KR100852771B1 - 고추 재배용 내생공생균 - Google Patents

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조남석
김동훈
엄안흠
최태호
이태근
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 고추(Capsicum annuum)의 뿌리로부터 분리한 내생공생균 (arbuscular mycorrhizal fungi, AMF), 보다 상세하게는 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantean KCTC 11073BP) 또는 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices KCTC 11074BP)에 관한 것으로, 상기 균주는 고추와 공생관계를 가지며 고추의 생장을 촉진시켜 고추의 재배에 유용하게 사용될 수 있다.
고추, 내생공생균(arbuscular mycorrhizal fungi)

Description

고추 재배용 내생공생균{ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI FOR CAPSICUM ANNUUM}
본 발명은 고추(Capsicum annuum)의 뿌리로부터 분리한 내생공생균 (arbuscular mycorrhizal fungi, AMF), 보다 상세하게는 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantean KCTC 11073BP) 또는 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices KCTC 11074BP)에 관한 것이다.
최근, 농업과 환경 분야에서는 균근균의 특성을 활용한 유기농법 또는 환경친화농법에 대한 관심이 상당히 증가되고 있다.
상기 균근균 (Arbuscular mycorrhizae)은 다양한 종류의 식물뿌리에 서식하며 인산, 동, 아연 등의 무기양분과 미량성분 등을 숙주식물에 공급하고 숙주식물로부터 생활장소와 대사에 필요한 에너지를 공급받는 균근균-숙주식물간의 특이적인 공생관계를 유지하며 자연계의 물질순환에 크게 기여하고 있다(J.H. Harley and S.E. Smith, Mycorrhizal Symbiosis, Academic Press, 1983). 또한, 균근균은 공생식물체에 척박한 토양환경에 대한 적응력과 식물 병원균에 대한 저항력을 부여해 줌으로써, 식물체의 외부환경에 대한 저항력을 증진시켜 주는 것으로 알려져 있 다(Conway, L.P. and Bagyaraj, D.J., VAMycorrhizal, CRC Press, 1984).
상기 균근균은 크게 내생균근균(endomycorrhizae)과 외생균근균(ectomycorrhizae)으로 분리되고, 이 중 토양에 널리 분포하며 광범위한 숙주 친화성을 갖는 내생균근균이 주요 연구대상이 되어 왔다.
특히, 상기 내생균근균은 무기양분과 미량성분 등을 숙주식물에 공급할 뿐만 아니라, 상기 내생균근균의 균사는 뿌리가 뻗을 수 없는 작은 토양공극의 틈까지 균사를 뻗어 식물의 뿌리털보다 양분흡수 면적을 넓혀줌으로써 효율적인 흡수조직으로 작용할 수 있어, 식물 생장과 관련하여 다양한 연구의 연구대상으로 연구되고 있다.
예를 들면, 고추의 생육효율을 증가시키기 위하여 인산 사용량에 따른 균근균의 접종효과 및 접종방법에 관한 연구가 보고되었고(이상선 등, 1999), 제주도 화산회 토양에 균근균을 활용하여 탱자(Poncitrus trifoliata) 유묘의 생육증진 효과와 관행적으로 이루어지는 인산 과다 시비에 따른 토양환경의 악화를 개선하고자 하는 연구가 수행되었다(한해룡 등, 2000). 이외에 딸기 (Fragaria grandiflora), 옥수수 (Zea mays), 오이 (Cucumis sativus), 또는 토마토 (Lycopersicon esculentum)와 같은 재배작물의 증식에 있어서 균근균의 접종효과가 연구되었다. 이러한 연구 결과들은 토양에 감염된 균근균의 감염 정도가 식물생장에 긍정적인 효과를 나타내고 있음을 의미하는 것이다. 이처럼, 식물의 생장에 중요한 역할을 하는 균근균은 화학비료의 사용을 줄임과 동시에 생물농약으로 이용할 수 있기 때문에 환경친화적 농업으로의 이용가능성이 증가되고 있다.
그러나, 균근균은 상기와 같은 많은 장점을 갖고 있음에도 불구하고, 균의 분리 및 동정이 어려워, 실제로 실용화되지 못하고 있는 실정이다.
즉, 균근균은 그 분자생물학적인 분석에 어려움이 있어, 균근균의 포자를 채취하여 현미경적 관찰을 통하여 동정을 하고 있으나, 균근균의 포자의 형태는 변이가 많지 않으며, 변이가 있다 하더라도 생육환경에 따라 형태의 변화가 일어날 수 있어서 작물의 포자의 형태로부터 종을 동정하기가 매우 어렵다는 문제점이 있다(Merryweather, et al., 1998). 구체적으로, 기존의 균근균(Mycorrhizae)을 이용한 미생물 비료는 주로 현미경상에서 관찰된 형태적 특징을 이용하여, 홀과 아보트 등이 정리한 균근균의 분류 목록집(Hall. I.R. and Abbott. L.K., 1981); 센크 등이 정리한 내생균근 목록집 (Schenck, N.C. and Perez, Y. 1987); 및 버치 등이 정리한 내생균근 목록집(Berch, S.M. 1988)에 기재된 균근균과 비교하여 균근균을 선별한 후, 선별된 균근균을 숙주식물을 고려하지 않고 무작위적으로 혼합하여 제조한 것에 관한 것이다．
그러나, 상기 균근균들 중에서, 실제 작물의 세포내에 침입하여 공생관계를 형성하는 균은 극히 일부에 불과하며, 상기와 같은 현미경적 관찰만을 통해서는 균근균의 정확한 동정 및 숙주식물에 특이적인 균근균을 선발하는 것이 불가능하다는 문제점이 있다.
즉, 여러 균근균의 집합체를 이용하는 경우, 상기와 같은 미생물 비료는 여러 균근균의 집합체를 숙주식물에 특이적인 균근균을 분류한 것이 아니므로 생장촉진 효과 등에 문제점이 있다.
또한, 상기 연구들은 특정 종의 균근균을 분리 동정하여 이용하는 것이 아니라, 여러 균근균의 집합체를 이용하는 것이므로, 특정 식물체의 배양에 특이적인 비료를 개발할 수 없다는 문제점이 있다.
따라서, 실제로 재배 대상인 작물 즉, 특정 식물체에 미생물 비료제제의 제조를 위한 내생공생균을 분리 및 동정에 관한 연구의 필요성이 증가되고 있다.
본 발명의 목적은 고추 뿌리로부터 분리되고, 고추(Capsicum annuum)와 공생관계를 가지며, 고추의 성장을 촉진시키고, 식물 병원균과는 다른 특징을 가진 내생공생균을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 극복하기 위하여 지속적으로 연구한 결과 고추 뿌리로부터 분자생물학적 방법을 이용하여 고추묘 또는 고추작물 증식에 유용한 내생공생균을 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 뿌리로부터 분리한 내생공생균(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)을 제공한다.
상기 내생공생균은 바람직하게는 고추(Capsicum annuum)와 공생관계를 가지는 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP) 또는 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP)일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 고추 뿌리로부터 분리한 내생공생균에 관한 것이다.
본 발명의 내생공생균은 기존의 식물 병원균과는 다르고, 고추식물과 공생관계를 가지며, 숙주식물 즉, 고추를 증식시킬 수 있는 고추 공생균으로, 고추 뿌리로부터 분리하여, 분자생물학적인 방법을 이용하여 동정하였다.
통상적으로 균근균(Arbuscular mycorrhizae)은 인산, 동, 아연 등의 다양한 무기양분과 미량성분 등을 숙주식물에 공급할 수 있고, 공생식물체에 척박한 토양환경에 대한 적응력을 부여해줄 있으며, 식물 병원균에 대한 저항력을 부여해 줌으로써, 식물체의 외부환경에 대한 저항력을 증진시키는 장점이 있다.
특히, 상기 균근균 중 내생균근균의 경우에는 상기 내생균근균의 균사가 숙주 식물의 뿌리가 뻗을 수 없는 작은 토양공극의 틈까지 균사를 신속히 뻗을 수 있으므로, 식물의 뿌리털보다 양분흡수 면적을 넓혀줌으로써 효율적인 흡수조직으로 작용할 수 있다는 장점이 있다. 상기와 같이 식물 생장에 도움을 줄 수 있는 상기 균근균은 화학비료의 사용을 줄임과 동시에 생물농약으로 이용할 수 있으므로, 환경친화적 농재료로 그 산업적 이용에 대한 요구가 증가되고 있다.
그러나, 균근균은 상기와 같은 많은 장점에도 불구하고, 균근균들 중에서, 실제 작물의 세포내에 침입하여 공생관계를 형성하는 균은 극히 일부에 불과하고, 포자에 대한 기존의 현미경적 관찰만을 통해서는 균근균의 분리 및 정확한 동정과 특정 숙주식물에 특이적인 균근균의 선발이 사실상 불가능하여 특정 숙주식물에 특이적인 균주만을 사용할 수 없으므로, 실제로 실용화되지 못하고 있는 실정이다.
본 발명은 균근균의 포자에 대한 현미경적 관찰만이 아니라, 고추 뿌리로부터 고추와 공생관계를 가지며 고추의 생장을 촉진시킬 수 있는 내생공생균을 분리하고, 특정 프라이머를 이용하여 분자생물학적인 방법으로 동정하여 완성하였다.
본 발명의 균주는 기가스포라 기간티아 ｃｂｕｓｆｒ－００１ 또는 글로무스 인트라라디세스 ｃｂｕｓｆｒ－００２로 명명하였다.
본 발명의 균주 기가스포라 기간티아 ｃｂｕｓｆｒ－００１을　２００７년 ２월 ２６일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11073BP를 부여받았다.
또한, 본 발명의 또 다른 균주 글로무스 인트라라디세스 ｃｂｕｓｆｒ－００２를 ２００７년 ２월 ２６일 대한민국 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원에 기탁하였으며, 기탁번호 KCTC 11074BP를 부여받았다.
본 발명의 일 예에서, 고추재배에 유용한 내생공생균의 동정은 포자의 현미경적 관찰 및 분자생물학적 방법을 이용하여 수행하였고, 상기 분자생물학적 방법은 18S rDNA 서열분석 및 TreeView 1.6.6 프로그램을 이용한 Neighbor-Joining method로 수행하였다.
상기 분자생물학적 방법은 i) 고추 뿌리로부터 추출한 게놈 DNA를 특정 프라이머를 이용하여 nested PCR을 수행하여 내생공생균의 18S rDNA를 증폭하는 단계; ii) 상기 증폭된 18S rDNA을 정제하고 시퀀싱(sequencing)하는 단계; 및 iii) 상기 시퀀싱을 수행하여 서열이 결정된 18S rDNA 염기서열을 기초로 다른 세균과의 계통발생학적 관계를 분석하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
본 발명의 일 예에서, 고추 뿌리로부터 추출한 게놈 DNA를 상기 분자생물학적 방법을 이용하여 동정을 수행한 결과, 내생공생균 중, 글로무스 모시애(Glomus mosseae), 글로무스 인트라라디세스(Glomus intraradices), 글로무스 라멜로숨(Glomus lamellosum), 글로무스 시누오숨(Glomus sinuosum), 글로무스 파시큘래튬(Glomus fasciculatum), 기가스포라 기간티아(Gigaspora gigantea), 또는 스큐텔 로스포라 세라덴시스(Scutellospora cerradensis) 등이 확인되어 상기 분자생물학적 방법의 유효성을 확인할 수 있었다.
상기 분자생물학적 방법을 통하여 동정하고, 기탁하였으며, 고추 뿌리에서 동정된 다른 균근균에 비하여 고추 생장에 우수한 효과가 있는 것으로 확인된 본 발명의 균주인 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantean KCTC 11073BP)는　그　포자의　모양이　구형　또는　타원형이고，　크기가　２００㎛　내지 ３５０㎛이고，　포자의　색은　엷은　황색이며，약　１０㎛의　얇은　포자벽을　가지고， Ｍｅｌｚｅｒ용액과　반응하여　엷은　황색을　나타내는　것으로　확인되었으며， 고추묘에 접종하여 확인한 결과, 고추 뿌리에 감염될 수 있고, 고추의 생장을 촉진시키는 것으로 확인되었다．
한편，　본　발명의　또　다른　균주인　글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices KCTC 11074BP)는 그　포자의　모양이　구형　또는　타원형이고，　경우에　따라서는　불규칙한　모양으로　관찰되었고， 크기는　４０㎛　내지　１２０㎛이며，　포자의　색은　엷은　황색이고，약　１０㎛의 얇은　포자벽을　가지며，　Ｍｅｌｚｅｒ용액과　반응하여　엷은　자주색을　나타내고 토양　또는　감염된　뿌리내에서　관찰되며，고추묘에 접종하여 확인한 결과, 고추 뿌리에 감염될 수 있고, 고추의 생장을 촉진시키는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명은 고추뿌리로부터 분리한 내생공생균을 유효성분으로 함유하는 고추재배용 미생물 제제에 관한 것이다.
상기 내생공생균은 바람직하게는 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균 주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP), 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP) 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 내생공생균은 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP), 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP) 또는 이들의 혼합물을 뿌리의 발달이 양호한 숙주식물에 접종시킨 후 1개월 내지 12개월, 바람직하게는 3개월 내지 9개월 생육시킨 후, 지상부의 식물체를 제거하고 지하부에 있는 상기 숙주식물의 뿌리, 토양, 근균근 또는 근균근의 포자를 수득한 것일 수 있다. 상기 숙주식물은 바람직하게는 수수, 보리, 수단그라스, 옥수수 또는 크로바일 수 있다.
상기 내생공생균의 함량은 미생물 제제의 0.1중량% 내지 99.9중량%, 바람직하게는 0.5중량% 내지 90중량%, 더욱 바람직하게는 1중량% 내지 49.9중량%일 수 있다.
상기 미생물 제제는 상기 내생공생균에 추가로 계면활성제, 결합제, 자외선차단제, 부패방지제, 미생물의 영양원 또는 증량제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 미생물 제제를 이용하여 고추를 재배하는 경우, 고추와 공생관계를 가지는 내생공생균이 고추 뿌리에 침입하여 공생관계를 형성하고, 고추 생장을 촉진시키며, 식물 병원균에 대한 내성을 나타내어 고추의 생장에 매우 유효한 효과가 있을 뿐만 아니라 고추에 대해 외부 환경에 대한 저항력을 부가하여 통상적으로 고추를 재배하기 어려운 환경에서도 고추를 재배할 수 있는 산업적으로 매우 유용한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 고추(Capsicum annuum)와 공생관계를 가지는 고추뿌리로부터 분리한 내생공생균 또는 상기 내생공생균을 유효성분으로 함유하는 고추재배용 미생물 제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 고추 재배방법에 관한 것이다.
상기 내생공생균은 바람직하게는 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP) 또는 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP)일 수 있으며, 일 예로 상기 내생공생균을 동시에 또는 독립적으로 이용할 수 있다.
일 예로, 본 발명은 a) 멸균된 배지에 상기 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP), 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP) 또는 이들의 혼합물을 멸균된 배지에 접종하는 단계; b) 상기 접종된 균주를 배양하는 단계 및 c) 고추묘를 상기 접종된 균주를 배양한 배지에서 재배하는 단계를 포함하는 재배방법일 수 있다.
상기 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주와 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주의 혼합물은 바람직하게는 각 균주의 개세수의 비가 1:1 내지 1:5(기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주: 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주)로 혼합될 수 있다.
상기 고추묘는 바람직하게는 조직 배양하여 얻은 것일 수 있다. 또한, 상기 고추묘의 재배는 바람직하게는 상기 고추묘를 무균처리를 한 후, 상기 배지에 재배하는 것일 수 있다.
상기 균주의 배지에 대한 접종량은 제한적이지 않으나, 유도기를 단축시키기 위하여 바람직하게는 배지 중량에 대하여 0.01중량% 내지 5중량%일 수 있다.
또한, 일 예로 본 발명은 a) 배양토를 멸균시켜 멸균토를 제조하는 단계; b) 상기 멸균토에 영양분과 물을 첨가하여 고체 배지를 제조하는 단계; c) 상기 제조된 고체 배지에 상기 기가스포라 기간티아 KCTC 11073BP 균주(Gigaspora gigantea KCTC 11073BP), 글로무스 인트라라디세스 KCTC 11074BP 균주(Glomus intraradices 기탁번호 KCTC 11074BP) 또는 이들의 혼합물을 접종하는 단계; d) 상기 접종된 균주를 배양하는 단계; 및 e) 고추묘를 상기 접종된 균주를 배양한 배지에서 재배하는 단계를 포함하는 재배방법일 수 있다.
상기 배양토는 통상적으로 사용되는 상토 등일 수 있고, 상기 배양토를 멸균시키는 방법은 고열 또는 고압을 통하여 수행할 수 있다. 상기 멸균토에 첨가되는 영양분은 상기 공생균의 배양을 위하여 첨가되는 것이고, 일 예로 호아그란드 영양액(Hoagland Nutrient Solution) 등일 수 있다.
상기 접종된 균주를 배양한 배지 또는 고체배지에서 재배한 고추묘를 온실 이나 야외 등의 재배지에서 재배하는 경우, 자연환경에 대한 적응력이 우수하고, 개체 성장률 등이 향상될 수 있다는 장점이 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 기탁번호 KCTC 11073BP인 기가스포라 기간티아 균주(Gigaspora gigantea) 또는 기탁번호 KCTC 11074BP인 글로무스 인트라라디세스 균주(Glomus intraradices)는 고추 재배시 고추 유묘들의 뿌리에 침입 하여 공생관계를 형성하고, 고추 생장을 촉진시키며, 식물 병원균에 대한 내성을 나타내어 고추의 생장에 매우 유효한 효과가 있으므로, 농업과 환경 분야 특히, 고추 관련 산업에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 고추균근의 DNA 추출 및 PCR 증폭
고추균근의 게놈 DNA를 분리하기 위하여, 우선 고추 재배지에서 고추 뿌리를 수집한 후 증류수로 깨끗이 세척하여 흙을 제거하였다. 상기　고추　재배지는　충북　괴산군　감물면　신대　２리（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　１）， 충북　음성군　원남면　문암리 （Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　２），　충북　음성군 원남면　보천리（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　３），　충북　충주시　주덕읍 대곡리（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　４），　충북　음성군　원남면 하당리（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　５）　및　경기도　평택시　안중면 안중리（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　６）이었다．　　상기 흙을 제거한 각 식물 뿌리 0.5g을 막자 사발에 넣고 액체질소를 넣어가면서 고운 분말이 될 때까지 분쇄한 후, 1.5ml microcentrifuge 튜브에 반 정도씩 담아 여러 개를 준비하였다.
*상기 고추 뿌리로부터 DNA의 추출은 DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen, German)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
고추 뿌리의 근균근의 18S rDNA는 상기 고추 뿌리로부터 추출한 DNA를 주형으로 nested PCR을 수행하여 증폭하였다(MyGenie32 Thermal Block, Bioneer, 한국).
상세하게는, 상기 nested PCR은 2 단계 과정으로 이루어져 있으며, 각 단계에서 사용된 프라이머와 PCR 조건은 하기 표 1 및 표 2와 같다.
PCR 단계 Primer 서열(5'→3') 서열번호
1st PCR NS1(Forward) 5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3' 1
NS4(Reverse) 5'-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3' 2
2nd PCR AML1(Forward) 5'-AACTTTCGATGGTAGGATAGA-3' 3
AML2(Reverse) 5'-CCAAACACTTTGGTTTCC-3' 4
온도 시간 Cycle
1st Denaturation 95℃ 3 min
Amplification 2nd Denaturation 95℃ 30 sec 30 Cycles
Annealing 47℃ 1 min go to 2nd Denaturation
Extension 72℃ 1 min
Final Extension 72℃ 10 min
상기 표 1의 첫 번째 PCR(1st PCR)에 사용된 프라이머는 진핵생물 universal 프라이머이고, 상기 표 1의 두 번째 PCR(2nd PCR)에 사용된 프라이머는 내생공생균에 특이적인 프라이머이다.
상기 첫 번째 PCR에 사용된 PCR용 조성물은 0.2ml PCR 튜브에 2X EF-Taq premix 1(Solgent Co., 대한민국) 10㎕, NS1/NS4 프라이머 1㎕, 상기 고추 뿌리로부터 추출한 DNA 1㎕, 멸균수 7㎕ 를 첨가하여 최종부피가 20㎕가 되도록 제조하였으며, 상기 두 번째 PCR용 조성물은 NS1/NS4 프라이머 대신에 AML1/AML2 프라이머를 사용한 것과 주형 DNA로 상기 고추 뿌리로부터 추출한 DNA 대신에 첫 번째 PCR을 수행하여 얻은 PCR 산물인 DNA를 사용한 것을 제외하고는 상기 첫 번째 PCR용 조성물과 동일하게 제조하였다.
상기 PCR용 조성물을 이용하여 상기 표 2의 조건으로 PCR을 수행하여 균근균의 전체 18S rDNA에서 증폭이 가능한 부분을 미리 증폭한 후, 첫 번째 PCR 반응물을 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하고 UV transiluminator를 이용하여 크기를 확인한 결과, 그 크기가 약 1,100 bp임을 확인하였다. 상기 첫 번째 PCR 반응물의 크기를 확인한 후, 근균근만을 선별적으로 증폭시킬 수 있는 프라이머인 서열번호 3 및 서열번호 4의 AML1 및 AML2의 프라이머를 이용하여 두 번째 PCR을 수행하였다.
< 실시예 2> 고추균근의 18S rDNA 클로닝 및 서열분석
상기 실시예 1로부터 얻어진 nested PCR의 최종산물을 0.8% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 예상된 크기 즉, 약 700bp의 DNA 밴드와 일치하는 부분을 면도날로 오려낸 후 Gel extraction kit(Qiagen, German)을 이용하여 상기 DNA를 정제하였다.
상기 정제된 DNA 중 2㎕를 취하여 1% 아가로스 겔 상에서 전기영동하여 DNA 밴드를 확인한 후, 클로닝을 하기 위하여 상기 정제된 DNA의 대략적인 농도를 결정하였다.
정제된 DNA를 클로닝하기 위하여, 클로닝 벡터인 pCR2.1-TOPO vector(Invitrogen, Carlsbad, USA)를 이용하였으며, 상기 클로닝은 상기 클로닝 벡터의 제조사의 지침에 따라 수행하였다.
상기 클로닝을 수행 한 후, 18S rDNA 서열분석을 위하여 각각의 플레이트에서 형성된 클론 중 20개의 콜로니를 선별하였다.
상기 콜로니로부터 접종된 형질전환체들을 배양하고 DNA를 분리하였다. 상기 DNA의 분리는 DNeasy® Plant Mini Handbook에 기재된 방법(Purification of Total DNA from Plant Tissue(Mini Protocol, Kit DNeasy® Plant Mini Handbook pp 24-27)으로 수행하였다.
상기 분리된 DNA는 프라이머를 하기 표 3의 pCR2.1 벡터용 프라이머를 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 조성의 PCR용 조성물 및 반응 조건으로 PCR을 수행하여 DNA를 증폭하였다.
Primer 서열(5'→3') 서열번호
M13F(Forward) 5'- GTAAAACGACGGCCAG -3' 5
M13R(Reverse) 5'- CAGGAAACAGCTATGAC -3' 6
상기 증폭된 각각의 콜로니로부터 얻은 DNA들은 ABI 3700XL DNA Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, SCA, USA)를 이용하여 서열을 분석하였고 (Xenotech, 대한민국), 상기 결정된 18S rDNA 염기서열들을 도 1a 내지 도 1n 및 서열번호 7 내지 서열번호 20에 나타내었다.
상기 결정된 각각의 콜로니로부터 얻은 DNA의 서열을 NCBI(National Center for Biotechnology Information; http://www. ncbi . nih . gov /)의 BLAST program 및 TreeView 1.6.6 프로그램을 이용한 Neighbor-Joining method를 이용하여 상동성 검색을 실시하였다. 상기 상동성 검색은 Clustal X를 이용하여 multiple sequence와 profile을 배열하고, Gene Doc 프로그램을 이용하여 수행하였다.
상기 상동성 검색의 결과를 하기 표 4 및 도 2 에 나타내었다.
Collection site (재배지) 숙주식물 균 종 등재번호 상동성 클론 No
1 Capsicum annuum Glomus mosseae Gigaspora gigantea Glomus lamellosum AY635833 Z14010 AJ276087 778/792(98%) 783/787(99%) 779/798(97%) 1 2 3
2 Capsicum annuum Glomus ef . etunicatum Diversispora spurca AJ276077 Y17650 758/793(95%) 761/793(95%) 1 2
3 Capsicum annuum Glomus ef . etunicatum Y17644 760/793(95%) 1
4 Capsicum annuum Paraglomus occultum AJ276081 761/788(96%) 1
5 Capsicum annuum Gomus versiforme Diversispora spurca X86687 Y17650 7760/793(95%) 762/793(96%) 1 2
6 Capsicum annuum Glomus clarum Gigaspora gigantea Glomus sinuosum Glomus intraradices Scutellospora cerradensis AJ276084 Z14010 AJ133706 AY635831 AB041344 785/791(99%) 786/791(99%) 753/778(96%) 777/789(98%) 785/787(99%) 1 2 3 4 5
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 결정된 각각의 콜로니로부터 얻은 DNA의 서열은 공생균으로 확인된 기존의 공생균과와 상동성이 매우 밀접한 것으로 확인되었다. 또한, 상기 고추 뿌리에서 분리한 균의 계통발생학적 분류인 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 고추 뿌리에서 분리한 균은 병원균들(T. ellipsoideus , P. cucumerina)과는 서로 다른 계통학적 특성을 가지는 것으로 확인되었고, 각각 글로무스 모시애(Glomus mosseae), 글로무스 인트라라디세스(Glomus intraradices), 글로무스 라멜로숨(Glomus lamellosum), 글로무스 시누오숨(Glomus sinuosum), 글로무스 파시큘래튬(Glomus fasciculatum), 기가스포라 기간티아(Gigaspora gigantea), 및 스큐텔로스포라 세라덴시스(Scutellospora cerradensis)에 속하는 균들과 95% 내지 99%의 유사성을 나타내어 공생균으로 확인되었다.
< 실시예 3> 고추 공생균의 분리 및 동정
실시예 2에서 공생균으로 확인된 균을 분리 및 동정하기 위하여, 상기 실시예 1의 고추의 뿌리를 고사시켜 고추 뿌리에 감염된 공생균의 포자를 수집하였다.
상기 수집된 공생균의 포자를 현미경을 이용하여 관찰하여, 포자의 크기 및 형태학적 특성이 공생균과 일치하는 포자를 분리하였다.
상기 분리된 포자를 생장속도가 빠른 숙주식물인 수수에 접종하고, 무균상태의 배양토에서 5개월 동안 재배 후에, 생장정도가 우수한 수수를 고사시켜 상기 생장정도가 우수한 수수로부터 포자를 분리하였다.
상기 분리한 포자를 현미경적으로 관찰한 특징과 포자의 18S rDNA 염기서열을 상기 실시예 2와 동일한 방법을 수행하여 분석하고, 서열을 NCBI의 BLAST program을 이용하여 상동성 검색을 수행하였으며, 상기 현미경 관찰 사진을 도 5 및 도 6에 나타내고, 포자의 18S rDNA 염기서열을 상기 실시예 2와 동일한 방법을 수행하여 분석한 결과를 도 3 및 도 4, 서열번호 21 및 22와 하기 표 5에 나타내었다．
번호 숙주식물 균종 기탁번호 유사도(%)
CBUSFR-００１ 수수 (Sorghum bicolor) Gigaspora gigantea Z14010 955/967(98)
CBUSFR-００２ 수수 (Sorghum bicolor) Glomus intraradices AY635831 789/792(99)
상기 현미경을 이용한 관찰 결과 CBUSFR-００１로 명명된 포자의 형태가 구형 혹은 타원형이고, 그 크기가 200㎛ 내지 350㎛이며, 포자의　색은　엷은　황색이고，약　１０㎛의　얇은　포자벽을　가지고，　지름　약　４0㎛의 ｂｕｌｂ에　균사　즉，　ｓｕｓｐｅｎｓｏｒ와　ｓｕｂｔｅｎｄｉｎｇ　ｈｙｐｈａｅ가　부착되어　있는　것이　관찰되었으며，　Ｍｅｌｚｅｒ용액과　반응하여　엷은　황색을　나타내는　것으로　확인되었고，포자의 18S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 공생균인 Gigaspora gigantea Z14010과 98%의 유사도를 보여 기간스포라 기간티아(Gigaspora gigantea)로 동정되었다.
또한, 상기 현미경을 이용한 관찰 결과 CBUSFR-００２로 명명된 포자의 형태가 구형 혹은 타원형이고, 그 크기가 40㎛ 내지 120㎛이며, 포자의　색은　엷은　황색이고，약　１０㎛의　얇은　포자벽을　가지며，　지름　약　１0㎛　의　균사　즉，　ｓｕｂｔｅｎｄｉｎｇ　ｈｙｐｈａｅ가　부착되어　있는　것이　관찰되었고，Ｍｅｌｚｅｒ용액과　반응하여　엷은　자주색을　나타내며　토양　또는　감염된　뿌리　내에서　관찰되었고， 포자의 18S rDNA 염기서열을 분석한 결과, 상기 표 5에 나타낸 바와 같이 공생균인 Glomus intraradices AY635831과 99%의 유사도를 보여 글로무스 인트라라디세스(Glomus intraradices)로 동정되었다.
상기 기간스포라 기간티아로 동정된 CBUSFR-００１를 기간스포라 기간티아 CBUSFR-００１로 명명하였고, 상기 글로무스 인트라라디세스로 동정된 CBUSFR-００２를 글로무스 인트라라디세스 CBUSFR-００２로 명명하였다.
< 실시예 4> 고추 공생균의 고추 생장 효능
실시예 3에서 동정한 고추 공생균인 기간스포라 기간티아 CBUSFR-００１와 글로무스 인트라라디세스 CBUSFR-００２의 고추 생장에 미치는 효능을 조사하기 위하여, 상기 기간스포라 기간티아 CBUSFR-００１와 글로무스 인트라라디세스 CBUSFR-００２ 균주를 배양토에 접종한 후, 고추종자를 파종하고 배양하여 고추의 생장에 미치는 효능을 조사하였다.
보다　상세하게는　121℃에서 1시간 동안 멸균하여 무균상태로 만든 배양토에 상기 2종류의 고추 공생균을 접종한 군, 즉 처리군(실험군)과 공생균을 접종하지 아니한 군, 즉 무처리군(대조군)에 고추종자 즉, 상아탑(씨드텍코리아, 대한민국)을 각각 파종하고, 2개월간 포트에서 배양한 후 고추줄기의 길이(cm) 및 직경(cm)을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
줄기길이 (cm) 줄기직경(cm)
실험군 대조군 실험군 대조군
1 40.3 25.5 0.93 0.69
2 41.5 24.7 0.94 0.70
3 39.6 20.8 0.87 0.58
4 44.5 23.6 0.91 0.65
5 40.7 25.0 0.90 0.66
평균 41.3 23.9 0.91 0.66
상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 고추 뿌리로부터 분리된 공생균 미처리구에서는 고추줄기의 길이생장이 20.8 cm 내지 25.5cm(평균 23.9cm)이고 직경생장은 평균 0.66cm인 반면에, 고추 뿌리로부터 분리된 공생균 처리구 에서는 줄기의 길이생장이 39.6cm 내지 44.5cm(평균 41.3cm)이고 직경생장은 평균 0.91cm로 확인되어, 무처리구에 비해 줄기의 길이는 약 17.4cm(72.8%), 직경은 약 0.25cm(37.9%) 정도 증가됨을 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 고추뿌리로부터 분리된 고추 공생균은 고추의 생장에 매우 유효한 효과가 있는 것으로 확인되어, 농업과 환경 분야에서 폭 넓게 사용될 수 있고, 특히 고추 관련 산업에 매우 유용하게 사용될 있을 것으로 확인되었다.
상기한 결과로부터, 본 발명의 공생균은 상토 등의 조성물 형태로 고추 뿌리 근처에 첨가되는 경우에도 고추 뿌리에 침투하여 공생관계를 형성하고, 고추 생장을 촉진시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
도 1a 내지 도 1n은 본 발명의 일 실시예에 따른 고추로부터 분리한 여러 내생공생균의 18S rDNA 염기서열이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 고추로부터 분리한 여러 내생공생균의 18S rDNA 염기서열을 기초로 한 계통발생학적 분류를 나타낸 계통도이며,
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 기가스포라 기간티아 CBUSFR-0０1(Gigaspora gigantean CBUSFR-0０1)의 18S rDNA 염기서열이고,
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 글로무스 인트라라디세스 CBUSFR-0０2 (Glomus intraradices CBUSFR-0０2)의 18S rDNA 염기서열이며,
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 기가스포라 기간티아 CBUSFR-0０1(Gigaspora gigantean CBUSFR-0０1) 포자의 현미경 사진이고,
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 글로무스 인트라라디세스 CBUSFR-0０2 (Glomus intraradices CBUSFR-0０2) 포자의 현미경 사진이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (2)

  1. 고추 뿌리로부터 분리한 내생공생균(arbuscular mycorrhizal fungi)인 글로무스 인트라라디세스 균주 KCTC 11074BP(Glomus intraradices KCTC 11074BP).
  2. 제1항의 균주를 유효성분으로 함유하는 고추재배용 미생물 제제.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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