CN1067590C - 适合静脉注射的蛋白质粒子组合物的生产方法及其产品 - Google Patents

Abstract

一种适合静脉注射的蛋白质粒子组合物的生产方法及其产品。该组合物包括人体白蛋白和纤维蛋白原两种组份，将人体白蛋白按一定生产方法制成人体白蛋白悬浮液球体，然后交联纤维蛋白原，此组合物球体在悬浮液中不凝聚，直径小于1微米。将该蛋白质微粒组合物通过静脉注射后不会导致血管阻塞，但会促进伤口血凝并能有效地减少患者失血量。

Description

适合静脉注射的蛋白质粒子组合物的生产方法及其产品

本发明涉及可减少在手术和内科治疗中的大量出血，并能够加速内科治疗和手术痊愈速度的蛋白质粒子组合物，尤指一种适合静脉注射的蛋白质粒子组合物的生产方法及其产品。

众所周知，人体血液充足是健康之本，许多手术及内科治疗，例如癌症手术，均会引起失血。然而输血又是一个很复杂的过程，可能会引起艾滋病和引入肝炎病毒；另外，尤其对于血小板缺乏的病人，失血过多则更是危险甚大。因而，在临床上急需一种对凝血有帮助的物质来解决上述这些问题。

由于此类物质其功效如同血小板，可减少开刀和手术病人及血小板缺乏的病人的失血量，因而在将其注射入人体后，对其性质要有一定的要求。其一：人体微血管的直径为7微米，那么此类物质微粒直径必须小于7微米；其二：此物质微粒本身不应在血流中凝聚，但能在伤口处凝聚，即是，此物质微粒不会引起血细胞在血管中凝聚，但会参与或促进血细胞在伤口处凝聚。

由于此类物质微粒有助于血液凝聚，那么这些微粒必须具有能够允许它们参与血液凝固的表面蛋白质，例如纤维蛋白原。

现有技术中，如K.J.Widder等人在《药理及化学治疗法的发展》，Vol.16,213-271中的“抗癌试剂生物物理示踪中的磁活性微球体及其他载体”一文所涉及的，用蛋白质水溶液和油通过加热或聚合得到的乳化液合成蛋白质微球体。然而由于蛋白质在此过程中极易变质而使此微粒其半衰期很短。因而在实际治疗中需要其能够在血管中保存至少一天以上不会变质的粒子。

Oppenhein等人在美国专利US4,107,288，“注射组合物中有效的极微粒子及其生产生产方法”中提出另一种生产方法，其中通过使用一种相反的增溶剂来调节去溶剂试剂的浓度而使蛋白质溶液达到一个去溶剂极限。这种生产方法存在的问题是在反应开始时条件极不稳定，在反应过程中间伴随着导致球体生成的大量的聚合，并伴随超过血凝程度的聚合现象出现。血凝球体直径大于7微米，超过了血管直径，这就会造成血管阻塞并引起危险。因而在实际治疗中需要其不会凝聚且其直径比7微米小得多的微粒。

本发明的目的在于提供一种在悬浮液中其蛋白质球体不凝聚、直径比1微米小且在其表面包含有纤维蛋白原的蛋白质组合物的生产方法和产品。

本发明中，在交联剂存在下所形成的球体其平均直径小于1微米且其变异系数很小。

本发明中，纤维蛋白原可作为示踪分子，其可携带蛋白质球体到达创伤处以减少出血量。

本发明中，由于此组合物的作用是凝血，其功效与血小板相同，故又将其称之为“凝血板”或“血小板替代品”(Fibrinopltate,ptateletAggregation Substitude)。

本发明中，此蛋白质组合物其组成为(重量份数表示)：

人体白蛋白：    90-100份

纤维蛋白原：    0.05-6份

本发明的组合物的生产方法为：

1、首先制造蛋白质粒子悬浮液，其中：

a、在渗透压适当的缓冲液中，溶解蛋白质粉末；

b、向a中所述的蛋白质溶液中加入表面活性剂；

c、向b中所述的蛋白质和表面活性剂混合液中加入交联剂；

d、向c中所述的蛋白质、表面活性剂和交联剂溶液中加入醇溶液，即刻，出现一混浊的蛋白质球体悬浮液，此悬浮液适于静脉注射并且不会阻塞血管。

本发明中，所述的蛋白质溶液是人体白蛋白溶液。

本发明中，所述的表面活性剂是洗涤剂。

本发明中，所述的表面活性剂可以选自四癸基硫酸钠(Sodiumtetradexylsulfate)、Tween-80、TritonX一151中的一种：

本发明中，所述的交联剂是包括戊二醛(glutaraldahyde)的共价小分子。

本发明中，所述缓冲溶液PH值范围为4-8。

本发明中，所述的缓冲溶液渗透压范围为14-680mOSm。

2、在上述的悬浮液混浊出现后，将表面蛋白质加到悬浮液中的球体中，这样，球体上未反应的交联部分将通过共价健将表面蛋白质连到人体白蛋白球体表面上。

其特征在于：本发明中的表面蛋白质可以是纤维蛋白原。

3、对上述的加入了的表面蛋白质的人体白蛋白的球体悬浮液再处理成粉末的过程包括进行稀释、过滤、渗析、再过滤、离心分离、电泳分离和色谱柱分离，再通过真空冷冻干燥及冷冻后的粉末重构化。其中在此过程中需加入缓冲液或改变缓冲液及加入防腐剂等生物相溶体，这些试剂的种类和用量是本领域技术人员所熟知的。

因此，本发明中涉及的一种适合静脉注射的蛋白质粒子悬浮液组合物，其中该蛋白质粒子悬浮液组合物不会造成血管阻塞(除在伤口部位外)该蛋白质粒于是通过人体白蛋白交联纤维蛋白原形成，其平均直径小于7微米。

其次，本发明涉及的也是一种经生物相溶液体重构后适千静脉注射的冷冻的蛋白质粒子组合物，其中该组合物不会造成血管阻塞(除在伤口部位外)，该蛋白质粒于是通过人体白蛋白交联纤维蛋白原形成，其平均直径小于7微米。

另外，本发明涉及的也是一种适合静脉注射的蛋白质粒子悬浮液组合物，其中该组合物不会造成血管阻塞(除在伤口部位外)，该组合物是人体白蛋白与纤维蛋白原以共价健形成的粒子，而且粒子表面是纤维蛋白原分子，内部是人体白蛋白分子，其平均直径小于7微米。

再次，本发明涉及的也是一种经生物相溶液体重构后适于静脉注射的冷冻的蛋白质粒子组合物，其中该组合物不会造成血管阻塞(除在伤口部位外)，该组合物是人体白蛋白与纤维蛋白原以共价键形成的粒子，而且该粒子的表面是纤维蛋白原，内部是人体白蛋白，其平均直径小于7微米。

本发明另一方面又提供了该蛋白质粒子在通过静脉注射到人体中以后的一个新用途，即该粒子能够迁移到新的伤口处，帮助血凝以减少患者失血量。

另外，可将此粒子用在外伤、手术或者大量内、外出血的病人上，这对减少失血量挽救病人的生命极为有益。

下面通过实施例对本发明进一步说明。尽管以下实施例是使用人体白蛋白，但是人体其它蛋白质，如免疫蛋白、肌红蛋白、胶原和明胶同样也可使用并能够形成球体。

实施例1

没有纤维蛋白原形成微粒的生产方法：

将人体白蛋白粉末放入0.9％的氯化钠溶液中，并加入浓度在0.05mg/mt-15m9/ml的表面活性剂，如四癸基硫酸钠、Tween-8c或TritonX-151，形成蛋白质溶液的重量百分比浓度在5-20％。然后向含有不同浓度的表面活性剂的2ml上述蛋白质溶液的系列试管中加入2ml以氯化钠溶液稀释过的，其浓度范围为0.01-3.0％的戊二醛。10分钟以后，再加入10ml的乙醇(用水稀释到80％(体积比))，这时溶液立刻出现混浊，形成悬浮液。再过10分钟，以5倍体积的氯化钠溶液稀释来观察此悬浮液是否澄清，结果为否定的。此后以1000倍的的显微镜观察此悬浮液，发现此悬浮液中粒子的直径小于1微米。

同时也发现，用浓度为1-2.5mg/ml的TritonX-151和浓度为100-200mg/ml的白蛋白制成的合剂效果最好。另外也发现用浓度为1-12mg/ml的四癸基硫酸钠制成的合剂其微粒直径的变异系数最小。

实施例2

将纤维蛋白原连到蛋白粒子上作为示踪粒子的生产方法：

采用与实施例1相同的条件，使用用1-125的标记的人体白蛋白通过以离心法沉淀球体，测量沉淀中和清液中各自含有的放射性蛋白质微粒数目，发现有95％的白蛋自粒子形成球体。如果将溶液的溶质度由0.9％的氯化钠溶液浓度提高2倍，即变成1.8％的氯化钠或将0.9％的氯化钠溶液降到0.09％的氯化钠溶液，发现对球体的产量没有很大影响：如果将缓冲溶液的PH降到4以下，则发现在形成球体时所需的醇的量比PH为8时所需醇的量要多，且PH在4以下时使球体的产率会稍微有所下降。

实施例3

在最优先的条件下重复实施例2，所不同的是用荧光异硫氰酸酯包覆人体白蛋白。采用实施例1的最佳条件，在出现混浊后在不同的时间间隔内将纤维蛋白原加到球体悬浮液中，结果发现在球体形成后十五分钟内加入纤维蛋白原能够使球体稳定且获得最好的合剂。

另外，必须对球体悬浮液进行进一步处理，其中包括进行稀释、过滤、渗析、再过滤、离心分离、电泳分离和色谱柱分离，再通过真空冷冻干燥及冷冻粉末的重构化后完成，其中在此过程中需加入或改变缓冲液或防腐剂。

根据McGill等人的在J.Lab clin Med 1987,109:127-133上的“血小板模腔可降低血小板缺乏的兔子的流血时间”一文，使用血小板缺乏的兔子进行药理试验，以70mg/kg的Busulfan法处理过的十只兔子的流血时间为697秒，经过注射1ml/kg的纤维蛋白原包覆的球体(用0.9％的氯化钠溶液溶解冷冻过的粉末)，流血时间降为115秒(标准偏差为43秒)。将兔子耳朵伤处切片并移至荧光显微镜下观察，发现凝血内有荧光粒子。如果对血小板缺乏的兔子注射不含纤维蛋白原的荧光球体，或是0.9％的氰化钠溶液，或是单纯的纤维蛋白原溶液(1mg/ml)，发现流血时间并未缩短，在耳朵凝血处也役有发现荧光粒子，这说明纤维蛋白原只是作为引导分子将粒子导至凝血活跃区域，并导致缩短流血时间及减少失血量。

对于那些有外伤或可能并未患有血小板缺乏症的手术患者来说，本发明的粒子同样具有疗效，并能感受较快的凝血时间和较少的失血量之利。

Claims (11)

1、一种适合静脉注射的蛋白质粒子组合物的生产方法，其特征在于：该生产方法包括：

a、在渗透压适当的缓冲液中，溶解蛋白质粉末，

b、向a中所述的蛋白质溶液中，加入表面活性剂，

c、向b中所述的蛋白质和表面活性剂混合液中，加入交联剂，

d、向c中所述的蛋白质、表面活性剂和交联剂深液中加入醇溶液，制成悬浮液；

e、把纤维蛋白原加入到球体悬浮液中；

f、经分离、干燥、重构化制成蛋白质粒子组合物粉末；

所述的蛋白质溶液是人体白蛋白溶液，其重量百分比浓度在5-20％；该表面活性剂的浓度为0.05-15mg/ml；该交联剂的浓度范围为0.01-3.0％；该醇溶液的用量为10ml。

2、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的表面活性剂是洗涤剂。

3、如权利要求3所述的生产方法，其特征在于：所述的表面活性剂是选自四癸基硫酸钠、Triton X-151、Tween 80中的一种。

4、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的交联剂是包括戊二醛的共价小分子。

5、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的缓冲溶液为PH=4-8。

6、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的缓冲液的渗透压范围为14-680mOsm。

7、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于：所述的醇溶液为乙醇溶液。

8、如权利要求1所述的生产方法生产的一种适合静脉注射的蛋白质粒子悬浮液组合物，其中该蛋白质粒子是通过人体白蛋白交联纤维蛋白原形成，其平均直径小于7微米。

9、如权利要求1所述的生产方法生产的适合静脉注射的蛋白质粒子组合物，其特征在于：经生物相容液体重构后制成的冷冻的蛋白质粒子组合物，该蛋白质粒子是通过人体白蛋白交联纤维蛋白原形成，其平均直径小于7微米。

10、权利要求8所述的适合静脉注射的蛋白质粒子悬浮液组合物，其特征在于：该组合物是人体白蛋白与纤维蛋白原以共价健形成的粒子，而且粒子表面是纤维蛋白原分子，内部是人体白蛋白分子，其平均直径小于7微米。

11、如权利要求9所述的适合静脉注射的蛋白质粒子组合物，其特征在于：经生物相溶液体重构后适于静脉注射的冷冻的蛋白质粒子组合物，该组合物是人体白蛋白与纤维蛋白原以共价键形成的粒子，而且该粒子其表面是纤维蛋白原，内部是人体白蛋白，其平均直径小于7微米。