KR100859096B1 - 돌단풍을 이용한 β-세크레타제 활성 저해 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 알츠하이머성 치매의 원인물질인 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성과정에 관여하는 효소의 하나인 β-세크레타제(β-site Amyloid precursor protein Cleaving Enzyme, BACE)의 활성을 특이적으로 저해하는 돌단풍 추출물을 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 치매 예방용 조성물, 발효유, 건강 식품 및 음료에 관한 것이다.
알츠하이머성 치매, β-세크레타제, 베타 아밀로이드, 돌단풍
Description
도1은 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 생체 외(in vitro) β-세크레타제의 활성 저해 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도2는 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 세포 수준에서의 β-세크레타제의 활성 저해 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도3은 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 세포에 대한 MTT assay 결과를 나타낸 그래프이다.
도4는 양성 대조군의 β-세크레타제의 활성 저해 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물, 발효유, 건강 식품 및 음료에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 치매의 원인 물질인 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성 과정에 관여하는 효소의 하나인 β-세크레타제(β-secretase) 활성을 특이적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물, 발효유, 건강 식품 및 음료에 관한 것이다.
현대 사회에서 노령 인구의 급격한 증가로 인해 노화와 관련된 치매(senile dementia)의 발생이 심각한 사회 문제로 대두되고 있다. 이 질환은 발병율이 높은데도 불구하고 현재 뚜렷한 치료제나 예방제가 없어 막대한 사회·경제적인 손실을 유발하고 있다. 알츠하이머병(AD)은 치매의 가장 통상적인 형태이며, 현재에 이르러서는 심혈관계 질환 및 암 다음으로 미국내 3번째 주요한 사망 원인이 되고 있다. 알츠하이머병은 기억력 감퇴 및 인지 장애를 특징으로 하는 점진적인 신경 퇴행성 질환이다. 알츠하이머병은 신경 조직 및 혈관에서 플라크(plaque)의 축적, 신경섬유 얽힘, 아밀로이드 침착, 시냅스 손상 및 신경세포 사멸을 병리학적 특징으로 한다. 알츠하이머병에 소요되는 비용은 막대하며 (미국의 경우, 연간 1천억 달러를 초과함), 환자의 고통, 환자 가족의 고통 및 환자와 간호자의 생산력 상실을 초래한다. 인간 사회의 수명이 증가함에 따라 알츠하이머병의 발생은 현저하게 증 가할 것이므로, 알츠하이머병의 예방 및 치료 방법이 개발되지 않을 경우, 2020년에 이르러서는 미국의 경우에서만 천만명이 알츠하이머병으로 인해 고통 받을 것으로 추산된다. 현재 65세를 넘는 인구의 10％ 및 85세를 넘는 인구의 50％가 알츠하이머병으로 인해 고통 받는 것으로 판단된다. 그럼에도 불구하고 현재 알츠하이머병을 효과적으로 예방하거나 그의 임상 증상 및 기존 병리생리학을 반전시키기 위해 현재 이용할 수 있는 치료법은 없는 실정이다. 현재 미국 식품의약품안전청(FDA)의 공인을 받아 시판되고 있는 노인성 치매 치료제로는 택크린(tacrine, Cognex사), 도네페질 (donepezil, Aricept사), 리바스티그민 (rivastigmine, novartis사), 갈란타민(galantamine, yansen사)이 있으나, 이들은 모두 신경전달물질의 일종인 아세틸콜린의 활성을 증가시키는 물질들로 약 20-40%의 환자에서만 치매의 진행을 약간 늦추는 효과를 나타낼 뿐이다. 지금까지 알츠하이머병에 대한 치료법이 없는 가장 큰 이유 중의 하나는 병의 원인이 확실히 밝혀져 있지 않았다는 것이었다. 그러나 최근의 임상적, 유전학적, 분자세포생물학적 연구 결과에 따라, 베타 아밀로이드(β-amyloid)의 뇌내 축적과 그로 인한 신경독성이 발병의 매우 중요한 원인으로 밝혀졌다. 따라서 노인성 치매의 치료제 개발을 위해서는 베타 아밀로이드의 생성저지 또는 독성저지 효과를 가지면서 부작용이 적은 물질의 개발이 적합할 것으로 판단되고 있다. 이외에 알츠하이머병의 병인 및 발병에 관련된 많은 이론들이 있다. 이러한 이론들은 다른 질병 및 증상과의 유사성을 기초로 하거나 (예, 지발 (遲發) 바이러스 및 알루미늄 이론), 또는 병리학적 관찰을 기초로 하였다(예, 콜린성, 아밀로이드, 또는 얽힘 이론). 초기 발병 형태의 알츠하이머병 및 관련 질환의 경향이 있는 개체에 대한 베타 아밀로이드 전구체 단백질 (β-Amyloid Precursor Protein, APP)의 돌연변이의 확인은 아밀로이드 생성 이론을 강력하게 뒷받침한다. 알츠하이머성 치매질환자들에 공통적으로 나타나는 노인반점(senile plaques)의 주요 요소인 베타 아밀로이드(β-amyloid, Aβ) 펩타이드는 그 전구 대사 단백질인 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 695, 751, 770으로부터 유래한다. 이 아밀로이드 전구체 단백질은 대부분의 경우 α-세크레타제(α-secretase)와 β-세크레타제(β-secretase)라고 불리우는 프로테아제(proteases)에 의하여 절단되어, P3 펩타이드와 세포의 바깥쪽으로 sAPPα라는 수용성 단백질을 방출하게 된다. 특이적으로 알츠하이머성 치매 질환자에서는 β-세크레타제와 γ-세크레타제가 활성화되어, 베타 아밀로이드 펩타이드와 sAPPβ(secreted form of β-secretase derived APP)라는 단백질이 세포 밖으로 방출된다. 알츠하이머성 치매 질환자들 중에서 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전인자의 돌연변이의 경우를 보면 대부분이 α, β, γ-세크레타제(α, β, γ-secretase)들의 인지부분에 돌연변이가 생긴 경우로 이러한 돌연변이가 단백질의 구조를 변화시켜서 β-, γ-세크레타제(β-, γ-secretase)에 노출이 더 잘 되어 정상인의 경우보다 많은 양의 베타 아밀로이드 펩타이드가 생성되는 것으로 밝혀져 있다. 베타 아밀로이드 펩타이드는 42개의 아미노산 잔기로 이루어진 녹지 않는 성질을 가지며, 기억 및 인식과 관련된 뇌 영역에 침착되어 뇌세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유발하는 것으로 알려져 있다. 최근 보고에 의하면 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전인자의 돌연변이가 카스파제 6(caspase-6)과 카스파제 3(caspase-3)이라는 아폽토틱 프로테아 제(apoptotic protease)의 기질로 작용하여 절단이 되며, 이렇게 절단되어진 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP)은 β-, γ-세크레타제(β-, γ-secretase)에 의하여 보다 용이하게 베타 아밀로이드를 형성하게 된다고 알려져 있다. 알츠하이머성 치매 질환자에서 보이는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP)돌연변이 유전인자를 과량 발현하는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 과다발현 형질 전환쥐의 경우, 치매 질환자에서 보이는 노인반점과 특이적 증상인 공간지각 학습능력이 저하되는 결과가 나타났다고 보고되어 있다. 이러한 여러 가지 보고들을 종합하여 볼 때 알츠하이머성 치매 질환자에서 보이는 베타 아밀로이드 전구체 단백질(APP) 유전인자의 변이는 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성량과 밀접한 관련이 있으며, 알츠하이머성 치매질환의 발병에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 알츠하이머성 치매질환의 원인 규명과 치료 방법의 개발에는 많은 연구가 이루어지고 있으나 현재까지 뚜렷한 효과가 확립된 치료 소재 개발은 다소 미흡한 실정이다.
한편, 돌단풍(Aceriphyllum rossii Engler)은 쌍떡잎식물 장미목 범의귀과의 여러해살이풀로 장정포 , 부처손 , 돌나리라고도 하며 관상용 내지 어린잎을 식용으로 이용할 수 있다. 주요 성분으로는 캠페롤, 쿼써틴과 같은 플라보놀과 트라이터페노이드이가 있으며, 강력한 항산화 능력을 갖는 것으로 보고되고 있다.
본 발명자들은 치매 치료효과가 우수하면서도 부작용이 없으며 치매의 원인적 치료까지 가능한 알츠하이머성 치매 예방용 조성물, 건강 식품, 유제품 및 음료를 개발 하고자 연구를 하던 중 돌단풍으로부터 분리된 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물이 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 β-세크레타제(β-secretase)에 대한 활성을 특이적으로 저해하는 활성을 갖고 있어 알츠하이머성 치매 예방 및 치료제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 알츠하이머성 치매 질환을 유발시키는 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 β-세크레타제(β-secretase)에 대한 활성을 특이적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 돌단풍으로부터 분리된 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물, 건강 식품, 유제품 및 음료를 제공하는데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물, 건강 식품, 유제품 및 음료를 제공하는 것을 그 특징으로 한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
돌단풍으로부터 β-세크레타제(β-secretase)에 대한 활성을 특이적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물을 효율적으로 분리하는 과정을 상세히 살펴보면 다음과 같다.
돌단풍의 메탄올 추출물의 경우, 경남 부산의 산야초연구소에서 구매한 돌단풍을 잘게 분쇄한 후 100% 메탄올에 넣고 35℃~40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 하면서 2~3회 추출한다. 이때 용액의 사용량은 돌단풍 부피의 10배 정도가 적당하다.
상기에서 분리된 돌단풍의 메탄올 추출액을 35℃~40℃의 조건하에서 증발 농축한 후 -10℃에서 24시간 동결한 후 다시 -80℃에서 24시간 동결 건조하여 추출액을 분말상태로 만든다. 그리고 상기 추출 분말 25 ㎎을 디메틸술폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO) 1 ㎖에 녹여서 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용한다.
돌단풍의 에탄올 추출물의 경우, 경남 부산의 산야초연구소에서 구매한 돌단풍을 잘게 분쇄한 후 100% 에탄올에 넣고 35℃~40℃에서 2시간 동안 환류 냉각 하면서 2~3회 추출한다. 이때 용액의 사용량은 돌단풍 부피의 10배 정도가 적당하다.
상기에서 분리된 돌단풍의 에탄올 추출액을 35℃~40℃의 조건하에서 증발 농축한 후 -10℃에서 24시간 동결한 후 다시 -80℃에서 24시간 동결 건조하여 추출액을 분말상태로 만든다. 그리고 상기 추출 분말 25 ㎎을 디메틸술폭사이드 1 ㎖에 녹여서 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용한다.
돌단풍의 열수 추출물의 경우, 경남 부산의 산야초연구소에서 구매한 돌단풍을 잘게 분쇄한 후 증류수에 넣고 90℃~100℃에서 3시간 동안 환류 냉각 하면서 2~3회 추출한다. 이때 수용액의 사용량은 돌단풍 부피의 10배 정도가 적당하다.
상기에서 분리된 돌단풍의 열수 추출액을 35℃~40℃의 조건하에서 증발 농축한 후 -10℃에서 24시간 동결한 후 다시 -80℃에서 24시간 동결 건조하여 추출액을 분말상태로 만든다. 그리고 상기 추출 분말 10 ㎎을 물 또는 디메틸술폭사이드 1 ㎖에 녹여서 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용한다.
본 발명에 따른 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또 본 발명의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화할 수 있는데, 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등 이 섞여 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌굴리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1 내지 30 ㎎/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
본 발명의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
한편, 본 발명은 상기 추출 방법에 의해서 얻어진 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머성 치매 예방용 건강 식품 ,유제품 및 음료로 사용 가능하다.
상기 치매 예방용 발효유는 탈지분유로 무지유고형분 함량을 조정한 원료유에 락토바실러스 카제이 HY 2782(Lactobacillus casei HY 2782)를 접종한 배양액에 과즙 농축액, 식이섬유, 포도당, 올리고당, 칼슘, 비타민, 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 등을 녹여 제조된 시럽을 일정 비율로 혼합, 교반하여 균질화한 뒤 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한 상기 치매 예방용 음료는 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물이 유효 성분으로서 포함되는 것 이외에 대추엑기스, 당귀농축액, 액상과당, 정제수를 첨가, 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조한다.
또한 상기 치매 예방용 건강 식품은 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
돌단풍의 메탄올 추출물의 분리 정제
돌단풍을 구입하여 수세, 풍건한 후 길이 1 cm 간격으로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 200 g을 추출병에 넣고 100% 메탄올 1000 ㎖를 첨가하였다. 상기 메탄올을 첨가한 시료를 36℃에서 72시간 동안 추출한 후 여과지(Whatman No.41)로 여과하였다. 상기의 여과액을 진공회전농축기(Eyela NE, Japan)를 사용하여 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 돌단풍의 메탄올 추출물을 제조하였다. 상기의 건조된 시료 25 ㎎(시료1)을 디메틸술폭사이드 1 ㎖에 녹여 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용하였다.
돌단풍의 에탄올 추출물의 분리 정제
돌단풍을 구입하여 수세, 풍건한 후 길이 1 cm 간격으로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 200 g을 추출병에 넣고 100% 에탄올 1000 ㎖를 첨가하였다. 상기 에탄올을 첨가한 시료를 36℃에서 72시간 동안 추출한 후 여과지(Whatman No.41)로 여과하였다. 상기의 여과액을 진공회전농축기(Eyela NE, Japan)를 사용하여 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 돌단풍의 에탄올 추출물을 제조하였다. 상기의 건조된 시료 25 ㎎(시료2)을 디메틸술폭사이드 1 ㎖에 녹여 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용하였다.
돌단풍의 열수 추출물의 분리 정제
돌단풍을 구입하여 수세, 풍건한 후 길이 1cm 간격으로 분쇄하였다. 분쇄된 시료 200 g을 추출병에 넣은 후 증류수 1000 ㎖를 첨가하였다. 그런 다음 상기 증류수를 첨가한 시료를 100℃에서 3시간 동안 추출한 후 여과지(Whatman No.41)로 여과하였다. 상기 여과지에 의한 여과액을 진공회전농축기(Eyela NE, Japan)를 사용하여 감압 농축시킨 후 동결 건조하여 돌단풍의 열수 추출물을 제조하였다. 상기의 건조된 시료를 25 ㎎(시료3)을 디메틸술폭사이드 1㎖에 녹여 β-세크레타제 활성 저해 물질로 사용하였다.
<실시예 2>
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 생체 외(
in vitro
) β-세크레타제의 활성저해측정
β-세크레타제 in vitro 활성 저해 측정은 형광공명에너지 전달 분석방법(FRET assay method)을 이용하였으며, panvera사의 BACE1 FRET Assay Kit를 사용하였다. 측정원리는 다음과 같다.
펩타이드 기질은 형광 주게(fluoroscent donor)와 형광을 소멸시키는 받게(quenching acceptor)의 두개의 형광발색단(fluorophore)으로 구성되어 있으며 빛에 의한 여기(Light excitation)가 일어나면 주게(donor)의 형광에너지(fluoroscence energy)가 받게(acceptor)에 의해 형광이 소멸(quenching)된다. 그러나 프로테아제 절단(protease cleavage)이 일어나면 상기의 두 개의 발색단 그룹이 분리되어 형광 에너지가 발생된다. 결국 이때 발생하는 형광에너지를 측정함으로써 상기 프로테아제에 의한 효소적 절단(enzymatic cleavage)을 알 수 있다.
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물을 이용한 측정방법은 다음과 같다.
상기의 돌단풍의 메탄올 추출물(시료1), 에탄올 추출물(시료2), 열수 추출물(시료3)을 25 ㎎/㎖의 농도로 디메틸술폭사이드에 녹인 용액을 assay buffer(50mM sodium acetate, pH4.5)에 순차적으로 희석하여, 최종 assay 농도가 0.1, 0.01 ㎎/㎖가 되게끔 0.3, 0.03 ㎎/㎖의 농도로 시료를 준비하였다. 이 시료를 96 well plate(costar사의 96 half well black opaque)에 20 ㎕씩 넣고, 펩타이드 기질 (Rh-EVNLDAEFK-Quencher, in 50mM ammonium bicarbonate) 20 ㎕를 첨가하고 상온에서 5분간 혼합하였다. ELISA reader를 이용하여 혼합된 시료의 형광을 측정 (ex:530nm/em:590nm, 12nm bw, sensitivity:75)하여 상기의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 시료의 blank 측정값으로 하였다.
또한 상기의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물과 assay buffer, 펩타이드 기질이 혼합된 시료에 β-세크레타제 효소{50mM Tris(pH 7.5), 10% glycerol} 20 ㎕를 첨가하여 상온에서 60분간 배양하였다. 배양 종료 후 반응 종료를 위해 stop solution(2.5M sodium acetate) 20 ㎕를 첨가한 후 ELISA reader를 이용해 배양 시료의 형광을 측정(ex:530 nm/em:590 nm,12 nm bw,sensitivity:75)하여 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 시료의 측정값으로 하였다.
대조군으로서는 상기의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 생체 외 β-세크레타제 활성 저해 물질 시료를 혼합하지 않은 assay buffer를 사용하여 위와 동일한 방법으로 처리해 측정 하였다.
활성저해(%)는 다음 식에 의해 구하였다.
활성저해(%)={1-(시료 측정값-시료 Blank 측정값)/(대조군 측정값-대조군 Blank 측정값)}ⅹ 100
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 생체 외(in vitro) β-세크레타제 활성 저해 실험결과는 표1과 도1에 나타내었다.
| 시료명(추출용매) | 농도(㎎/㎖) | 저해율(%) |
| 돌단풍(메탄올) | 0.1 | 75 |
| 돌단풍(메탄올) | 0.01 | 41 |
| 돌단풍(에탄올) | 0.1 | 69 |
| 돌단풍(에탄올) | 0.01 | -4 |
| 돌단풍(열수) | 0.1 | 78 |
| 돌단풍(열수) | 0.01 | 21 |
표1 및 도1에 도시된 바와 같이, 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물은 알츠하이머성 치매 질환을 유발시키는 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 β-세크레타제에 대한 활성을 특이적으로 저해함을 알 수 있었다. 특히, 생체 외(in vitro)β-세크레타제 활성 저해는 돌단풍 에탄올 추출물 0.01 ㎎/㎖에서의 결과를 제외하고, 돌단풍 메탄올 추출물, 열수 추출물, 에탄올 추출물의 순으로 높은 저해율을 보임을 알 수 있었다.
<실시예 3>
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 세포(cell) 수준에서의 β-세크레타제의 활성저해측정
HEK 293 cell에 APPswe(아밀로이드 전구 단백질 swedish mutant) 유전자를 안정하게 발현시켜, 배지로 베타 아밀로이드를 배출하는 cell line을 구축하였다. 24 well plate에 1ⅹ105개/well의 세포를 600 ㎕의 배지와 함께 접종하고, 24시간이 지난 후, 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물을 최종 농도 0.01 ㎎/㎖이 되게끔 적용하였다. 시료 적용 48시간 후, well당 150 ㎕의 배지를 취하여 베타 아밀로이드 분석에 이용하였고, 세포에는 MTT assay를 수행하여 세포 생존도를 측정하였다. MTT assay와 베타 아밀로이드 분석법은 다음과 같다.
MTT assay는 로슈사의 cell proliferation kit Ι을 이용하였으며, 150 ㎕의 배지를 덜어낸 24 well plate에 well당 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 -diphenyltetrazolium bromide) 50 ㎕를 넣은 후, 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 Solubilization 용액(10% SDS in 0.01M HCl)을 well당 500 ㎕ 넣은 후, 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양기에서 15시간 동안 정치하여 550 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포의 생존률은 다음과 같이 계산하였다.
생존률(%)=(실험군의 흡광도/대조군의 흡광도)ⅹ100
배지 내의 베타 아밀로이드 분석은 베타 아밀로이드(1-40)을 특이적으로 잡는 Sandwich ELISA 방법으로 측정하였다. ELISA kit 은 Biosource사로부터 구입하였다. ELISA 방법은 Biosource사에서 제공된 방법에 따라 다음과 같이 수행하였다. Standard 펩타이드로 제공된 베타 아밀로이드(1-40)를 주어진 buffer(55 mM sodium bicarbonate, pH 9.0)에 녹이고 standard dilution buffer를 이용하여 7.81, 15.63, 31.25, 62.5 125, 250, 500 pg/㎖ 로 희석시켜 standard curve를 얻는데 사용하였다. 배지를 dilution buffer로 10배 희석하여, well당 50 ㎕씩 준비된 ELISA 96 well plate에 넣고, 이어서 50 ㎕의 detection antibody를 넣었다. 3시간 배양한 후에 washing buffer로 4회 씻어주고 HRP conjugation 된 secondary antibody를 30분간 붙여준 후에 4회 세척(washing) 하였다. 20분간 stabilized chromogen을 넣어 발색 반응을 시키고 stop solution 을 넣어주어 발색반응을 정지 시켰다. 발색반응의 정도는 450 nm 파장에서 spectrophotometer를 이용하여 측정하였다. 각 샘플의 값을 standard 값과 비교하여 샘플 내에 들어있는 베타 아밀로이드의 절대량을 환산하였고, MTT assay에 의해서 측정된 세포(cell)생존률로 나누어 일정한 세포(cell) 수당 베타 아밀로이드 양으로 보정하였다. 시료에 의한 베타 아밀로이드 저해율은 다음과 같이 계산하였다.
활성저해(%)={1-(시료를 넣은 cell에서의 베타 아밀로이드 양)/(대조군에서의 베타 아밀로이드 양)}ⅹ 100
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 세포 수준에서의 β-세크레타제 활성 저해 실험 결과는 표2와 도2에 나타내었다.
| 시료명(추출용매) | 농도(㎎/㎖) | 저해율(%) |
| 돌단풍(메탄올) | 0.01 | 37 |
| 돌단풍(에탄올) | 0.01 | 30 |
| 돌단풍(열수) | 0.01 | 16 |
표2 및 도2에 도시된 바와 같이, 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물은 세포 수준에서도 알츠하이머성 치매 질환을 유발시키는 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 β-세크레타제에 대한 활성을 특이적으로 저해함을 알 수 있었다. 특히, 0.01 ㎎/㎖ 농도에서의 돌단풍의 메탄올 추출물, 열수 추출물의 저해 효과(돌단풍의 메탄올 추출물의 저해율 37%, 돌단풍의 열수 추출물의 저해율 16%)가 생체 외 실험 결과(돌단풍의 메탄올 추출물의 저해율 41%, 돌단풍의 열수 추출물의 저해율 21%)와 연관성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
이에 반해, 양성 대조군인 STA-200은 세포 수준에서는 β-세크레타제 활성을 저해하지 않는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 생체 외(in vitro)실험의 한계인 세포막(cell membrane) 투과 여부를 세포 수준에서의 β-세크레타제 활성 저해 실험을 통해 보완함으로써 돌단풍의 메탄올 추출물, 열수 추출물이 세포막을 투과하여 저해 효과를 나타낼 수 있음을 보여줌을 알 수 있었다.
한편, 세포 독성에 대한 지표로도 사용될 수 있는 MTT assay의 결과는 표3과 도3에 나타내었다.
| 시료명(추출용매) | 농도(㎎/㎖) | 생존률(%) |
| 돌단풍(메탄올) | 0.01 | 95 |
| 돌단풍(에탄올) | 0.01 | 86 |
| 돌단풍(열수) | 0.01 | 104 |
표3 및 도3에 도시된 바와 같이, 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물의 MTT assay 결과를 통해 0.01 ㎎/㎖의 농도에서는 돌단풍의 에탄올 추출물에서 약간의 세포독성을 나타낼 뿐 돌단풍의 메탄올 추출물 및 열수 추출물에서는 세포 독성이 없음을 알 수 있었다.
<실시예 4>
양성 대조군의 β-세크레타제 활성 저해측정
상기 실시예 2, 3의 β-세크레타제 활성 저해 측정법(FRET assay method)의 검증을 위해 양성 대조군 시험(positive control test)을 실시하였다. 양성 대조군으로는 Enzyme systems products사의 STA-200(Sequence:Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-(Statine)-Val-Ala-Glu-Phe-OH)을 사용하였다.
STA-200(Sequence:Lys-Thr-Glu-Glu-Ile-Ser-Glu-Val-Asn-(Statine)-Val-Ala-Glu-Phe-OH) 1 ㎎을 디메틸술폭사이드 1 ㎖에 녹여 0.61 mM stock solution을 제조한다. 제조된 stock solution을 assay buffer(50mM sodium acetate, pH 4.5)로 희석하여 각각 0.61 μM, 0.061 μM 농도로 제조해 각각 양성 대조군 1, 2로 하였다.
상기 양성 대조군 1, 2를 실시예 2와 3에서와 같이 생체 외(in vitro) β-세크레타제의 활성저해 측정과 세포(cell) 수준에서의 β-세크레타제의 활성저해 측정을 하였다.
상기 양성 대조군의 β-세크레타제 활성 저해 실험 결과는 표4와 도4에 나타내었다.
| 양성 대조군 | STA-200농도(μM) | 저해율(%) | |
| in vitro | Cell 수준 | ||
| 1 | 0.61 | 80 | -17 |
| 2 | 0.061 | 41 | 2 |
표4 및 도4에 도시된 바와 같이, 생체 외에서는 양성 대조군인 STA-200의 저해율은 80%(0.61 μM)으로 실시예 2의 돌단풍의 열수 추출물(0.1㎎/㎖)의 저해율 78% 보다 약간 높은 것으로 나타났다. 한편, 세포 수준에서는 양성 대조군인 STA-200은 β-세크레타제 활성을 저해하지 않는 것으로 나타났다.
<실시예 5>
급성독성시험
25±5g의 ICR계 마우스(대한실험동물)와 235±10g의 특정 병원 부재 스프라그-도올리(Sprague Dawley, Bio genomics 사) 쥐를 각각 3마리씩 6군으로 나누어 본 발명의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물들을 각각 20 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏의 용량으로 복강 투여한 후 24시간 동안 독성 여부를 관찰하였다. 실험 결과, 5군 모두에서 사망한 예를 전혀 관찰할 수 없었고, 체중 증가, 사료 섭취량 등에서 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다. 따라서 본 발명의 돌단풍 추출물은 안전한 소재임을 확인할 수 있었다.
<실시예 6>
돌단풍의 추출물을 이용한 약학적 조성물 제조
본 발명의 돌단풍 추출물을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
캡슐제의 제조
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 중 하나의 시료 100 ㎎, 옥수수 전분 100 ㎎, 유당 100 ㎎, 스테아린산 마그네슘 2 ㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
산제의
제조
돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물 중 하나의 시료 2 g, 유당 1 g을 완전히 혼합한 후 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<실시예 7>
돌단풍 추출물을 이용한 발효유 제조
돌단풍의 메탄올 추출물을 이용한 발효유 제조
탈지분유로 무지유고형분 함량을 8~20 중량%로 조정한 원료유를 72~75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 37℃로 냉각시킨 후 락토바실러스 카제이 HY 2782를 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 배양액이 pH 4~5가 될 때까지 37℃에서 배양하고 냉각시켰다. 시럽은 과즙 농축액 0.1~50 중량%, 식이섬유 0.1~20 중량%, 포도당 0.5~30 중량%, 올리고당 0.1~15 중량%, 칼슘 0.001~10 중량%, 비타민 0.0001~5 중량% 및 돌단풍의 메탄올 추출물 0.1~5 중량%를 녹여 제조하고 살균한 뒤 냉각하였다. 이렇게 제조된 시럽과 상기 배양액을 1:3의 부피비율로 혼합, 교반하여 균질화한 뒤 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에서 양호한 결과를 보였다.
돌단풍의 에탄올 추출물을 이용한 발효유 제조
탈지분유로 무지유고형분 함량을 8~20 중량%로 조정한 원료유를 72~75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 37℃로 냉각시킨 후 락토바실러스 카제이 HY 2782를 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 배양액이 pH 4~5가 될 때까지 37℃에서 배양하고 냉각시켰다. 시럽은 과즙 농축액 0.1~50 중량%, 식이섬유 0.1~20 중량%, 포도당 0.5~30 중량%, 올리고당 0.1~15 중량%, 칼슘 0.001~10 중량%, 비타민 0.0001~5 중량% 및 돌단풍의 에탄올 추출물 0.1~5 중량%를 녹여 제조하고 살균한 뒤 냉각하였다. 이렇게 제조된 시럽과 상기 배양액을 1:3의 부피비율로 혼합, 교반하여 균질화한 뒤 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에서 양호한 결과를 보였다.
돌단풍의 열수 추출물을 이용한 발효유 제조
탈지분유로 무지유고형분 함량을 8~20 중량%로 조정한 원료유를 72~75℃에서 15초간 살균하였다. 살균된 원료유를 37℃로 냉각시킨 후 락토바실러스 카제이 HY 2782를 106 cfu/㎖의 농도로 접종하여 배양액이 pH 4~5가 될 때까지 37℃에서 배양하고 냉각시켰다. 시럽은 과즙 농축액 0.1~50 중량%, 식이섬유 0.1~20 중량%, 포도당 0.5~30 중량%, 올리고당 0.1~15 중량%, 칼슘 0.001~10 중량%, 비타민 0.0001~5 중량% 및 돌단풍의 열수 추출물 0.1~5 중량%를 녹여 제조하고 살균한 뒤 냉각하였다. 이렇게 제조된 시럽과 상기 배양액을 1:3의 부피비율로 혼합, 교반하여 균질화한 뒤 용기에 포장하여 발효유를 제조하였다. 제조된 발효유는 관능검사 결과 풍미, 물성, 전체적인 맛에서 양호한 결과를 보였다.
<실시예 8>
돌단풍 추출물을 이용한 음료 제조
돌단풍의 메탄올 추출물을 이용한 음료의 제조
돌단풍의 메탄올 추출물 14 중량%, 대추엑기스 1.5 중량% 및 당귀농축액 7 중량%에 액상과당 7.4 중량%를 혼합하고 여기에 정제수를 첨가, 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 90~95℃에서 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조하였다.
돌단풍의 에탄올 추출물을 이용한 음료의 제조
돌단풍의 에탄올 추출물 14 중량%, 대추엑기스 1.5 중량% 및 당귀농축액 7 중량%에 액상과당 7.4 중량%를 혼합하고 여기에 정제수를 첨가, 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 90~95℃에서 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조하였다.
돌단풍의 열수 추출물을 이용한 음료의 제조
돌단풍의 열수 추출물 14 중량%, 대추엑기스 1.5 중량% 및 당귀농축액 7 중량%에 액상과당 7.4 중량%를 혼합하고 여기에 정제수를 첨가, 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 90~95℃에서 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조하였다.
<실시예 9>
돌단풍 추출물을 이용한 건강보조식품 제조
돌단풍의 메탄올 추출물을 이용한 건강보조식품 제조
돌단풍의 메탄올 추출물 0.01~30 중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올을 상기의 돌단풍의 메탄올 추출물 100 중량%에 대하여 5~10 중량%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10 중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2 mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40℃~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조될 수 있다.
돌단풍의 에탄올 추출물을 이용한 건강보조식품 제조
돌단풍의 에탄올 추출물 0.01~30 중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올을 상기의 돌단풍의 에탄올 추출물 100 중량%에 대하여 5~10 중량%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10 중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2 mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40℃~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조될 수 있다.
돌단풍의 열수 추출물을 이용한 건강보조식품 제조
돌단풍의 열수 추출물 0.01~30 중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올을 상기의 돌단풍 의 열수 추출물 100 중량%에 대하여 5~10 중량%가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10 중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2 mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40℃~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조될 수 있다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명의 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물, 열수 추출물은 알츠하이머성 치매 질환을 유발시키는 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 가장 중요한 역할을 하고 있는 β-세크레타제(β-secretase)에 대한 활성을 특이적으로 저해함으로써 알츠하이머성 치매 예방을 위한 유제품, 건강 식품 및 음 료로 이용될 수 있다.
Claims (7)
- 돌단풍(Aceriphyllum rossii Engler)의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,상기 추출물은 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 관여하는 β-세크레타제 활성을 특이적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 약학 조성물.
- 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 발효유.
- 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 음료.
- 돌단풍의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 건강 식품.
- 돌단풍(Aceriphyllum rossii Engler)의 메탄올 추출물, 에탄올 추출물 또는 열수 추출물 중 어느 하나를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 식품 조성물.
- 제6항에 있어서,상기 추출물은 베타 아밀로이드 펩타이드의 생성에 관여하는 β-세크레타제 활성을 특이적으로 저해하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머성 치매 예방용 식품 조성물.
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| 경남대 대학원 석사학위 논문, 한재택, 2000 |
| 충남대 대학원 박사학위 논문, 유재국, 2007 |
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