KR100871529B1 - 정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 외과(surgical) 및 내과 치료(medical treatment)시에 특히 환자의 혈액 손실을 상당히 줄이는데 사용되고, 이러한 외과 및 내과 치료로부터 빠른 쾌유를 돕는데 사용되는 합성 단백질 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 정맥내 주사용으로 적합한 단백질 입자를 제조하는 방법은: a. 적절한 몰삼투압농도(osmolarity)의 버퍼 중에 단백질 분말을 용해하고; b. 테트라데실황산나트륨, 트윈(Tween)-80 및 트리톤(Triton) X-151로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 계면활성제를 상기 단백질 용액에 가하며; c. 글루타르알데히드 등의 공유결합 소분자를 포함하는 가교제 용액을 상기 단백질과 계면활성제의 혼합물에 가하고; d. 상기 단백질과 계면활성제와 가교제 용액의 혼합물에 알콜을 가하는 것을 포함한다.

Description

정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자의 제조방법{Method of making fibrinogen particles suited for intravenous injections}

본 발명은 외과(surgical) 및 내과 치료(medical treatment)시에 특히 환자의 혈액 손실을 상당히 줄이는데 사용되고, 이러한 외과 및 내과 치료로부터 빠른 쾌유를 돕는데 사용되는 합성 단백질 입자를 제조하는 방법에 관한 것으로, 특히 정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

암 수술 등의 많은 외과 및 내과 조치로 인해, 종종 환자가, 특히 혈액 내 충분한 혈소판이 결핍된 환자가 사망할 위험에 처할 수 있는 다량의 혈액 손실이 일어나는 것이 공지되어 있다. 혈액 손실을 구제하는 한 해결책으로는 수혈을 이용하는 것이다. 그러나, 수혈은 HIV 바이러스 또는 간염 바이러스 등의 치명적인 질병을 도입할 수 있다. 따라서, 임상 의학 분야에 있어서, 혈액 응집에 유용하거나, 사실상 사람 혈액의 혈소판으로서 기능하는 물질을 제공하는 것이 강력히 요구되고 있다. 이러한 물질은 하기 요건을 충족시켜야 한다. 첫째로, 이러한 물질의 입자 크기는 인체의 모세혈관망으로 유입할 수 있도록 가능한한 작아야 한다. 이러한 물질의 최대 직경은 평균하여 사람 모세혈관의 직경인 7㎛를 초과할 수 없다. 둘째로, 이러한 물질은 사람 혈액에서 그 자체가 응집하거나 혈구의 혈액 응집을 개시해서는 안되지만, 상처 부위에서의 혈액 응집을 촉진시켜야 한다. 특히, 이러한 물질은 상처 부위에서의 응혈에 관여하거나 촉진시키는 능력을 지녀야 한다.

오일 중에서 단백질 수용액을 에멀젼화한 후, 열처리 또는 광범위한 중합반응에 의해 합성되는, 단백질로 제조된 미소구체(microsphere)가 개시되어 있다[참조문헌: K.J. Widder et al. in "Magnetically Responsive Microspheres and Other Carriers for the Biophysical Targeting of Antitumor Agents", Advances in Pharmacology and Chemotherapy, vol.6, pp. 213-271]. 그러나, 위더(Widder)의 방법에 따라 제조된 미소구체의 수명은 단백질이 이러한 미소구체의 제조시에 바람직하지 않은 변성 반응을 일으키므로 짧다. 실제로는, 합성된 혈소판상 입자는 사람 혈관내에 적어도 1일 이상 보존되어야 한다.

천연원의 고분자 입자의 가교 매트릭스를 포함하는 입자를 제조하는 방법이 개시되어 있다[참조문헌: Oppenheim et al., in U.S.Pat.No.4,107,288 entitled "Injectable compositions, nanoparticles useful therein, and process of manufacturing same"]. 이 방법에 있어서, 단백질 용액을 콘트라스팅 재용매화제(contrasing resolubilization agent)로 탈용매화제의 농도를 조절함으로써 탈용매화 한계값으로 만들었다. 이 공정은 불안정한 상태로 개시하여, 광범위한 중합반응을 계속하여, 응집도에 대하여 제어되지 않고, 구체(sphere)를 형성시킨다. 직경이 7 미크론보다 큰 응집체는 혈관을 클로깅할 수 있으므로, 혈관내 적용에는 위험하다. 따라서, 응집하지 않고, 직경이 7 미크론보다 상당히 작은 입자 가 필요하다.

본 발명의 주 목적은 정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 가교제의 존재하에 형성된 미소구체는 평균 직경이 1 미크론 미만이다.

본 발명에 따르면, 피브리노겐은 타겟 분자로서 사용될 수 있고, 단백질 입자를 상처 부위에 가져갈 수 있어서, 혈액 손실을 줄인다.

본 발명에 따르면, 합성된 물질은 사람 혈액의 혈소판으로서 작용한다. 본 발명의 합성된 물질은 피브리노플레이트(fibrinoplate) 또는 혈소판 응집 대용품으로도 불리운다.

본 발명에 따르면, 물질의 조성은 다음과 같다(중량부):

사람 알부민: 90∼100부

피브리노겐: 0.02∼6부

본 발명의 물질은 하기 절차에 따라 제조된다:

1. 단백질 입자 현탁액의 제조는:

a. 적절한 몰삼투압농도를 갖는 버퍼 용액 중에 단백질 분말을 용해하고;

b. 계면활성제를 단계 a의 제조 용액에 가하며;

c. 가교제를 단계 b의 혼합 용액에 가하고;

d. 알콜 용액을 단계 c의 혼합 용액에 가하는 것을 포함한다.

그리하여, 정맥내 주사용으로 적합하고 혈관을 클로깅하지 않는 불투명한(nebulous) 단백질 입자 현탁액이 제조된다.

본 발명에 의하면, 단백질 용액은 사람 알부민 용액이다.

본 발명에 의하면, 계면활성제는 클리닝제이거나 세정제이다.

본 발명에 따르면, 계면활성제는 테트라데실황산나트륨, 트윈-80 및 트리톤 X-151로 구성되는 그룹 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따르면, 가교제는 글루타르알데히드 등의 공유결합 소분자이다.

본 발명에 따르면, 버퍼 용액의 pH는 4∼8이다.

본 발명에 따르면, 몰삼투압농도는 14∼680 mOsm이다.

2. 상기 불투명한 단백질 입자 현탁액을 조제한 후에, 표면 단백질은 현탁액에 가해진다. 이렇게 함으로써, 미소구체의 미반응 부분은 공유결합에 의해 표면 단백질을 피브리노겐으로 변환시킬 것이다.

3. 그 다음에, 표면 단백질을 함유하는 사람 알부민 구체 현탁액은 희석, 여과, 투석, 다이어필트레이션(diafiltration), 원심 분리, 전기 영동, 컬럼 크로마토그래피, 진공 동결 건조, 및 분말 재구성에 의해 분말 형태로 처리된다. 몇몇 경우에는, 당해 기술분야에 공지되어 있는 것으로, 버퍼 용액의 첨가나 변화 또는 방부제의 첨가가 필요하다.

따라서, 본 발명은 정맥내 주사용으로 적합한 피브리노겐 입자의 제조방법으로, 단백질 입자 현탁액의 조성물이 혈관을 클로깅하지 않지만, 상처 부위에서 응 집하며, 형성된 단백질 입자는 평균 직경이 7㎛ 미만인 사람 알부민 가교 피브리노겐으로 제조된다.

본 발명은 바이오솔루블(bio-soluble) 액체에 의해 재구성되고 정맥내 주사용으로 적합한 동결 단백질 입자 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 조성물은 혈관을 클로깅하지 않는다(상처 부위를 제외). 생성된 단백질 입자는 평균 직경이 7㎛ 미만인 사람 알부민 가교 피브리노겐으로 형성된다.

본 발명은 정맥내 주사용으로 적합한 단백질 입자 현탁액에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 조성물은 혈관을 클로깅하지 않는다(상처 부위를 제외). 생성된 단백질 조성물은 공유결합에 의해 사람 알부민 가교 피브리노겐으로부터 구체 표면에 형성된다. 생성된 단백질 입자는 평균 직경이 7㎛ 미만이다.

본 발명은 바이오솔루블 액체에 의해 재구성되고 정맥내 주사용으로 적합한 동결 단백질 입자 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 단백질 조성물은 혈관을 클로깅하지 않는다(상처 부위를 제외). 생성된 단백질 입자 조성물은 공유결합에 의해 사람 알부민 가교 피브리노겐으로부터 구체 표면에 형성되고, 피브리노겐은 사람 알부민을 캡슐화한다. 생성된 단백질 입자는 평균 직경이 7㎛ 미만이다.

본 발명의 또 하나의 측면에 따르면, 본 발명은 정맥내 주사를 통한 인체로의 이러한 단백질 입자의 새로운 유틸리티를 제공한다. 단백질 입자는 새로운 상처로 이동되어, 응집을 촉진함으로써, 혈액 손실을 줄일 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질 입자는 다량의 혈액 손실 위험이 있는 외상 환자에 대하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적, 이점 및 새로운 특성은 첨부도면과 관련하여 기술된 하기 상세한 설명에 의해 더욱 용이하게 명확해질 것이다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하기 실험이 출발 물질로서 사람 혈청 알부민(HSA)을 사용하지만, 면역글로불린, 미오글로빈, 콜라겐, 또는 젤라틴 등의 다수의 보통 사람 단백질이 구체의 성분으로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.

1. 실험 1: 피브리노겐을 함유하지 않는 구체의 형성. 분말 사람 혈청 알부민(HSA)을 표준 염수(NS, 또는 0.9% 염화나트륨 용액)에 용해시켜, 계면활성제로서 농도 범위가 0.05㎎/㎖∼15㎎/㎖인 테트라데실황산나트륨 또는 트윈-80, 또는 트리톤 X-151도 함유하는 5%∼20%(용적당 중량)의 용액을 형성한다. 여러 농도의 계면활성제를 함유하는 단백질 용액 2㎖를 포함하는 일련의 튜브에 대하여, 0.01%∼3.0%의 농도 범위로 표준 염수로 희석된 글루타르알데히드 2㎖를 단백질 용액에 가한다. 10분후에, 약 10㎖의 에탄올(물에 약 80%로 희석)을 가한다. 혼탁도를 즉시 관찰한다. 또 10분후에, 재용해되는 지를 알아보기 위해 혼탁한 현탁액을 5배의 염수로 희석시켰는데, 재용해되지 않았다. 그 후에, 입자를 ×1000 위상차 현미경 검사에 의해 관찰한다.

구체의 평균 직경이 1 미크론 미만인 것을 알았다.

또한 HSA 농도가 100∼200㎎/㎖인 1∼2.5㎎/㎖의 트리톤 X-151가 가장 우수한 제제를 부여함을 알았다. 1∼12㎎/㎖ 범위의 테트라데실황산나트륨이 크기 분포면에서 보아 가장 균일한 제제를 제조하는 것을 알 수 있다.

2. 실험 2: 타겟 시약, 피브리노겐을 단백질 구체에 결합. 방사선 표지된 사람 혈청 알부민(요오드-125 사용)을 사용하여, 실험 1의 농도를 사용하는 구체를 제조한다. 구체를 침전하도록 원심분리한 후에, 상청액에 대한 펠릿의 방사선 계수에 의해 측정된 바와 같이, 95%를 초과하는 단백질이 구체에 혼입되었음을 알 수 있었다. 용액의 몰삼투압농도를 1.8% 염화나트륨 용액(표준 염수의 2배)까지 증가시키거나, 0.09% 염화나트륨 용액까지 감소시키는 것은, 구체의 수율에 그다지 영향을 미치지 않았다. 버퍼의 pH를 4 미만으로 감소시키면, 구체를 형성하기 위해서는 pH 8을 초과하는 알콜을 필요로 하며, 수율은 4 미만의 pH에서 약간 감소되었다.

상기 실험은 플루오레세인 이소티오시아네이트로 표지된 사람 혈청 알부민을 사용하는 것 외에는 최적 조건을 맞추면서 반복되었다. 실험 1에서 리스트된 바와 같은 최적 조건을 이용하여, 혼탁 상태의 출현 후에, 피브리노겐(1㎎/㎖)를 수회 구체 현탁액에 가한다. 구체가 안정하였고, 구체가 형성된 후 15분 이내에, 피브리노겐을 가함으로써, 가장 우수한 제제가 얻어지는 것을 관찰하였다.

필요로 하는 대상에게 즉시 투여할 수 있는 생리적으로 적합한 현탁액을 얻기 위해서는, 희석, 여과, 투석, 다이어필트레이션, 원심 분리, 전기 영동, 컬럼 크로마토그래피, 버퍼 또는 방부제의 첨가 또는 변화, 동결 건조, 및 수성 유체(물 또는 표준 염수 또는 젖산을 가한 링거액 또는 당 함유 유체)를 사용한 동결 건조된 분말의 재구성 등과 같은 추가 처리를 구체 현탁액에 행하는 것이 바람직할 것이다.

문헌[참조: McGill et al., "Platelet membrane vesicles reduced microvascular bleeding times in thrombocytopenic rabbits, J. Lab Clin Med 1987; 109: 127-33]의 방법에 따라, 래빗의 혈소판을 감소시켰다. 부설판(busulfan) 70㎎/㎏ 처리후에 10마리의 래빗의 전형적인 출혈 시간은 597초이었다. 피브리노겐으로 코팅된 구체(동결 건조된 분말로부터 표준 염수로 재구성됨) 1㎎/㎏의 주사로, 출혈 시간은 115초로 감소되었다(표준편차 43초). 형광 현미경 검사에 의해 귀 상처 부위를 조사한 결과, 응괴 내에 형광 입자가 관찰되었다. 피브리노겐을 함유하지 않거나, 표준 염수, 또는 피브리노겐 용액(1㎎/㎖)을 함유하는 형광 구체를 주입한 혈소판 감소된 래빗에서는, 귀 내의 출혈 응괴의 개선이 나타나지 않았다. 이로부터, 피브리노겐 분자가 입자를 활성 응괴 형성 부위로 가져가는 자동유도장치로서 작용하여, 출혈 시간이 개선되고 혈액 손실이 낮아질 수 있다는 것을 알 수 있다.

이들 입자는, 혈소판은 감소시키지 않으면서, 빠른 응혈 시간으로부터 이익을 얻을 수 있는 외상이나 수술 환자에게 유효할 것이다. 전장(battle field) 조건에서나 핵전쟁 사변후와 같이 다수의 환자가 치료를 요하나, 혈소판 공여체를 찾기가 어려운 경우에 특히 유용하다는 것을 알 수 있다.

본 발명의 가르침을 유지한 채로, 당해 기술분야의 숙련가는 다양한 변경 및 변형이 이뤄질 수 있음을 쉽게 알 수 있다. 따라서, 상기 설명은 본 발명의 특허청구범위의 한계 및 범위내에서만 한정하여 기술된 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

1. a. 버퍼 중에 단백질 분말을 용해시키고;

   b. 테트라데실황산나트륨, 트윈(Tween)-80 및 트리톤(Triton) X-151로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 계면활성제를 상기 단백질 용액에 가하며;

   c. 글루타르알데히드를 포함하는 가교제 용액을 상기한 단백질과 계면활성제의 혼합물에 가하고;

   d. 상기한 단백질과 계면활성제와 가교제 용액의 혼합물에 알콜을 가하는 것을 포함하고,

   코어 단백질 성분으로서 단백질 분말을 포함하는, 정맥 내 주사용으로 적합한 현탁액 중의 단백질 입자의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질 용액은 사람 혈청 알부민 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 계면활성제는 세정제(detergent)인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 버퍼의 pH는 4∼8인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 삭제
6. 제 1 항에 있어서, 상기 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 현탁액 중의 입자는 분말 형태로 되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 현탁액 중의 입자는 여과, 건조 및 재구성을 통해 분말형태로 되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 추가로 상기 구체 현탁액에 표면 단백질을 가하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 9 항에 있어서, 상기 표면 단백질은 사람 피브리노겐인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 상기 단백질 용액은 사람 혈청 알부민 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 9 항에 있어서, 상기 계면활성제는 세정제인 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 계면활성제는 테트라데실황산나트륨, 트윈-80 및 트리톤 X-151로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 삭제
15. 제 9 항에 있어서, 상기 알콜은 에탄올인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 9 항에 있어서, 상기 용액의 pH는 4∼8인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 삭제
18. 제 9 항에 있어서, 상기 현탁액 중의 입자는 분말 형태로 되어지는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 18 항에 있어서, 상기 현탁액 중의 입자들은 여과, 건조 및 재구성을 통해 분말형태로 되어지는 것을 특징으로 하는 방법.