 간섭에 대한 매트리겔 침윤 분석 결과 그래프이다.

도 15는 레티노산에 의한 Cks1b 분해의 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 16은 레티노산의 항-증식 활성에 있어서 Cks1b 과발현의 영향을 나타낸 그래프이다.

도 17은 레티노산의 농도에 따른 Cks1b 과발현이 레티노산의 항-증식 활성 에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 18은 NIH3T3 세포에서의 Cks1b 과발현에 대한 노던 블럿 분석 결과 및 Cks1b의 과발현이 체외 증식에 미치는 효과를 나타낸 그래프이다.

도 19는 Cks1b 과발현의 NIH3T3 세포의 비부착성장에 대한 영향을 나타내는 그래프이다.

도 20은 MEF 세포의 Cks1b 과발현에 대한 RT-PCR 분석 결과 및 Cks1b 과발현이 MEF 세포의 체외 증식에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

도 21a는 Huh7세포(모크 및 shCks1b)에서의 Bioanalyzer를 이용한 RNA 정량 그래프이고, 도 21b는 노던 블럿 분석 결과이고, 도 21c는 각종 암 홀마크에 대한 Cks1b 녹다운의 영향을 모식화한 것이다.

도 22는 Cks1b 녹다운에 의한 각종 유전자의 노던 블럿 분석 결과이다.

도 23은 Cks1b 녹다운에 의한 Interleukin 8 (IL8) 단백질 발현의 ELISA 분석 결과 그래프(도 23a), 관련 경로 활성 억제가 IL8의 발현에 미치는 영향을 보여주는 ELISA 분석 결과 그래프(도 23b) 및 노던 블럿 분석 결과(도 23c)이다.

도 24는 인간 간암에서의 Cks1b의 유전자 발현 패턴을 나타낸 그래프이다.

도 25는 p27-과발현 Huh7세포의 노던 블럿 분석 결과(도 25a), 비부착성 성장에 대한 웨스튼 블럿 분석(도 25b-a) 및 소프트 아가 분석 사진(도 25b-b) 및 매트리겔 침윤 분석 결과 그래프(도 25c)이다.

도 26은 Huh7 세포에서 p27-과발현이 Osteopontin (이하 OPN) 및 IL8발현에 미치는 영향을 나타내는 웨스턴 블럿 분석(도 26a), 노던 블럿 분석(도 26b) 결과이다.

도 27은 Huh7 세포에서 OPN 녹다운에 따른 OPN의 발현을 분석한 노던 블럿 및 웨스턴 블럿 분석 결과(도 27a), OPN 녹다운의 영향을 보여주는 체외 증식 분 석 그래프(도 27b), 소프트 아가 분석 사진(도 27c) 및 매트리겔 침윤 분석 그래프(도 27d)이다.

도 28은 Huh7 세포에서 IL8 녹다운에 따른 IL8의 발현을 분석한 웨스턴 블럿 분석 결과(도 28a), IL8 녹다운의 영향을 보여주는 체외 증식 분석 그래프(도 28b), 소프트 아가 분석 사진(도 28c) 및 매트리겔 침윤 분석 그래프(도 28d)이다.

도 29는 Huh7 세포에서 Cks1b 녹다운의 NFkB 경로와 관련한 프로모터 요소의 활성 분석 그래프(도 29a) 및 Cks1b 녹다운 Huh7세포와 p27 과발현 Huh7세포의 NFkB 경로 활성에 관련된 단백을 분석한 웨스턴 블럿 분석 결과(도 29b))이다.

도 30은 SK-Hep1에서 Cks1b 과발현에 따른 노던 블럿 분석, 소프트 아가 분석 및 체외 증식 분석 결과(도 30a), Cks1b 녹다운에 따른 노던 블럿 분석, 소프트 아가 분석, 체외 증식 분석 결과(도 30b) 및, Cks1b 녹다운에 따른 OPN, IL8 및 urokinase type plasminogen activator(이하 UK)의 노던 블럿 분석 결과이다(도 30c).

본 발명은 특정 유전자 Cks1b의 발현이 암세포의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성에 대한 지표인 사실에 기초하여, Cks1b 유전자를 녹다운 시키기 위한 Cks1b RNAi를 도입하여 암 발생, 성장, 전이를 억제하는 항암용 조성물 및 Cks1b RNAi 도입용 재조합 벡터에 관한 것이다.

간세포암 (Hepatocellular carcinoma, HCC)은 해마다 50만명이 사망하는, 세계에서 5번째로 일반적인 종양이다 (Okuda 2000). HCC 환자의 생존률은 지난 20년에 걸쳐 개선되지 않았고, 사망율과 거의 동일한 발병률을 지니고 있다 (Marrero, Fontana et al. 2005). B형 간염 바이러스 또는 C형 간염 바이러스에 감염되어 발병하는 만성 간염 및 아플라톡신 B1 (aflatoxin B1)과 같은 발암물질에의 노출은 HCC에 대한 주요 위험 인자로 알려져 있다 (Thorgeirsson and Grisham 2002).

최근에, DNA 마이크로어레이 기술은, 간 발암현상의 메커니즘의 고찰을 위한 시도에서 HCC-유래 세포주뿐만 아니라 인간 HCC 조직에서의 글로벌 유전자 발현 패턴 (global gene expression pattern)을 특징짓는데 사용되어 왔다. 다수의 보고서에서, 신규한 치료학적 타겟의 규명뿐만 아니라 HCC의 재분류 (refining classification)에 도움이 될 수 있는 HCC의 종양-관련 유전자 발현 프로파일을 기술하고 있다 (Okabe, Satoh et al. 2001; Shirota, Kaneko et al. 2001; Aizaki, Harada et al. 2002; Lee and Thorgeirsson 2002; Chuma, Sakamoto et al. 2003; Lee, Chu et al. 2004). 상기 보고서들 중에서, 일부는 HCC에서 Cks1b가 발현 증가된 유전자들 중의 하나임을 보여준다 (Okabe, Satoh et al. 2001; Xu, Huang et al. 2001).

Cks 단백질은 본래 사이클린-Cdk 복합체와 긴밀히 상호작용하는 서브유닛으로 알려져 있었다 (Hayles, Beach et al. 1986; Hadwiger, Wittenberg et al. 1989). 최근에, 인간 Cks1b가 SCF^Skp2에 의한 p27^Kip1의 유비퀴틴화 및 분해에 있어서 필수적이면서 특정한 보조인자로 작용함이 규명되었다. (Ganoth, Bornstein et al. 2001; Spruck, Strohmaier et al. 2001). 포유동물 세포에서, G1기에서 S기로의 전이는 CDK 저해제 (CKIs) p27의 활성에 의해 조절되고, 보다 적은 범위로서는, p21의 활성에 의해 조절된다 (Sherr and Roberts 1999). 세포 증식의 억제성 조절인자로서 p27은 다양한 유형의 암종에서 홀마크 (hallmark)이고, p27의 낮은 단백질 수준은, HCC를 포함한 매우 다양한 악성종양에 있어서 높은 공격성(aggressiveness) 및 좋지 못한 예후(poor prognosis)와 관련이 있다 (Philipp-Staheli, Payne et al. 2001; Claudio, Russo et al. 2004). 최근에, Cks1b 및/또는 Skp2의 발현 증가는 역으로 p27의 낮은 단백질 발현 수준과 관련이 있고, 다수의 암에서 좋지 못한 예후와 상당히 관계가 있다고 보고되고 있다 (Hershko, Bornstein et al. 2001; Kudo, Kitajima et al. 2001; Chiarle, Fan et al. 2002; Shapira, Ben-Izhak et al. 2005). 염색체 밴드 1q21에서의 Cks1b 유전자 증폭 및 단백 과발현은 p27^Kip1의 발현 감소 및 다발성 골수종(myeloma)에서 공격적 임상 진행과 관련이 있다고 보고되어 있다 (Shaughnessy 2005). 이전 연구에서 1q의 높은 획득 빈도가 간세포암종(HCC)에서 검출되었고, 이중 특히 1q21-22는 증폭된 염색체 부분 중 HCC와 연관된 종양발생유전자 후보들을 포함하는 최소 부위임이 규명되었다 (Wong, Chan et al. 2003). 이러한 사실들은 Cks1b가 HCC 발생에 연루될 가능성이 있음을 시사한 다.

또한, 오스테오폰틴(Osteopontin, OPN)은 Huh7 세포에서 Cks1b 녹다운에 의해 대략적으로 6-폴드의 큰 감소를 보여주었다. OPN은 유방암, 간세포암, 전립선암 및 대장암을 포함하는 다양한 암 유형에 있어서, 암의 진행과 관련된 인테그린-결합 분비성 인단백질(secreted, integrin-binding phosphoprotein)이다 (Thalmann, Sikes et al. 1999; Furger, Menon et al. 2001; Agrawal, Chen et al. 2002; Ye, Qin et al. 2003). 임상적으로, 증가된 OPN 수준은 다양한 조직의 암종에서 검출된다. 실험적 연구들은 OPN이 암세포의 이동 및 침윤, 종양의 신생혈관 형성 및 세포사멸의 억제를 통해 암세포 생존에 영향을 미칠 수 있음을 보여주었다 (Denhardt and Chambers 1994; Tuck, Arsenault et al. 1999; Lin and Yang-Yen 2001; Geissinger, Weisser et al. 2002; Takahashi, Akutagawa et al. 2002). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이 기술을 사용하여, OPN을 과발현시키도록 형질전환된 21NT 유방암 세포의 유전자 발현 프로파일을 대조군 세포와 비교한 최근 연구는, 이 모델에서 OPN이 암 발달에 중요한 여섯 카테고리에 연관된 유전자의 발현에 영향을 끼치고, 종양 진행 및 악성종양 성장의 다양한 양상에 영향을 준다는 것을 보여주었다 (Cook, Tuck et al. 2005). 더욱이, 두경부 편평 세포암종 세포주(head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines) 및 NIH3T3 세포에서, 저산소상태(hypoxia)시에 ras-activated enhancer (RAE)를 통해 OPN의 발현이 증가되며, 이는 Akt-키나아제 신호 경로에 의해 매개됨이 보고되었다 (Zhu, Denhardt et al. 2005).

비록, 많은 종양 특성들이 유전적으로 변형된 암세포 자체에 의한 것일 수도 있지만, 조직 환경과의 상호작용을 통하여 영향을 미치는 암세포의 능력이 암 발생에 대하여 결정적인 요인이 될 수 있음이 확인되었다 (Sparmann and Bar-Sagi 2004). 또한, 종양 부위로의 비만세포(mast cells)의 침입은 전암 혈관신생 (premalignant neovascularization)을 활성화한다는 점을 발견함에 따라서 혈관신생의 개시에 있어서 종양-관련 염증 역시 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다 (Coussens, Raymond et al. 1999; Coussens and Werb 2002). Coussens 등은 전암 혈관신생이 비만세포-결손 (KIT^W/KITW^Wv) HPV16 트랜스제닉 마우스에서 완화되고, 이 모델에서의 신생물성 진행 (neoplastic progression)은 조직 이상에 대한 염증반응이 관여함을 보여주었다 (Coussens, Raymond et al. 1999). 최근 자료는, 염증이 종양 진행의 결정적인 주요 요소라는 개념을 확장시키고 있다. 간세포암을 포함하여 (Thomas and Abbruzzese 2005), 많은 암들이 감염, 만성적 자극 및 염증 부위로부터 야기된다. 현재, 염증세포에 의해 광범위하게 조정되는 종양 미세환경이, 신생물성(종양성) 진행, 증식 촉진, 생존 및 이동에 필수불가결하게 관련되어 있음이 명백해졌다 (Coussens and Werb 2002).

원형성 인간 케모카인(prototypic human chemokine)인 IL8 (인터루킨 8)은 십년 이상 전에 케모카인 수퍼패밀리의 구성원으로 검출되었다. 최근에는, IL8이 Ras 시그널링의 전사 타겟이고, Ras-의존성 IL8 분비는 종양-관련 염증(tumor- associated inflammation) 및 신혈관형성(neovascularization)의 개시에 필요함이 증명되었다 (Sparmann and Bar-Sagi 2004). Mizukami 등은 IL8의 유도가 HIF-1a-결손 대장암 세포에서 혈관신생 반응을 유지시킴을 보여주었다 (Mizukami, Jo et al. 2005).

레티노산(RA)은 정상 세포 증식, 분화 및 세포주기 정지(arrest)에 의한 종양 성장 억제 및 세포사멸에 있어서 중요한 조절인자이다. 또한, RA는 폐암, 두경부암, 유방암 및 간세포암HCC)의 전임상(preclinical) 및/또는 임상 모델에 있어서, 항암작용(chemo-preventive activity)을 나타낸다 (Lotan 1980; Sporn and Roberts 1983). 이러한 성장 억제 및/또는 분화 유도는 HCC 세포를 가지고 한 많은 실험에서 보고 되고 있다 (Falasca, Marcellini et al. 1999; Jung, Park et al. 2005). 최근에, Zancai 등은 레티노산이 EBV-immortalized lymphoblastoid B 세포주에서 Skp2(p45) 및 Cks1b 단백질의 프로테오좀-의존성 분해의 강화를 통하여 p27을 안정화시킨다고 보고하였다 (Zancai, Dal Col et al. 2005).

이러한 최근의 분자적 고찰은, p53, 베타 카테닌, 및 AXIN1와 같은 종양 억제 유전자 또는 종양발생유전자의 유전자 변형이 HCC에 대한 진행과 연관되어 있을 가능성을 발견하였지만 (de La Coste, Romagnolo et al. 1998; Satoh, Daigo et al. 2000; Pang, Ng et al. 2003), 이러한 체세포 돌연변이의 빈도는 실제 HCC에서는 낮게 나타난다. 또한, 어떻게 이러한 유전적 변화가 개개인의 종양에 대한 임상적 특징에 반영되는지도 불분명하다. 그러므로, 대부분의 환자에서 HCC의 기초를 이루는 유력한 분자적 기전에 대한 연구가 여전히 과제로 남아 있다 (Nam, Park et al. 2005).

본 발명의 목적은, Cks1b RNAi를 함유하는 항암용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Cks1b 발현을 억제하는 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 Cks1b RNAi를 함유하는 암 유전자 치료용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 간암 (HCC) 조직에서 Cks1b의 발현수준을 분석함으로써, 주위 비-종양 간 조직보다 HCC 조직에서 Cks1b가 현저히 과발현됨을 발견하고, 간암 발생에서 Cks1b의 역할을 조사하기 위하여, Cks1b 유전자 또는 Cks1b의 shRNAs (short hairpin RNAs )를 각각 발현하는 렌티바이러스 시스템을 이용해, Chang liver 또는 Huh7 세포를 포함하는, 안정한 Cks1b-과발현 또는 Cks1b-녹다운 HCC 세포를 만들어 그 효과를 검토하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 Cks1b의 과발현에 따른 HCC 세포의 현저히 증가된 증식 및 콜로니-형성 활성을 발견하였고, 비-종양성 또는 일차세포 (예를 들어, NIH3T3, 인간 -포피 섬유아세포, 및 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)) 에서도 마찬가지였다. 이를 기초로 Cks1b의 RNA 간섭(RNAi)은 체외 증식, 침윤 및 콜로니-형성 활성을 현저히 감소시키고, HCC 세포에서 체내 고체 종양 성장을 효과적으로 억제함을 발견하였다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본원에 설명되거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에게 일반적으로 잘 이해되고, 통상적인 방법, 예를 들어 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.]에 기재된 바와 같은 널리 이용되는 분자 클로닝 방법을 사용하여 이용된다. 적절한 경우, 시판되는 키트 및 시약의 사용을 수반하는 과정은 달리 언급되지 않으면 제조사에 의해 규정된 프로토콜 및/또는 파라미터에 따라 일반적으로 수행된다.

본 발명의 방법 및 분석을 설명하기 전에, 본 발명이 물론 변할 수 있는, 본원에서 설명되는 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구성체 및 시약으로 제한되지 않음을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 실시태양을 설명하기 위한 것으로서 단지 첨부되는 청구의 범위에 의해서만 제한되는 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 이해하여야 한다.

본원 명세서 및 첨부되는 청구의 범위에서 단수 형태 (부정관사) 및 정관사 는 달리 분명하게 문맥에서 언급되지 않으면 복수 형태를 포함함을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어 "유전자 변형"은 복수의 유전자 변형을 포함하고, "프로브"의 언급은 하나 이상의 프로브 및 당업자에게 공지된 그의 동등물 등에 대한 언급을 포함한다.

본원에서 언급되는 모든 간행물은 그 간행물이 그와 관련하여 언급되는 방법 및/또는 물질을 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된다. 본원에서 언급되는 간행물은 본원의 출원일 이전의 그의 개시 내용에 대해 인용된다.

용어의 정의

"대상" 또는 "환자"는 인간, 소, 개, 기니아 피그, 토끼, 닭, 곤충 등을 포함하여 치료가 요구되는 임의의 단일 개체를 의미한다. 또한, 임의의 질병 임상 소견을 보이지 않는 임상 연구 시험에 참여한 임의의 대상 또는 역학 연구에 참여한 대상 또는 대조군으로 사용된 대상이 대상에 포함된다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상 또는 환자의 조직으로부터 얻은 유사한 세포의 집합체를 의미한다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선한, 동결된 및/또는 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고형 조직; 혈액 또는 임의의 혈액 구성분; 체액, 예를 들어, 뇌척수액, 양수, 복수, 또는 간질액; 대상의 임신 또는 발생의 임의의 시점의 세포일 수 있다. 조직 샘플은 또한 1차 또는 배양 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 얻는다. 조직 샘플은 특성상 조직과 서로 혼합되지 않는 화합 물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정액, 영양물질, 항생제 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 하나의 일부 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단한 조직 또는 세포의 얇은 슬라이스를 의미한다. 본 발명이 조직 샘플의 동일한 절편이 형태학적 및 분자적 수준 모두에 분석되거나 단백질 및 핵산 모두에 대해 분석되는 방법을 포함함을 이해한다면, 조직 샘플의 다수의 절편을 취하여 본 발명에 따른 분석에 적용할 수 있음이 이해된다.

"핵산"은 임의의 DNA 또는 RNA, 예를 들어, 조직 샘플에 존재하는 염색체, 미토콘드리아, 바이러스 및/또는 세균 핵산을 포함하는 의미이다. 용어 "핵산"은 이중가닥 핵산 분자의 하나 또는 두개 모두의 가닥을 포함하고, 무손상 핵산 분자의 임의의 단편 또는 일부를 포함한다.

"유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미한다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.

용어 "프라이머" 또는 "프라이머들"은 상보성 RNA 또는 DNA 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화하고 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응에서 발생하는 뉴클레오티딜트랜스퍼라제의 작용에 의해 모노뉴클레오티드로부터 폴리뉴클레오티드의 단계적 합성을 위한 출발점으로 기능하는 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다.

본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로 무손상 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 2개의 무손상 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예를 들어 이중특이적 항체) 및 목적하는 생물학적 활성을 보이는 항체 단편을 포함한다.

본원에서 사용될 때 용어 "표지"는 직접 또는 간접적으로 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 컨쥬게이팅 되거나 융합되고 컨쥬게이팅 되거나 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 표지는 그 자체가 검출될 수 있거나 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지의 경우에, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉매 할 수 있다.

용어 "세포사멸"은 넓은 의미로 사용되고, 일반적으로 세포질 압축, 형질막 미세융모의 상실, 핵의 분할, 염색체 DNA의 분해 또는 미토콘드리아 기능의 상실을 포함하는 하나 이상의 특징적인 세포 변경이 수반되는 포유동물의 규칙에 따르거나 조절된 세포 치사를 의미한다.

용어 "암", "암성" 또는 "악성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장의 특징을 갖는 포유동물의 생리학적 상태를 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 백혈병, 모세포종 및 육종을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 , 하나 또는 그 이상의 치료제를 '결합하여 투여함'은 동시적(동시발생적) 및 임의의 순서로 연속적 투여함을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 '길항제(antagonist)' 또는 '차단제(blocker)' 또는 '저해제(inhibitor)'는 Cks1b의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 의미한다. 길항제의 활성 메커니즘은 특별히 제한되지 않는다. 길항제의 예로서는 유기 또는 무기 화합물, 단백질, 탄수화물, 지질과 같은 폴리머 화합물, 다양한 화합물의 컴포지트(composite)를 포함한다. 예를 들어, 'Cks1b 저해제' 또는 'Cks1b 차단제'는 종양발생(tumorigenesis)에서 Cks1b 단백질의 활성을 억제, 차단 또는 감소시키는 물질을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 "성장억제제"는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 세포, 특히 본원에서 확인된 임의의 유전자를 과다발현하는 암 세포의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장억제제는 S기에서 상기 유전자를 과다발현하는 세포의 비율을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 시기에)차단하는 물질, 예를 들어 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 물질을 포함한다. 전통적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제, 예를 들어 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 억제제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예를 들어 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C는 S기 정지로까지 이어질 수 있다. 추가의 정보는 문헌[The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p.13]에서 볼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "담체"는, 사용되는 복용량 및 농도에서 담체에 드러나는 세포 또는 포유류에 대해 무독성인, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제일 수 있다. 때때로, 약학적으로 허용가능한 담체는 수성 pH 완충용액이다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예로는 비제한적으로 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 폴리펩티드(약 10 잔기 미만), 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질, 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산, 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물, EDTA와 같은 킬레이트화제, 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당알코올, 나트륨과 같은 염-형성 반대이온(salt-forming counterion), 및/또는 TWEEN®, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 및 PLURONICS®같은 무이온 계면활성제를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 저해제 화합물의 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적 으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.

본 명세서에서 사용되는 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지않거나의 여부를 포함한다. 또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명의 최선의 실시형태 및 상세한 설명

편평세포암(squamous cell carcinoma), 폐암 및 위암을 포함하는 다양한 암에서 Cks1b 과발현이 보고되어 있다. 또한, 최근에 HCC 조직을 가지고 하는 마이크로어레이 연구를 통해서 HCC에서의 Cks1b 증가(upregulation)가 보고되었다. 이들 보고서 및 세포 주기 조절에 있어서의 Cks1b의 기능에 기초하여 본 발명자들은 HCC 발생에 있어서 Cks1b의 역할을 조사하였다. 본 발명자들은 간세포암 (HCC) 조직에 서 Cks1b의 발현수준을 분석함으로써, 주위 비-종양 간 조직보다 HCC 조직에서 Cks1b가 현저히 과발현됨을 발견하였다.

이러한 발견에 기초하여, (a) 시험 암 조직 또는 세포 샘플에서 Cks1b 유전자의 발현량을 측정하는 단계; (b) 대조 정상 조직 또는 세포 샘플에서 Cks1b 유전자의 발현량을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (a)단계에서의 측정값과 상기 (b)단계에서의 측정값을 비교하여 암 여부를 판정하는 단계를 포함하는 암진단 방법을 제공한다. 상기 Cks1b 유전자의 발현은 암세포의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성에 대한 지표임을 특징으로 한다.

즉, 상기 암 진단방법은 암세포 조직 또는 샘플에서 특정 마커의 발현을 조사하는 것에 관한 것이고, 여기서 상기 특정 마커는 Cks1b이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 방법은 암 환자 치료를 위해 적절하거나 효과적인 요법을 평가할 때 유용한 데이터 및 정보를 얻기 위한 편리하고, 효율적이며, 비용 효과적인 수단을 제공할 수 있을 것으로 생각된다. 예를 들어, 암으로 진단된 환자에 대해 조직 또는 세포 샘플을 얻기 위해 생검을 수행할 수 있고, 치료제가, 예를 들어 Cks1b의 활성과 관련되는 경우 치료제의 효과를 예측하기 위해 환자의 조직 또는 샘플을 각종 시험관내 분석에 의해 조사할 수 있다.

상기 방법에서, 포유동물의 암 조직 또는 암 세포 샘플을 얻고 Cks1b 마커의 발현에 대해 조사한다. 상기 방법은 mRNA 발현을 검출하는 분석, 효소 활성의 존재를 검출하는 효소 분석, 및 면역조직화학 분석을 포함하여 다양한 분석 포맷으로 수행할 수 있다. 상기 조직 또는 세포에서 상기 Cks1b 마커의 발현의 결정은 상기 조직 또는 세포가 가지는 암의 발생 및 증식활성, 암 전이의 활성, 또는 세포주기의 전이 활성의 정도를 예측하게 할 것이다.

아래에서 논의하는 바와 같이, 샘플에서 다양한 바이오마커의 발현은 면역조직화학적 및/또는 웨스턴 분석, 정량적 혈액기반 분석 (예를 들어 혈청 ELISA) (예를 들어 단백질 발현 수준을 조사하기 위해), 생화학적 효소 활성 분석, mRNA의 계내 혼성화, 노던 블럿 분석 및/또는 PCR 분석, 및 게놈 웨스턴 블럿 분석 (예를 들어 유전자 결실 또는 증폭을 조사하기 위해), 및 유전자 및/또는 조직 어레이 분석에 의해 수행될 수 있는 매우 다양한 분석 중의 임의의 하나를 포함하여 이로 제한되지 않는 많은 방법에 의해 분석할 수 있고, 상기 방법 중 많은 방법은 당업계에 공지되고 당업자에게 이해되고 있다. 유전자 및 유전자 산물의 상태를 평가하기 위한 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting), 4 (Southern Blotting), 15 (Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis)]에서 볼 수 있다.

샘플에서 특정 Cks1b 마커의 검출에 관련된 하기 프로토콜을 예시를 위해 제시한다

상기 방법은 포유동물의 암 조직 또는 암 세포 샘플에서 Cks1b 단백질의 존재를 조사 또는 시험하는 프로토콜을 포함한다. Cks1b 관련 단백질을 검출하기 위한 다양한 방법을 사용할 수 있고, 예를 들어 면역조직화학적 분석, 면역침전, 웨스턴 블롯 분석, 분자 결합 분석, ELISA, ELIFA, 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 등 을 포함한다. 본 발명의 특정 실시태양에서, 샘플에서 Cks1b 단백질의 발현은 면역조직화학 및 염색 프로토콜을 사용하여 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학적 염색은 샘플에서 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 판명되었다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.

샘플 제조를 위해, 포유동물 (일반적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예는 암 세포, 예를 들어 간, 결장, 유방, 전립선, 난소, 폐, 위, 췌장, 림프종 및 백혈병 암 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하여 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 과정에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시태양에서, 샘플은 냉동시켜 사용하였다.

조직 샘플은 통상적인 방법에 의해 고정 (즉 보존)될 수 있다 (예를 들어, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정액을 선택할 수 있음을 이해할 것이다. 당업자는 또한 고정 길이가 조직 샘플의 크기 및 사용되는 고정액에 따라 결정됨을 이해할 것이다.

상기 방법은 추가로 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA 발현을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 (계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR 등)을 포함한다. 포유동물의 조직 또는 세포 샘플은 노던 블럿, 도트 블롯 또는 PCR 분석을 사용하여 mRNA에대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 분석, 정량적 PCR 분석은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시태양에서, 생물학적 샘플에서 mRNA를 검출하는 방법은 적어도 하나의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성시키고, 상기 cDNA를 증폭시키기 위해 센스 및 안티센스 프라이머로서 폴리뉴클레오티드를 사용하여 상기 생성된 cDNA를 증폭시키고, 증폭된 cDNA의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 또한, 상기 방법은 생물학적 샘플에서 mRNA의 수준을 결정할 수 있도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다 (예를 들어 mRNA의 수준을 "하우스키핑(housekeeping)" 유전자, 예를 들어 액틴 패밀리 멤버의 비교가능한 대조군 mRNA 서열과 동시에 조사함으로써).

상기 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직 또는 세포 샘플에서 mRNA를 조사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용하여, 시험 및 대조조직 샘플로부터의 시험 및 대조 mRNA 샘플을 역전사시키고, 표지하여 cDNA 프로브를 생성시킨다. 이어서, 프로브는 고체 지지체 상에 고정된 핵산 어레이에 혼성화된다. 어레이는 어레이의 각각의 멤버의 서열 및 위치를 알 수 있도록 준비 한다. 예를 들어, 특정 질병 상태에서 발현되는 능력을 갖는 유전자가 고체 지지체 상에 배열된다. 표지된 프로브와 특정 어레이 멤버의 혼성화는 프로브가 그로부터 유도되는 샘플이 유전자를 발현함을 나타낸다. 질병 조직의 차등 유전자 발현 분석은 유용한 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술은 단일 실험 내에서 수천개의 유전자의 mRNA 발현 프로필을 평가하기 위해서 핵산 혼성화 기술 및 컴퓨터 기술을 이용한다 (예를 들어, 2001년 10월 11일 공개된 WO 01/75166 참조; 어레이 제조에 대해서는 예를 들어 미국 특허 5,700,637, 미국 특허 5,445,934 및 미국 특허 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999) 참조). DNA 마이크로어레이는 유리 또는 다른 기재 상에서 직접 합성되거나 상기 기재 상에 스포팅된 유전자 단편을 포함하는 미세 어레이이다. 수천개의 유전자가 일반적으로 단일 어레이에 제시된다. 전형적인 마이크로어레이 실험은 1. 샘플로부터 추출된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조, 2. 표지된 표적의 마이크로어레이에 대한 혼성화, 3. 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝, 4. 스캐닝된 영상의 분석 및 5. 유전자 발현 프로필의 생성을 포함한다. 현재 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용되고 있다: 올리고뉴클레오티드 (보통 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이.

상기와 같은 프로토콜에 의해 Cks1b 발현을 측정하여 암의 진단방법을 제공할 수 있다. 또한 후술하는 실시예 들에서 확인할 수 있는 것처럼 Cks1b 과발현이 OPN, IL8, SHC1, 또는 uPA의 관련 유전자 발현을 증가시키는 점에 기초하여 상기 유전자들의 발현을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기와 같은 사실을 기반으로 하여, (a) 항암 후보 물질의 존재하에, 서열번호 1로 표시되는 Cks1b 유전자를 함유하는 세포를 배양하여 상기 Cks1b 유전자를 발현시키는 단계; 및 (b) 항암 후보물질이 없이, 서열번호 1로 표시되는 Cks1b 유전자를 함유하는 세포를 배양하여 상기 Cks1b 유전자를 발현시킨 경우에 비하여, Cks1b의 발현이 억제되는 경우의 항암 후보물질을 항암제로 선택하는 단계를 포함하는 항암제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 방법에서는 먼저 항암 후보물질의 존재하에 서열번호 1(이에 상응하는 아미노산 서열은 서열번호 2로 표시함)로 표시되는 Cks1b 유전자를 함유하는 세포를 배양한다. 이러한 세포로서는 Cks1b 유전자를 발현하는 암세포 또는 Cks1b 유전자를 발현하도록 형질전환된 세포를 포함한다.

본 발명에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드로부터 폴리펩타이드를 발현하는 암세포로서는, 예를 들면 간세포암 세포(HCC 세포), 췌장암세포, 위암세포, 간암세포, 대장암세포, 뇌암세포, 또는 폐암세포 또는 인위적으로 제조한 암세포 등을 들 수 있고, 바람직하게는 간세포암 세포(HCC 세포)이다.

서열번호 1로 표시되는 Cks1b 유전자를 발현하는 세포를 당업자의 통상적인 지식에 따라서 선택할 수 있는 배지 및 배양 조건에서 배양한다.

다음으로, 항암 후보물질이 없이, 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩타이드를 발현하는 암세포, 즉 Cks1b 유전자로 형질전환된 세포를 배양하여 Cks1b 유전자를 발현시킨 경우와 비교하여, Cks1b의 발현이 억제되는 경우 의 항암 후보물질을 항암제로 선택한다.

이상에서 설명한 바와 같이, 암 관련 질환의 마커로서의 Cks1b의 기능에 기초하여 Cks1b RNAi의 기능을 예측할 수 있고, 이에 의해 본 발명은 Cks1b RNAi를 함유하는 항암용 조성물을 제공한다.

인간을 포함한 포유동물에서 발생하는 암 관련 질환의 치료를 위해 유효량의 Cks1b RNAi 유전자 함유 조성물을 포유동물에게 투여할 수 있음이 고려된다. 즉, 본 발명의 핵산 분자 및 다른 표적 길항제 또는 작용제는 통상적인 약학 합성 기법에 따라 제조되는 항암용 약학 조성물로 제형화 될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Publishing, Company, Easton, PA, U.S.A.)]을 참조한다. 조성물은 활성 제제 또는 활성 제제의 약학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 동시적, 또는 연속적으로 투여될 수 있다.

이들 조성물은 하나의 활성 물질 이외에, 당업계에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 버퍼, 안정화제 또는 다른 물질을 포함할 수 있다. 이러한 물질들은 비독성이어야 하며 활성 성분의 효능을 방해해서는 안된다. 담체는 투여를 위해 바람직한 제제 형태, 예를 들어, 국소형, 정맥내, 경구, 뇌막, 신경상막 또는 비경구인지에 따라 다양한 형태를 취할 수 있다. 일반적으로 충진제, 확장제, 결합제, 습윤제(wetting agent), 붕해제(disintegrating agent), 계면 활성제와 같은 희석제, 부형제와 혼합함으로써 경구 또는 비경구 투여용으로 제조할 수 있다.

경구 투여에 있어서, 화합물은 고체 또는 액체 제제, 예컨대 캡슐, 환약, 정 제, 로젠지, 분말, 현탁액 또는 에멀젼으로 제형화될 수 있다. 경구 투여용 고체 제형은 정제, 알약, 더스팅 파우더, 과립 및 캡슐을 포함할 수 있다. 이러한 고체 제형은 하나 이상의 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등과 같은 적절한 부형제와 혼합함으로써 제조할 수 있다. 간단한 부형제외에도, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등과 같은 윤활제를 사용할 수 있다. 경구 투여용 액체 제형은 현탁액, 용액, 에멀젼 및 시럽을 포함할 수 있고, 상기 언급한 제형은 일반적으로 사용되는 물 및 액체 파라핀과 같은 단순한 희석제뿐만 아니라 습윤제, 감미료(sweeteners), 방향제 및 보존제(preservatives)와 같은 다양한 부형제를 포함할 수 있다. 이들의 투여의 용이성 때문에, 정제 및 캡슐이 가장 유리한 경구 투여단위 형태이고, 이 경우 고체 약학 담체가 사용된다. 필요하다면, 정제는 표준 방법에 의해 당-코팅 또는 장용-코팅될 수 있다. 활성 제제는 코팅외에 위장관 통과시에 안전하며, 동시에 뇌혈관 장벽을 통과하여 지나갈 수 있도록 해준다. 예를 들어, 국제특허공보 WO 96/11698 를 참조한다.

비경구 투여에 있어서, 화합물은 약학적 담체에 용해되어 현탁 용액으로서 투여될 수 있다. 적절한 담체의 예로서는 물, 식염수, 덱스트로스 용액, 프럭토스 용액, 에탄올, 리포솜 또는 그 유도체, 또는 동물성, 식물성 또는 합성 오일이 있다. 담체는 또한 다른 성분들, 예를 들어, 보존제, 현탁제, 가용화제, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 제형들로는 멸균된 수성 용액, 수-불용성 부형제, 현탁액, 에멀젼, 좌약(suppositories) 등이 있다. 수불용성 부형제 및 현탁액은 프로필렌, 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 오일, 에틸로레이 트와 같은 주사형 에스테르 등을 포함하는 활성 화합물을 포함할 수 있다. 좌약은 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈61, 카카오 버터, 라우린 버터(laurin butter), 글리세린화된 젤라틴(glycerinated gelatin) 등을 포함할 수 있다

활성 제제는 바람직하게는 치료적 유효량으로 투여된다. 투여되는 실제량과 투여 시간은 치료되는 질환의 특성 및 중증도에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 투여량, 시간 등에 대한 치료 처방의 결정은 일반적인 당업자 또는 전문가의 역량 내에 있으며, 보통 치료될 질병, 개개 환자의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 당업자에게 알려진 기타 요인을 고려하게 된다. 예시적인 기법과 프로토콜은 상기 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 것으로, "RNAi 시약" 및 "올리고리보뉴클레오타이드"는 상호 교환적으로 사용되며, 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 그의 유사체를 의미한다. RNAi 시약은 또한, 변형된 리보뉴클레오타이드 잔기를 포함할 수도 있다. 적합한 변형은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조예: Uhlmann, Current Opin. Drug Discovery Dev., Vol. 3, No. 2, pp. 203-213 (2000); 및 Uhlmann and Peyman, Chem. Rev., Washington, DC, Vol. 90, No. 4, pp. 543-584 (1990)]. RNAi 시약은 단일-스트랜드 및 이중-스트랜드 핵산 분자 둘 다를 포함 한다. 이중-스트랜드 핵산 분자는 두개의 별도의 스트랜드로, 또는 이중-스트랜드 구조를 형성할 수 있는 두개의 영역을 포함하는 하나의 스트랜드와 헤어핀 루프 (hairpin loop)를 형성하는 두개의 영역 사이의 스페이서 (spacer) 영역으로 구성될 수 있다.

본 발명에 따르는 RNAi 시약은 RNAi 실험에 적합한 RNAi 시약이다. RNAi에 적합한 다양한 타입의 RNAi 시약은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: Dykxhoorn et al., Nature Rev., Vol. 4, pp. 457-467 (2003)]. 이러한 RNAi 시약은 표적 유전자에 대해 상보적인 서열을 포함한다. 본 발명과 관련하여 표적 유전자에 대해 상보적이라는 것은 그 서열이 프리-mRNA, mRNA, cDNA를 포함한, 표적 유전자의 DNA 서열로부터 전사된 RNA에 대해 상보적인 것을 의미한다. 용어 "표적 유전자"는 세포, 조직 또는 유기체 내에서 발현되는, 즉 RNA로 전사되는 어떤 DNA 서열이라도 포함하는 것을 의미한다. 발현된 서열은 단백질로 반드시 번역될 필요는 없으며, 예를 들어, 프리-mRNA, 조절성 RNA, rRNA 등을 포함한다. 표적 유전자에 대해 상보적인 서열은 일반적으로 길이가 약 19-23 뉴클레오타이드이지만, 더 길 수도 있다. 바람직하게는, 상보적 서열은 길이가 50 뉴클레오타이드 미만, 더욱 바람직하게는 길이가 15-35 뉴클레오타이드, 또는 길이가 18-25 뉴클레오타이드이다. RNAi를 위해서 사용된 RNAi 시약은 바람직하게는 이중-스트랜드화 된 것이며, 두개의 별개의 스트랜드로 구성될 수 있지만, 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 스트랜드로 구성될 수도 있다. RNAi를 매개하는 RNAi 시약의 타입에 대한 예로는 예를 들어, siRNA 또는 miRNA (마이크로RNA) 또는 소형 헤어핀 RNA (shRNA)가 있다. 본 발명의 일 실시태양에서는 shRNA를 사용하였다.

상기 "핵산", "뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태 및 혼성 중합체, 센스 및 안티센스 스트랜드 모두를 포함하며, 당업자에게 명백한 바와 같이, 화학적으로 또는 생화학적으로 개질 될 수 있거나, 또 는 비천연 또는 유도체화 뉴클레오티드 염기를 포함할 수 있다. 안티센스 폴리뉴클레오티드 서열은, 예를 들어, Cks1b의 유전자의 전사물을 사일런싱하는데 유용하다. 세포 내의 이러한 안티센스 구조물의 발현은 Cks1b 유전자 전사 및/또는 번역을 방해한다. 또한, 예컨대 siRNA를 이용하여 RNAi를 유도하는 기작 및 공동억제도 사용될 수 있다. 따라서, 안티센스 또는 센스 분자는 직접 투여될 수 있다. 후자의 구체예에서, 안티센스 또는 센스분자는 또한 조성물로 제형화되어 표적 세포에 임의의 다수 수단으로 투여되거나 발현 구조체를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, Cks1b RNAi는 서열번호 5, 8, 11, 14, 17, 20 및 23으로 구성된 군에서 선택되는 올리고뉴클레오티드를 타겟으로 할 수 있다. 또한, 이 때, 상기 Cks1b RNAi는 서열번호 5를 타겟으로 하는 경우에 서열번호 7, 서열번호 8을 타겟으로 하는 경우에 서열번호 10, 서열번호 11을 타겟으로 하는 경우에 서열번호 13, 서열번호 14를 타겟으로 하는 경우에 서열번호 16, 서열번호 17을 타겟으로 하는 경우에 서열번호 19, 서열번호 20을 타겟으로 하는 경우에 서열번호 22, 그리고, 서열번호 23을 타겟으로 하는 경우에 서열번호 25로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다.

RNAi 시약의 RNAi 효능을 실험적으로 결정하는데 적합한 다수의 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다. 일반적으로, 소정의 표적 유전자에 대한 상보적 영역을 포함하는 이중-스트랜드 RNAi 시약은 표적 유전자를 발현하는 세포에 형질전환시킨다. 형질전환을 위해서는 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 형질전환을 위한 헬퍼로서 양이온성 리피드 또는 양이온성 폴리머의 사용과 같은 다 양한 방법이 사용될 수 있다. 그 후, 세포를 표적 유전자의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에서 배양한다. 이어서 표적 유전자의 발현을 예를 들어, RT-PCR 또는 리포터 유전자의 양의 측정과 같은 적합한 기술을 사용하여 측정한다. 기본적으로, 어떤 종류의 세포라도 형질감염전환을 위해서 사용될 수 있지만, 바람직한 구체예에서 세포는 진핵세포, 바람직하게는 동물 세포, 더욱 바람직하게는 포유동물 세포, 가장 바람직하게는 인간 세포이다.

본 발명은 Cks1b의 발현과 관련하는 유전자의 발현의 상향 조절 또는 하향 조절에 대한 유전적 접근까지 확장한다. 일반적으로, 유전자 사일런싱 예컨대 전사 전 또는 전사후 유전자 사일런싱을 유도하기 위해 유전적 수단을 사용하는 것이 보다 편리하다. 그러나, 발현을 상향 조절하는데 사용되는 일반적 기법은 유전자 복제수를 증가시키거나 또는 유전자 발현의 억제제를 길항시키는 것이다. 본 발명에 있어서, Cks1b RNAi는 OPN, IL8, SHC1, 또는 uPA의 관련 유전자 발현을 감소시키고, 특히, 본 발명의 마이크로어레이 데이터는 IL8이 Huh7에서 Cks1b RNAi에 의해 10배까지 크게 감소함을 보여주었다. 즉, 본 발명자들에 의하여 IL8이 Cks1b 발현 억제에 의해 하향조절(down regulation)된다는 점이 새롭게 밝혀졌다.

또한, 본 발명에서 암세포 또는 조직에 Cks1b RNAi 유전자를 도입하는 방법으로서, 당업계에 공지된 유전자 전달 시스템이 유전자 조작의 수행에 있어 유용할 수 있다. 이들은 바이러스 및 비-바이러스성 전달 방법을 포함한다. 일 구체예로서본 발명은 Cks1b RNAi를 함유하는 암의 유전자 치료용(항암용) 벡터를 제공한다.

다수의 바이러스가 유전자 전달 벡터 또는 유전자 전달 벡터 제조를 위한 재료로서 사용되어 왔는데, 이의 예로서는 파르보바이러스(예를 들어 SV40, Madzaket al., J Gen. Virol. 73: 1533-1536, 1992), 아데노바이러스(Berkner, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-66, 1992; Berkner et al., BioTechniques 6; 616-629, 1988;Gorziglia and Kapikian, J. Virol. 66: 4407-4412, 1992; Quantin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584,1992; Rosenfeld et al., Cell 68: 143-155, 1992; Wilkinson et al., Nucleic Acids Res. 20: 2233-2239, 1992;Stratford- Perricaudet et al., Hum. Gene Ther. 1: 241-256, 1990; Schneider et al., Nature Genetics 18: 180-183,1998), 백시니아 바이러스(Moss, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 25-38, 1992; Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11341-11348, 1996), 아데노수반바이러스(Muzyczka, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 97-129,1992; Ohi et al., Gene 89: 279-282, 1990; Russell and Hirata, Nature Genetics 18: 323-328, 1998), 헤르페스바이러스 예컨대 HSV 및 EBV(Margolskee, Curr. Top. , Microbiol. Immunol. 158: 67-95, 1992; Johnson et al., J Virol,66: 2952-2965, 1992; Fink et al., Hum. Gene Ther. 3: 11-19,1992; Breakefield and Geller, Mol. Neurobiol. 1:339-371,1987; Freese et al., Biochem. Pharmacol. 40: 2189-2199, 1990; Fink et al., Ann. Rev. Neurosci. 19:265-287, 1996), 렌티바이러스(Naldini et al., Science 272: 263-267, 1996), Sindbis and Semliki Forest 바이러스(Berglund et al., Biotechnology 11: 916-920,1993), 및 조류(Bandyopadhyay and Temin, Mol. Cell. Biol. 4: 749-754,1984; Petropoulos et al., J. Viol. 66: 3391-3397,1992], 쥐과 [Miller, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 1-24,1992; Miller et al., Mol. Cell. Biol.5: 431-437,1985; Sorge et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1730-1737, 1984; 및 Baltimore, J. Virol. 54: 401-407,1985; Miller et al., J. Virol. 62: 4337-4345, 1988] 및 인간 [Shimada et al., J Clin. Invest. 88: 1043-1047,1991; Helseth et al., J Virol. 64: 2416-2420,1990; Page et al., J Virol. 64: 5270-5276,1990; Buchschacher and Panganiban, J Virol. 66: 2731-2739,1982] 기원의 레트로바이러스를 포함한다.

본 발명에 있어서 「바이러스 벡터」란 숙주 내에 핵산분자를 도입하는 능력을 갖는 바이러스 입자를 가리킨다. 「Cks1b RNAi 도입용 벡터」란 상기 벡터를 구성하는 바이러스 입자에 포함되는 핵산분자가 Cks1b RNAi 게놈에 기초하는 것을 말한다. 「재조합」 바이러스 벡터란 유전자 재조합 기술에 의해 구축된 바이러스벡터를 말한다. 바이러스 게놈을 코드하는 DNA와 패키징세포를 사용하여 구축한 바이러스 벡터는 재조합 바이러스벡터에 포함된다. 본 발명의 일 실시태양에서는 렌티 바이러스 벡터를 사용하였다.

비-바이러스성 유전자 전달 방법은 예컨대 칼슘 포스페이트 공침전을 포함하는 화학적 기법, 기계적 기법, 예를 들어, 마이크로인젝션, 리포좀을 이용한 막 융합-매개 전달 및 직접적 DNA 흡수 및 수용체-매개 DNA 전달과 같이 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 일 태양에서, 상기 Cks1b RNAi 도입은 비제한적으로 형질전환, 일 렉트로포레이션, 마이크로인젝션, 상기 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터에 의한 형질도입, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로세포-매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합(spheroplast fusion) 등을 포함하는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 실행할 수 있다. 이러한 기술들은 수여세포(recipient cell)의 필요한 발생 및 생리적 기능이 파괴되지 않도록 본 발명에 따라서 사용될 수 있다. 상기 방법들은 핵산이 세포에 의해 발현되도록, 필요한 경우 세포의 자손(cell progeny)에게 유전 및 발현이 가능하도록 핵산의 세포로의 안정적 전달을 제공하여야 한다.

핵산이 유전자 치료요법의 목적으로 도입될 수 있는 세포들은 임의의 바람직하고 유용한 세포 타입을 포함하고, 비제한적으로, 상피세포, 내피세포(endothelial cell), 피부각질세포(keratinocytes), 섬유아세포(fibroblasts), 근육세포, 간세포(hepatocytes); T-림프구, B-림프구와 같은 혈액세포, 단핵세포, 대식세포(macrophages), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 거대핵세포(megakaryocytes), 과립세포(granulocytes); 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 예를 들어 골수, 제대혈, 말초혈액, 태아 간 등으로부터 수득 되는 조혈모 줄기 또는 전구 세포를 포함한다.

Cks1b RNAi의 투여에 효과적인 투여량 및 계획은 경험적으로 결정할 수 있고, 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 단일 또는 다중 투여량을 사용할 수 있다. Cks1b RNAi의 생체내 투여가 사용될 경우, 바람직하게는 0.1 ~ 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 1 ~ 50 ㎎/㎏의 Cks1b RNAi를 함유하고, 투여 횟수는 1일 1 내지 4회일 수 있다. 추가의 요법을 본 발명의 방법에 사용할 수 있음이 고려된다. 하나 이상의 다른 요법제는 당업계에 공지되고 특히 상기에서 추가로 정의된 방사선요법,수술요법, 면역요법, 사이토킨(들), 성장억제제(들), 화학요법제(들), 세포독성제(들), 티로신 키나제 억제제, ras파르네실 트랜스퍼라제 억제제, 혈관 형성 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제를 포함할 수 있고, 이로 제한되지 않는다.

그 중에서 화학요법 약물은 알킬화제, 항대사화제, 식물 알칼로이드, 토포아이소머라아제 저해제, 및 항종양제로 나눌 수 있다. 이 모든 약물은 세포 분열 또는 DNA 합성 및 일부 경로에서의 기능에 영향을 준다. 일부 제제는 티로신 키나아제 억제제(Gleevec®)와 같이 DNA에 직접적으로 간섭하지 않는다

·알킬화제

알킬화제는 세포에서 조건의 존재하에 알킬기를 많은 electronegative group에 부가하는 능력 때문에 그렇게 명명된다. 알킬화제는 DNA 이중나선구조에서 구아닌 핵산염기(nucleobases)의 가교결합에 의해 종양의 성장을 중단시킨다. 예로는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 이포스파미드(ifosfamide), 클로람부실(chlorambucil), 부술판(busulfan), 티오테파(thiotepa)를 포함한다.

·항대사화제

항대사화제는 퓨린 또는 피리미딘을 모방하여 이 물질들이 복제 동안 DNA 내로 통합되는 것을 방지한다. 예로는 티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase)를 저해하는 5-플루오로우라실(5FU), 다중 DNA 폴리머라아제의 기능을 억제하는 플루다라빈, DNA primase and DNA ligase I; 및 디하이드로폴레이트 환원 제(dihydrofolate reductase )를 저해하는 methotrexate, 퓨린 및 피리미딘 합성에 필수적인 효소를 포함한다.

·식물 알칼로이드

상기 알칼로이드는 식물로부터 유래하고 미세소관 기능을 방해함으로써 세포분열을 차단한다. 미세소관(Microtubule)은 세포분열에 매우 중대하여 그들이 없으면 세포분열은 일어날 수 없다. 주요한 예들은 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid) 및 탁산(taxane)이다.

빈카 알칼로이드 (Vinca alkaloids): 빈카 알칼로이드는 튜블린 상의 특정 위치에 결합하여 튜블린에서 미세소관으로의 조합(assembly)을 억제한다. 빈카 알칼로이드는 마다가스카르 페리윙클(Madagascar periwinkle), 카사란더스 로세우스(Catharanthus roseus)로부터 유래한다 (공식적으로 빈카 로세아(Vinca rosea)로 알려져 있음).

탁산: 탁산은 Percific yew tree, Taxus brevifolia로부터 유래한다. 탁산은 미세소관의 안정성을 강화시키고, 핵분열 후기(anaphase) 동안 염색체의 분리를 방지한다.

·토포아이소머라아제 억제제

토포아이소머라아제는 DNA의 토폴로지(topology)를 유지시키는 필수적인 효소이다. Type I 또는 type II 토포아이소머라아제의 억제는 적절한 DNA 수퍼코일링을 전복시킴으로써 DNA의 전사 및 복제 모두를 저해한다. 일부 type I 토포아이소머라아제 억제제는 camptothecins: irinotecan and topotecan을 포함한다. Type II 억제제의 예는 amsacrine, etoposide, etoposide phosphate, and teniposide를 포함한다. 후자는 메이애플(mayapple, Podophyllum peltatum)의 뿌리에서 자연적으로 발생하는 알칼로이드인 epipodophyllotoxin의 반합성 유도체(semisynthetic derivatives)이다

·항종양 항생제

많은 다른 항종양 항생제가 있지만, 일반적으로 그들은 여러 가지 방법으로 세포분열을 방해한다: (1) 두 인접한 뉴클레오티드 염기 사이에의 삽입을 통해 DNA에 결합함, (2) 리보뉴클레오티드(RNA)를 저해하여 효소 합성을 방지함 (3) 세포 복제를 저해함. 항종양 항생제는 다양한 균주의 산물이다.

본 발명에서의 Cks1b RNAi 함유 항암용 조성물의 투여로 이루어지는 암 발생, 성장 또는 전이 억제 방법은 Cks1b RNAi의 전사 수준, 번역 수준 또는 단백질 상호작용 수준에서 이루어질 수 있다

본 발명은 다양한 암을 치료하는 것과 직접적으로 관련되어 있고, 이는 암종, 흑색종 및 육종(sarcoma)에 제한되지 않는다. 상기 암은 방광암종(bladder carcinoma), 뇌종양(brain tumor), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장직장암(colorectal cancer),식도암(esophageal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 간세포암(hepatocellular carcinoma), 위장관기질종양(gastrointestinal stromal tumor, GIST), 후두암(laryngeal cancer), 폐암(lung cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신세포암(renal cell carcinoma) 및 갑상선암(thyroid cancer) 등으로 구성된 군에서 선택될 수 있고, 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양일 수 있다. 바람직하게는, 간세포암, 전립선암, 폐암, 대장암 또는 직장암일 수 있다. 또한, 다른 구체예에서는, 항암제가 일차 종양의 치료에 사용될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 HCC 세포주만을 사용하고 있으나, 이 밖에도 췌장암세포, 위암세포, 간암세포, 대장암세포, 뇌암세포, 유방암세포, 전립선암세포, 자궁암세포, 또는 폐암세포 등의 인간 유래의 다양한 종류의 암조직 및 암세포주를 사용할 수 있는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

재료준비

일차 HCC 조직을, 한국 전북국립대학병원에서 HCC의 외과적 치료를 한 16명 의 환자로부터 채취하였다. 간장 절제 후 즉시, 새로이 HCC 병소를 포함하는 간조직을 제거하고, 그 주위의 비-종양 병소부위를 빠르게 얼린 후 사용할 때까지 액체질소에 보관하였다.

인간 HCC 세포주(cell line) Chang liver (Acc. No. CCL-13), HepG2 (Acc. No. HB-8065), Hep3B (Acc. No. HB-8064), SK-Hep1(Acc. No. HTB-52), 그리고 인간 포피 섬유아세포(foreskin fibroblast, Acc. No. CRL-2076)를 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)로부터 구입하였다. SNU387 (Acc. No. 00387) 및 SNU475 (Acc. No. 00475) 를 한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank)에서 구입하였다. 그외 인간 간암 세포주인 Huh7 세포주를 실험에 사용하였다.

인간의 정상 간 전체 RNA는 Clontech사 (Ca. 64022-1: BD Sciences, Clontech, CA)로부터 구입하였다. HUVEC은 Clonetics로부터 수득하였다. 모든 HCC 세포주 및 섬유아세포 세포주를 5% CO₂의 습기 있는 대기에서 37℃ 하, 10% FBS (BioWhittaker, MD, USA) 및 항생제(Gibco BRL, Grand Island, NY)가 첨가된 DMEM (GibcoBRL, Grand Island, NY) 배지에서 배양하였다. 상기 배지는 세포주 배양 특성에 따라 3일 내지 6일마다 교환하였다.

레티노산 (all trans-RA)을 시그마사(St Louis, MO)로부터 구입하고 에탄올에 용해하여 10mM의 저장용액(stock solution)을 만들어서 -20℃의 암소에 보관하였다. 상기 저장용액을 희석하여 상술한 최종 농도가 되도록 하여 부드러운 빛(subdued light)하에서 사용하였다.

웨스턴 블럿 분석을 위해 이하의 항체들을 사용하였다: 항-Cks1b (토끼, C-term, Zymed, ca.36-6800, USA), 항-E-Cadherin (mouse, Zymed, ca.13-5700), 항-p27KIP1 (mouse, Zymed, ca.33-2800), 항-p27^Kip1 (mouse, monoclonal, BD Pharmingen, ca.554069), 항-Ephrin-A1 (rabbit, Zymed, ca.18-2301), 항-Aurora A (rabbit, polyclonal, abcam, Cambridge, UK), 항-베타 액틴 (mouse, monoclonal, A4441, Sigma), 항-CUL1 (rabbit, polyclonal, Cell Signaling Technology), 항-베타-튜블린 (mouse, monoclonal, sc-5274, SantaCruz Biotechnology), 항-GAPDH (mouse, monoclonal, sc-32233, SantaCruz Biotechnology), 항-베타-카테닌 (mouse, monoclonal, sc-7963, SantaCruz Biotechnology), 항-c-Myc (mouse, monoclonal, sc-40, SantaCruz Biotechnology), 및 항-p45(Skp2) (mouse, monoclonal, Zymed, ca.32-3400).

실시예 1: 인간 간세포암( HCC ) 조직에 있어서 Cks1b 의 노던 블럿 분석

노던 블럿 분석을 위하여, 각 환자의 HCC 조직 전체 RNA(total RNA) 및 이에 매칭되는 주위 비-종양 간 조직을 트리졸 시약(Gibco BRL, MD)을 사용하여 제조자의 설명서에 따라 추출하였다. 각 샘플로부터 얻어진 전체 RNA (10mg)을 2% 포름알데하이드를 함유하는 1% 아가로오즈 겔 상에서 전기영동하였다. 상기 겔을 20분 동안 50mM NaOH/1xSSC에 적시고, 그 후 10xSSC에서 추가로 20분 동안 더 적셨다. 밤새 상기 RNA는 모세관 전달 방법(capillary transfer method)에 의해 Hybond-N+ 멤 브레인 (Amersham Biosciences, UK)으로 운반되어 UV 가교결합에 의해서 멤브레인 상에 고정되었다. 상기 RNA 블럿은 전혼성화(prehybridized) 된 후, [a-³²P]-dCTP-표지된 Cks1b-특이 cDNA 프로브와 혼성화되었다. 상기 프로브는 Prime-It II Random Primer Kit (Stratagene, CA)를 사용하여 표지되었다. 밤새 배양한 후, 상기 멤브레인을 high-stringency conditions (65℃, 0.1xSSC)하에서 세척하고, X-ray 필름에 노출시켜 자동방사선촬영(autoradiography)을 하였다. 또한, RNA 로딩 컨트롤(RNA loading control)을 위해 상기 멤브레인을 스트립하여(stripped) 18S rRNA로 재프로브화(reprobe)하였다.

상기 분석 결과는, 분석한 전체 16명의 환자의 13명의 경우에 있어서 Cks1b mRNA 발현이 인접 비-종양 조직보다 HCC 조직에서 현저하게 높다는 것을 보여준다(도 1). 이러한 사실은 Cks1b 과발현이 HCC 발생과 매우 깊이 관련되어 있음을 의미한다.

실시예 2: 인간 HCC 세포주에서 Cks1b 발현의 노던 블럿 분석

Cks1b 발현 패턴을 조사하기 위하여 각 세포주의 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 제조하고, 노던 블럿 분석을 수행하였다 (전체 RNA 20ug/레인).

그 결과는 Cks1b가 인간 정상 간 조직 및 일차 비-발암성 세포주에서보다, 다수의 HCC 세포주에서 과발현된다는 것을 보여준다(도 2). 이는 Cks1b 과발현이 HCC 발생과 매우 깊이 관련되어 있을 가능성을 나타낸다.

실시예 3: HCC 에서 Cks1b 의 렌티바이러스 과발현

(1) Cks1b 의 렌티바이러스 발현 벡터의 제작

Cks1b 렌티바이러스 발현 벡터의 설계는 이하와 같이 이루어졌다(도 3a-1). 전체 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. Cks1b 전체 ORF (open reading frame)는 다음의 프라이머를 사용하여 Huh7로부터 RT-PCR에 의해 수득하였다: 센스, 5'-CACCATGTCGCACAAACAAATTTACTAT-3' (서열번호 3) 및 안티센스, 5'-TCATTTCTTTGGTTTCTT-3'(서열번호 4).

PCR 조건은 이하와 같다: 1분 동안 95℃에서 변성(denaturation), 1분 동안 48℃에서 어닐링(annealing) 및 1분 동안 72℃에서 신장(extension) (30 싸이클).

상기 PCR 생성물은 pGEM-T Easy 벡터(Promega)로 서브클로닝한 후, 과발현용 pLenti6/V5 벡터(pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit, ca. K4955-10, Invitrogen)의 SpeI 및 ApaI 사이에 라이게이션시켰다 (pLenti-Cks1b로 명명). 공(Empty) pLenti6/V5를 모크 벡터(mock vector)로서 사용하였다.

재조합 렌티바이러스를 제조사의 설명에 따라 293FT 세포(Invitrogen)에서 만들었다. 요컨대, 형질감염(tranfection)하는 전날에 293FT세포를 혈청을 함유하는 10ml의 성장 배지에서 10cm 배양접시 당 5x10⁶ 세포로 플레이팅 하였다. 형질감염시키는 날에 293FT 세포를 항생제를 포함하지 않는 새로운 5ml의 Opti-MEM I 배 지로 리플레이팅 하였다

Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen), 3ug의 pLenti-Cks1b 및 9ug의 팩킹 혼합 DNA (packing mix DNA) (ViraPower Lentiviral Expression System, Invitrogen)를 가지고 293FT 세포에 동시에 형질감염시켰다(co-transfection). 다음날, DNA- Lipofectamine^TM 2000 (Invitrogen) 복합체를 함유하는 배지를 제거한 후, 새로운 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Opti-MEM I (8ml)로 대체하였다. 48 내지 72시간 동안 후형질감염(posttransfection) 시킨 후, 렌티바이러스-함유 상청액을 수거하여, 3000rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 멸균된 45um 저단백질 결합 필터(Millex-HV 0.45um PVDF filters, Millipore, Ca.SLHVR25LS)를 통해 여과한 후, HCC 세포에서 Cks1b 과발현을 위해 사용될 때까지 -70℃에서 보관하였다. 바이러스 스톡 용액의 역가측정(titration)은 제조자의 지시에 따라서 수행되었다. 일반적으로 생성된 렌티바이러스 스톡 용액은 대략 5x10⁵-1x10⁶ TU (transducing unit)/ml를 나타낸다. Stable cell은 블라스티시딘 선별(blasticidin selection)(3ug/ml)을 통해 만들어졌다.

(2) Chang liver 및 Huh7 세포에서 Cks1b 의 렌티바이러스 과발현의 노던 블럿 분석

Chang liver 및 Huh7에서 Cks1b를 과발현시키기 위하여, 세포를 Cks1b-과발현 재조합 렌티바이러스 (Lenti-Cks1b) 및 모크 렌티바이러스(Lenti-Mock) (M.O.I.= 0.5)로 각각 감염시켰다. 상기 감염 세포는 14일 동안 3ug/ml의 블라스티 시딘(Invitrogen, US)으로 선별 되어지고, 그리고 전체 RNA를 수거하여 Cks1b에 대한 노던 블럿 분석에 사용하였다.

도 3a-2)는 숙주 세포-발현 Cks1b 뿐만 아니라 Cks1b의 렌티바이러스 과발현이 Chang liver 및 Huh7 세포의 두 세포주 모두에서 성공적으로 이루어졌음을 보여준다.

(3) Cks1b-과발현 HCC 세포의 체외(in vitro ) 증식 분석

세포의 체외 증식능 (in vitro proliferation)에 있어서, Cks1b의 기능을 조사하기 위하여, 체외 증식 분석을 수행하였다. Chang liver 세포들의 경우는 2.5x10⁴ cells/well의 농도로, Huh7 세포들의 경우는 2x10⁴ cells/well 의 농도로 6-웰 플레이트에 각각 씨딩(seeding)하였다. 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 세포들을 37℃ 하 CO₂ 인큐베이터에서 12일 또는 8일 동안 각각 성장시킨 후 계수하였다.

도 3b에서 알 수 있는 것처럼, 상기 결과는 Cks1b 과발현이 HCC 세포 증식을 현저히 높인다는 사실을 보여준다 (Chang liver: 83%까지 증가, Huh7: 40%까지 증가).

(4) Cks1b-과발현 HCC 세포의 세포주기

세포주기에 대한 Cks1b 과발현의 효과를, 제조사의 지시에 따라 CycleTEST PLUS DNA 시약 키트(Becton Dickinson, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석기로 분석하였다. 간단히 설명하면, 세포 1x10⁵ 를 100mm 배양 접시에 플레이팅(plating)하여 37℃하 CO₂ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포들을 트립신 처리한 후 (trypsinized), PBS로 2회 세척하고, 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide)로 염색하여 FACScan 유세포분석기(Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 세포주기의 각 단계에 대한 백분율을 세포주기 분석 소프트웨어(ModFit LT V3.0)를 사용하여 측정하였다.

상기 결과는 Chang liver 세포의 Cks1b 발현 증가 (up-regulation)는 세포주기에서 G1 단계의 감소 및 S단계의 증가를 유도하고, 이는 HCC 세포의 증식률을 향상시키는 요인 중에 하나가 될 수 있다는 것을 보여준다(표 1).

[표1]

실시예4 : Cks1b 의 발현 감소와 HCC 세포 증식률의 관계 조사

(1) Cks1b RNA 간섭( RNA interference )을 위한 shRNA 서열

Cks1b RNA 간섭은 pLentiLox3.7 벡터 (Rubinson and Dillon et al, Nature Genetics, 2003)를 사용한 렌티바이러스-기초 시스템에 의하여 수행되었다. 상기 벡터를, 선택 마커로서 기존의 EGFP 대신 블라스티시딘 S-디아미나아제를 코딩하는 유전자(pLL3.7B로 명명함)를 가지도록 변경하였다. shRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 HpaI 및 XhoI 제한 부위 사이로 클로닝하였다. 상기 전체 올리고뉴클레오티드 서열은 이하와 같이 Cks1b RNA 간섭을 위하여 설계되었다(도 4a-1):

Target I(서열번호 5): 5'- GAATGGAGGAATCTTGGCGTT -3'

(센스) 5'-TGAATGGAGGAATCTTGGCGTTCAAGAGACGCCAAGATTCCTCCATTCTTTTTTC-3'(서열번호 6)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGAATGGAGGAATCTTGGCGTCTCTTGAACGCCAAGATTCCTCCATTCA-3'(서열번호 7)

Target II(서열번호 8): 5'-GTGCTGGTAACTGCTTTGCTT-3'

(센스) 5'-TGTGCTGGTAACTGCTTTGCTTCAAGAGAGCAAAGCAGTTTACCAGCACTTTTTTC-3'(서열번호 9)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGTGCTGGTAACTGCTTTGCTCTCTTGAAGCAAAGCAGTTACCAGCACA-3'(서열번호 10)

Target III (서열번호 11): 5'- GGTGACTTGCGGATTTATGTT -3'

(센스) 5'-TGGTGACTTGCGGATTTATGTTCAAGAGACATAAATCCGCAAGTCACCTTTTTTC-3'(서열번호 12)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGGTGACTTGCGGATTTATGTCTCTTGAACATAAATCCGCAAGTCACCA-3'(서열번호 13)

Target IV(서열번호 14): 5'-GAATCTGAATGGAGGAATCTT-3'

(센스) 5'-TGAATCTGAATGGAGGAATCTTCAAGAGAGATTCCTCCATTCAGATTCTTTTTTC-3'(서열번호 15)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGAATCTGAATGGAGGAATCTCTCTTGAAGATTCCTCCATTCAGATTCA-3'(서열번호 16)

Target V(서열번호 17): 5'- GTCCTTACTTCCTAACATCTT -3'

(센스) 5'-TGTCCTTACTTCCTAACATCTTCAAGAGAGATGTTAGGAAGTAAGGACTTTTTTC-3'(서열번호 18)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGTCCTTACTTCCTAACATCTCTCTTGAAGATGTTAGGAAGTAAGGACA-3'(서열번호 19)

Target VI(서열번호 20): 5'-GAGTTTGAGACCATGGCTGTT-3'

(센스) 5'-TGAGTTTGAGACCATGGCTGTTCAAGAGACAGCCATGGTCTCAAACTCTTTTTTC-3'(서열번호 21)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGAGTTTGAGACCATGGCTGTCTCTTGAACAGCCATGGTCTCAAACTCA-3'(서열번호 22)

Target VII (서열번호 23): 5'- GTTTCAGTGTACTGGAAACTT -3'

(센스) 5'-TGTTTCAGTGTACTGGAAACTTCAAGAGAGTTTCCAGTACACTGAAACTTTTTTC-3'(서열번호 24)

(안티센스) 5'-TCGAGAAAAAAGTTTCAGTGTACTGGAAACTCTCTTGAAGTTTCCAGTACACTGAAACA-3'(서열번호 25)

상기 설계된 Cks1b RNA 간섭용 벡터(pLL3.7B-CT1 for Target I and pLL3.7B-CT3 for Target III)가 각각 RNA 사일런싱(silencing) 렌티바이러스의 생산을 위해 사용되었다 (각각의 재조합 렌티바이러스에 대하여 LV3.7B-CT1 및 LV3.7B-CT3로 명명함). 상기 RNA 사일런싱 렌티바이러스를 상기 실시예 3 (1)에서 언급한 것과 동일한 공정에 따라서 생산하였다. 상기 공벡터 pLL3.7B를 모크(mock) 벡터로서 사용하여 모크 RNA 사일런싱 렌티바이러스를 제조하였다 (LV3.7B-mock).

(2) Chang liver 및 Huh7 세포에서 Cks1b RNA 간섭의 노던 블럿 분석

상기 RNA 사일런싱 렌티바이러스 LV3.7B-CT1 및 LV3.7B-CT3, 그리고 대조군 렌티바이러스 LV3.7B-mock를 HCC 세포주인, Chang liver 및 Huh7 세포의 형질도입에 사용하였다. 상기 감염된 세포들을 블라스티시딘(3ug/ml)으로 14일 동안 선별한 후, 노던 블럿을 이용하여 Cks1b 발현을 분석하였다.

상기 결과는 Chang liver 및 Huh7 세포에서 모세포 및 모크 세포와 비교하여, 두 shRNA 모두 Cks1b 유전자 발현을 효과적으로 감소시킴을 보여준다(Target I에 대한 shCks1b-T1 및 Target III에 대한 shCks1b-T3)(도 4a-2).

(3) Cks1b - RNA 사일런싱 HCC 세포의 체외 증식 분석

세포의 체외 성장률에 있어서 Cks1b의 기능을 조사하기 위하여 체외 증식 분석을 수행하였다. Chang liver 및 Huh7 세포들을 LV3.7B-CT3로 감염시킨 후, 블라스티시딘으로 선별하였다 (shCks1b-T3으로 명명). 몇몇의 안정한 Cks1b RNAi 클론을 분리하여 증식분석에서 모세포 및 모크 세포와 함께 사용하였다. 세포들을 각각 Chang liver에 대하여는 1x10⁴ cells/well의 농도로, Huh7 세포에 대하여는 2x10⁴ cells/well의 농도로 6웰 플레이트에 씨딩하였다. 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 세포들을 37℃ 하 CO₂ 인큐베이터에서 9일 동안 성장시킨 후 계수하였다.

상기 결과는 숙주 및 모크 세포의 평균 증식률과 비교하여 Cks1b RNA 간섭이 HCC 세포 증식을 현저히 감소시킨다는 것을 보여준다[Chang liver-shCks1b-T1 (대조군의 45%), -T2 (대조군의 35%); Huh7-shCks1b-C7 (대조군의 27% ), -C9 (대조군의 14% ), -C11 (대조군의 13% )](도 4b).

(4) Cks1b - RNA 사일런싱 HCC 세포의 세포주기 분석

세포주기에 대한 Cks1b 사일런싱의 효과를, 제조사의 설명서에 따라 CycleTEST PLUS DNA 시약 키트(Becton Dickinson, CA, USA)를 사용하여 유세포분석기로 분석하였다. 세포 5x10⁴를 100mm 배양 접시에 플레이팅하여 37℃ 하 CO₂ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였다. 그 다음, 세포들을 트립신 처리하고 (trypsinized), PBS로 2회 세척하고, 프로피디움 아이오다이드로 염색하여 FACScan 유세포분석기 (Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 세포주기의 각 단계에 대한 백분율을 세포주기 분석 소프트웨어(ModFit LT V3.0)를 사용하여 측정하였다.

상기 결과는 Huh7 세포에서 Cks1b RNA 간섭이 세포주기에서 G1 단계의 증가를 가져오는 반면, S단계의 감소를 유도하고, 이는 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 HCC 세포의 증식률을 감소시키는 요인 중에 하나가 될 수 있다는 것을 보여준다(표 2). 상기 Cks1b-과발현 또는 RNA 간섭 HCC 세포를 이용한 세포주기 분석 실험은 Cks1b가 HCC 세포에서의 세포주기 진행과정에서 G1/S 전이에 중요한 역할을 할지도 모른다는 점을 시사하고 있다.

[표2]

실시예 5: 세포주기 관련 단백질의 웨스턴 블럿 분석

웨스턴 블럿 (추출물 제조 및 웨스턴 블럿): 제조사의 설명에 따라 전체 세포 용해물(Whole cell lysate)을 세포용해 버퍼(lysis buffer)(M-PER^R Mammalian Protein Extraction Reagent, Pierce, US)를 이용하여 제조하였다. 상기 상청액을 수거하고, 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석기(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, US)를 이용하여 측정하였다. 적절한 양의 단백질 샘플(20-50mg 단백질)을 로딩 버퍼와 혼합하고 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후, SDS-PAGE를 사용하여 분별하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, CA, US) 상으로 옮기고 ECL 플러스 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.

(1) Chang liver 세포에서 Cks1b 의 렌티바이러스 RNA 사일런싱

웨스턴 블럿 분석은 Chang liver 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 Cks1b 단백질 양이 현저히 감소됨을 보여주었다(도 5a). 사이클린 E의 단백질 수준이 Cks1b의 RNA 간섭에 따라서 조금 증가하였고, 이는 일부 프로테오좀-의존성 분해의 감소 때문에 일어난 것일 수 있다.

(2) Huh7 세포에서 Cks1b 의 RNA 간섭

웨스턴 블럿 분석은 Huh7 세포에서도 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 Cks1b 단백질 양이 현저히 감소됨을 보여주었다(도 5b). Chang liver 세포에서 관찰된 바와 유사하게, 사이클린 E가 Cks1b의 RNA 간섭에 따라서 조금 증가하였고, 이것 역시 부분적으로 프로테오좀-의존성 분해의 감소 때문에 일어난 것일 수 있다.

대조적으로, 종양 억제제 p27은 Cks1b의 RNA 간섭에 따라서 명백히 증가하였고, 이는 Cks1b가 HCC 세포에서 p27의 Skp2-매개 프로테오좀에 의한 분해의 필수적인 보조인자로서 역할을 한다는 것을 보여준다. 또한, Cks1b의 RNA 사일런싱의 결과로서 Skp2가 감소하였고, 이는 Cks1b가 아직 공지되지않은 메커니즘을 경유하여 Skp2 단백질 발현과 관련해서 영향을 미칠 수 있다는 점을 시사한다. 본 발명에서 사용된 실험적인 조건에서 CDK1, CDK2, 및 CDK4의 단백질 수준은 변하지 않았다.

결론적으로, Cks1b는, 세포주기의 G1/S 전이에 결정적인 역할을 하는 p27의 Skp2-매개 프로테오좀-의존성 분해에 있어 중요한 필수 보조인자이기 때문에, HCC 세포에서 Cks1b의 상향 조절은 G1의 감소 및 S의 증가와 함께 p27의 분해 증가를 통해 증식률을 높일 수 있다. HCC세포에서 Cks1b RNA 사일런싱은 G1의 증가 및 S의 감소로 p27의 분해 감소를 통해 세포 증식률을 크게 감소시킨다. 그러므로, Cks1b는 G1/S 전이의 조절자로서 간암 세포 성장에 매우 중요한 기능을 한다.

실시예 6: p27 의 프로테오좀 분해

p27 단백질 증가가 프로테오좀-의존성 분해의 감소 때문인지 아닌지를 알아보기 위하여, Huh7-shCks1b 세포 및 모크 세포들을 60mm 배양 접시에서 3x10⁵ 세포의 농도로 플레이팅하였다. 다음날, 상기 세포들을 최종농도 10mg/ml에서 선택적 프로테오좀 억제제 MG132 (10mM in DMSO, Calbiochem, US)로 7시간 동안 처리하였다. 그 후 상기 세포 용해물들을 p27 단백질에 대하여 웨스턴 블럿 분석하였다.

상기 결과는 Huh7 세포에서 Cks1b의 RNA 간섭으로 인한 p27의 발현 증가는 RNA 전사의 증가 때문이 아니라 프로테오좀-의존성 분해의 감소 때문임을 확인하였다(도 6).

실시예 7: 세포주기 진행에서 Cks1b RNA 사일런싱의 효과 [ 노코다졸에 의한 G2 /M 정지( arrest ) 및 방출( release )]

세포주기 진행에서 Cks1b RNA 사일런싱의 효과를 조사하기 위하여, 노코다졸 처리에 의해 G2/M 단계에서 정지시킨 Huh7 세포에 대하여 FACS를 사용하여 세포주 기 분석을 수행하였다. 1x10⁶ 세포들을 플레이팅하고, 24시간 동안 배양한 후, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶겼다. 이후에, 세포들을 노코다졸(0.15mg/ml)로 18시간 동안 처리하고, 노코다졸이 없는 새로운 배지로 이후 배양하였다. 세포들을 트립신 처리한 후, PBS로 2회 세척하고, 프로프디움 아이오다이드로 염색하고, FACScan 유세포 분석기(Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 세포주기의 각 단계에서의 백분율을 셀 퀘스트 소프트웨어(Cell Quest software) (Becton Dickinson, CA)를 사용하여 측정하였다. 하기 표 3 및 도 7은 Huh7, 모크 세포-C2 (클론 2) 및 shCks1b-C9 (Cks1b RNA 사일런싱 클론 9) 세포를 사용한 노코다졸 정지/방출 실험의 결과 분석을 나타낸다.

상기 결과는 Huh7 세포에서 Cks1b의 RNA 간섭은 G1/S 전이의 지연을 유도하고, 이는 상기 세포의 증식 감소에 기여할 수 있음을 시사한다.

[표3]

실시예 8: 혈청-고갈 조건하에서 Cks1b 발현에 의한 Chang liver 세포의 생존율 향상

(1) HOE 33342로 염색한 후 염색체-응축( Chromatin - condensation ) 분석

세포 생존에 대한 Cks1b 과발현의 효과를 조사하기 위하여, Chang liver-모크-C1 (클론 1)및 -C4 (클론 4), 그리고 Chang liver-Cks1b-C1(클론 1) 및 -C5 (클론 5) 세포를 씨딩하고 90% 컨플루언스(confluence)로 배양하였다. 상기 세포를 혈청 없는 DMEM 배지에서 5일 동안 배양하였다. 부착성 세포를 1 mg/ml의 최종농도에서 15분 동안 HOE 33342 (MERCK)로 염색하였다. 세포들을 분석하여 15분 내에 형광 현미경으로 365nm-필터를 사용하여 촬영하였다(도 8a).

현미경 사진은 Cks1b 과발현은 실질적으로 혈청-고갈된 배양 조건(serum-depleted condition)하에서 Chang liver 세포의 생존률을 향상시킴을 보여주는데, 이는 대조군보다 Cks1b 과발현된 Chang liver에서 염색체-응축/세포사멸 세포의 수를 현저히 감소시키기 때문이다.

(2) PI 염색 후 세포주기 분석

혈청-고갈 조건하에서 세포 생존에 대한 Cks1b 과발현의 효과를 조사하기 위하여, Chang liver-모크-C1 및 -C4, 그리고 Chang liver-Cks1b-C1 및 -C5 세포를 3x10⁶ cells/dish로 씨딩하고, 혈청-고갈된 조건에서 3일 동안 배양하였다. 모든 세포를 수거하여 프로프디움 아이오다이드(PI)로 염색하고 유세포 분석기로 분석하였다(도 8b 및 표 4).

[표4]

상기 결과는 Cks1b 과발현이 Chang liver 세포의 sub-G1 (세포사멸성) 세포수를, 모크 세포와 비교하여 약 60%까지 현저히 감소시킴을 보여주고, 이는 도 8a의 결과와도 일치하였다.

실시예 9: 혈청-고갈 조건하에서 Cks1b 발현에 의한 Huh7 세포의 생존율 향상

(1) Cks1b의 과발현: 염색체-응축 분석

혈청-고갈 조건하에서 세포 생존에 대한 Cks1b 과발현의 효과를 조사하기 위하여, Huh7-모크 및 Huh7-Cks1b-C6 세포들을 각 웰 당 2x10⁵ 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 혈청-고갈된 조건하(0% FBS)에서 4일 동안 배양하였다. 부착성 세포를 15분 동안 HOE 33342 (MERCK) (1 mg/ml)로 염색하였다. 세포들을 분석하여 15분 내에 형광 현미경으로 365nm-필터를 사용하여 촬영하였다(도 9a).

도 8a에 나타난 결과와 유사하게, 모크 세포와 비교하여 Cks1b 과발현은 혈청-고갈된 배양 조건하에서 생존가능한 Huh7 세포의 수를 현저히 증가시켰다.

(2) Cks1b 의 RNA 간섭: 염색체-응축 분석

혈청-고갈된 조건하에서 세포 생존에 대한 Cks1b RNA 사일런싱의 효과를 조사하기 위하여, Huh7-모크-C2 또는 Huh7-shCks1b-C9 세포들을 각 웰 당 6x10⁴ 세포의 농도로 6-웰 플레이트에 씨딩하고 24시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 혈청 -고갈된 조건하에서 3일 동안 배양하였다 (혈청 없는 DMEM 배지). 부착성 세포를 15분 동안 HOE 33342 (MERCK)로 염색하였다. 세포들을 분석하여 15분 내에 형광 현미경으로 365nm-필터를 사용하여 촬영하였다.

도 9b에서 알 수 있는 것처럼, 모크 세포와 비교하여 Cks1b RNA 사일런싱은 혈청-고갈된 조건하에서 생존가능한 Huh7 세포의 수를 실질적으로 감소시키고 세포사멸 세포의 수를 증가시킨다.

종합적으로, 이러한 결과들은 Cks1b는 성장인자가 없을 때 세포생존을 결정하는 중요한 요인 중의 하나일 수 있음을 나타낸다.

실시예10 : Cks1b RNA 사일런싱에 의한 소염색체의 유도

정상 배양 조건하의 세포 염색체를, 세포 투과성이고 아데닌-티민-특정 형광 염료인 HOE 33342 (MERCK)로 염색하여 염색체 완전성(Choromosome integrity)을 평가하였다. 세포들을 6-웰 플레이트에 씨딩하고 (웰 당 2x10⁴ 세포), 3일 동안 배양하였다. 배양 후, 세포들을 HOE33342로 염색하고 형광 현미경으로 분석하였다.

도 10에서 알 수 있는 것처럼, Cks1b RNA 사일런싱은 Huh7 세포에서 소염색체(microchromosome)의 형성을 이끌어내고, 이는 세포의 유사분열에서 Cks1b가 유전적 안정성의 유지에 중요한 역할을 할 수 있음을 가리킨다.

실시예11 : 비부착성 성장에 있어서 Cks1b RNA 간섭의 효과

Huh7 세포의 종양형성능(tumorigenicity)에 대한 Cks1b 사일런싱의 효과를 조사하기 위하여, 소프트 아가 분석을 앞서 기술한 바에 따라서 수행하였다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 315, 950-958, 2004). 60-mm 배양접시에, 2x10⁴ 세포 (for Cks1b 과발현에 대하여) 또는 1x10⁴ 세포 (Cks1b RNA 사일런싱에 대하여)를 0.3% 상부(top) 아가로오스 (2 ml)에 혼합하고, 0.5% 하부(bottom) 아가로오스(5 ml) 상에 플레이팅하였다. 상기 배양접시를 37℃의 5% CO₂ 조건 하에서 규정된 시간 동안 배양하였다. 콜로니들을 광학현미경으로 모니터하고, 사진촬영하였으며, 0.1mm 보다 큰 직경을 가진 콜로니들의 수를 세었다(도 11a).

Cks1b 과발현이 모크 세포와 비교하여 Huh7 세포의 콜로니-형성 효율을 현저히 향상시킴을 관찰하였다(도 11b). 이와 일치하여, 또한 해당 시간 동안, Cks1b RNA 사일런싱 세포를 함유하는 배양접시 상에서는 콜로니가 거의 보이지 않았기 때문에 Cks1b RNA 사일런싱은 Huh7 세포의 콜로니-형성 능력을 실질적으로 손상시켰음을 관찰하였다. Huh7 모세포, 모크-C1 또는 -C2에 비하여, shCks1b-C7, -C9, 또는 -C11 세포에서 콜로니-형성 능력의 감소가 관찰되었다. 또한, shCks1b-C7, -C9, 또는 -C11를 유도하는 세포로부터 유래된 콜로니의 수는 10 미만이었으며, 심지어 배양시간을 30일 정도로 길게 연장한 후에도 10 미만이었다. 따라서, Cks1b RNA 사일런싱에 의한 비부착성 증식능(anchorage-independent growth)의 감소는 세포증식률 감소뿐만 아니라 미지의 다른 요인들에 의해서도 결정됨을 추측할 수 있다. 또한, 이러한 미지의 요소가 p27-관련 요소인지 아닌지는 추가로 연구되어야 한다. 종합적으로, 이러한 결과들은 Cks1b가 HCC 세포의 종양발생에 있어서 중추적이고 필수적인 역할을 할 수 있음을 가리킨다.

실시예 12: 체내 종양형성에서 Cks1b RNA 간섭의 효과

HCC 세포의 종양형성에 대한 Cks1b RNA 사일런싱의 효과를 알아보기 위하여, 다음의 동물실험을 수행하였다. 세포들을(5x10⁶/mouse) 흉선없는 (누드) 마우스[athymic (nude) mice]의 옆구리로 피하 주사하였다. 매주 상기 동물에서의 종양형성에 대하여 모니터하고 45일 뒤에 희생시킨 후, 종양 길이(L) 및 너비(W)를 측정하고 종양 부피를 공식 (L x W²) x 0.52로 계산하였다.

소프트 아가 시험 분석으로부터의 결과와 일치하게, Huh7 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱은 실질적으로 고형 종양의 성장을 손상시켰다(도 12). 그러므로, Cks1b는 Huh7 세포의 종양 형성능에 있어서 결정적인 요인이 될 수 있음을 보여주었다. 이러한 결과는 Cks1b RNA 사일런싱이 HCC의 좋은 치료방법이 될 수 있음을 시사한다.

실시예 13: s.c. 종양 조직의 면역조직화학분석

체내 종양조직에서 Cks1b RNA 사일런싱에 의하여 Cks1b 단백질 발현은 감소하였으며, 이와 함께 p27의 발현은 증가하였다. 세포사멸 세포가 Cks1b RNA 사일런싱에 의하여 조금 증가하였다. 대조적으로, Cks1b RNA 사일런싱 세포로부터 유래 된 종양 조직에서는 활발히 증식하는 세포를 나타내는 PCNA-양성 세포수가 현저히 감소하였다(도 13).

이러한 결과를 기초로, Cks1b RNA 사일런싱에 의해 손상된 종양 성장은 종양세포의 세포 증식능 감소 및 세포사멸 증가로부터 기인한 것으로 생각된다.

실시예 14: 체외 침윤 분석

침윤 능력에 있어서 Cks1b 녹다운 효과를 조사하기 위하여, 매트리겔 침윤능 분석(Matrigel invasion assay)을 수행하였다. 2.5x10⁵ 세포들을 100mm 배양접시에 플레이팅하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶겼다. 분석 당일날, 8.0-㎛ 구멍이 있는 트랜스웰 (직경 6.5-mm) 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(Costar, Cambridge, MA, USA)의 상부에 매트리겔(각 웰 당 40㎍; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 챔버 하부에 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가한다. 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 단일 세포 현탁액(single-cell suspensions)을 만든 후 트랜스웰 멤브레인 필터(각 웰당 1x10⁵ 세포) 상에 씨딩한 다음 37℃, 5% CO₂ 하에서 23시간 동안 배양하였다. 필터들을 세척하고, 상부 표면의 세포들을 면봉으로 제거하였다. 침윤되어 필터 하부 표면(lower surface)에 부착해 있는 세포들을 15분 동안 메탄올로 고정시키고, 15분 동안 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 필터들을 30% 아세트산으로 추출하였다. 침윤되어 있는 세포들을 595nm에서 흡광도를 측정하여 간접적으로 정량하였다..

도 14a 및 14b는 세 개의 독립적인 실험의 대표적인 결과를 나타낸다 (평균 ±SD). 모크 세포 (모크-C2)와 비교하여, Cks1b 녹다운 Huh7 세포들 (shCks1b-C9)은 침윤 능력에 있어서 현저한 감소를 보였다. 상세하게는, Cks1b 녹다운이 10% FBS에 반응하여 침윤된 세포의 수를 다음과 같이 감소시켰다: shCks1-C7의 경우 모크의 13.2%에 해당, p<0.00005; shCks1-C9의 경우 모크의 13.6%에 해당, p<0.0005; shCks1-C11의 경우 모크의 17.9%에 해당, p<0.00005). 이러한 결과들은 Cks1b가 세포주기의 G1/S 전이 조절 역할에 더하여 종양 세포의 침윤능 즉, 종양의 전이에 참여할 가능성을 시사하고 있다.

실시예15 : 올-트랜스 레티노산(atRA)에 의한 Cks1b 의 분해

레티노산이 HCC 세포에서 Cks1b 및 Skp2의 분해를 유도하여 항-증식제(anto-proliferating agent)로서 작용하는지 여부를 시험하기 위하여, atRA 처리 후에 Cks1b 및 Skp2 단백질 수준을 웨스턴 블럿 분석으로 측정하였다. 이 경우에, 5x10⁵ Chang liver 세포들을 100mm 배양접시에 플레이팅하고 2일 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 10mM atRA를 24시간 동안 처리하거나 또는 처리하지 않았다. 전체 세포 용해물에 대하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

도 15는 레티노산이, HCC 세포에서 Cks1b 및 Skp2 모두에 대해 단백질 분해 를 유도함을 보여준다.

실시예16 : Cks1b 과발현의 레티노산 항-증식활성의 저해

렌티바이러스 발현 시스템을 이용하여 Chang liver 및 Huh7 세포에서 Cks1b 를 과발현시켰다 [Invitrogen, pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit (ca. K4955-10)]. Cks1b ORF는 Huh7 전체 RNA를 사용한 RT-PCR에 의해 수득하였다. 상기 프라이머들은 다음과 같이 사용되었다; 센스, 5'-CAC CAT GTC GCA CAA ACA AAT TTA CTA T -3', 안티센스, 5'-TCA TTT CTT TGG TTT CTT-3'. 얻어진 상기 PCR 단편을 pGEM-T 벡터 (Invitrogen)에 서브클로닝하고, 그 다음 pLenti6/V5 벡터의 SpeI 및 ApaI 사이에 라이게이션하였다 (pLenti-C).

주형으로 pLenti-C를 사용하여, C-말단에 6xHis로 표지한 Cks1b를 PCR 방법에 의해 생성하였다. 상기 프라이머들은 다음과 같다: 센스, 5'-CAC CAT GTC GCA CAA ACA AAT TTA CTA T-3', 안티센스, 5-'TCC CCG CGG TCA ATG GTG ATG GTG ATG ATG TTT CTT TGG TTT-3'. 상기 PCR 단편을 pLenti6-V5의 SpeI 및 SacII 사이 부위로 서브클로닝하였다 (pLenti-Cks1b). 상기 공벡터 (pLenti6/V5)는 pLenti6-LacZ/V5의 SacII 라지 프래그먼트(large fragment)의 자체 라이게이션에 의해 제조하였으며, 이를 모크 벡터로서 사용하였다 .

Cks1b-과발현 렌티바이러스 (LV-Cks1b)를 제조하고, Chang liver 또는 Huh7 세포를 포함하는 HCC 세포의 형질도입을 위해 사용하였다. Cks1b-과발현 Chang liver 또는 Huh7 세포를 블라스티시딘 (>3mg/ml)으로 선별하였다. 몇몇의 블라스티 시딘-저항성(blasticidin-resistance)인 독립적인 클론들을 선별하여 노던 블럿팅 또는 웨스턴 블럿팅에 의해 Cks1b 과발현을 분석하여 본 실험에 사용하였다.

레티노산은 Cks1b 단백질의 분해를 촉진하여 일부 항-증식 능력을 나타내기 때문에 (도 15), 본 발명자들은 Cks1b의 과발현이 HCC 세포에서 레티노산의 항-증식 활성을 저해할 수 있는지 여부를 조사하였다. Chang liver-모크 세포 (클론 #1) 및 Cks1b-과발현 세포 (클론 #5)를 사용하여 수행하였다.. 상세하게는, 2x10⁴ 세포를 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 0.1% 혈청을 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 동안 굶겼다. 세포들을 atRA 0uM를 함유하거나 혹은 함유하지 않는, 10% FBS 함유 DMEM 배지에서 추가로 8일 동안 배양한 후, 계수하였다.

레티노산 처리 조건에서 Cks1b 과발현은 모크 세포와 비교하여 58%까지 세포증식을 향상시킨다. Cks1b-과발현 Chang liver 세포 (Cks1b-C5)는 atRA의 항-증식 활성에 대하여 큰 저항성을 보여주었다. 이 저항성은 Cks1b의 과발현 수준에 의존할 것이다.

실시예17 : 다양한 농도에서의 레티노산 항-증식활성의 저해에 있어서 Cks1b 과발현의 효과

실시예16에서와 동일한 방법으로 분석을 수행하였으며, 이때 atRA는 0, 1, 5, 10, 20, 또는 50 uM 농도로 처리하였다.

비록 정확한 메커니즘이 아직 밝혀지진 않았지만, 1uM의 atRA는 모크 세포의 성장을 자극하였다. 이러한 자극은 atRA 1uM 및 5uM 두 경우 모두에서 성장이 촉진되는 Cks1b-과발현 세포 (Chang liver-Cks1b-C5)에서 더욱 명백하게 나타났고, 이는 모크 세포보다 훨씬 증가된 것이었다(도 17). 일반적으로, Cks1b-과발현 세포들은 사용된 atRA의 모든 농도에서 모크 세포에 비해 향상된 저항성을 보여주었고, 저농도의 atRA에서는 HCC 세포의 성장이 억제되기보다는 향상되었다. 이는 항암치료요법에 있어서 레티노산의 사용에 보다 더 주의를 기울여야 함을 시사한다.

실시예 18: NIH3T3 세포의 체외 증식에 있어서 Cks1b 과발현의 효과

일차 세포의 증식에 대한 Cks1b의 효과를 조사하기 위하여, NIH3T3 세포들을 렌티바이러스 발현 시스템 (LV-Cks1b)을 사용하여 Cks1b가 과발현하도록 제조하였다. Cks1b 과발현은 노던 블럿팅에 의해 분석하였다. 2x10⁴ 의 NIH3T3 세포 (모크와 Cks1b-과발현 세포 각각)들을 6-웰 플레이트에 씨딩하였다. 세포들을 DMEM (0.1% FBS) 배지에서 24시간 동안 굶기고, DMEM (10% FBS) 배지에서 5일 동안 배양한 후, 계수하였다. 상기 결과는 Cks1b가 비-종양성 NIH3T3 세포의 증식 능력을 현저히 향상시킴을 보여주었다(숙주 및 모크의 평균 값과 비교하여 90%까지 증가)(도 18). 이는 Cks1b가 과발현될 때, 일차 세포 또는 비-종양성 세포의 증식 능력을 촉진하고, 이는 암의 발생에 대해 잠재적으로 기여할 수 있음을 시사한다.

실시예 19: NIH3T3 세포의 비부착성 성장에 있어서 Cks1b 과발현의 효과

NIH3T3 세포에서, Cks1b 과발현에 의해 향상된 세포 증식이 콜로니-형성 활성에도 기여할 수 있는지 여부를 추가로 조사하기 위하여, 콜로니-형성능 분석을 실시예11에서 사용한 것과 동일한 실험 조건하에 수행하였다. 2x10⁴ 세포들을 60mm 배양접시에서 25일 동안 배양하고, 형성된 콜로니의 수를 세었다. NIH3T3 또는 모크 세포를 함유하는 배양접시에서는 콜로니가 관찰되지 않았다. 대조적으로, Cks1b-과발현 NIH3T3 세포의 배양접시에서는 10-20개의 콜로니가 관찰되었다(도 19). 종양유전자로서의 잠재성(oncogenic potential)을 측정하기 위한 간접적인 방법으로서 소프트 아가 분석을 통해서, 본 발명은 Cks1b가 단순한 성장 촉진 역할 보다는 종양 발생에 있어서 종양유전자로서의 역할을 할 수 있다는 점을 보여 주었다.

실시예 20: 마우스 배아 섬유아세포의 성장에 있어서 Cks1b 과발현의 효과 (Balbc/J로부터의 MEF )

상기 설명한 바에 따라서, 렌티 바이러스 발현 시스템을 사용하여 Cks1b를 과발현하도록 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblast cells)를 조작하고 Cks1b 유전자의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 분석하였다. MEF 세포의 증식에 있어서 Cks1b의 효과를 알아보기 위하여 체외 증식 분석을 수행하였다. 2x10⁴ 세포들을 6-웰 플레이트에 씨딩하고, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후 10% FBS 함유 배지에서 7일 동안 배양하였다. NIH3T3 세포와 유사하게, Cks1b 과발현은 MEF 세포의 증식을 현저히 향상시켰다 (숙주 및 모크의 평균 값과 비교하여 76%까지 증가)(도 20).

실시예 21: Huh7 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱의 효과에 대한 마이크로어레이 연구

세포 생리학상의 Cks1b RNA 사일런싱의 효과에 대한 유전체적 고찰 (genome-wide insights)을 위하여, 본 발명자들은 Huh7-모크-C2 및 Huh7-shCks1b-C9 세포를이용하여 마이크로어레이 연구를 수행하였다. Huh7세포(모크 및 shCks1b)에서 Bioanalyer을 이용하여 RNA를 정량하였으며(도 21a), 노던 블럿 분석을 수행하였다(도 21b). RNeasy Mini Kit (Qiagen) 및 RNase를 함유하지 않는 DNase I을 사용하여 제조한 전체 RNA를 추출한 후, 컨트롤 유전자를 제외한, 52,486 유전자 타겟을 포함하는 코드링크 인간 전체 게놈 바이오어레이(CodeLink human whole genome bioarray)에 혼성화시켰다. 유전자 발현에서, 2배 이상의 매우 유의성 있는 변화가 1,432 타겟에서 관찰되었고, 그들 중에 108개 타겟의 유전자 발현이 증가한 반면, 1,324개 타겟의 유전자 발현은 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 감소하였다. 발현 수준에서 유의성 있는 변화를 보여준 유전자들은 유전자 전사, 세포 사망(cell death), 세포사멸(apoptosis), 신호전달(signal transduction), 스트레스 반응, 면역 반응, 세포주기, 및 세포의 생리학적 과정 등을 포함하는 다양한 범주에 속하는 것들이다. 이들 중 대표적인 유전자들은 종양 발생에 있어서의 기능과 관련하여 다음과 같은 여러 가지 범주로 분류된다 (표5 및 도 21c).

자급자족적 증식 신호 (Self-sufficiency in growth signals) 관련

-증가: Foxo3A, GLIPR, NKX3.1, RhoB

-감소: Ras, Raf, Bcl3, Ets2, SHB, SHC1, SHD

조직으로의 침윤 및 전이 관련

-감소: S100A4, S100A6, PLAU, OPN, CTSs, LEF1, 인테그린aV/aII, Epha2

지속적인 혈관신생(Sustained angiogenesis) 관련

- 감소: IL8, MIP2, MIP2b, MIP3a, Lkn1

세포사멸 회피(Evading apoptosis)

-감소: HSPA5, IRS4, INSIG2

-증가: STK17

[표5]

특히, 증식, 혈관신생, 종양 염증(tumor inflammation), 종양유전자, 침윤 및 전이와 같은 대부분의 모든 세포 생물학에서 요구되는 유전자의 전사가 현저히 감소되었다. 본 마이크로어레이 실험 결과는 Cks1b가 세포생리 전반에 중요한 역할을 하며, 최초에 예상한 세포주기 조절 기능 이외에도 종양의 발생 및 진행에 있어서 다양한 기능을 한다는 것을 보여주었다.

실시예22 : Huh7 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 변화된 유전자 발현의 노던 블럿 분석

마이크로어레이 연구에서 드러난 유전자 발현 프로파일에서의 변화는 RT-PCR 또는 노던 블럿팅에 의해서 확인되었다. 종양 세포의 침윤 및 전이와 깊이 관련된 것으로 알려져 있는 오스테오폰틴(osteopontin, OPN)의 발현은, Huh7 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 현저히 감소하였다. 염증 매개인자(inflammatory mediator) 및 혈관신생 인자로 알려져 있는 인터루킨 8 (IL8이라고 지칭함)은 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 실질적으로 발현이 감소하였다. 또한, 종양유전자인 SHC1 및 요-타입 플라즈미노겐 활성인자(urine-type plasminogen activator, uPA;종양 세포의 침윤 및 전이에 있어 중요하다고 알려져 있음) 역시 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 유전자 발현의 현저한 감소를 보였다(도 22). 이러한 결과들은 종합적으로, 발현 변화를 보인 이들 인자들이 종양 발생에서의 Cks1b 기능에 있어 중요한 매개자일 수 있음을 보여 주며, Cks1b RNA 사일런싱이 종양 성장을 억제함은 물론, 관련 유전자들의 발현감소를 통해 암의 전이 억제도 가능할 수 있음을 보여주고 있다.

실시예 23: Huh7 세포에서 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 변화된 IL8 의 발현 분석

Cks1b RNA 사일런싱에 의한 IL8 유전자 발현 감소는 노던 블럿팅에 의해 확인되었으며(도 22), 또한 IL8 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA)에 의하여 확인되었다. Huh7 모세포, 모크 클론 세포 (M1 및 M2) 또는 Cks1b-녹다운 클론 세포 (shCks1b-C7, -C9, 및 -C11)를 3x10⁵ 세포/웰의 농도로 6-웰 플레이트에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 8시간 동안 배양하였다. 상기 세포들을 PBS로 세척하고 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 18시간 동안 배양하였다. 도 23에서 나타낸 바와 같이, Huh7 세포를 각각 IkB-a 인산화의 선택적 저해제 (BAY11-7082, Calbiochem, U.S.A.), MEK (U0126, A.G. Scientific Inc., CA) 및 PI3K (LY294002, A.G. Scientific Inc., CA)의 선택적 저해제 5~50nM로 30분 동안 배양하였다. 이후 상기 세포들에 10% FBS를 첨가하고 각 저해제의 존재하에서 5시간 또는 24시간 동안 추가 배양하였다. 대조군은 단지 동량의 비히클만 처리하였다 (해당하는 DMSO의 최대 부피). 상기 배양 상청액을, OptEIATM 인간 IL8 ELISA 키트 2 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 사용하여 제조사의 설명에 따라 IL8 단백질의 수준에 대하여 분석하였다. 상기 배양 상청액을, 항-인간 IL8 단일클론 항체 (mAb)-코팅된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 그 이후, 상기 플레이트를 세척용 완충용액으로 씻고 비오틴화된 항-인간 IL8 mAb로 1시간 동안 배양하였다. 세척 후에, 상기 플레이트를 홀스래디쉬 퍼옥시다아제-결합된 스트렙타비딘(horseradish peroxidase-conjugated streptavidin)으로 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 나아가 상기 분석에서 기질시약(substrate reagent)으로는 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)을 사용하였다. 실온에서 약 30분 배양 후에, 490nm에서의 흡광도를 ELISA 리더기를 이용하여 측정하였다..

도 23a는 IL8이 Cks1b RNA 사일런싱에 의해 mRNA 수준에서뿐만 아니라 단백질 수준에서 98%까지 현저히 발현 감소 될 수 있음을 보여준다. IL8 발현의 조절에 관여하는 인자를 조사하기 위하여, 세포들을 각 신호 전달 경로의 선택적 저해제로 처리하고 IL8 생성에 대한 효과를 측정하였다. 도 23b에서 보여주는 것처럼, NFkb, MEK, 및 PI3K 경로에 대한 각각의 선택적 저해제들은, 용량-의존적 방식(dose-dependent manner)으로 IL8 생성을 억제함을 보여 주었으며, 이는 이들 각각의 신 호 전달 경로의 활성이 Cks1b에 의한 IL8 단백질의 조절에 관여함을 시사한다. 상기 효과들은 5시간 및 24시간 동안 배양된 세포에서 유사하게 나타났다 (데이터 도시 않음). 또한, IL8 발현에 대한 저해제들의 상기 효과는 노던 블럿팅에 의해 유전자 전사 수준에서 분석되었다. 도 23c에서 알 수 있는 것처럼, MEK 또는 PI3K 경로 저해제인 U0126 및 LY294002는 각각 IL8 유전자 발현을 현저히 감소시킨다.

이와 대조적으로, 노던 블롯팅 결과, IkB-a 인산화 저해제인 BAY11-7082는 IL8 유전자 전사에 있어서 유의성 있는 효과를 나타내지 않았으며, 이러한 결과는 NFkB 경로가 전사 후 단계에서 IL8 발현을 조절할 가능성을 시사하였다.

실시예24 : HCC 에서 Cks1b 발현에 대한 공공데이터( Public data ) 조사

실시예1에서 나타낸 Cks1b의 간암조직에서의 높은 발현 증가와 맥락을 같이하여, 공공 데이터베이스(www.oncomine.org)로부터 수득한 Cks1b 발현 프로파일 또한, 비-종양 간 조직에서보다 HCC 조직에서 Cks1b가 현저히 증가하였음을 보여주었다 (도 24).

실시예25 : p27 과발현에 따른 HCC 세포에서의 종양발생 능력 감소

(1) Huh7 세포에서 재조합 렌티바이러스에 의한 p27 의 과발현

p27-과발현 렌티바이러스 발현 벡터의 제조는 다음과 같이 이루어졌다. RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 Huh7 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. p27의 ORF를 다음의 프라이머들을 사용하여 RT-PCR에 의해 수득하였다: 센스 5'- CGGGATCCATGTCAAACGTGCGAGTGTC-3'(서열번호 26) 및 안티센스, 5'-CCGCTCGAGTTACGTTTGACGTCTTCTGAG-3'(서열번호 27). PCR 조건은 이하와 같다: 95℃에서 1분간 변성, 65℃에서 1분 동안 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1분 동안 신장(extension) (30 싸이클). 상기 PCR 생성물을 BamHI/XhoI으로 분해하고, 과발현용 pLenti6/V5 벡터의 BamH1/XhoI 사이에 라이게이션하였다 (pLenti-p27로 명명). 공(Empty) pLenti6/V5를 모크 벡터(mock vector)로서 사용하였다.

재조합 렌티바이러스를 제조사의 설명에 따라 293FT 세포에서 만들었다. p27-과발현 렌티바이러스-함유 상청액을 수거하여 추후 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. Huh7에서 p27을 과발현하기 위하여, 세포들을 p27-과발현 재조합 렌티바이러스 (LV-p27) 및 모크 렌티바이러스 (LV-Mock)로 각각 감염시켰다 (M.O.I.= 0.5).

상기 감염된 세포들을 블라스티딘 (Invitrogen, US) 3ug/ml로 14일 동안 선별하고, 상기 세포의 전체 RNA를 추출하여 p27에 대한 노던 블럿팅을 수행하였다. 노던 블럿을 위한 p27 프로브를 제조하기 위해 사용된 프라이머들은 다음과 같으며, Huh7 전체 RNA를 사용한 RT-PCR 방법을 이용하여 만들었다: 센스, 5'-ACGGGAGCCCTAGCCTGGAGC-3'(서열번호 28) 및 안티센스, 5'-TGCCCTTCTCCACCTCTTGCC-3'(서열번호 29). PCR의 어닐링 온도는 62℃로 하였다.

도 25a는 재조합 렌티바이러스에 의한 p27의 과발현이 Huh7 세포에서 성공적으로 이루어졌음을 보여준다. 이 실험은 일차적으로 HCC 세포에서 Cks1b 녹다운 후에 나타나는 OPN, IL8, 및 uPA의 발현감소가 p27 단백의 증가에 기인하는 것인지 를 알아보기 위해 수행되었다. p27-I, II, III, 및 III'는 p27-과발현 Huh7 세포의 개개의 형질도입 세포 풀(pool)에 해당한다. p27-C1 , C2, C4, C5, 및 C6는 p27-III' 세포 풀로부터 분리된 단일 클론들에 해당한다.

(2) 비부착성 성장에 있어서 p27 의 영향

p27의 과발현은 웨스턴 블럿 분석으로 확인하였으며, 이 세포들을 이후 실험에 사용하였다(도 25b (a)).

Huh7 세포에서의 p27 과발현이 Huh7의 종양 형성능에 미치는 효과를 알아보기 위하여, 앞서 설명한 소프트 아가 실험을 수행하였다 (Biochem. Biophys. Res. Commun., 315, 950-958, 2004). 60mm 배양 접시에서, 2x10⁴ 세포들을 0.3% 상부(top) 아가로오스 (2 ml)에 혼합한 후, 0.5% 하부(bottom) 아가로오스 (5 ml) 위에 플레이팅하였다 상기 배양 접시들을 37℃의 5% CO₂ 조건하에 22일 동안 배양하였다. 생성된 콜로니들은 광학현미경으로 모니터링 하고 사진촬영을 하였다(도 25b (b)).

상기 실험에서, 본 발명자들은 모크 세포와 비교하여 p27 과발현이 Huh7 세포의 콜로니-형성(비부착성 증식) 능력을 현저히 감소시킴을 관찰하였고, 이러한 결과는 Cks1b 녹다운의 결과와 일치하였다.

(3) Huh7 세포의 세포주기에 있어서 p27 과발현의 영향

p27 과발현의 세포 주기에 대한 영향을 알아보기 위해서, 제조사의 설명에 따라 CycleTEST PLUS DNA 시약 키트 (Becton Dickinson, CA, USA)를 이용한 유세포 분석법을 수행하였다. 5x10⁴ 세포들을 100mm 배양 접시에 플레이팅 하고 37℃의 5% CO₂ 인큐베이터에서 4일 동안 배양하였다. 세포들을 트립신 처리하고, PBS로 2회 세척한 후, 프로피디움 아이오다이드로 염색하여 FACScan 유세포 분석기 (Becton Dickinson, CA)로 분석하였다. 세포주기의 각 단계에 대한 백분율은 세포주기 분석 소프트웨어 (ModFit LT V3.0)를 사용하여 측정하였다.

상기 결과는 Huh7 세포에서 p27 과발현이 G1의 세포 수는 증가시키는 반면, S기의 세포 수는 감소시킴을 보여 주었으며, 이는 전반적으로 Cks1b 녹다운에 의한 세포주기 프로파일의 변화와 유사함을 보여주었다(표6).

[표6]

(4) Huh7 세포의 체외( in vitro ) 침윤 능력에 대한 p27 의 영향

세포 침윤 능력에 대한 p27 과발현의 효과를 알아보기 위하여, 매트리겔 침윤 분석을 수행하였다. 2.5x10⁵ 세포들을 100mm 배양 접시에 플레이팅 하고 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶겼다.

분석 당일 날, 트랜스웰 (직경 6.5-mm, pore size 8um) 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(Costar, Cambridge, MA, USA)의 상부에 매트리겔 (각 웰 당 40 ㎍; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 챔버 하부에 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가한 후, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 단일 세포 현탁액(single-cell suspensions)을 만든다. 상기의 세포 현탁액을 멤브레인 필터 위에 주입한 다음(1x10⁵ 세포/well), 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 23시간 동안 배양하였다. 멤브레인 필터들을 PBS로 세척하고, 상부 표면의 이동하지 않고 부착되어 있는 세포들을 면봉으로 제거하였다. 침윤되어 멤브레인의 하부 표면(lower surface)에 부착해 있는 세포들을 15분 동안 메탄올로 고정시키고, 15분 동안 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 염색된 필터들을 30% 아세트산으로 추출하였다. 595nm에서 추출액의 흡광도를 측정하여 간접적으로 세포의 침윤능을 정량화하였다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다.

도 25c는 모크 세포와 비교하여, p27 과발현이 Huh7 세포들의 체외 침윤 능력을 현저히 감소시킴을 보여준다 (p27-C1의 경우 모크의 48.1%의 침윤능 보임, p<0.002; p27-C5의 경우 모크의 44%의 침윤능 보임, p<0.005; p27-C6의 경우 모크 의 35.68%의 침윤능 보임, p<0.001). 이러한 결과에 기초하여 Cks1b 녹다운에 의한 Huh7 세포들의 침윤 능력 감소는 적어도 부분적으로 p27의 분해 감소에 의한 p27 단백 수준 증가 때문이다. 따라서, Cks1b 녹다운에 따른 p27 증가는 HCC 세포에서 Cks1b 감소에 의해 나타나는 항암 효과에 어느 정도 기여하는 것으로 보인다.

실시예 26: HCC 세포에서 p27 의 과발현이 오스테오포틴 ( OPN ) 및 인터루킨 8(IL8)의 발현에 미치는 영향 분석(웨스턴 및 노던 블럿 분석 )

Cks1b 녹다운에 의해 유도되는 OPN 및 IL8의 유전자 및 단백질 발현 감소가 프로테오좀-의존성 분해 저하에 의한 p27의 증가에 기인하는지를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 p27-과발현 Huh7 세포를 사용하여 p27 과발현에 의한 OPN과 IL8의 발현 변화를 웨스턴 및 노던 블럿 분석법을 이용하여 알아보았다.

p27 및 GAPDH의 웨스턴 블럿 분석을 위하여, 세포용해 버퍼 (M-PERR Mammalian Protein Extraction Reagent, Pierce, US)를 이용하여 제조사의 설명에 따라 세포용해물을 제조하였다. 상기 상청액을 수거하고, 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 분석 시약(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, US)을 이용하여 측정하였다. 20-50mg의 단백질을 로딩 버퍼와 혼합하고 95℃에서 5분 동안 변성시킨 후, SDS-PAGE를 사용하여 분별하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad Laboratories, CA, US)으로 옮기고 ECL 플러스 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 사용하여 웨스턴 블럿팅을 수행하였다.

세포 배양액으로 분비되는 OPN 및 IL8의 분석을 위하여, Huh7 세포를 무혈청 배지로 2일 배양한 후 원심분리에 의해 배양 상청액을 수거하고, 상기 단백 분석을 위해 사용하였다. 그 결과, p27 증가는 Cks1b 녹다운에서처럼 Huh7 세포에서의 OPN 단백질 발현은 현저히 억제하였으나, IL8 단백질의 경우에는 영향을 보이지 않았다.

OPN 단백의 발현 감소가 유전자 발현의 전사 수준에서의 감소 때문인지를 조사하기 위하여, 역시 노던 블럿 분석을 수행하였다. 전체 RNA를 추출하여 OPN 및 IL8의 분석에 이용하였다. 다음 프라이머들을 이용하여 RT-PCR에 의해 OPN과 IL8 r각각의 노던 프로브를 제작하였다: 1.OPN, 센스, 5'-CGGGATCCATGAGAATTGCAGTGATTTGC-3' (서열번호 30) 및 안티센스, 5'- CCGCTCGAGTTAATTGACCTCAGAAGATGC-3'(서열번호 31) 2. IL8, 센스, 5'-ATGACTTCCAAGCTGGCCG-3'(서열번호 32) 및 안티센스, 5'- TTATGAATTCTCAGCCCTC-3'(서열번호 33). 18S rRNA를 로딩 대조군으로 사용하였다. 그 결과, p27 과발현에 의한 OPN 발현 감소가 유전자 발현의 전사적 수준에서의 감소에 의한 결과이며, IL8 유전자 발현은 p27 발현 수준과 무관함을 발견하였다.

상기 결과는 Cks1b에 의한 OPN 발현의 조절이 일부 p27-의존성일 수 있는 반면, Cks1b에 의한 IL8의 조절은 p27-비의존성 경로에 의해 이루어진다는 것을 시사하고 있다. 그러므로, HCC 세포에서, Cks1b 녹다운에 의한 IL8 발현 감소는 기존에 알려진 Cks1b의 p27 프로테오좀-의존성 분해 경로에 있어 Skp2의 보조인자로서의 기능과는 무관한 Cks1b의 새로운 특이적 기능에 의한 결과일 가능성이 있다.

실시예 27: Cks1b 녹다운에 의한 OPN 발현 감소의 항- HCC 효과의 평가

(1) OPN -녹다운 Huh7 세포의 제조

OPN의 RNA 간섭은 Cks1 RNAi에서 사용된 것과 같은 방식으로, pLL3.7B 벡터를 사용하여 렌티바이러스를 기초로 한 발현시스템으로 수행하였다. OPN에 대한 shRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 HpaI 및 XhoI 사이의 위치로 클로닝하였다. OPN 녹다운을 위해 사용된 상기 전체 올리고뉴클레오티드 서열은 이하와 같다: 센스, 5'-TGAAGATAAACACCTGAAATTTCAAGAGAATTTCAGGTGTTTATCTTCTTTTTTC -3'(서열번호 34), 안티센스, 5'-TCGAGAAAAAAGAAGATAAACACCTGAAATTCTCTTGAAATTTCAGGTGTTTATCTTCA-3'(서열번호 35).

상기 제작된 OPN의 RNA 간섭 벡터(pLL3.7B-OPN이라 명명)는 OPN RNA 사일런싱 렌티바이러스(LV3.7B-OPN)의 생산을 위해 사용되었다. 상기 RNA 사일런싱 렌티바이러스는 상기 실시예 3(1)에서 언급한 것과 동일한 공정을 따라서 생산하였다. 상기 공벡터 pLL3.7B를 모크 벡터로서 사용하여 모크 렌티바이러스(LV3.7B-mock)를 제조하였다.

상기 LV3.7B-OPN, 및 대조군 렌티바이러스 LV3.7B-모크를 Huh7의 형질도입에 사용하였다. 상기 감염된 세포들을 블라스티시딘 (3ug/ml)으로 14일 동안 선별한 후, 노던 블럿 (도 27a) 및 웨스턴 블럿 분석 (도 27b)을 이용하여 OPN 발현을 분석하였다.

노던 블럿 분석은 전체 RNA를 사용하여 수행되었고, OPN의 웨스턴 블럿 분석은 OPN-녹다운 및 대조군 Huh7 세포를 2일 동안 무혈청 배지로 배양한 후 원심분리 법을 이용해서 배양 상청액을 수거하여 수행되었다. cMyc 및 p27의 웨스턴 블럿 분석은 상기 세포들의 전체 세포 용해물(total cell lysates)을 통해 이루어졌다

도 27a에서, PI, PII, 및 PIII는 LV3.7B-OPN으로 감염된 Huh7 세포의 각각의 감염 세포 풀(pool)을 의미하고, C1-C9 및 C13는 PIII 세포로부터 분리된 단일 클론을 의미한다. 상기의 결과는 제조된 OPN RNAi 벡터가 Huh7 세포에서 OPN 녹다운을 위해 성공적으로 작용했음을 보여준다.

(2) 체외 증식능 분석

Cks1b 녹다운에 의해 유도되는 OPN 발현 감소가 Cks1b 녹다운의 항-HCC 효과에 기여하는지의 여부를 알아보기 위하여, 체외 증식 분석을 수행하였다. 이를 위해 세포들을 2x10⁴ cells/well의 농도로 6웰 플레이트에 씨딩하였다 [Huh7, 모크 Huh7 세포, 및 OPN-녹다운 Huh7 클론들 (shO-2, shO-3, shO-4, 및 shO-5)]. 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 세포들을 37℃ 하, CO₂ 인큐베이터에서 9일 동안 배양한 후 계수하였다. 데이터는 평균±표준편차(SD)로 나타내었다(도 27b).

상기 결과는 OPN의 RNA 간섭이 대조군 세포와 비교하여, HCC 세포 증식을 현저히 감소시킨다는 것을 보여준다: shOPN-C2 (모크 세포의 21.2%, p<0.00005), -C3 (모크 세포의 3.73%, p<0.000005), -C4 (모크 세포의 8.44%, p<0.000005), -C5 (모크 세포의 3.03%, p<0.000005).

(3) 체외 콜로니 형성능 분석

Cks1b 녹다운에 의해 유도되는 OPN 발현 감소가 Cks1b 녹다운의 항-HCC 효과에 기여하는지의 여부를 알아보기 위하여, 소프트 아가 분석법을 앞서 기술한 바에 따라서 수행하였다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 315, 950-958, 2004). 60-mm 배양 접시에, 2x10⁴ 세포를 0.3% 상부 아가로오스 (2 ml)에 혼합하고, 0.5% 하부 아가로오스(5 ml) 상에 플레이팅하였다. 상기 배양 접시를 37℃의 5% CO₂ 대기 하에서 22일 동안 배양하였다. 생성된 콜로니들을 광학현미경으로 모니터링하고, 사진촬영하였다.

도 27c와 관련하여, 본 발명자들은 OPN 녹다운이 상기 실험기간 동안, 모크 세포와 비교하여 Huh7 세포의 콜로니-형성 능력을 현저히 손상시킴을 관찰하였다. 이는 Cks1b-녹다운 Huh7 세포의 경우와 유사한 결과였다. 이러한 실험 결과는, Cks1b 녹다운에 의한 비부착성 증식능(anchorage-independent growth)의 감소가 부분적으로 Cks1b 발현 감소에 의해 p27 단백질 수준이 증가하고 이에 의한 OPN의 발현 감소 때문임을 시사한다.

(4) 체외 침윤능 분석

침윤 능력에 대해 OPN 녹다운이 미치는 효과를 조사하기 위하여, 매트리겔 침윤능 분석법(Matrigel invasion assay)을 수행하였다. 2.5x10⁵ 세포들을 100mm 배 양 접시에 플레이팅 하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 2일 동안 배양하였다. 그 후, 세포들을 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶겼다. 분석 당일, 8.0-㎛ 구멍이 있는 트랜스웰 (직경 6.5-mm) 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(Costar, Cambridge, MA, USA)의 멤브레인 필터 상부를 매트리겔 (각 웰 당 40 ㎍; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 챔버 하부에 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가한 후, 단일 세포 현탁액(single-cell suspensions)을 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 제조한 후 코팅된 멤브레인 상에 씨딩한 후(각 웰당 1x10⁵ 세포), 37℃, 5% CO₂ 하에서 23시간 동안 배양하였다. 필터들을 세척하고, 상부 표면의 세포들을 면봉으로 제거하였다. 이동하여 멤브레인의 하부 표면(lower surface)에 부착하고 있는 세포들을 15분 동안 메탄올로 고정시키고, 15분 동안 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 필터들을 30% 아세트산으로 추출하였다. 595 nm에서 흡광도를 측정하여 간접적으로 세포의 침윤능을 정량하였다.

도 27d는 세 개의 독립적인 실험의 대표적인 결과를 나타낸다 (평균 ± SD). 대조군 세포(Huh7, 모크, 및 모크-2)와 비교하여, OPN 녹다운 Huh7 세포들은 침윤 능력에 있어서 현저한 감소를 보였다(shO-C2, 모크세포의 63.37%에 해당하는 침윤능 보임, p<0.005; shO-C3, 모크세포의 66.86%, p<0.01; shO-C4, 모크세포의 56.11%, p<0.0005). 모크-2 세포들은 비특이적 shRNA를 발현하는 대조군 모크 바이러스 (비특이적 shRNA 발현 벡터인 pLL3.7B-2로부터 제조된 재조합 렌티바이러스, LV-3.7B-2)를 이용하여 제조하였다. 상기 pLL3.7B-2는 다음에 제시된 프라이머들을 어닐링(annealing)한 후에 pLL3.7B의 HpaI 및 XhoI 부위 사이에 삽입하여 만들어졌다. 사용된 프라이머는 다음과 같다: 센스, 5'-TGTTCTCCGAACGTGTCACGTTCAAGAGACGTGACACGTTCGGAGAACTTTTTTC-3'(서열번호 36), 안티센스, 5'-TCGAGAAAAAAGTTCTCCGAACGTGTCACGTCTCTTGAACGTGACACGTTCGGAGAACA-3'(서열번호 37).

위의 실험 결과는, OPN이 종양 세포 침윤에서 결정적인 역할을 하며, HCC 세포에서 종양 전이에 대한 Cks1b의 작용을 매개하는 한 요소로 작용할 수 있음을 강하게 시사한다. 따라서, Cks1b 녹다운에 의해 나타나는 HCC 세포의 침윤능 저하는 기전적으로 보아, 일부 또는 상당 부분, Cks1b 녹다운에 의해 수반된 세포내 p27 단백 증가가 OPN의 발현 감소를 유도하여 나타난 결과로 보인다.

실시예 28: Cks1b 녹다운에 의한 IL8 발현 감소의 항- HCC 효과의 평가

(1) IL8 -녹다운 Huh7 세포의 제조

IL8의 RNA 간섭은 Cks1 RNAi에서 설명한 대로, pLL3.7B 벡터를 사용하여 렌티바이러스 발현 시스템을 사용하여 수행하였다. IL8에 특이적인 shRNA를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 HpaI 및 XhoI 제한 부위 사이에 있는 위치로 클로닝하였다. 상기 전체 올리고뉴클레오티드 서열은 이하와 같이 IL8 녹다운을 위하여 설계되었다: 센스, 5'-GAGAATATCCGAACTTTAATTCAAGAGATTAAAGTTCGGATATTCTCTTTTTTC -3'(서열번호 38), 안티센스, 5'-TCGAGAAAAAAGAGAATATCCGAACTTTAATCTCTTGAATTAAAGTTCGGATATTCTCA-3'(서열번호 39).

상기 제조된 IL8의 RNA 간섭 벡터(pLL3.7B-IL8)를 이용하여 IL8 RNA 사일런싱 재조합 렌티바이러스(LV3.7B-IL8)를 생산하였다. 상기 RNA 사일런싱 렌티바이러스를 상기 실시예 3(1)에서 언급한 것과 동일한 공정에 따라서 생산하였다. 상기 공벡터 pLL3.7B를 모크 벡터로서 사용하여 모크 렌티바이러스(LV3.7B-mock)를 생산하였다.

상기 LV3.7B-IL8 및 대조군 렌티바이러스 LV3.7B-모크를 Huh7의 형질도입에 사용하였다. 상기 감염된 세포들을 블라스티시딘 (3ug/ml)으로 14일 동안 선별한 후, 웨스턴 블럿 분석을 이용하여 IL8 발현을 분석하였다. IL8의 웨스턴 블럿 분석은 IL8-녹다운 및 대조군 Huh7 세포의 무혈청 DMEM 배지에서 2일 동안 배양한 후 원심분리를 통해 얻어진 배양 상청액에 의해 수행되었다.

도 28a에서, shIL8는 LV3.7B-IL8으로 감염시킨 Huh7 세포의 풀(pool)을 의미하고, C1 및 C2는 상기 세포 풀로부터 분리된 단일 클론을 각각 의미한다. 이러한 결과는 제조된 IL8 RNAi 벡터가 Huh7 세포에서 IL8 녹다운을 위해 성공적으로 작용했음을 보여준다.

(2) 체외 증식 분석

Cks1b 녹다운에 유도되는 IL8 발현 감소가 Cks1b 녹다운의 항-HCC 효과에 기여하는지 여부를 알아보기 위하여, 체외 증식 분석을 수행하였다. 이를 위해 세포들을 2x10⁴ cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다 (Huh7, 비특이적 shRNA를 발현하는 모크-2 Huh7 세포, 및 shIL8로 표시된 IL8-녹다운 Huh7 세포). 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 세포들을 37℃하 CO₂ 인큐베이터에서 8일 동안 배양한 후 계수하였다.

상기 결과 (도 28b)는 IL8 녹다운이 대조군 Huh7 세포 및 모크 세포와 비교하여, HCC 세포 증식을 현저히 감소시킴을 보여준다 (shIL8의 경우 모크-2 세포의 30.1%의 증식을 보임, p<0.00001).

(3) 체외 콜로니 형성 분석

Cks1b 녹다운에 유도되는 IL8 발현 감소가 Cks1b 녹다운의 항-HCC 효과에 기여하는지 여부를 알아보기 위하여, 소프트 아가 분석을 앞서 기술한 바에 따라서 수행하였다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 315, 950-958, 2004). 60-mm 배양 접시에서, 2x10⁴ 세포를 0.3% 상부 아가로오스 (2ml)에 혼합하고, 0.5% 하부 아가로오스(5ml) 상에 플레이팅하였다. 상기 배양 접시를 37℃의 5% CO₂ 조건 하에서 28일 동안 배양하였다. 생성된 콜로니들을 광학현미경으로 모니터링하고, 사진촬영하였다.

도 28c 와 관련하여, 본 발명자들은 IL8 녹다운이 상기 기간 동안, 모크 세포와 비교하여 Huh7 세포의 콜로니-형성 능력을 현저히 감소시킴을 관찰하였다. OPN 녹다운에서처럼, 이는 Cks1b-녹다운 Huh7 세포의 경우와 비슷한 결과였다. 이러한 결과에 기초하여, Cks1b 녹다운에 의한 비부착증식능(anchorage-independent growth)의 감소는, Cks1b 녹다운에 의해 수반되는 IL8의 발현 감소에 의해, 부분적으로 또는 상당 부분, 유도된 것으로 판단된다.

(4) 체외 침윤 분석

세포의 침윤 능력에 대한 IL8 녹다운 효과를 조사하기 위하여, 매트리겔 침윤 분석 시험(Matrigel invasion assay)을 수행하였다. 이를 위해 세포들을 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 3일 동안 배양한 후 후, 세포들을 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶겼다. 분석 당일, 트랜스웰 (직경 6.5-mm, pore 크기 8um) 폴리카보네이트 멤브레인 삽입물(Costar, Cambridge, MA, USA)의 상부를 매트리겔(각 웰 당 40 ㎍; BD Biosciences, Bedford, MA)로 코팅하였다. 챔버 하부에 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지를 첨가한 후, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에 단일 세포 현탁액(single-cell suspensions)을 만든 후, 트랜스웰 멤브레인 필터 상에 씨딩하였다(각 웰당 1x10⁵ 세포). 이후 37℃, 5% CO₂ 하에서 23시간 동안 배양한 후 필터들을 세척하고, 상부 표면의 이동하지 않은 세포들을 면봉으로 제거하였다. 침윤되어 하부 표면(lower surface)에 부착해 있는 세포들을 15분 동안 메탄올로 고정시키고, 15분 동안 0.1% (w/v) 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 상기 필터들을 30% 아세트산으로 추출하였다. 침윤되어 있는 세포들을 595 nm에서 흡광도를 측정하여 간접적으로 정량하였다. 데이터를 평균±표준편차(SD)로 나타내었다.

도 28d에서, 대조군 세포(Huh7 및 모크-2)와 비교하여, IL8-녹다운 Huh7 세 포들은 침윤 능력에 있어서 현저한 감소를 보였다 (shIL8 풀(pool) 세포의 경우, 모크 세포의 44.89%에 해당하는 침윤능 보임, p<0.005; shIL8-C1, 모크세포의 19.57%, p<0.001; shIL8-C2, 모크세포의 40.41%, p<0.005). 이러한 결과들은 IL8이 종양 세포의 침윤 작용에서 결정적인 역할을 수행하며, HCC 세포에서 Cks1b에 의한 종양 전이에 일부 또는 상당 부분 관여함을 시사한다.

실시예 29: Cks1b 녹다운에 의한 IL8 발현감소에 대한 기전적 연구: Cks1b 녹다운에 의한 NFkB 경로 활성 억제

(1) 프로모터 활성 분석

몇몇의 신호 전달 경로가 IL8 발현 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. IL8 프로모터는 그 내부에 NFkB 및 AP1 인핸서 서열을 포함하는 것으로 일찍이 보고되었다 (Journal of Leukocyte Biology, volume 72, pp847-855). Cks1b에 의한 IL8 유전자 발현의 조절 메커니즘을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 NFkB 또는 AP1 신호 경로가 HCC 세포에서 IL8 유전자 발현의 조절에 참여하는지 여부를 시험하였다. 이를 위하여, 본 발명자는 NFkB 인핸서[pNFkB-Luc: (TGGGGACTTTCCGC)(서열번호 40)x5를 함유], AP1 인핸서 [pAP1-Luc: (TGACTAA) x7를 함유] 또는 IL8 프로모터(pIL8-Luc)를 함유하는 루시페라아제 리포터 벡터 시스템(pGL3-Basic, Promega)을 사용하였다. 상기 pIL8-Luc는 Huh7 세포의 전체 RNA를 사용하여 RT-PCR에 의해 제조되었다. pIL8-Luc 제조를 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다; 센스, 5'-GATGCTAGCGATAATTCACCAAATTGTGGAG-3'(서열번호 41), 안티센스, 5'- GATCTCGAGGTTTACACACAGTGAGATGGT-3(서열번호 42)'. 상기 분석은 제조사의 설명에 따라 수행되었다 [루시페라아제 분석 시스템 (Promega) 및 베타-갈락토시다아제 효소 분석 시스템 (Promega)].

형질감염시키는 날에 세포들을 2x10⁶ cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 8시간 후에 상기 1ug의 루시페리아제 리포터 벡터 및 1ug의 RSV-LacZ (형질감염 효율의 normalization을 위한 베타-갈락토시다아제 발현 벡터)를 리포펙타민2000 (Invitrogen)을 사용하여 동시에 함께 형질감염시켰다. 형질감염 뒷날, 배지를 신선한 배양 배지로 교체하였다. 24시간 후에, 루시페라아제 분석 및 베타-갈락토시다아제 분석을 수행하였다. 도 29 (a)의 결과는 Cks1b 녹다운이 IL8 프로모터 활성 및 NFkB 시그널링 경로 활성을 현저히 감소시키지만, AP1 경로에는 영향을 미치지 않음을 보여준다. 이로부터 HCC 세포에서 Cks1b 녹다운에 의한 IL8 발현 감소는,(일부 또는 상당부분), Cks1b 녹다운에 의한 NFkB 시그널링 활성의 억제로 인한 IL8 유전자의 전사 감소로부터 비롯된 결과임을 알 수 있었다.

(2) 웨스턴 분석

1) Cks1b -녹다운 Huh7

NFkB 활성이 Cks1b 녹다운에 의해 손상됨을 확인한 후에, 인산화를 통해 IkBa(NFkB 억제제)를 억제함으로써 NFkB 경로를 활성화시키는 IKKa 및 IKKb와, 및 NFkB(p50) 자체에 대한 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. IL8을 제외한 전체 세포 용해물(20-50ug protein/lane)을 이용하여 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(IL8은 세포 용해물 대신 2일 동안 무혈청 DMEM 배지에서 배양한 후 원심분리를 통해 얻어진 배양 상청액 사용). 상기 실험은 Cks1b 녹다운에 의한 NFkB 경로의 저해를 통하여 IL8 유전자 발현이 감소함은, HCC 세포에서 Cks1b 녹다운에 의해 유도된 IKKb 및 IKKa의 단백 수준 저하 때문임을 명확히 보여주었으며, 이는 HCC 세포 특이적인 Cks1b의 새로운 기능일 가능성도 배제할 수 없다(도 29 B).

2) p27 -과발현 Huh7

NFkB 활성이 Cks1b 녹다운에 의해 손상됨을 확인한 후에, p27-과발현 Huh7 세포의 전체 세포 용해물을 이용하여 IKKa 및 IKKb의 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다. 이 실험은 Cks1b 녹다운에 의한 NFkB 경로의 억제에 있어서 p27 관여 가능성을 알아보기 위한 것이다. 상기 결과에 기초하여, Cks1b 녹다운에 의한 NFkB 경로의 저해를 통하여 IL8 유전자 발현이 감소함은 Cks1b 감소에 의한 특이적 결과이며, 이는 HCC 세포에서 Cks1b 녹다운에 의한 p27 증가와는 연관이 없음을 알 수 있었다(도 29 b).

실시예 30: SK-Hep1에서 Cks1b 과발현의 영향 평가

(1) Cks1b 과발현

SK-Hep1에서 Cks1b의 과발현은 Huh7 세포에서와 동일한 방법으로 이루어졌다. 이 실험의 목적은 Huh7 세포 이외의 다른 간세포암종 세포의 세포 성장에서도 Cks1b가 중요한 역할을 하는지 여부를 조사하는 것이다. Cks1b-과발현 SK-Hep1 클론 (Cks1-C4 and -C6)을 노던 블럿 분석에 의해 규명하였다 (도 30). Cks1b가 SK-Hep1 세포에서도 콜로니-형성 능력과 관련이 있다는 것을 증명하기 위하여 소프트 아가 분석을 수행하였다. 60-mm 배양 접시에서, 2x10⁴ 세포를 0.3% 아가를 포함하는 상부 층에 섞어 플레이팅하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 13일 동안 배양한 후, 사진 촬영을 하였다 (도 30a).

상기 결과는 Cks1b 과발현이 SK-Hep1 세포의 비부착증식(anchorage-independent growth)을 현저히 촉진함을 보여주었다. 또한, 체외 증식 분석을 수행하였다. 이 분석에서, 세포들을 2x10⁴ cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 6일 동안 배양하였다. 계수된 세포수는 Cks1b의 과발현이 SK-Hep1 세포의 체외 증식률을 크게 촉진시킴을 나타낸다(Cks1b-C4의 경우 모크 세포의 214%의 증식률 보임, p<0.000001; Cks1-C6의 경우 모크 세포의 175% , p<0.00001).

(2) Cks1b 녹다운

SK-Hep1에서 Cks1b 녹다운이 Huh7 세포에서와 동일한 방법으로 이루어졌다. 이 실험의 목적은 Huh7 세포 이외의 다른 HCC 세포에서도 Cks1b 녹다운이 동일한 항암 효과를 가지는지 여부를 조사하기 위한 것이다.

Cks1b-녹다운 SK-Hep1 클론 (shCks1-C3 and -C4)을 노던 블럿 분석에 의해 규명하였다(도 30b). Cks1b가 SK-Hep1 세포의 콜로니-형성 능력과 관련이 있다는 것을 증명하기 위하여 소프트 아가 분석을 수행하였다. 60-mm 배양 접시에서, 2x10⁴ 세포를 0.3% 아가를 포함하는 상부 층에 플레이팅하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂에서 13일 동안 배양한 후 사진 촬영을 하였다. 상기 결과는 Cks1b 녹다운이 SK-Hep1 세포의 경우에도 비부착성 증식능(anchorage-independent growth)을 현저히 손상시킴을 보여주었다.

SK-Hep1의 체외 세포 성장에 있어서, Cks1b의 효과를 조사하기 위하여, 체외 증식 분석시험을 수행하였다. 이 분석에서, 세포들을 1x10⁴ cells/well의 농도로 6-웰 플레이트에 플레이팅하고, 0.1% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 24시간 굶긴 후에, 6일 동안 배양하였다. 계수된 세포 수는 Cks1b의 녹다운이 SK-Hep1 세포의 체외 증식률을 크게 손상시킴을 나타낸다 (shCks1-C3의 경우 모크 세포의 37.02%, p<0.00005; shCks1-C4의 경우 모크 세포의 44.72%의 증식률 보임, p<0.0001).

SK-Hep1 세포의 전이 능력에 대한 Cks1b의 영향을 조사하기 위하여 체외 침윤 분석시험을 수행하였다. 상기 분석은 Huh7 세포의 실험에 적용한 것과 동일한 프로토콜에 따라서 수행하였으나, 단지 1x10⁵ cells/well을 사용하고 침윤을 위해 18시간 동안 배양하였다. Cks1b 녹다운은 SK-Hep1 세포의 체외 침윤 능력을 현저히 손상시킴을 명확히 보여주고 (shCks1-C3의 경우 모크 세포의 50.02%, p<0.001; shCks1-C4의 경우 모크 세포의 75.01%의 침윤능 보임, p<0.02), 이는 종양 전이 능 력의 감소를 시사한다.

(3) OPN , IL8 및 uPA 발현에 있어서 Cks1b 녹다운의 영향

SK-Hep1에서 OPN, IL8, 및 uPA의 발현 조절에 있어서 Cks1b 녹다운의 영향을 조사하기 위하여, Huh7 세포에서와 동일한 방법으로 실험하였다. 노던 블럿 분석은 Cks1b-녹다운 SK-Hep1 세포를 이용하여 수행하였다. 18S rRNA은 로딩 대조군을 대표한다. 도 30b의 결과는, Huh7 및 SK-Hep1을 포함하는 간세포암종에서 Cks1b가 OPN, IL8, 및 uPA의 조절에 있어서 중요한 역할을 수행함을 보여준다.

본 발명의 Cks1b RNAi를 함유한 조성물 및 재조합 벡터는 다양한 암질환, 특히 간세포암종, 전립선암, 폐암, 대장암 및 직장암의 치료 및 예방에 있어서 유용하게 이용될 수 있다. 그 중에서도 유전자 치료의 한 방법으로서의 유용성이 크다.

<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE <120> An Anticancer Composition <130> P07-B106 <150> US 60803013 <151> 2006-05-23 <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgtcgcaca aacaaattta ctattcggac aaatacgacg acgaggagtt tgagtatcga 60 catgtcatgc tgcccaagga catagccaag ctggtcccta aaacccatct gatgtctgaa 120 tctgaatgga ggaatcttgg cgttcagcag agtcagggat gggtccatta tatgatccat 180 gaaccagaac ctcacatctt gctgttccgg cgcccactac ccaagaaacc aaagaaatga 240 240 <210> 2 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser His Lys Gln Ile Tyr Tyr Ser Asp Lys Tyr Asp Asp Glu Glu 1 5 10 15 Phe Glu Tyr Arg His Val Met Leu Pro Lys Asp Ile Ala Lys Leu Val 20 25 30 Pro Lys Thr His Leu Met Ser Glu Ser Glu Trp Arg Asn Leu Gly Val 35 40 45 Gln Gln Ser Gln Gly Trp Val His Tyr Met Ile His Glu Pro Glu Pro 50 55 60 His Ile Leu Leu Phe Arg Arg Pro Leu Pro Lys Lys Pro Lys Lys 65 70 75 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatgtcg cacaaacaaa tttactat 28 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcatttcttt ggtttctt 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gaatggagga atcttggcgt t 21 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 6 tgaatggagg aatcttggcg ttcaagagac gccaagattc ctccattctt ttttc 55 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 7 tcgagaaaaa agaatggagg aatcttggcg tctcttgaac gccaagattc ctccattca 59 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gtgctggtaa ctgctttgct t 21 <210> 9 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 9 tgtgctggta actgctttgc ttcaagagag caaagcagtt taccagcact tttttc 56 <210> 10 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 10 tcgagaaaaa agtgctggta actgctttgc tctcttgaag caaagcagtt accagcaca 59 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggtgacttgc ggatttatgt t 21 <210> 12 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 12 tggtgacttg cggatttatg ttcaagagac ataaatccgc aagtcacctt ttttc 55 <210> 13 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 13 tcgagaaaaa aggtgacttg cggatttatg tctcttgaac ataaatccgc aagtcacca 59 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gaatctgaat ggaggaatct t 21 <210> 15 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 15 tgaatctgaa tggaggaatc ttcaagagag attcctccat tcagattctt ttttc 55 <210> 16 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antsense <400> 16 tcgagaaaaa agaatctgaa tggaggaatc tctcttgaag attcctccat tcagattca 59 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 gtccttactt cctaacatct t 21 <210> 18 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 18 tgtccttact tcctaacatc ttcaagagag atgttaggaa gtaaggactt ttttc 55 <210> 19 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 19 tcgagaaaaa agtccttact tcctaacatc tctcttgaag atgttaggaa gtaaggaca 59 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 gagtttgaga ccatggctgt t 21 <210> 21 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 21 tgagtttgag accatggctg ttcaagagac agccatggtc tcaaactctt ttttc 55 <210> 22 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 22 tcgagaaaaa agagtttgag accatggctg tctcttgaac agccatggtc tcaaactca 59 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gtttcagtgt actggaaact t 21 <210> 24 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 24 tgtttcagtg tactggaaac ttcaagagag tttccagtac actgaaactt ttttc 55 <210> 25 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 25 tcgagaaaaa agtttcagtg tactggaaac tctcttgaag tttccagtac actgaaaca 59 <210> 26 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 cgggatccat gtcaaacgtg cgagtgtc 28 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ccgctcgagt tacgtttgac gtcttctgag 30 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 acgggagccc tagcctggag c 21 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 tgcccttctc cacctcttgc c 21 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 cgggatccat gagaattgca gtgatttgc 29 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 ccgctcgagt taattgacct cagaagatgc 30 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 atgacttcca agctggccg 19 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 ttatgaattc tcagccctc 19 <210> 34 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 34 tgaagataaa cacctgaaat ttcaagagaa tttcaggtgt ttatcttctt ttttc 55 <210> 35 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 35 tcgagaaaaa agaagataaa cacctgaaat tctcttgaaa tttcaggtgt ttatcttca 59 <210> 36 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 tgttctccga acgtgtcacg ttcaagagac gtgacacgtt cggagaactt ttttc 55 <210> 37 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 tcgagaaaaa agttctccga acgtgtcacg tctcttgaac gtgacacgtt cggagaaca 59 <210> 38 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense <400> 38 gagaatatcc gaactttaat tcaagagatt aaagttcgga tattctcttt tttc 54 <210> 39 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense <400> 39 tcgagaaaaa agagaatatc cgaactttaa tctcttgaat taaagttcgg atattctca 59 <210> 40 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> enhancer <400> 40 tggggacttt ccgc 14 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gatgctagcg ataattcacc aaattgtgga g 31 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gatctcgagg tttacacaca gtgagatggt 30

Claims (16)

1. 서열번호 7 또는 13으로 표시되는 Cks1b RNAi를 함유하는 항암용 또는 암전이 억제용 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 Cks1b RNAi이 서열번호7로 표시되는 경우에는 서열번호5를, 서열번호13으로 표시되는 경우에는 서열번호11를 타겟(targetting)으로 하는 것을 특징으로 하는 항암용 또는 암전이 억제용 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 암은 방광암종(bladder carcinoma), 뇌종양(brain tumor), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장직장암(colorectal cancer),식도암(esophageal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 위장관기질종양(gastrointestinal srtomal tumor, GIST), 후두암(laryngeal cancer), 폐암(lung cancer), 골육종(esteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신세포암종(renal cell carcinoma) 및 갑상선암(thyroid cancer)으로 구성된 군에서 선택되는 것 또는 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양인 것을 특징으로 하는 항암용 또는 암전이 억제용 조성물.
4. 제3항에 있어서, 상기 암은 간세포암종, 전립선암, 폐암, 대장암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택되는 것 또는 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양인 것을 특징으로 하는 항암용 또는 암전이 억제용 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 암전이는 오스테오포틴(OPN) 및/또는 인터루킨 8(IL-8)의 발현증가에 의한 것을 특징으로 하는 항암용 또는 암전이 억제용 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 서열번호 7 또는 13으로 표시되는 Cks1b RNAi를 함유하는 항암용 또는 암전이 억제용 재조합 벡터.
11. 제10항에 있어서, 상기 암은 방광암종(bladder carcinoma), 뇌종양(brain tumor), 유방암(breast cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 대장직장암(colorectal cancer),식도암(esophageal cancer), 자궁내막암(endometrial cancer), 간세포암종(hepatocellular carcinoma), 위장관기질종양(gastrointestinal srtomal tumor, GIST), 후두암(laryngeal cancer), 폐암(lung cancer), 골육종(esteosarcoma), 난소암(ovarian cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신세포암종(renal cell carcinoma) 및 갑상선암(thyroid cancer)으로 구성된 군에서 선택되는 것 또는 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
12. 제11항에 있어서, 상기 암은 간세포암종, 전립선암, 폐암, 대장암 및 직장암으로 구성된 군에서 선택되는 것 또는 이들의 암성 종양, 및 이들의 일차 종양인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
13. 제10항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스는 렌티 바이러스인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
15. 삭제
16. 제10항의 재조합 벡터로 형질 전환된 미생물.

Images