KR100856819B1 - Ｌｌ―37 유래의 펩티드성 독소 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 독소 특히 곰팡이 및 박테리아 독소, 예컨대 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 리포타이코산(LTA)과 같은 독소에 대하여 친화성을 가지는 펩티드성 화합물 군에 관한 것이다. 상기 화합물은 독소를 억제 또는 중화할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 화합물의 치료 및 진단 약제로서의 용도에 관한 것이다.

독소, 중화, 펩티드

Description

ＬＬ―37 유래의 펩티드성 독소 억제제{PEPTIDE INHIBITORS OF TOXINS DERIVED FROM ＬＬ-37}

본 발명은 독소 특히 곰팡이 및 박테리아 독소, 예컨대 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 리포타이코산(LTA)과 같은 독소에 대하여 친화성을 가지며, 이러한 독소를 억제 또는 중화할 수 있는 화합물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 화합물의 제조방법, 그것의 치료 및 진단 용도, 상기 화합물을 포함하는 조성물, 이들을 코딩하는 유전물질, 및 이들의 투여방법에 관한 것이다.

현대의 약물요법은, 19세기 중반까지 조기사망의 주된 원인이었던 미생물 및 특히 박테리아 감염을 대처하는데 있어 매우 성공적이었다. 최근에 들어, 그러나, 박테리아 내성의 꾸준한 증가로 인하여 고효능 항생제의 광범위한 사용에 대한 우려가 증가하고 있다. 사실, 지난 25년 동안, 항생제 내성은 - 특히 광범위한 항생제 화합물에 대한 다중 내성(multiple resistance)- 사실상 검사한 모든 박테리아 종에 있어 증가하였다. 통상적 내성 기전에 의해 영향을 받지 않는, 현재 가장 발전된 형태의 항 박테리아성 제제는, 이의 사용이 복수 약물-내성 돌연변이체에 대해 선별적인 것으로 보이는 화합물인 것으로 생각된다.

이러한 발전을 근거로, 전문가들은 농약 및 인강용 의약품에 있어, 항생제를 과거보다 훨씬 더 제한적으로 사용할 것을 권고하고 있다. 예를 들면, 경미한 감염증은 - 특히, 감기와 같이 전형적으로 박테리아에 의해 유발되지 않는 감염증 - 항생제로 치료하지 말아야하며, 항생제는 보다 심각한 증상을 위해 사용되어야만 한다.

나아가, 완전히 상이한 유형의 약학적 활성을 갖는, 바람직하게는 통상의 항생제에 대한 박테리아의 내성과는 독립적인 활성을 갖는, 박테리아성 감염의 치료를 위한 신규 화합물을 개발할 필요성이 있다.

항생제의 광범위한 사용이 논쟁이 되었던 증상 중 하나는 급성 또는 만성상태의 중이염이다. 삼출성 중이염(OME), 즉 급성 감염 증상이 없이 중이에 유체의 존재를 특징으로 하는 중이염이 있는 환자의 수가 초기 급성 중이염(AOM)에 대하여 항생제요법을 사용한 후에 급격히 증가한다는 것이 보고되었으며, 이는 항생제 자체가 OME에 있어 소정의 역할을 함을 암시한다 (Lim et al., Laryngoscope 92, 278-286, 1982). 이는 페니실린과 같은 항생제는 예컨대 중이에서의 IgM의 국소적 생산과 같은 국소적 면역반응의 발생을 방해하는 것으로 생각된다 (Howie etal., Ann. Otol. Rhino. Laryngol.85 Suppl. 25, 18-19, 1976). 항생제 요법의 다른 단점은 박테리아는 죽이지만, 이들의 독소는 여전히 활성이 있다는 것이다.

박테리아 또는 곰팡이 감염으로부터 초래되는 여러 증상의 치료의 경우, 미생물 또는 병균 자체를 죽이지는 않지만, 이들의 독소를 중화하여 숙주의 자연 방어기전이 감염의 확산을 조절하도록 하는 화합물의 사용이 이로울 수 있고 발표된 바 있다 (Nell, The Role of Endotoxin in the Pathogenesis of Otitis Media With Effusion, PhD Thesis, Leiden, 1999). 동시에 이러한 전략은 손상된 점막 기능의 신속한 회복을 도울 것이다.

중이염과 같은 다수의 감염증에 연루된 곰팡이 독소 및 특히 박테리아 독소와 같은 미생물성 독소의 주 역할은 매우 독성이 강한 지질 모이어티인 지질 A와 접합된 폴리사카리드로 구성된, 그람음성 박테리아의 세포벽에서 발견되는 리포폴리사카라이드(LPS) 그룹인, 내독소에 의해 수행된다. OME 치료를 위한 최근의 치료법 중 하나는 내독소, 또는 LPS(Nell, ibid)를 중화하는 화합물을 투여하는 것이다.

현재 내독소, 또는 LPS를 중화할 수 있는 다양한 화합물이 공지되어 있다. 예를 들면, 수개의 항-내독소 항체, 예컨대 HA-1A 및 E5, 인간 및 쥐의 단일클론성 IgM 항체가 각각 개발되었다. 이러한 항체는 패혈증 쇼크와 같은 일부 심각한 증상이 있는 환자의 생존율을 증가시키는 것으로 나타났다 (Ziegler et al., New Engl. J. Med. 324, 429-436,1991). 그러나, 이들의 활성 및 특이성은 만족스럽지 못한 것으로 생각된다.

내독소에 대하여 활성이 있는 다른 그룹의 물질은 박테리아 침투-증가성 단백질(Bacterial permeability-increasing protein: BPI)로 명명된 인간 내독소 단백질로부터 유래되며, 이는 호중구의 아주르친화성(azurophilic) 과립에 저장되어 있다 (Gazzano-Santoro et al., Infection and Immunity 60 : 11, 4754-4761,1992). 강한 양이온성 단백질인 BPI는 자유 내독소를 중화시킬 뿐만이 아니라, 박테리아 외막의 침투성을 증가시켜 박테리아 세포 자체를 저해하거나 사멸한 다. BPI는 실로 강력하고, 자연적인 항생제로서, LPS의 존재 및 종양괴사인자 (TNF)를 포함하는 일부의 다른 촉발제에 의해 유도된다. 그러나 대부분의 이러한 활성은 이를 합성하는 면역세포, 즉 다형핵 대식세포와 연관되어 있다.

BPI 유래의 수개의 재조합 단백질, 예컨대 rBPh₂₃ (Kohn et al., 1993) 및 rBPI₂₁ (Horwitz et al., 1996)이 개발되었으며, 이들은 개략적으로 각각 23 및 21 kDa 분자량을 갖는 BPT의 N-말단 부분을 나타낸다. OME의 치료에 있어 BPI 및 BPI 유래 화합물의 사용은 예를 들면 WO-A-00/71149에 기술되어 있다.

항미생물 활성을 갖는 다른 천연 화합물 패밀리는 카텔리시딘(cathelicidin)), 호흡 상피세포, 허파꽈리 대식세포, 및 기타 다른 조직이 생산하는 펩티드류가 있다. 천연 상태에서, 이들은 선형이며, α-나선형의 시스테인이 결여된 펩티드 또는 단백질이다. 카텔리시딘은 양이온성이며, 매우 잘 보존된 신호서열 및 프로-영역(pro-region)인 카텔린을 포함한다. 그러나, 이들의 성숙한 펩티드를 코딩하는 C-말단 도메인은 상당한 이질성을 나타낸다. 상기 펩티드는 12 내지 80개의 아미노산을 가질 수 있다.

가장 두드러진 인간 카텔리시딘은 18 kDa의 양이온성 항미생물성 단백질, CAP18이다. CAP18의 C-말단 부위의 37개의 아미노산인 펩티드 LL-37은 LPS에 대한 고친화성 및 중화능력의 원인이 되는 부위를 나타낸다 (Sawa et al., Antimicr. Agents Chemother. 42: 12, 3269-3275,1998). CAP18 또는 LL-37 유래의 수개의 절단 펩티드가 개발 및 시험되었으며, 이들에 관하여는 예컨대 Sawa (Sawa et al., ibid. ), Gutsmann (Gutsmann et al., Biophys. J. 80, 2935-2945, 2001), 및 US Patent No. 6,040, 291 및 이의 유럽 대응특허 EP-A-0 955 312에 개시되어 있다.

나아가, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 9 (5) (2002) 972-982의 Nagaoka Isao 등 및 Infection and Immunity 66 (5) (1998), 1861-1868의 Kirikae 등의 문헌을 참조한다.

Nagaoka 등은 LL-37의 아미노산 서열 및 이에서 유래된 18 mer K¹⁵-V³² 를 기술하며, 반면, Kirikae 등은 다수의 CAP-18 유래의 특허발명에 촛점을 맞추고 있다.

따라서, 천연의 아미노산 서열이 보존된 LL-37 유래의 절단 펩티드, 및 특히 아미노산서열 KEFKRIVQRIKDFLRNLV를 함유하는 펩티드가 종래기술로 기재되어 있다.

일반적으로, 상대적으로 작은 펩티드가 여러 가지 이유로 인하여 치료 화합물용 선도 후보로서, 예컨대 CAP18과 같은 단백질에 대하여 선호된다. 첫 번째 이유는 이들은 이들의 목적하는 활성 및 특이성을 보존 또는 증강하기 위해 보다 용이하게 최적화, 적응 및 변형될 수 있다. 두 번째로, 이들은 수득 또는 합성하기가 보다 용이하여, 이로인해 취득하기가 보다 용이하다. 셋째, 이들은 단백질이 종종 불안정하여 비경구 투여 후에 생체이용성이 없는 것과는 달리, 제형화 또는 전달하기가 보다 용이하다.

종래기술에 있어서의 노력에도 불구하고, LPS- 및 LTA-중화 활성을 가지며 중이염과 같은 박테리아 유도성 질병 및 증상의 치료용 약학 제제 또는 신규한 약학 제제의 개발을 위한 선도물질이 될 수 있는 또 다른 펩티드 및 펩티드성 화합물에 대한 필요성이 존재한다.

나아가, 원치않는 염증활성, 예컨대 사이토카인 생산 자극, T-세포 증식, 세포외성 신호-관련 키나제(ERK), 또는 호중구의 화학주성과 같은 염증활성으로, 이들 모두는 현재 알려진 CAP18 유도 펩티드의 활성 스펙트럼의 일부인, 원치않는 염증활성이 없거나 또는 적은 화합물에 대한 지속적인 요구가 있다.

본 발명의 주요 목적 중 하나는 미생물 독소, 및 특히 곰팡이 및 박테리아 독소 예컨대 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포타이코산(LTA)에 대한 친화성 및 중화성을 가지는 동시에 염증활성은 저하된 신규한 화합물을 제공하는 것이다.

나아가 친화성 및 중화성 또는 억제기능이 대략 동일한 정도로 유지되거나 또는 향상됨과 동시에 펩티드의 안전성을 최적화하는 방식으로 LL-37 (및 CAP18) 유래의 공지의 천연 아미노산 서열을 적합화하는 것이 본 발명의 또 다른 목적이다.

또 다른 목적 및 그 외의 목적들은 이러한 화합물의 제조방법 및 치료 및 진단방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적은 하기의 기재로부터 명백하게 될 것이다.

발명의 요약

일 측면에 있어서, 본 발명은 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포타이코산(LTA)에 대해 친화성이 있는 화합물을 제공한다. 상기 화합물은 화학적 특성면에 있어서는 펩티드성으로 아미노산 서열 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆ (본원에서 이하 또한 핵심 (아미노산)서열로 언급됨)을 포함하며, 아미노산 서열에서, X₁ 은 상기 서열의 N-말단부위를 나타내며, X₂ 는 K 또는 E, X₃ 은 Q 또는 E, X₄ 는 D 또는 R, X₅ 는 N 또는 E, 및 X₆ 은 C-말단 부위를 나타낸다; 아미노산 서열에서, 핵심 서열의 하나 이상의 아미노산은 유도체화 될 수 있다; 여기에서, N-말단 부위는 아세틸화 및/또는 C-말단 부위는 아미드화되며 및/또는 상기 아미노산 서열은 천연아미노산 서열 X₁ KEFKRIVQRIKDFLRNLV X₆ 과 상이하다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 상기 화합물의 제조방법을 제공한다. 상기 방법은 아미노산 단량체 또는 올리고머를 화학 및 효소적으로 연결하여 화합물을 회합하는 것을 포함한다. 이들은 또한 숙주세포에서 핵산 서열을 갖는 숙주세포 형질감염용 벡터를 사용하여 상기 화합물을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 포함한다. 임의의 상기 전 청구항에 따른 화합물의 제조방법으로, 여기에서 아미노산 단량체, 아미노산 올리고머, 또는 아미노산 유사 또는 모사체의 모노- 또는 올리고머는, 액상에서 및/또는 관능화된 고상의 경계면에서의 화학적 또는 효소적 연결에 의해 회합된다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물의, 박테리아 독소, 특히 LPS 및 LTA의 존재로부터 초래되거나 또는 이와 연관된 질병 및 증상의 진단, 예방, 및/또는 치료에 적합한 약학 또는 진단 조성물의 제조용 용도에 관한 것이다. 이러한 독소는 감염성 박테리아가 유기체에 더이상 존재하지 않는 경우에도 유기체에 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 진단 조성물은 생체 내 및 생체 외에서 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물은 전형적으로 하나 이상의 약학적 담체 및/또는 부형제를 또한 포함할 것이며, 특정 투여 경로, 예컨대 비경구 주사 또는 주입, 지엽적(locoregional) 적용, 예컨대 점적주입, 관류흡입, 주사, 또는 주입; 또한 흡입, 구강섭취, 코 또는 점막을 통한 투여, 또는 기타 임의의 적절한 투여 경로에 유용하도록 적합화될 수 있다. 상기 조성물은 추가로 약물 표적제, 생체이용도 증강제, 또는 본 발명의 화합물 이외의 활성 성분을 포함할 수 있으며, 즉각적 또는 변형된 방출을 제공한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 아미노산 서열 KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LV를 포함하는 펩티드를 코딩하는 핵산 서열에 관한 것으로, 상기 아미노산 서열에서, X₂ 은 K 또는 E, X₃ 은 Q 또는 E, X₄ 는 D 또는 R, X₅ 는 N 또는 E를 나타내며, 여기에서, X₂, X₃, X₄ 및 X₅ 각각은 동시에 K, Q, D 및 N이 아니다.

본 발명의 여러가지 실시예들이 하기의 상세한 설명 및 첨부되는 청구범위에 개시될 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 화합물은 리포폴리사카라이드(LPS) 및 리포타이코산(LTA)에 대해 친화성이 있는 펩티드성 화합물이다. 이들은 핵심 아미노산 서열 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆ 을 포함하며, 아미노산 서열에서, X₁ 은 상기 서열의 N-말단부위를 나타내며, X₂ 는 K 또는 E, X₃ 은 Q 또는 E, X₄ 는 D 또는 R, X₅ 는 N 또는 E, 및 X₆ 은 C-말단 부위를 나타낸다; 아미노산 서열에서, 핵심 서열의 하나 이상의 아미노산은 유도체화 될 수 있으며, 여기에서 N-말단 부위는 아세틸화 및/또는 C-말단 부위는 아미드화되며 및/또는 상기 아미노산 서열은 천연 아미노산 서열 X₁ KEFKRIVQRIKDFLRNLV X₆ 과 상이하다.

본 상세한 설명 및 첨부하는 청구항에서, "N-말단 부위가 아세틸화되었다"라는 표현은 하기의 의미를 가진다. 상기 N-말단 부위는 카르복실산과의 반응에 의해 아미드로 연결된 안정 또는 보호기가 생성되어 보호된다. 예를 들면, 퓸산을 펩티드와 반응시켜 포밀 안정화 펩티드를 수득할 수 있다; 아세트산과 반응시켜 아세틸 보호 펩디드를 수득할 수 있다. 추가로, 상기 펩티드는 프로피온산 및 탄수화물 부위 R에 6개 이하의 탄소원자 및 많게는 10개 이하의 탄소원자를 갖는 기타의 유기산과 반응할 수 있다. 이러한 유기산에서, 탄수화물기는 선형 또는 분지형, 또는 환형일 수 있고, 및/또는 하나 이상의 불포화를 포함할 수 있는 10개 이하의 탄소원자를 갖는 R이다. 나아가, 상기 알킬쇄는 예를 들면, 히드록실, 할로겐, 아미노메르캅토 및 설포옥사이드 기로 치환될 수 있다. 따라서, N-말단 부위에, 하기의 기가 존재할 수 있다: -C(O)-R¹. 대안적으로, 카르복실산과의 반응대신에, 상기 반응을 또한 설폰산과 수행하여 상응하는 설폰아미드 결합을 수득할 수 있다. 따라서, N-말단 부위에서, -SO₂-R기가 존재할 수 있다. 대안적으로, 상기 용어는 또한 알킬화 및 디알킬화를 포함하는 것으로, N-말단 부이에, 2차 또는 3차 아민기 -N-(R)₁ 또는 -N-(R)₂ 가 존재할 수 있으며 여기에서 각 R은 상기 의미를 가진다.

추가의 실시예에서, "아세틸화"는 펩티드의 이소시아네이트 또는 이소티오시아네이트와의 반응을 포함하는 것으로 여기에서 우레아 또는 티오우레아가 생성된다: 각각 R-N-C(O)- 또는 R-N-C(S)-, R은 상기 정의된 바와 같음.

마지막으로, 상기 N-말단은 산에 안정한 블로킹기로 보호될 수 있으며, 상기 기는 펩티드의 합성동안 편리하게 도입될 수 있으나, 제거되지 않을 것이다. 공지의 블로킹 기는 F_moc 및 Z 기이다.

"C-말단 부위는 아미드화된다"라는 표현의 의미와 관련하여, 하기를 주의한다. "아미드화"라는 용어는 C-말단에 자연적으로 존재하는 -OH가 -X 기에 의해 대체되는 것을 의미하는 것으로, X는 (i) -NY₂ 기, Y는 독립적으로 H 또는 R이며, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같거나 또는 두 개의 Y-기는 함께, 이들이 부착되어 있는 N-기와 더불어 환형 모이어티를 형성할 수 있다; (ii) -OR 기, 여기에서 R은 상기 정의된 바와 같거나, 또는 (iii) -R기 이다. 고안정성으로 인해 펩티드 아미드가 선호된다.

상기 본 발명의 펩티드성 화합물은 제 1 항으로부터 배제되는 천연 아미노산 서열과 비교하여 최적화된 안정성을 가짐을 발견하였다.

펩티드성 화합물은 펩티드, 예컨대 올리고- 또는 폴리펩티드, 단백질, 또는 펩티드 유래의 물질이다. 펩티드 자체 이외에, 펩티드성 화합물은 또한 펩티드 유사체, 펩티드 유도체, 변형 펩티드, 및 펩티드 접합체를 포함한다. 펩티드성 화합물은 공통적으로 아미노산 서열을 포함한다. 더욱 상세하게, 펩티드는 한 아미노산의 아미노기와 다른 아미노산의 카르복실기의 조합에 의한 두 개 이상의 아미노산 유래의 아미드로 정의된다 (Merriam Webster Medical Dictionary 2001). 대조적으로, 펩티드성 화합물은 또한 분자내의 펩티드 구조를 언급하는 것일 수 있다. 전형적으로, 펩티드는 자연적으로 나타나는 (L-)α-아미노산, 구체적으로 알라닌 (Ala 또는 A), 아르기닌 (Arg 또는 R), 아스파라긴 (Asn 또는 N), 아스파르트산 (Asp 또는 D), 시스테인 (Cys 또는 C), 글루타민 (Gln 또는 Q), 글루탐산 (Glu 또는 E), 글리신 (Gly 또는 G), 히스티딘 (His 또는 H), 이소루이신 (Ile 또는 I), 루이신 (Leu 또는 L), 리신 (Lys 또는 K), 메티오닌 (Met 또는 M), 페닐알라닌 (Phe 또는 F), 프롤린 (Pro 또는 P), 세린 (Ser 또는 S), 트레오닌 (Thr 또는 T), 트립토판 (Trp 또는 W), 티로신 (Tyr 또는 Y), 및 발린 (Val 또는 V)으로 구성된다.

펩티드의 유사물 또는 등가물은, 종류면에 있어, 그러나 반드시 양적인 면에 있어서는 아닌, 미생물 및 특히 박테리아성 독소에 대하여 동일한 활성 특히 동일한 친화성을 포함하는 펩티드성 분자로 예를 들면, 변형 펩티드, 펩토이드, 펩티드 유사체 또는 펩티도모사체일 수 있다.

변형된 펩티드는 일반적으로 천연 아미노산에는 존재하지 않는 치환체 또는 관능기의 도입에 의해 유래된 펩티드 분자이다. 상기 용어는 또한 펩티드의 다른 화학적 카테고리 유래의 분자와의 반응에 의해 수득되는 화합물을 포함하며, 상기 분자는 천연적 또는 비천연적이어도 된다. 예를 들면, 인산화, 황화 및 바이오티닐화 펩티드, 글리코단백질, 및 리포단백질이 자연에서 흔히 발견되는 반면, 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 펩티드는 펩티드 특성의 전부가 아닌, 일부만을 변경하도록 고안된 화학적으로 변형된 펩티드의 예이다.

펩토이드는 펩티드와 마찬가지로 또한 펩티드성 화합물이다. 이들도 또한 전형적으로 두 개 이상의 아미노산의 아미드이다. 그러나 이들은 천연 아미노산으로부터는 직접적으로 흔히 유도되지 않으며, 그보다는 다양한 유형의 화학적으로 합성된 L- 및/또는 D-아미노산이다.

펩티도모사체는 가장 넓은 범위에서 이들의 관능기 구조에 있어 펩티드에 다소 유사하지만, 또한 골격에 비-펩티드성 결합을 포함할 수 있는 화합물, 또는 D-아미노산이다. 일반적으로 펩티도모사체는 수용체 및 효소와의 상호작용에서 천연 펩티드의 대체물로서 기능한다 (Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 138).

유사펩티드는 펩티도모사체의 한 부류로 아미드 결합대신에 아미드결합 등입체성계(isosteres)를 포함하는 화합물이다 (ibid., pp. 137-140).

본 발명의 화합물은 또한 펩티드 또는 등가물의 염, 예컨대 약학적으로 허용가능한 산- 또는 염기 부가염, 및 첨가생성물을 포함한다. 이들은 또한 펩티드 또는 등가물의 다량체를 포함한다.

본 발명의 화합물은 하나 이상의 독소, 특히 박테리아성 독소에 대하여 친화성을 가진다. 구체적으로, 약 1 마이크로몰라 농도의 펩티드는 시험관내에서 LPS/LTS 활성을 상당히 감소(50% 초과)시키는 것으로 나타났다. 실제, 본 상세한 설명에 사용된 "친화성"이라는 용어는 적용하는 분석에서 펩티드의 활성을 언급하는 것이다.

이러한 분석에서, 바람직한 펩티드의 활성은 저 마이크로몰라 내지 고 마이트로몰라 범위인 것으로 측정되었다. 더우기, 일반적으로, 본 발명의 화합물은 서브-밀리몰라 활성을 가지며, 고친화성, 예를 들면 저 마이크로몰라 또는 나노몰라 활성을 나타내는 화합물이 바람직하다. 많은 감염성 질환에서, 그람음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS) 부류와 같은, 박테리아 독소는 질환의 발현과 연관되어 있다. 이러한 독소는 중대한 염증 반응을 유도할 수 있다. 예를 들면, 상부 기도 감염에서, 염증은 중이 또는 부비동(sinuses)의 상피세포의 점막 손상을 일으킬 수 있어 상부 기도의 주요 방어계 중의 하나인 점액섬모 청소계(MCS)의 장애를 초래한다. 본 발명의 화합물은 또한 장감염의 치료에 특히 적합할 수 있다. 곰팡이 또는 박테리아 독소에 대한 친화성은 임의의 중화 능력에 대한 필요조건이며, 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 LPS 및 다른 독소에도 결합할 뿐만이 아니라, 또한 이러한 독소를 중화, 억제하는 능력, 그렇지 않은 경우에는 상기 독소의 효과를 상쇄하는 능력을 가진다.

박테리아 독소에 대한 바람직한 유형의 활성은 펩티드성 화합물이 청구범위 제 1 항에 정의된 구조적 요구조건을 충족하는 경우에 관찰되며, 이에 의하면 상기 화합물은 아미노산 서열 X₁KEFX₂RIVX₃RIKX₄FLRX₅LVX₆ 을 포함하며, 아미노산 서열에서, X₁ 은 상기 서열의 N-말단 부위를 나타내며, X₂ 는 K 또는 E, X₃ 은 Q 또는 E, X₄ 는 D 또는 R, X₅ 는 N 또는 E, 및 X₆ 은 C-말단 부위를 나타낸다. 이러한 기본 모티브는 천연의 항미생물 단백질 CAP18, 또는 그 자신이 CAP18 유래인 LL-37 펩티드 유래이다.

본 명세서에 사용된, N-말단 부위는, 화합물의 N-말단 모이어티 또는 도메인을 나타내는 기, 원자, 또는 서열, 즉 서열내에서 아미드 결합에 참여하지 않는 핵심 서열의 말단 α-아미노기에 부착된 구조이다. 상기 N-말단 부위는 자유 α-아미노기인 경우에는 단순히 수소원자일 수 있으며; 또는 말단 α-아미노 질소원자에 부착된 화학기, 예컨대 아실기로 구성될 수 있다. 이는 또한 더 큰 기, 예컨대 두 개 이상의 아미노산의 서열, 또는 아미노산으로 구성되지 않거나 또는 오로지 아미노산만으로는 구성되지 않은 화학적 구조체를 나타낼 수 있다. 상기 C-말단 부위는 유사한 형식으로 정의된다.

바람직하게, 본 발명의 화합물은 핵심 모티브를 정의하는 총 18개를 초과하는 아미노산을 포함한다. 한 실시예에서, 상기 N-말단 부위는 두 개 이상의 아미노산을 포함한다. 이러한 서열의 적합한 아미노산 일원은 I 및 G이며, 바람직한 N-말단 부위는 IG이다.

다른 실시예에서, 상기 C-말단 부위는 또한 아미노산 서열을 포함한다. 상기 서열은 1, 2, 3, 4, 또는 4개 초과의 아미노산을 포함할 수 있다. 한 실시예에서 상기 C-말단 부위는 4개의 아미노산을 포함한다. 상기 C-말단 부위의 4개의 아미노산의 C-말단 끝은 펩티드 LL-37 내의 동등한 위치에서와 마찬가지로, E 일 수 있다. 그러나, 이러한 C-말단 끝은 또한 R로서 정의될 수 있다. C-말단 아미노산의 옆에 위치하는 아미노산은 LL-37의 경우처럼 T 일 수 있거나, 또는 L 일 수 있으며, 나머지 두 개의 위치 중 어느 하나에서, 상기 C-말단 부위 4개의 아미노산 일원 중 바람직한 다른 아미노산은 P 및 R이다. 가장 바람직하게, 상기 C-말단 부위는 PRTE 및 RPLR로부터 선택된다.

추가의 실시예에서, 상기 N-말단 부위 및 C-말단 부위는 상술한 바람직한 화합물로부터 선택되는 총 24개의 아미노산을 갖는 펩티드성 구조체이다. 현재 가장 바람직한 화합물 중에는 펩티드 그 차제의, 또는 변형된 펩디드 또는 펩티드 유도체로서의 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 및 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 가 있다.

바람직한 변형 중에는 상기 정의한 바에 따른 아미드화 및/또는 아세틸화 펩티드가 있다, 아미드화가 특히 이로울 것으로 보이는 위치 중의 하나는 펩티드의 C-말단이다. 아세틸화는 반면에, N-말단 아미노산에서 수행된다. 현재 한 바람직한 실시예에서, 펩티드 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 및IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 은 N-말단은 아세틸화되고 C-말단은 아미드화된 것이다. 예비시험에 하면 이들 변형은 엑소- 펩티다제의 존재하에서 증가된 안정성을 갖는 것으로 나타났다.

화합물은 일반적으로 펩티드 및 유사물질의 제조에 있어 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 단지 수개의 아미노산 또는 유사한 단위체를 포함하는, 그리고 바람직하게는 30-50 단위체 이하인, 보다 작은 화합물은, 반응이 용액 또는 현탁액 중에서 일어나는 전통적 방법을 이용하거나, 또는 펩티드가 중합성 비드와 같은 고형표면 상에 고정되어 회합되는 보다 현대적인 고상 방법을 사용하는, 화학 또는 효소적 결합 기술로 제조될 수 있다. 보다 큰 분자는 전형적으로 자동화 고상 펩티드 합성기로 합성된다.

대안적으로, 상기 화합물은 공지의 유전공학 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 접근법은 화합물이 실질적 펩티드이거나 또는 약간 변형된 펩티드인 경우에 특히 효과적이다. 예를 들면, 상기 화합물을 코딩하는 DNA 서열은 세포를 형질감염할 수 있는 발현벡터와 회합 또는 조합될 수 있다. 상기 방법의 다른 단계에서, 숙주세포 또는 표적세포는 형질감염이 일어나게 하는 조건하에서 상기 세포를 상기 벡터 및 상기 벡터-회합된 DNA와 접촉시킴으로써 상기 DNA로 형질감염된다. 추가의 단계에서, 숙주 또는 표적세포는 상기 화합물이 발현되도록 하는 조건하에서 배양된다. 후속적으로, 상기 화합물을 분리될 수 있다. 만약 상기 화합물 자체가 코딩될 수 없거나 또는 발현될 수는 없지만, 코딩 또는 발현될 수 있는 펩티드에 유사하다면, 상기 방법을 이러한 화합물과 유사한 펩티드의 제조에 적용할 수 있으며, 이 후, 하나 이상의 단계에서 상기 펩티드를 화학적 또는 효소적 기술로 변형하여 상기 화합물을 제조할 수 있다.

다양한 유형의 벡터, 예컨대 바이러스 벡터, 리포플렉스, 폴리플렉스, 마이크로스피어, 나노스피어, 덴드리머스, 네이키드 DNA, 펩티드 전달 시스펨, 지질, 특히 양이온성 지질, 또는 이로 만들어진 리포좀, 중합성 벡터, 특히 다중양이온 중합체로 만들어진 것들이 이러한 목적을 위해 사용된다. 바람직한 바이러스 벡터 중에는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 및 바이로솜이 있다. 바람직한 비-바이러스 벡터는 키토산, SPLP, PLGA, 폴리에틸렌이민, 폴리리신, 폴리포스포아미데이트, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리포스파젠을 기본으로 하는 중합 시스템, ; DOPE, DOTAP, 및 DOTMA를 포함한다.

본 발명의 화합물의 제조에 적용될 수 있는 보다 방법에 관한 보다 종합적인 요약은 하기에 기술되어 있다 : W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 25-30; Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 53-70,167-180, 123-152,8-20 ; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1-442; Solid-Phase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1-780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 1-89.

펩티드 또는 등가물의 염은 공지의 방법에 의해 제조되며, 이는 전형적으로 펩티드 또는 펩토이드를 약학적으로 허용가능한 산과 혼합하여 산부가염을 형성하거나 또는 약학적으로 허용가능한 염기와 혼합하여 염기 부가염을 형성하는 것을 포함한다. 산 또는 염기가 약학적으로 허용가능한 지 여부는 기술분야의 당업자라면 상기 화합물의 목적하는 구체적 용도를 고려한 후 용이하게 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 시험관 내 진단 조성물에 허용되는 모든 산 및 염기가 치료용 조성물에 사용될 수 있는 것은 아니다. 의도하는 용도에 따라서, 약학적으로 허용가능한 산은 펩트드 및 등가물의 자유 아미노기와 암모늄염을 형성하는, 유기 및 무기산 예컨대 포름산, 초산, 프로피온산, 젖산, 글리콜산, 옥살산, 피르브산, 숙신산, 말레산, 말론산, 계피산, 황산, 염산, 하이드로브롬산, 질산, 과염소산, 인산, 및 티오시안산을 포함한다.

펩티드 및 등가물의 자유 카르복실기와 카르복실산염을 형성하는 약학적으로 혀용가능한 염기는 에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 트리에틸아민, 이스프로필아민, 디이소프로필아민, 및 기타 모노-, 디, 및 트리알킬아민, 및 아릴아민을 포함한다. 더우기, 약학적으로 허용가능한 용매화물(solvate), 착화합물 또는 첨가생성물, 예컨대 수화물 또는 에테르산염을 포함한다.

본 발명에 따른 펩티드의 바람직한 변형 중 일부는 합성 동안 또는 합성의 마지막에 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들면, 펩티드가 고상(solid phase) 기술을 이용하여 합성되는 경우, N-말단 아세틸화는, 아직 수지에 결합하여 있는 아미노산 서열을 반응 마지막에 다른 아미노산 대신에 초산과 반응시킴으로써 수행될 수 있다.

C-말단 아미드화는 반면에, 고상 펩티드 합성에 있어 특별한 종류의 수지, 예컨대 시판되는 Tentagel S AM (예를 들면, Rapp, Tubbingen, Germany)을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 수지는 화학적 "핸들"을 포함하며, 이로부터 아미드화 펩티드가 절단과정 동안에 방출된다. 이들 및 추가의 펩티드 변형방법은 기술분야의 모든 당업자에게 공지되어 있다.

본 발명의 추가의 측면은 펩티드성 화합물의 용도에 관한 것이다. 상기 화합물은 미생물 독소 및 특히 박테리아 독소, 예컨대 리포폴리사카라이드 (LPS) 및 리포타이코산(LTA)에 대한 친화성이 있다. 그러므로, 상기 화합물은 이러한 독소가 관여하는 증상 및 질병의 치료 및 진단 목적용으로 유리하게 사용될 수 있다. 상기 결합 능력은 전형적으로 상기 독소를 중화시킬 것이며, 이로 인해 상기 화합물은 길항적 또는 부분적으로 길항적인 것으로 간주될 수 있다. 나아가. 이들은 상기 독소를 중화할 수 있으며, 그리고 본 발명의 화합물과 공유 또는 비공유 결합을 통하여, 또는 약물 담체, 예컨대 리포좀, 나노- 또는 마이크로입자, 나노- 또는 마이크로캡슐, 지질복합체, 또는 마이셀의 표면에 공유 또는 비공유 결합을 통하여 이들 독소를 특이적 표적으로 할 수 있는, 다른 화합물에 대한 표적제 또는 리간드로서 사용될 수 있다.

진단에 있어, 본 발명의 화합물은 생리적 유체, 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 점막 상피, 예컨대 호흡기를 덮고 있는 점액, 또는 예컨대 삼출성 중이염(OME)의 중이에서 발견되는 유체와 같은 병리적 상태로부터 초래되는 유체에 존재하는 박테리아 독소의 검출, 또는 독소의 정량용으로 사용될 수 있다. 이러한 용도의 경우, 상기 화합물은 시험관 내에서 사용되는 진단 키트, 또는 환자에게 투여될 수 있는 진단 조성물에 혼입될 수 있다. 이러한 용도의 경우, 하나의 선택은 본 발명의 화합물을, 궁극적으로는 적절한 모니터링 시스템으로 검출할 수 있는 방사선 표지와 복합체를 형성할 킬레이트제와 접합하는 것이다.

바람직한 용도는, 상기 화합물을 곰팡이 및 박테리아성 감염 및 체내의 곰팡이 및 박테리아 독소의 존재와 연관된 질병 및 증상의 예방 또는 치료를 위한 활성 약물제로서 투여하는 것이다. 상기 언급한대로, 급성 또는 만성 감염에서 항생제 요법은 예컨대 내성의 유도 및 내성 박테리아 변이체의 선별, 환자의 자연적 방어 시스템의 억제, 점막에 자연적으로 상주하는 박테리아 균총의 손상, 박테리아이 사멸되면서 방출되는 많은 양의 박테리아 독소 등과 같은 특정 한계 및 단점을 가진다. 나아가, 미생물 자체가 아니라, 독소 특히 박테리아 독소의 존재가 주원인인 증상 및 질병이 있을 수 있으며, 이에는 예컨대 OME가 있으며, 이 경우, 중이에 국소적으로 존재하는 독소가 급성 감염의 증상이 없는 경우에도 질환의 발현에 중대한 기여를 한다.

모든 경우들에서, 항생제가 아닌 박테리아성 독소를 중화시킬 수 있는 물질로 상기 질환을 치료하는 것이 현명한 일이 것이다. 이러한 목적으로, 본 발명의 화합물은 가장 적절한 미생물 독소, 예컨대 그람 음성 박테리아의 경우 리포폴리사카라이,(LPS) 그람 양성 박테리아의 경우 리포타이코산(LTA)에 대해 높은 결합성 및 중화 활성을 나타내므로, 특히 유익하다. 상부 기도 감염시 본 발명의 화합물이 특히 바람직한 치료에 있어서, 이러한 박테리아성 산물은 중이나 부비동(sinuses)에 염증을 유발할 수 있으며, 상부 기도 상피의 점막 손상을 유발할 수 있다. 관여한 독소 중화는 예방, 조절 또는 감소되는 점액섬모청소계(mucociliary clearance system)의 손상을 포함한 점막 손상을 허용할 수 있으며, 따라서 자연 방어 시스템을 증강시킬 것이다. OME를 포함한 박테리아성 독소는 살아있는 박테리아이 유의할만한 숫자로 존재하지 않더라도 중요한 문제점을 나타낼 수 있는 경우에, 본 발명의 화합물을, 예컨대 직접 중이에 투여하는 요법은 일차적인 치료 방식일 수 있다. 그러나, 그외 급성 또는 만성 부비강염, 또는 급성 또는 만성 이염과 같은 기도 감염의 경우에서도, 상기 화합물은 정상적인 점막 기능과 자연 방어 시스템을 복구하는데 매우 유용할 수도 있다.

보다 일반적으로는, 본 발명의 화합물은 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae), 모락셀라 카타르할리스(Moraxella catarrhalis) 그룹 Aβ-용혈성 스트렙토코쿠스(group Ap-hemolytic streptococci), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 그람 음성 장내 박테리아(gram-negative enteric bacilli), 스트렙토코수스 피오게네스(Streptocossus pyogenes), E. coli(Escherichia coli), 그람 음성 박테리아, 슈도모나스 sp(Pseudomonas sp).을 포함한 감염성 박테리아으로부터 발생되는 증상의 예방 및 치료에 유용한 약제이다.

천연 단백질과 이로부터 유래된 펩티드에 이르는, 예컨대 CAP18과 LL-37과 같은 본 발명의 화합물의 구체적인 이점은, 원치않는 염증성 활성의 정도가 낮다는 것이다. 상기 활성은 증식, 분화 및 사이토카인과 같은 전-염증성 매개체를 코딩하는 유전자의 발현을 포함한, 다양한 세포 과정에 관한 것이다. 사이토카인은 염증의 직접적인 매개체이고, 많은 면역학적 반응의 진행과 방향에 영향을 미친다. 사이토카인 생산에 균형성의 붕괴는, 여러가지 질환 상태에서 중요한 인자로 널리 인식된다. 삼출성 중이염 또는 부비강염과 같은 상태에서, 상기 균형은 이미 깨어져 있다. T 세포 증식 역시 상기 상황에 우호적이지 않는데, 이는 이미 통제를 벗어난 면역 반응을 더 자극할 것이기 때문이다.

따라서, 상기 화합물은 약학적 조성물에 사용하는 것이 유익할 것이다. 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 화합물 자체와 함께 제공된다. 본 발명에서, 용어 "약학적 조성물"은 치료 조성물 및 진단 조성물 뿐만 아니라 상기 조성물을 포함하는 의약제 및 진단제를 의미한다. 치료 조성물 및 의약제는 질병과 그외 이의 증상 개선이 바람직한 포유류의 증상의 예방 및 치료에 사용된다. 진단체 및 진단 조성물은 생체내 및 생체외에서 상기 질환의 진단에 사용된다.

전형적으로, 상기 조성물은 활성 성분으로서 본 발명의 화합물 1종 이상과 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제 1종 이상을 포함한다. 또한 상기 조성물은 동물 또는 인간에게 투여될 수 있는 방식으로 처리되거나 형태화된다. 본 발명에서, 담체 또는 부형제는 임의의 약학적 허용가능한 물질 또는 실질적인 약학적 활성이 없는 물질들의 혼합물이며, 이들은 비히클 또는 보조 물질로 사용하여 화합물을 안정하고 투여되기에 적합한 투약 형태로 제형화하는데 사용할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제의 예들은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 약전 전공의 연구서에서 확인할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 비경구 주입, 점적(instillation) 또는 관류흡입(irrigation), 바람직하기로는 정맥내 또는 동맥내와 같은 혈관내 주입, 또한 근육내, 피하, 병소내, 복강내, 지엽적(locoregional) 또는 그외 비경구 투여 경로를 통한 주입을 위해 제형화되고 가공된다. 다른 바람직한 실시예에 있어서, 상기 조성물은 중이와 같이 상부 기도의 손상된 점막에 직접적으로 투여된다. 이러한 투여 경로에 대한 기타 약물의 제형에 적용되는 동일한 원칙이, 상기 조성물을 제조하는 방법에 대해 당업자에게 제시될 것이다. 예를들면, 비경구 투약 형태의 조건은 멸균성이다. 다른 조건은 USP 24, 연구서 "General Requirements for Tests and Assays. 1. Injections", p. 1775-1777 에서와 같이 모든 전공 약전에 기재되어 있다. 비경구 제형의 안정성을 증가시키기 위하여, 투여되기 전에 재구성되어야 하는 건조 투약으로 제공되는 것이 필요할 수도 있다. 이러한 투약 형태의 예로는, 냉동 건조(freeze-dried) 또는 동결 건조(lyophilized) 제형이 있다. 적합하기로는, 본 발명의 조성물은 또한 점액용해성 용매를 포함할 수도 있다.

본 발명의 화합물은 비경구 조절 방출성 투약 형태로 투여하여, 빈번한 주입을 방지하고 치료 효능과 용이성을 개선시키는 것이 적합할 수 있다. 상기한 도포트(dopot) 제형을 제조하는 여러가지 방법이 알려져 있다. 서방형(Prolonged release)은 고체 임플란트, 나노입자, 나노캡슐, 미세입자, 미세캡슐, 유액, 현탁액, 오일성 용액, 리포좀 또는 유사 구조체에 의해 제공될 수 있다.

손상된 점막에 국소적으로 투여되는 조성물의 경우, 의약제의 효과를 증가시키기 위해 투여 부위에 국소 정체 시간을 연장시킬 수 있는 특성을 가진 제형을 제공하는 것이 유용할 것이다. 상기 목적을 이루기 위해, 점막점착성 부형제를 상기 제형내에 혼입시킬 수 있다. 이러한 기능성 부형제는 당업자에게 알려져 있으며, 부형제로는 폴리아크릴산 및 그것의 유도체, 폴리메타크릴산 및 그것의 유도체와 같은 폴리머, 하이드록시프로필 메틸셀룰로스를 포함한 셀룰로스 에테르, 카르복시메틸셀룰로스, 전분, 키토산 등을 포함한다. 적합하기로는 또는 대안적으로는, 본 발명의 조성물은 또한 점액용해성 용매를 또한 포함할 수 있다. 구체적으로, 점액용해성 용매를 사용하여, 본 발명의 펩티드성 화합물의 점막, 예컨대 호흡관으로의 투과성에 영향을 미칠 수 있다. 적합한 용매는 N-아세틸시스테인, S-카르복시메틸 시스테인, 브롬헥신(bromhexine), 암브록실(ambroxyl), DNAse, 에르도스테인(erdosteine), 식염수 및 네소스테인(nesosteine)과 같은 공지의 점액 조절성 약제 또는 점액 용해성 약제를 포함할 수 있다. 바람직하기로는, 브롬헥신을 사용하는 것이다.

포괄적인 정의에서 비경구 제형의 제조에 특히 유용한 추가적인 부형제는, 멸균수, 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 부탄디올, 지방 오일, 단쇄- 또는 중쇄 트리글리세라이드, 렉시틴, 폴리옥시에틸렌 카스토르 오일 유도체(polyoxyethylene castor oil derivatives)와 같은 용매, 공용매, 액체 또는 반고형 담체; 당, 특히 글루코스, 당 알콜, 특히 만니톨, 소듐 클로라이드, 소듐 카보네이트, 시트릭산, 아세테이트, 포스페이트, 포스포릭산, 하이드로클로릭산, 소듐 하이드록사이드 등과 같은 삼투압과 pH를 조절하기 위한 물질들; 아스코르빈산, 소듐 설파이트 또는 소듐 하이드로겐 설파이트, EDTA, 벤질 알콜등과 같은 안정화제, 항산화제 및 보존제; 알부민, 덱스트란 등과 같은 그외 부형제 및 동결건조 보조제가 있다.

이와 유사하게, 본 발명의 화합물은 경점막 투약 형태로 투여되는 것이 유익할 수도 있다. 투여 경로는 비침습성이며 환자 친화적이며; 동시에 특히 상기 화합물이 소화계의 유액내에서 불안정하거나 또는 매우 커서 장에서 효과적으로 흡수되지 않는다면 본 발명의 화합물의 생체 이용성은 경구 투여에 비해 일반적으로 향상된다. 경점막 투여는 예컨대 코를 통한, 구강을 통한, 설하의, 잇몸을 통한 또는 질을 통한 투약 형태가 가능하다. 이러한 투약 형태는 공지 기법에 의해 제조될 수 있다: 상기 투약 형태는 점비액 또는 스프레이, 삽입체, 필름, 패치, 젤, 연고 또는 정제로 제형화될 수 있다. 바람직하기로는, 경점막 투약 형태로 사용되는 부형제는, 또한 1종 이상의 점막 부착성을 제공하는 물질을 포함하여, 따라서 흡착 부위와 투약 제형의 접촉 시간을 염장시켜 그로 인해 흡수량을 잠재적으로 증가시킨다.

대안적으로, 상기 약학적 조성물은 경구 투여용으로 설계되어 가공될 수 있다. 적절한 경구 투약 형태로는 정제, 경질 캡슐, 연질 캡슐, 분말, 과립제, 경구 붕해성 투약 형태, 시럽, 점적제, 현탁제, 발포성 정제, 츄잉성 정제, 경구 필름, 동결건조된 투약 형태, 서방형 투약 형태, 조절 방출성 투약 형태를 포함한다. 바람직한 실시예에 있어서, 상기 경구 투약 형태는 위의 산성 및 단백질 분해 환경으로부터 상기 화합물을 보호하기 위해 장용성 코팅된 고형의 투약 형태이다.

또한 상기 조성물은 장 투여를 위해 제형화될 수 있다.

다른 실시예에서, 상기 화합물은 정량식 흡입제(metered dose inhaler), 분무기, 에어로졸 스프레이 또는 분말 흡입제를 이용하여 폐 경로로 투여된다. 적절한 제형은 공지 방법과 기법으로 제조될 수 있다. 경피, 직장 또는 안 투여 또한 일부 경우에서는 실시가능할 수 있다.

진보된 약물 전달 또는 표적 방법을 이용하여 본 발명의 화합물을 보다 더 효과적으로 전달하는 것이 이로울 수 있다. 예컨대, 경구 투여 경로를 선택하는 경우, 적합한 투약 형태는 임의의 물질이거나 또는 상기 화합물의 이용성을 증가시키는 물질들의 혼합물일 수 있는, 생체이용성 증강제를 포함할 수 있다. 이는 예컨대, 상기 화합물을 분해로부터 보호함으로써, 예컨대 효소 저해제 또는 항산화제에 의해 이룰 수 있다. 더 바람직하기로는 상기 증강제는 흡수막, 일반적으로는 점막의 투과성을 증가시킴으로써 상기 화합물의 생체 이용성을 증가시킨다. 투과 증강제는 다양한 기작을 통해 작용할 수 있다: 일부는 점막성 멤브레인의 유동성을 증가시키고, 다른 것은 점막성 세포 사이의 갭 정션(gap junction)을 열거나 확장시킨다. 그외는 점막성 세포 층을 덮고 있는 점액의 점성을 감소시킨다. 바람직한 생체이용성 증강제는, 콜린산 유도체, 인지질, 에탄올, 지방산, 올레인산, 지방산 유도체, EDTA, 카보머, 폴리카모필 및 키토산과 같은 양친성 물질이다.

하기 실시예들은 본 발명을 더 예시하기 위한 것일 뿐 첨부된 실시예로 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 화합물의 제조

다음 펩티드성 화합물들, 24개의 아미노산으로 이루어진 각각은 이하 P60, P60.4, P60.Ac, 및 P60.4Ac로 표시되며, 이들은 복합 펩티드 자동 합성기(SyroII, MultiSyntech, Witten, Germany)에서 고체상 기법으로 제조하였다. P60와 P60.4에는, Tentagel S AC (Rapp, Tubingen, Germany), 폴리에틸렌글리콜 및 폴리스티렌의 그래프트 폴리머를 수지로 사용하였다(0.2 meq 주입, 입자 크기 90 μm). P60. Ac와 P60.4Ac에서는, Tentagel S AM를 이용하였고, C-말단이 아미드화된 펩티드를 제조하였다. 반복적인 커플링(coupling)은, 반응 용기에 NMP 내의 적합한 Fmoc 아미 노산 0.60 M 용액을 6 당량(주입 수지를 기본으로)으로, NMP 내의 0.67 M PyBOP를 6 당량으로 그리고 NMP 2/1(v/v)내의 NMM을 12 당량으로 첨가함으로써 수행하였다. 분지 보호기는 다음과 같다: D, E, S, T는 tBu; K는 Boc; N, Q는 Trt 및 R은 Pmc. Fmoc-탈보호는 각 반응 용기에 피페리딘/NMP 1/4 (v/v)을 3회 첨가함으로써 수행하였다. 커플링 및 탈보호 시간은 각각 45분 및 3분 3회이다. 커플링 및 Fmoc-탈보호 반응 후 세척은 NMP로 6회 실시하였다. P60.Ac 및 P60.4Ac의 경우, 펩티드가 수지에 결합된 상태에서 아세트산을 이용하여 N-말단 아세틸화를 수행하였다. 합성 후 펩티딜 수지를 NMP, 디클로로메탄, 디클로로메탄/에테르 1/1(v/v) 및 에테르로 각각 세척하고 공기중에 건조하였다. 펩티딜 수지를 절단하고, 분지는 2.5시간동안 TFA/물 95/5(v/v)에서 탈보호하고(펩티드 10 μmol당 1.5 ㎖), 상기 수지는 여과하여 제거하고 펩티드는 에테르/펜탄 1/1 (v/v)를 이용하여 TFFA 용액으로부터 침전시켰다(펩티드 10 μmol 당 10 ㎖). 용액은 1시간동안 -20 ℃에서 차갑게 하였고, 침전된 펩티드는 원심분리(-20 ℃, 2,500g, 10분)로 분리하였다. 펠렛을 분쇄하여 10 ㎖의 에테르/펜탄 1/1(v/v)로 혼합하고 상기 동일한 공정으로 분리한 다음, 펩티드는 1시간동안 실온에서 공기중에 건조하였다. 펩티드는 물 2 ㎖ 또는 10 v%의 아세트산 2 ㎖에 용해하고, 상기 용액은 약 5분간 액체 질소에서 동결한 다음 원심분리하면서 동결건조하였다(1,300 rpm, 8-16시간). 펩티드 분석은 RP-HPLC와 Maldi-Tof 질량 분석기로 실시하였다.

상기 화합물들의 아미노산 서열은 다음과 같다:

P60 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

P60.Ac* IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE

P60.4 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

P60.4Ac* IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR

*상기 첨자 Ac는 N-말단이 아세틸화되고 C-말단이 아미드화된 펩티드를 의미한다.

실시예 2: 독소 중화

실시예 1에 따라 제조한 화합물들의, 박테리아성 독소 LPS를 중화시키는 능력을 LAL(limulus amoebocyte lysate) 분석과 전 혈액(WB) 분석으로 테스트하였다. 또한 LTA 중화는 전 혈액 분석으로 측정하였다. 펩티드 LL-37를 양성 대조군으로 사용하였다. 50% LPS가 중화되는(50% 저해) 펩티드의 농도를 펩티드 활성 크기로 사용하였다. 이러한 농도 값은 표 1과 같다. 각 분석에서 상기 화합물들간의 차이는 통계학적으로 유의성이 없었다. 즉, 본 발명의 테스트 화합물들은 천연 미생물항생 펩티드 LL-37와 유사하게 거의 동일한 수준의 항-독소 활성을 나타내었다.

펩티드	50%-LTA 저해 (ug/㎖), n=3	50%-LPS 저해(ug/㎖)
		LAL분석	WB 분석	평균
LL-37	1.6 ± 0.5	1.3 ± 0.2 (n=5)	1.2 ± 0.2(n=3)	1.3 ± 0.2(n=8)
P60	2.1 ± 0.7	1.5 ± 0.5 (n=5)	1.4 ± 0.1(n=4)	1.5 ± 0.3(n=9)
P60.4	2.0 ± 1.3	1.7 ± 0.6 (n=5)	2.1 ± 0.6(n=2)	1.8 ± 0.6(n=7)
P60.Ac	2.1 ± 0.1	1.8 ± 0.8 (n=5)	2.4 ± 0.5(n=2)	2.0 ± 0.8(n=7)

표 1: LL-37, P60, P60.4 및 P60.Ac에 대한 50%-LTA 저해치 (+ SD) ug/㎖, 50%-LPS 저해치(+ SD) ug/㎖. LTA-저해는 전 혈액(WB) 분석에서 테스트하였다. LPS-저해는 LAL-분석과 전 혈액 분석으로 테스트하였다. 상기 합성 펩티드는 LTA 중화를 유발하였으며 이는 LL-37과 유의할만한 차이가 없었다. 합성 펩티드에 의해 유도된 LPS 중화 역시 LL-37과 유의할만한 차이가 없었다. n= 실험 수.

실시예 3: 화합물에 의한 면역세포 활성화

실시예 1에 따라 제조한 화합물들을 Elispot, T-세포 증식, ERK-활성화 및 호중구 주화성 분석(neutrophil chemotaxis assay)을 이용하여 원치않는 면역 활성에 대해 검사하였다. Elispot 분석은 약물, 화합물 또는 기타 화합물의 생체외 사이토카인 분비에 대한 효과를 결정하는데 적용가능하며, 따라서, 생체내 면역 기능에 대한 매개 효과에 대한 추정의 결과를 제공한다. 상기 분석의 결과는, IFN-감마에 대한 양성 반응의 비율로 제공된다. ERK(extracellular signal-related kinases)-1/2는 MAP 키나제 시그널링 경로의 일부이며, 증식, 분화 및 사이토카인과 유사한 전염증성 매개체를 코딩하는 유전자의 발현을 포함한 다양한 세포 기작에 관여하는 것으로 알려져 있다. 사이토카인은 염증의 직접적인 매개체이고, 다수의 면역 반응의 진행 및 방향에 영향을 미친다. 사이토카인 생산의 균형성 교란은 여러가지 질환 상태들의 주된 요인인 것으로 널리 인식되어져 있다. 이러한 균형은 이미 삼출성 이염 또는 부비강염과 같은 질환들에서 깨져 있다. 또한 T 세포 증식 역시 이미 통제를 벗어난 면역 반응을 자극할 것이므로 상기 상황에서는 우호적이지 않다. 따라서, 본 발명의 화합물들은 사이토카인 생산, T-세포 증식, ERK-활성화 및 호중구의 주화성을 자극하지 않는 것이 바람직하다.

T 세포 증식으로, 150,000 말초혈액의 단구세포(PBMC)를 96웰 둥근 바닥 플레이트(Costar Inc. Cambridge, MA)내에서 5일간 상기 화합물 10 ug/㎖이 있거나 없는 조건하에서, 최종 부피 150 ㎕ IMDM 컴플리트(complete)에서 배양하였다. 양성 대조군으로서, PBMC를 재조합 IL-2가 25 U/㎖으로 존재하는 조건에서 배양하였다. 최종 20시간 배양하는 동안, PBMC에 [³H]티미딘(0.5 μCi/웰)을 처리하였고, 이후 ³H 통합(incorporation)을 액상 신틸레이션 카운트로 계수하였다. Elispot 분석에 의해 T 세포 사이토카인 IFN와 IL-10를 검출하기 위해, 1.5 x 10⁶ PBMC를 합성 펩티드가 존재하지 않거나 또는 다양한 농도로 존재하는 조건하에서 0.5 ㎖ IMDM 컴플리트에서 배양하였다. 양성 대조군으로서, PBMC는 10 ㎍/㎖ PWM(poke weed mitogen)으로 자극하였다. 배양 48시간 후, PBMC는 따뜻한 IMDM으로 상기 웰을 부드럽게 헹구어 부착되지 않은 세포를 수집함으로써 수거하였고, 이들은 다량의 IMDM으로 세척하였다. 이후 PBMC는 항체가 미리 코딩된 ELISA 플레이트 상에 두고 인간에서 수득한 2% AM 혈청(pooled human AB serum)이 첨가된 IMDM 에서 5시간동안 37 ℃에서 5% CO₂로 배양하였고, 이후 상기 플레이트를 제조사의 프로토콜(U-CyTech, Utrecht, The Netherlands)에 따라 검출하였다. 스팟은 올림푸스 현미경상에서 계수하였고 올림푸스 마이크로 이미지 4.0 소프트웨어(Paes Nederland, Zoeterwoude, The Netherlands)로 분석하였다. 최종 결과는 양성 자극 지수에 대한 비율로 나타내었다(양성: > 2).

ERK-1/2 활성화는 점액표피양 폐 종양 세포주(mucoepidermoid lung tumor cell line) NCI-H292(ATCC, Rockville, MD)로부터 유래된 세포로 테스트하였고, 이 들은 24웰 또는 6웰의 조직 배양 플레이트에서 2 mM L-글루타민(Bio Wittaker, Walkersville, MD), 200 U/㎖ 페니실린(Bio Wittaker), 200 ug/㎖ 스트렙토마이신(Bio Wittaker)과 10% (v/v) 열에 의해 불활성화된 우태아 혈청(Gibco)이 보충된 RPMI1640 배지(Gibco, Grand Island, NY)상에서 배양하였다. 거의 컨플루언스에 도달하면, 세포를 혈청 무첨가 배지에서 배양하였다. 세포를 이후 지시된 자극으로 15분간 자극하였다. 세포 용해물(lysate)는 라이시스 완충액(0.5% [v/v] Triton X-100,0. 1M Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM Na₃V0₄, mini complete protease inhibitor cocktail [Boeringer Mannheim, Roche, Basel, Switzerland])으로 제조하였다. 샘플은 10% 글리신을 주 성분으로한 젤상에서 SDS-PAGE를 수행하고, 전개된 단백질들은 폴리비닐리딘 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 이동시켰다. 비특이적 결합 부위는 PBS/0.05% 트윈-20/ 1% 카세인으로 봉쇄하였다. 블롯은 인산화 ERK-1/2 (New England Biolabs, Beverly, MA)에 대한 토끼 다클론 항체와 함께 반응시켰고, 항-토끼 IgG 항체가 접합된 호르세라디쉬 페록시데이즈를 이차로 반응시켰다. 증강된 화학발광(ECL) 웰스턴 블롯팅 검출 시스템(Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Sweden)을 사용하여 면역반응성을 확인하였다.

호중구 주화성은 말초 혈액으로부터 Percoll 밀도 원심분기(밀도: 1.082 g/㎖)을 이용하여 분리된 호중구로 측정하였다. 상기 세포는 무혈청 RPMI와 1:1로 희석한 주화성 배지(20 mM N-2-하이드록시에틸피페라진-N'-2-에탄설폰산(HEPES 완 충액) HEPES, 132 mM NaCl, 6 mM KCl, 1.2 mM KH₂PO₄, 1 mM MgS0₄, 5.5 mM 글루코스, 0.1 mM CaCl₂ 및 0.5% (wt/vol) 인간 혈청 알부민[Central Laboratory of the Netherlands Red Cross Blood Transfusion Service (CLB), Amsterdam, The Netherlands])에 2.5 x 10⁶ cells/㎖의 농도로 재현탁하였다. 상기 화합물의 주화 활성은 수정된 Boyden Camber 기법을 이용하여 평가하였다. 간략하게 설명하면, HEPES 완충액에 희석한 26 ㎕의 자극원을 하위 구획의 웰에 넣고, 호중구 현탁액(2.5 x 10⁶ cells/㎖) 50 ㎕을 상위 구획에 첨가하였다. 상기 구획들은 두개의 필터에 의해 분리되어 있다: 하위 필터(Millipore Products, Bedford, MA)의 포어 크기는 0.45 ㎛이고, 상위 필터(Sartorius Filter, San Francisco, CA)의 포어 크기는 8 ㎛이다. 37 ℃에서 90분간 둔 후 상층 필터를 제거하고 에탄올-부탄올(80:20, vol/vol)에서 고정한 다음 Weigert 용액으로 염색하였다. 오중구 주화 활성을 결정하기 위해, 호중구는 6차 임의 고배율 필드(x400)에서 계수하였고 양성 대조군(10-8 M N-포르밀메티오닐-루실-페닐알라닌(F㎖P, Sigma))과 비교한 멤브레인상의 호중구 퍼센트를 계산하였다.

그 결과는 표 2이 기재되어 있다. 즉, 본 발명의 테스트 화합물 특히 P60.4는 천연 펩티드 LL-37에 비해 더 낮은 매우 낮은 면역 반응을 유발하였다. 이는 낮은 ERK-활성화를 보였으며 실제 호중구 주화성을 나타내지 않았다.

표 2: 화합물의 면역원성

화합물 γ-IFN Elispot T 세포 증식 ERK 활성화 주화성(%)

P 60 1/8 0/8 - 76 + 39 P 60.Ac 3/8 0/8 + 61 + 36 P 60.4 3/8 0/8 + 0 + 0 P 60.4Ac nd 0/8 + 24* LL-37 4/8 4/8 + 84 + 17

* 1회 측정

실시예 4: 생체 내성(tolerability)

화합물 P60.4Ac를 실시예 1에 따라 제조하였고, 생체내 내성에 대해 검사하였다. 보다 구체적으로는, 잠재적인 피부 자극성 및 눈 자극성을 토끼에서 실험하였고, 내이신경독성은 기니 피그 모델에서 실험하였다. 또한 이의 전신성 독성은 정맥내 투여를 통해 평가하였다.

피부 및 눈 자극 테스트로, 3마리의 토끼를 0.5 ㎖의 포스페이트 완충화된 펩티드 용액(2 ㎎/㎖)에 노출시키고, 이발한 피부에 반 폐쇄 드레싱을 이용하여 4 시간동안 도포하였다. 노출 후 1, 24, 48 및 72 시간후에 관찰하였다. 0.1 ㎖의 포스페이트 완충화된(pH7.5) 펩티드 용액(2 ㎎/㎖) 샘플 하나를 3마리 토끼 각각의 한쪽 눈에 주입하여 급성 눈 자극/ 손상 실험을 수행하였다. 주입 후 1, 24, 48 및 72 시간후에 관찰하였다.

그 결과, 어떠한 피부 자극도 검출되지 않았다. 상기 펩티드 용액의 눈 주입은 주입 후 24시간 이내에 완전히 용해되어 결막이 충혈되었다.

P60.4Ac의 전신성 독성은 단회 및 반복 투약 독성 연구로 랫에서 평가하였다. 상기 펩티드는 투여량을 증가시키면서 매일 정맥 주사로 투여하였다. 상기 단계에서, 최대 내성 투여량(MTD)를 확립하였다. 반복 투여 독성은 또한 MTD 단계 에서 실험하였다. 투여량 증가 단계에서, 9마리의 랫을 9 그룹으로 나누고, 2일간 0.4, 2 또는 8 ㎎/kg/day을 제공하였다. 임상 증상은 투약한 날과 그 이후에 매일 2회 기록하였고, 첫 투약 이전과 투약 후 체중을 기록하였다. MTD 단계에서, 5마리의 암컷과 5마리의 수컷 랫에 이후 5일간 8 ㎎/kg/day을 제공하였다. 임상 증상은 투여시 매일 2회 기록하였고 체중은 1일 및 6일째에 기록하였다. 임상 실험 연구를 검시 전에 수행하였다. MTD 단계가 종결되는 시점에 육안 검사(Macroscopy)를 수행하였다.

그 결과 투여량 증가 전신성 실험에서 사망 동물이 나타나지 않았다. 또한 임상 증상과 체중에서 뚜렷한 편차도 나타나지 않았다. MTD 단계동안, 사망이 없었으며, 펩티드와 관련된 결과가 임상 증상, 체중, 혈액학적 파라미터, 임상 생화학적 파라미터 및 육안 검사에서 나타나지 않았다.

내이신경독성에 대한 평가로, 9마리의 외이 병변이 없는 건강한 수컷 알비노 기니 피그(500-1200 g)를 사용하였다. 동물에 케타민 40 ㎎/kg과 롬푼 10 ㎎/kg을 복막 주사하여 마취시켰다. 대조군 청각 실험을 실시한 후, 귀의 수포(auditory bullae)를 외과적으로 개봉하고 달팽이창(round window membrane)에 작은 스폰고스탄(spongostan) 조각을 넣고, 여러가지 용액(약 10 ㎕)을 스폰고스탄에 가하였다. 피부는 봉합하고 청력 실험을 실시하였다.

기니 피그는 처리되어지는 2마리로 이루어진 각 그룹과 대조군 1마리로, 즉 3 그룹으로 나누었다. 테스트 제형과 대조군 제형을 우측 귀의 RWM에 투여하고, 좌측 귀는 처리하지 않았다. 그룹 1에서, 2마리의 기니 피그에 시스플라틴(0.66 ㎎/㎖ in PBS)을 공급하였고, 나머지 동물에는 대조군으로서 PBS를 공급하였다. 내이신경독성이 알려진 시스플라틴은 테스트에 대한 양성 대조군으로서 제공된다. 그룹 2에는 포스페이트 완충액(pH7.5)내의 펩티드(2 ㎎/㎖)를 제공하였고, 그룹 3에는 소듐 클로라이드 등장액내의 7% 마크로골 10,000을 포함하며 0.02% 벤즈알코니움 클로라이드 및 0.1 % Na₂EDTA로 보존되고 포스페이트로 pH 5.5로 완충화된 제형액내의 펩타이드(2 ㎎/㎖)를 공급하였다.

뇌간유발반응(Auditory brainstem response)은 약물 투여 전에 실시하였고, 수술후, 그리고 3, 7, 14 및 22일 후에 컴퓨터를 토대로한 신호 평균화 시스템(Tucker-Davis Technology, Alucha, FL, USA)을 이용하여 직접 실시하였다. 기니 피그를 마취한 다음 삽입 이어폰을 외이관(external ear canal)에 장착하였다. 피하 전극을 정점(활성) 및 동측성 수포(참고) 상에 위치시켰다. 접지 전극은 목 근육 상에 위치시켰다. 전기적으로 보호되고(electrically shielded), 격벽으로 되어 있는(double-walled) 방사-진동-보호된(radio-frequency-shielded) 소음 챔버에서, 1 kHz에서 10 ms 톤의 파열에 대한 반응을 ABR에 기록하였다. 자극 강도를 측정하였고 dB로 나타내었다. ABR 역치는 복제가능하며 가시적으로 검출가능한 반응을 도출하는 가장 낮은 강도로서 정의된다. 후 처리 ABR 역치는 전 처리 ABR 역치와 비교하였다.

그 결과, 그룹 1에서 PBS를 달팽이창에 도포하면 수술 후 22일째에 역치의 -9 dB 변화가 발생되었으나, 시스플라틴은 각각 -49 dB 및 -64 dB의 역치 변화를 유발하였다(표 3). 제 2 그룹에서는, 포스페이트 완충액 적용으로 인한 역치 변화는 발생되지 않았다(표 4). 2 ㎎/㎖의 펩티드가 함유된 포스페이트 완충액은 수술 후 22 일째에 -7 dB의 역치 변화를 유발하였다. 동물 한 마리에서는, 수포가 개방되지 않아, 이 동물은 실험에서 제외하였다. 마지막 그룹에서는, 제형액으로 제형화한 펩티드의 투여시 2 및 1 dB의 매우 낮은 역치 변화가 있었다(표 5).

표 3: 시스플라킨의 내이신경독성(양성 대조군)

그룹 1	PBS 단독		PBS내 시스플라틴		PBS내 시스플라틴
	역치(dB)	Δ 수술전	역치(dB)	Δ 수술전	역치(dB)	Δ 수술전
수술전	86		58		82
수술후	72	-14	56	-2	81	-1
3일	67	-19	26	-32	44	-38
7일	76	-10	26	32	37	-45
14일	78	-8	28	-30	23	-59
22일	77	-9	9	-49	18	-64

표 4: 포스페이트 완충액에서의 P60.4Ac의 내이신경독성 결핍

그룹 2	PBS 단독		PBS내 P60.4Ac
	역치(dB)	Δ 수술전	역치(dB)	Δ 수술전
수술전	77		72
수술후	78	1	70	-2
3일	74	-3	70	-2
7일	74	-3	72	0
14일	77	0	60	-12
22일	77	0	65	-7

Claims (18)

1. 24개의 아미노산 또는 그것의 유도체로 이루어진 서열로 구성되며, 상기 서열은 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 및 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 박테리아성 및 곰팡이성 독소에 친화성을 갖는 펩티드성 화합물로서, 상기 서열의 N-말단 부분은 아세틸화된 것이고/것이거나, 상기 C-말단 부분은 아미드화된 것을 특징으로 하는 펩티드성 화합물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 제 1항에 있어서, 상기 N-말단 부분은 아세틸화된 것이며, C-말단 부분은 아미드화된 것을 특징으로 하는, 펩티드성 화합물
7. 제 1항 또는 제 6항에 따른 펩티드성 화합물의 시험관내 제조 방법으로서,

   (a) 상기 화합물 또는 상기 화합물과 유사한 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 바이러스 벡터, 지질 벡터 및 폴리머 벡터로부터 선택되는 형질전환 가능한 벡터와 조합하는 단계;

   (b) 상기 벡터와 그것에 조합된 상기 핵산 서열을 숙주에 형질감염시키는 단계;

   (c) 상기 숙주 세포를 상기 화합물 또는 상기 화합물과 유사한 펩티드의 발현이 허용되는 조건 하에서 배양하는 단계;

   (d) 상기 화합물 또는 상기 화합물과 유사한 펩티드를 분리하는 단계; 및

   (e) 선택적으로 상기 화합물과 유사한 펩티드를 변형하여 상기 화합물을 수득하는 단계

   를 포함하는, 제 1항 또는 제 6항에 따른 화합물의 시험관내 제조 방법.
8. 삭제
9. 제 1항 또는 제 6항에 따른 펩티드성 화합물 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 곰팡이 또는 박테리아 감염, 또는 곰팡이성 또는 박테리아성 독소 노출이 관여되거나 또는 이로부터 발생되는 질환 또는 증상을 치료하기 위한 약학적 조성물.
10. 제 9항에 있어서, 곰팡이 또는 박테리아 감염, 또는 곰팡이성 또는 박테리아성 독소 노출이 관여되거나 또는 이로부터 발생되는 질환 또는 증상은 상부기도 또는 호흡계에 곰팡이 또는 박테리아 감염 또는 이로부터 발생되는 증상으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
11. 제 9항에 있어서, 곰팡이 또는 박테리아 감염, 또는 곰팡이성 또는 박테리아성 독소 노출이 관여되거나 또는 이로부터 발생되는 질환 또는 증상은 급성 또는 만성 부비강염(sinusitis), 급성 또는 만성 이염 및 삼출성 중이염(otitis media with effusion)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
12. 삭제
13. 제 9항에 있어서, 비경구 투여를 위해, 제형화하거나, 가공하거나 또는 순응시킨 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물,
14. 제 9항에 있어서, 관류액(irrigation liquid), 점이제(ear drop), 점비제(nose drop), 에어로졸, 분말형 에어로졸, 분무액, 젤, 현탁액, 또는 점액점착성 투약형(mucoadhesive dosage form)의 형태로, 환부 또는 조직의 점막에 국소 투여하기 위해, 제형화하거나, 가공하거나 또는 순응시킨 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물,
15. 제 9항에 있어서, 약물 표적제, 생체이용성 증강제 및 조절성 전달제 중 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
16. 제 1항에 기재된 아미노산 서열 IGKEFKRIVQRIKDFLRNLVPRTE 또는 IGKEFKRIVERIKRFLRELVRPLR 로부터 선택되는 서열로 구성된 펩티드성 화합물을 코딩하는 핵산 서열.
17. 삭제
18. 제 16항의 핵산 서열을 포함하는, 곰팡이 또는 박테리아 감염, 또는 곰팡이성 또는 박테리아성 독소 노출이 관여되거나 또는 이로부터 발생되는 질환 또는 증상을 치료하기 위한 유전자 전달용 조성물.