KR100832553B1 - 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법 - Google Patents

암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100832553B1
KR100832553B1 KR1020060128139A KR20060128139A KR100832553B1 KR 100832553 B1 KR100832553 B1 KR 100832553B1 KR 1020060128139 A KR1020060128139 A KR 1020060128139A KR 20060128139 A KR20060128139 A KR 20060128139A KR 100832553 B1 KR100832553 B1 KR 100832553B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
lipid nanoparticles
heparin
lipid
amphotericin
peg
Prior art date
Application number
KR1020060128139A
Other languages
English (en)
Inventor
신병철
정석현
최민수
성하수
조선행
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020060128139A priority Critical patent/KR100832553B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100832553B1 publication Critical patent/KR100832553B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 암포테리신 B를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 지질나노입자를 형성하는 지질 중에서 음이온성 인지질을 일정량 포함하고, 헤파린으로 개질시키기 위한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 수상에서 난용성인 암포테리신 B의 봉입효율을 증가시키고, 독성이 매우 강한 암포테리신 B를 생체 친화성이 우수한 지질나노입자에 봉입하여 정상세포에 대한 독성을 감소시킴은 물론, 헤파린으로 수식하여 체내 순환시간을 증가한 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
암포테리신 B, 헤파린, 지질나노입자, 음이온성 인지질, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자

Description

암포테리신 Β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자 및 이의 제조방법{Heparin coated lipid nanosphere containing Amphotericin B and preparation method of the same}
도 1은 시험예 1에서 산출되어진 약동력학적 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 시험예 2에서 산출되어진 독성실험 결과를 나타낸 것이다.
본 발명은 암포테리신 B를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 지질나노입자을 형성하는 지질 중에서 음이온성 인지질을 일정량 포함하고, 헤파린으로 개질시키기 위한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 수상에서 난용성인 암포테리신 B의 봉입효율을 증가시키고, 독성이 매우 강한 암포테리신 B를 생체 친화성이 우수한 지질나노입자에 봉입하여 정상세포에 대한 독성을 감소시킴은 물론, 헤파린으로 수식하여 체내 순환시간의 증가를 갖도록 한 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
폴리엔계 항진균제인 암포테리신 B는 거의 모든 진균 감염증에 대한 치료효과를 갖고 있다. 특히, 암포테리신 B는 전신성 진균증에 대하여 치료효과가 우수하기 때문에 암환자, 골수이식환자, 호중구 감소환자, 면역저하환자, 혹은 면역결핍환자에게 있어 생명을 위협하는 심각한 감염증을 효과적으로 치료할 수 있다. 암포테리신 B는 진균류의 막 스테롤인 에르고스테롤과 결합하고 이온통로로 재배치함으로써 진균 세포의 삼투조절을 방해하여 진균에 치료효과를 나타내는 폴리엔계의 항진균제, 항생제이다.
그러나, 암포테리신 B는 정맥 주사시 에르고스테롤과 동일한 기전으로 정상 세포의 콜레스테롤과 결합함으로써 정상세포와 조직에 대하여 독성을 나타내며, 오한, 발열, 조직괴사, 신독성 등의 부작용을 함께 수반한다. 특히, 암포테리신 B는 혈액투석에 의한 요로의 방출이 어렵기 때문에 사용에 제약과 주의가 필요하며 특히, 신독성이 매우 강하게 나타나며 소아, 노인 및 면역력이 약한 환자에 사용할 때 각별한 주의를 필요로 한다.
이와 더불어 암포테리신 B는 pH 6 ~ 7에서 물에 불용성이며, pH 2나 pH 11에서 0.1 ㎎/㎖의 매우 낮은 용해도를 갖고 있어 정맥주사로 사용하기 위해 염이나 마이셀, 에멀젼, 나노입자, 혹은 리포솜의 형태로 가용화하여 사용한다.
미합중국 특허 제4,822,777호는 암포테리신 B를 염의 형태로 제조하여 용해도를 향상하였다. 상기 특허에서는 암포테리신 B와 콜레스테롤 황산염만을 사용하여 100 ~ 400 nm 크기의 입자를 제조하였으며, 이때 암포테리신 B와 염을 형성 함으로써 수상에 대한 용해도를 향상시킨 것이다. 그러나, 상기 특허는 암포테리신 B를 단순히 염의 형태로 제조하여 용해도 향상은 이루어 졌으나, 제형으로 형성되지 않아 체내 순환시간이 짧고 투여 용량이 제한적이며 정상세포에 대한 독성을 나타내게 된다.
미합중국 특허 제5,059,591호는 암포테리신 B와 콜레스테롤-폴리에틸렌글리콜(PEG)을 사용하여 암포테리신 B의 독성을 감소시켰다. 상기 특허에서는 암포테리신 B를 콜레스테롤-PEG와 염의 형태로 결합시켰으며 이때 콜레스테롤과 결합된 PEG의 특성을 이용하여 체내 순환시간을 증가시켰다. 그러나, 상기 특허는 암포데리신 B의 제형화가 이루어지지 않아서 제형화된 암포테리신 B에 비해 독성이 클 문제가 있다.
미합중국 특허 제4,981,690호는 암포테리신 B를 봉입한 리포솜의 제조방법에 관한 내용이 기술되어 있으며, 상기 특허에서는 인지질과 콜레스테롤을 사용하여 다중막 리포솜 형태로 제조하는 방법을 기술하였다. 그러나, 상기 특허는 암포테리신 B의 제형화는 이루어졌으나 지속적인 생체 순환을 유도하는 물질의 함유가 되지 않아서 비교적 생체순환시간이 짧을 수 있다.
미합중국 특허 제5,965,156호는 암포테리신 B를 봉입한 리포솜의 제조방법에 관한 것이다. 상기의 특허는 암포테리신 B를 리포솜에 봉입하였으며 산성 유기용매에서 암포테리신 B와 음이온성인 포스파티딜글리세롤을 이온결합시켜 제형으로 형성시에 봉입율을 증가시키고 체내 독성을 감소시켰다. 그러나, 상기의 특허는 포스파티딜글리세롤과 암포테리신 B의 이온결합을 위하여 산성용액을 사용할 경 우 암포테리신의 분해가 촉진되어 손실율이 증가한다는 단점을 갖고 있다. 또한, 제형 자체의 안정성 역시 산 촉매의 분해로 인해 약화되어 암포테리신 B의 급격한 방출이 이루어지기 때문에 잦은 투여와 투여 농도에 있어 제한을 갖는다.
따라서, 암포테리신 B의 수상 용해도를 향상시키고 약물의 독성을 감소시키고 체내 순환시간이 증가되며 더불어 대량 생산이 가능한 새로운 방법이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 상기 특허들의 문제점을 해결하기 위하여 노력한 결과, 독성이 매우 강한 암포테리신 B를 생체 친화성이 우수한 지질나노입자에 봉입하여 정상세포에 대한 독성을 감소시킴은 물론, 헤파린으로 지질나노입자의 표면을 개질하여 지속적 방출효과를 갖는 헤파린으로 표면 개질된 암포테리신 B-지질나노입자 및 이의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 암포테리신 B를 봉입하기 위한 음이온성 인지질로 형성된 지질나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 헤파린으로 개질시킨 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 암포테리신 B를 봉입하기 위한 음이온성 인지질로 형성된 지질나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 헤파린으로 개질시킨 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자를 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
(1) 포스파티딜콜린, 음이온성 인지질, 스테롤류 및 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 40~70 : 5~20 : 10~40 : 10~30 의 중량비로 혼합하여 유기용매에 용해시키는 단계;
(2) 암포테리신 B를 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 용해시키는 단계;
(3) 상기 (1) 및 (2) 단계의 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합하는 단계;
(4) 상기 (3) 단계의 혼합용액을 수상에 2:1 ~ 1:10의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시키는 단계;
(5) 상기 (4) 단계의 리포솜 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 암포테리신 B를 봉입한 음이온성 지질나노입자를 제조하는 단계;
(6) 상기 (5) 단계의 지질나노입자를 형성하는 지질과 헤파린의 중량비가 100:0.1 ~ 100:10 이 되도록 혼합하는 단계; 및
(7) 상기 (6) 단계의 혼합용액에서 지질나노입자에 수식되지 않은 헤파린 또는 그 유도체를 제거하는 단계를 포함하는 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 지질나노입자를 형성하는 지질 중에서 음이온성 인지질을 일정량 포함하고, 헤파린으로 개질시키기 위한 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 수상에서 난용성인 암포테리신 B의 봉입효율을 증가시키고, 독성이 매우 강한 암포테리신 B를 생체 친화성이 우수한 지질나노입자에 봉입하여 정상세포에 대한 독성을 감소시킴은 물론, 헤파린으로 수식하여 체내 순환시간의 증가를 갖도록 한 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명의 암포테리신 B를 봉입한 지질나노입자 제조를 위해서는 지질나노입자의 형성 지질로 음이온성 인지질을 사용하는 것에 그 특징이 있다. 상기 음이온성 인지질은 소수성 기 탄소수 16 ~ 18의 알킬사슬을 갖는 포스파티딜산이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 디팔미토일글리세로포스페이트(DPPA), 디스테로일글리세로포스포글리세롤(DSPG) 그리고 디팔미토일글리세로포스포라글리세롤 (DPPG) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상을 포함한다. 음이온성 인지질의 탄소수가 16 미만일 경우 상전이온도가 체온 이하로 떨어져 지질나노입자의 체내 안정성이 저하되고, 탄소수가 18을 초과하는 경우에는 암포테리신 B와 결합력이 약해져 암포테리신 B의 봉입효율이 감소하고, 지질나노입자 입자의 크기가 증가하기 때문에 바람직하지 못하다.
상기 음이온성 지질은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 5 ~ 20 중량% 함유하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서 지질나노입자를 형성하기 위한 지질로서 포스파티딜콜린을 사용하는 것이 바람직하며, 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린 또는 보바인 인지질을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 소수성기의 탄소수가 16 ~ 18인 알킬사슬을 가지는 것이고, 예를 들어 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린 등을 사용할 수 있다. 탄소수가 16 미만인 경우에도 양친매성인 암포테리신 B와 강한 결합을 이루나, 상전이온도가 체온 이하로 떨어져 지질나노입자의 체내 안정성이 저하되고, 탄소수가 18을 초과하는 경우에는 암포테리신 B와 결합력이 약해져 지질나노입자에 암포테리신 B의 봉입효율이 감소하고, 지질나노입자의 크기가 증가하기 때문에 바람직하지 못하다. 상기 포스파티딜콜린은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 40 ~ 70 중량% 함유하는 것이 바람직하다.
또한, 지질나노입자을 형성하기 위해 사용되는 지질로서 스테롤류를 사용하는데, 바람직한 스테롤류로는, 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤, 스티그마스테롤 또는 라노스테롤 등을 들 수 있다. 상기 스테롤류는 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 10 ~ 40 중량% 함유하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 암포테리신 B를 봉입한 지질나노입자 표면을 헤파린으로 개질하기 위하여 PEG 함유 고분자를 지질나노입자에 도입하여 사용한다. PEG 그룹을 갖는 고분자는 헤파린과 결합력을 갖고 있으며 이에 관한 내용은 Biomaterials 27 (2006) p2621~2626에 보고되어 있다. 이를 위해 지질나노입자 형성 지질 중에 본 발명에서는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자로 디스테로일글리세로포스포에탄올아민메틸옥시에틸렌글리콜(DSPE-mPEG), 폴리옥시에틸렌 소비탄 모노팔미테이트 및 폴리에틸렌폴리프로필렌 글리콜(poloxamer) 중에서 선택된 1종 또는 2 종 이상을 사용하며, 상기 고분자를 전체 지질에 대하여 10 ~ 30 중량%로 첨가하는 것이 바람직하다. PEG 그룹을 갖는 고분자의 함량이 상기 하한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자와 헤파린 결합력의 약화로 인해 지질나노입자 표면이 헤파린으로 충분히 개질되지 않으며 상기 상한을 벗어난다하더라도 지질나노입자 표면의 면적은 한정되어 있기 때문에 더 높은 농도로 헤파린이 지질나노입자 표면을 개질시키지 못한다.
본 발명에서 지질나노입자 표면을 수식하기 위한 헤파린은 다양한 동물조직에서 분리 추출하거나, 재조합 헤파린(recombinant heparin)을 사용하는 것도 가능하다. 현재 이러한 목적으로 사용되는 대부분의 헤파린은 돼지의 장 점막으로부터 분리되고, 분리공정은 점막의 가수분해 단계 및 헤파린의 추출 단계를 포함한다. 특히, 본 발명의 헤파린은 중량 평균 분자량이 500 ~ 50,000인 헤파린을 사용하는 것이고, 더욱 바람직하게는 중량 평균 분자량이 1,000 ~ 5,000인 헤파린을 사용하는 것이다. 분자량이 상기 범위 미만일 경우에는 헤파린의 특성 (체내순환 지속시간 증가)이 감소되는 문제가 있고, 분자량이 상기 범위를 초과할 경우에는 지질나노입자 사이에 헤파린의 네트워크를 통한 지질나노입자의 뭉침 현상, 지질나노입자의 구조적 안정성 감소 등의 문제가 있다. 특히, 분자량이 수십~수백만인 일반 헤파린을 이용할 경우 지질나노입자 자체의 안정성이 감소하기 때문에 제형의 제조가 용이하지 않으므로 입자의 크기나 봉입율 및 제타포텐셜의 측정이 불가능하다.
이하, 본 명세서에서 사용하는 "헤파린"은 상기 헤파린, 상기 헤파린의 분 절(fragments), 상기 헤파린의 염 또는 상기 헤파린의 유도체를 포함하는 의미이다.
본 발명에서는 헤파린으로 지질나노입자의 표면을 개질하여 혈액 내 안정성 및 순환시간이 향상된 음이온성을 나타내는 "체내순환 지속형" 지질나노입자를 제공한다. 본 명세서에서 사용하는 "표면 개질"은 생체순환 기능증가 능력을 갖고 있는 헤파린을 지질나노입자 표면의 PEG 작용기와 쌍극자 결합을 통해 코팅된 것을 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용하는 "체내순환 지속형"지질나노입자는 헤파린이 지질나노입자 표면에 수식된 지질나노입자로 투여 후 수 시간 내에 혈류에서 사라지는 통상의 제형과 달리, 투여 후 혈류에 60시간 이상 잔류하는 제형을 의미한다. 상기 헤파린은 지질나노입자를 형성하는 지질 100 중량부에 대하여 0.1 ~ 10 중량부 포함하는 것이고, 바람직하게는 1 ~ 10 중량부 포함하는 것이다. 헤파린이 상기 범위 미만으로 존재하는 경우에는 지질나노입자 표면의 음이온성이 충분하지 않아 혈액 내에서 혈장단백질의 흡착이 우려되고, 안정성 및 순환시간 향상 효과가 크지 않고, 상기 범위를 초과하더라도 지질나노입자의 표면적이 제한되어 있으므로 더 이상 헤파린으로 인한 체내순환시간 증대 효과가 발생하지 않는다.
본 발명의 암포테리신 B를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자의 평균 입경은 50 ~ 300 nm, 바람직하게는 100 ~ 150 nm인 것이다. 지질나노입자의 평균 입경이 상기 범위를 초과하는 경우 체내 순환시 장기, 즉 간이나 비장에서 세망내피계에 의하여 흡수(uptake)가 발생하며, 상기 범위 미만이 경우에는 목표 부위에 전달하는 약물의 양(drug payload)이 불충분하다.
이하, 암포테리신 B를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자의 제조 방법을 단계별로 설명한다.
(1) 단계에서는 지질나노입자 형성 지질인 포스파티딜콜린, 음이온성 인지질, 스테롤류 및 PEG 그룹을 갖는 고분자를 40~70 : 5~20 : 10~40 : 10~30의 중량비로 혼합한다. 이때 사용되는 포스파티딜콜린이 상기 범위 미만일 경우 지질나노입자의 형성이 용이하지 않고, 초과할 경우에는 지질나노입자의 안정성이 감소한다. 음이온성 인지질의 함량이 상기 하한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자에 헤파린코팅의 약화, 지질나노입자 자체 크기 증가, 지질나노입자 간의 뭉침 현상 등의 문제가 있고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자와 헤파린과의 뭉침 현상으로 인한 입자크기의 증가 문제가 있다. 또한, 콜레스테롤의 함량이 상기 하한을 벗어나는 경우에는 약물의 봉입효율이 감소하는 문제가 있고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 지질나노입자의 안정성이 감소되는 문제가 있다. 또한, 스테롤류는 중량비가 증가할수록 약물의 봉입율은 증가하나 상기 범위 이상에서는 입자의 크기가 증가하여 상기 범위에서 제조하는 것이 바람직하다. PEG 그룹을 갖는 고분자의 경우에는 상기 범위 하한일 경우 헤파린의 코팅이 용이하지 않고 상한을 벗어나는 경우에는 입자의 크기가 지나치게 증가하여 상기의 범위로 지질나노입자를 제조하는 것이 바람직하다. 상기 지질나노입자 형성 지질은 클로로포름, 메탄올, 톨루엔 등과 같이 지질의 용해가 가능한 유기용매에 용해시킨다.
(2) 단계에서는 암포테리신 B를 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올 에 용해시킨다. 상기 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 이소부탄올, 이소프로판올 등이 있다. 상기 알코올에 암포테리신 B를 0.1 ~ 1 ㎎/㎖로 용해시키는 것이 바람직하다. 암포테리신 B의 농도가 상기 하한을 벗어나는 경우에는 약물 봉입농도가 저하되고, 상기 상한을 벗어나는 경우에는 암포테리신 B가 알코올에 완전히 용해되지 않는 문제가 있다. 또한, 암포테리신 B를 상기 알코올이 아닌 디메틸술폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF) 등과 같은 다른 유기 용매를 사용하는 경우에는 용매의 제거가 용이하지 않고 생체적합성이 감소되는 문제점이 있다.
(3) 단계에서는 상기 (1) 및 (2) 단계의 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합한다. 상기 (1) 용액의 비율이 50 (v/v)%를 초과할 경우 약물의 농도가 감소하는 문제가 있고, 10 (v/v)% 미만일 경우에는 인지질의 양이 지나치게 감소하여 제형 형성에 어려움이 있다.
(4) 단계에서는 상기 (3) 단계의 혼합용액을 수상에 2:1 ~ 1:10의 부피비가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1:1 ~ 1:3의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시킨다. 상기 수상으로는 증류수, 인산염 완충용액, 살린 용액, 슈크로스 용액, 말토즈 용액 및 마니톨 용액 등의 당용액, 완충용액 또는 등장액을 사용할 수 있다. 상기 수상이 상기 부피 비 범위보다 적을 경우 분산되었던 지질나노입자 입자가 응집하여 최종 지질나노입자의 입자크기가 증가하며, 수상이 상기 부피 비를 초과할 경우에는 용액이 희석되어 불필요한 농축과정이 추가되어야 할 경우가 있다. 또한, 지질나노입자의 형성을 위하여 팁 소니케이션(tip sonication)에 서 1 ~ 5 ㎖/min 속도로 주사기를 이용하여 (3) 단계의 혼합용액을 물에 분산시키는 것이 바람직하다. 분산속도가 상기 범위를 초과하는 경우에는 입자의 크기가 증가되고 상기범위 미만이라 하더라도 일정크기 이하의 입자형성에는 어려움이 있기 때문에 상기 범위의 분산속도가 바람직하다.
(5) 단계에서는 상기 (4) 단계의 지질나노입자 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 암포테리신 B를 봉입한 PEG 작용기를 갖는 지질나노입자를 제조한다. 상기 감압 증류할 때의 온도가 20 ℃ 미만일 경우 제거시간이 증가하고 유기용매의 완벽한 제거가 어려우며, 50 ℃를 초과하는 경우에는 형성된 지질나노입자의 파괴 및 약물이 변성될 수 있기 때문에 상기의 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 또한, 유기용매의 완벽한 제거를 위하여 상기 감압 증류 시 상기 유기용매와 함께 유기용매 부피의 0.5 ~ 5배의 물을 제거하는 것이 바람직하다. 정제된 지질나노입자 용액은 사출성형기를 사용하여 0.1 ~ 0.5 ㎛ 사이에서 균일한 크기분포를 갖는 지질나노입자 용액으로 제조한다. 이때 사출성형기에 사용되는 여과막은 지질나노입자의 입자크기와 동일한 0.1 ~ 0.5 ㎛의 기공크기가 적합하다. 상기 기공크기가 0.5 ㎛를 초과하여 지질나노입자가 0.5 ㎛을 초과할 경우에는 정맥 주사 시 모세혈관이나 세망내피 세포에 걸려 체내 순환시간이 급격히 짧아져 바람직하지 않고, 0.1 ㎛ 미만인 경우에는 입자의 대부분이 반투막에서 여과되어 수율이 급격히 감소하는 문제가 있다.
(6) 상기 (5) 단계의 지질나노입자를 형성하는 지질과 헤파린의 중량비가 100 : 0.1 ~ 100 : 10이 되도록 중량비로 혼합한다. 헤파린의 중량비가 상기 범위 미만일 경우 지질나노입자 표면에 충분한 양의 헤파린이 수식되기 용이하지 않고, 상기 범위를 초과할 경우에도 지질나노입자 표면적이 한정되어있기 때문에 코팅된 헤파린의 양이 증가하지 않는다. 또한, 헤파린 용액에 지질나노입자 용액의 혼합시키는 속도는 0.01 ~ 1 ㎖/min이 바람직하며, 상기 속도를 초과하면 지질나노입자 사이에 헤파린으로 인한 급격한 뭉침 현상이 발생하며, 상기 속도 미만에서로 혼합한다 하더라도 코팅효과에는 큰 영향을 미치지 않기 때문에 상기속도가 바람직하다.
(7) 상기 (6) 단계의 혼합용액에서 지질나노입자에 수식되지 않은 헤파린을 제거한다. 지질나노입자와 수식되지 않은 헤파린을 제거하기 위하여 투석, 겔 투과 크로마토그래피 또는 고압여과기 등을 이용할 수 있다. 투석의 경우, 반투막의 분자량은 선형 고분자인 헤파린 제거를 위해 50,000 ~ 500,000의 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 헤파린과 함께 지질나노입자로 형성되지 못한 인지질과 암포테리신 B 등을 동시에 제거하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 사용하는 것이 보다 바람직하다.
이렇게 제조된 지질나노입자는 수상에서 난용성인 암포테리신 B의 봉입율을 향상시킴과 동시에 지질나노입자 표면에 PEG 그룹을 갖는 고분자를 도입하고 지질나노입자 표면을 헤파린으로 개질함으로서 체내 순환시간의 증가를 갖기 때문에 암포테리신 B를 비롯한 여러 가지 난용성 약물의 가용화에 매우 유용하리라 기대된다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이 들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제조예 1
디라우로일포스파티딜콜린(DLPC), 디미리스토일포스파티딜콜린(DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC) 및 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC) 중에서 선택되는 어느 하나의 포스파티딜콜린(PC) 60 ㎎과 콜레스테롤(CHOL) 20 ㎎을 2 ㎖의 클로로포름에 용해하여 지질 혼합용액으로 제조하였다.
암포테리신 B(AmB)는 메탄올에 0.5 mg/㎖ 농도로 용해하고 상기 지질 혼합용액 2 ㎖와 암포테리신 B 용액 8 ㎖를 혼합하여, AmB-지질 혼합용액 용액 10 ㎖를 제조하였다.
상기 AmB-지질 혼합용액 10 ㎖을 주사기를 이용하여 팁 소니케이션하면서 2 ㎖/min의 속도로 20 ㎖의 증류수에 분산시켜 지질나노입자를 형성한 후, 갑압증류기를 이용하여 35 ℃에서 용액의 총량이 10 ㎖가 될 때까지 유기용매 10 ㎖와 증류수 10 ㎖을 제거하고, 압출기를 이용하여 0.2 ㎛ 반투막을 통과시켜 입자의 크기분포를 균일화한다.
상기 과정으로 제조한 지질나노입자의 입자크기를 입자분석기(Electrophoretic light scattering spectrophotometer, ELS-8000, Osuka Electronics, Japan)로 측정하여 다음 표 1에 나타내었다.
Figure 112006092804373-pat00001
제조예 2: 음이온성 인지질이 함유된 지질나노입자의 제조
상기 제조예 1과 같은 방법으로 지질나노입자를 제조함에 있어 지질나노입자 입자의 크기가 보다 바람직하게 150 nm 이하이면서 Tg가 41 ℃인 시료 3의 봉입율을 90% 이상으로 증가시키기 위하여 음이온성 인지질인 디팔미토일글리세로포스페이트(DPPA)과 디스테로일글리세로포스포글리세롤(DSPG)을 각각 첨가하여 음이온성 지질나노입자를 제조하였다.
DPPA와 DSPG의 함량 변화에 따른 지질나노입자의 입자 크기의 변화와 제타 포텐셜(zeta potential) 및 봉입효율을 측정하여 다음 표 2와 표 3에 각각 나타내었다.
Figure 112006092804373-pat00002
Figure 112006092804373-pat00003
제조예 3: 헤파린이 코팅된 지질나노입자의 제조
상기 제조예 2의 시료 8과 같은 방법으로 지질나노입자를 제조함에 있어 헤파린을 표면 코팅하기 위하여 시료 8에 DSPE-mPEG2000을 0 ~ 80 중량비로 첨가하였다. 이때 제조된 DSPE 입자의 크기 변화를 다음 표 4에 나타내었다.
Figure 112006092804373-pat00004
제조예 4: 헤파린이 수식된 지질나노입자 제조
헤파린은 중량 평균 분자량이 3,000이고 선형인 특성을 갖고 있는 것을 사용하였다.
상기 제조예 3의 시료 10 방법으로 제조된 지질나노입자를 형성하는 지질과 헤파린을 100:0 ~ 100:20의 중량비로 0.01 ~ 1 ㎖/min의 혼합속도로 혼합하였으며, 이때 헤파린은 0.1 ~ 10 ㎎/㎖용액으로 지질나노입자 용액과 동일한 부피의 수상에 용해하여 혼합하였다. 혼합 용액은 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 정제하여 헤파린이 수식된 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자를 제조하였고, 지질나노입자와 헤파린의 중량부에 의한 입자크기, 제타포텔셜 및 봉입효율을 측정하여 다음 표 5에 나타내었다.
Figure 112006092804373-pat00005
PEG 작용기에 따른 지질나노입자 표면에 코팅된 헤파린을 정량적으로 분석하기 위하여 시료 14와 동일한 질량의 헤파린(100:2.5)을 시료 8과 혼합하여 지질나노입자 표면에 코팅된 헤파린의 양을 톨루이딘 블루 헤파린 정량법으로 분석하였다. PEG 작용기의 유무에 따른 지질나노입자 표면에 코팅된 헤파린의 질량은 다음 표 6에 나타내었다.
Figure 112006092804373-pat00006
시험예 1: 체내순환시간 확인 실험
지질나노입자의 체내 순환시간을 관찰하기 위하여 SD 랫트 실험용 쥐에 암포테리신 B의 주사제 가용화를 위해 소디윰 디옥시콜레이트가 첨가된 Bristol Myers-Squibb 사의 Fungizone®, 지질을 사용해 리포솜 제형으로 만들어진 Nexstar 제약의 Ambisome® 그리고 지질과 헤파린의 중량비가 100 : 5와 100 : 10인 시료 15와 시료 16을 꼬리 정맥을 통하여 투여하고 시간별로 혈액을 채취함으로써 지질나노입자 내부에 봉입된 약물의 농도를 측정하였고, 측정되어진 약물의 농도로서 약동력학적 결과를 산출하였다. 약동력학적으로 산출된 결과를 통하여 약물의 체내 순환시간을 확인하였다. 지질나노입자 내부의 약물의 농도는 시간별로 채취한 혈액을 헤파린 용액으로 희석하여 원심분리 후 상층액을 1-아미노 4-니트로나프탈렌이 0.5 ㎍/ml의 농도로 메탄올에 녹아있는 용매를 사용하여 희석해서 측정할 용액을 제조하고, 이 용액을 사용하여 흡광도를 측정하였다. 상기 흡광도는 자외선 분광광도계를 이용하여 측정하였으며 약물의 파장은 408 nm에서 측정하였다.
상기 실험에서 산출되어진 약동력학적 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 도 1에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 4의 시료 15와 시료 16의 헤파린으로 코팅한 지질나노입자는 Fungizone®과 비교시 월등히 긴 체내 순환시간을 보여주고 있으며 주사 후 3시간까지는 Ambisome® 보다도 긴 체내 순환시간을 관찰할 수 있다. 지질과 헤파린의 중량비가 100 : 5인 경우가 100 : 10의 경우보다 초기 체내 순환시간이 긴 것을 관찰할 수 있는데 이것은 지질과 헤파린의 중량비가 100 : 10인 시료 16번의 지질나노입자의 크기가 커서 체내 대식세포나 단백질 등의 흡착에 의한 결과로 보여진다. 이상의 결과로서 제조예 4의 헤파린이 결합된 지질나노입자를 사용한 주사제가 체내 순환시간이 가장 우수하며, 이러한 결과는 지질나노입자의 표면에 헤파린을 결합함으로써 지질나노입자의 체내 순환시간을 기존의 암포테라신 B의 제형보다 증가시킬 수 있다는 사실을 증명한다.
시험예 2: 독성시험
지질나노입자의 독성시험을 위해 인간 신장 세포인 293 세포를 사용하여 MTT 실험을 실행하였다. 293 세포를 1 ×104 cells/ml의 농도로 96-웰 플레이트에 이산화탄소 배양기에서 37 ℃, 24시간 동안 배양한 후 각각의 웰 플레이트에 암포테리신 B를 6.25, 12.5, 25, 50 그리고 100 ㎍/ml의 농도로 각각의 제형인 Fungizone®과 지질과 헤파린의 중량비가 100 : 5와 100 : 10인 시료 15와 시료 16을 첨가하고 12시간 동안 다시 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)시약을 첨가하여 이산화탄소 배양기에서 37 ℃, 4시간 동안 배양시켜 포마잔 결정(formazan crystal)을 생성시켰다. 각각의 웰 플레이트에서 200 ㎍/ml의 용액을 제거한 후 포마잔 결정을 150 ㎍/ml의 디메틸설폭사이드용액을 첨가하여 용해하였다. 이렇게 용해된 시료가 담긴 웰 플레이트를 효소면역측정법(ELISA)을 통하여 590 nm에서 측정하였다.
상기 실험에서 산출되어진 독성실험 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 도 2에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 제조예 4의 시료 15와 시료 16의 헤파린으로 코팅한 지질나노입자는 Fungizone®과 비교시 전반적으로 세포 생존율이 높은 것을 볼 수 있다. 반면, 시료 15와 시료 16의 비교시 거의 동일한 세포 생존율을 보여주었다. 이것은 생체적합성 물질인 인지질, 콜레스테롤 그리고 헤파린을 사용하여 제형화되어 독성이 높은 암포테리신 B의 독성을 낮춘 효과 때문으로 사료된다. 이로서 생체 적합성 물질로서 지질나노입자에 암포테리신 B를 봉입함으로써 세포독성을 낮출 수 있다는 것을 증명한다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 수상에서 난용성인 암포테리신 B을 봉입한 지질나노입자의 봉입율 향상과 체내순환시간 증가를 위하여 헤파린 표면 개질방법에 있어 음이온성 인지질을 사용하거나 지질나노입자 표면에 PEG 그룹을 갖는 고분자를 도입하여 지질나노입자 표면을 헤파린으로 개질함으로써 체내 순환시간의 증가를 갖는 헤파린으로 표면 개질된 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 난용성약물인 암포테리신 B의 수용성 주사제로의 새로운 가용화 방법과, 암포테리신 B 제제의 독성감소 및 체내 순환시간 증가에 매우 유용하리라 기대된다.

Claims (12)

  1. 음이온성 인지질을 포함하는 지질나노입자의 표면에 폴리에틸렌글리콜(PEG)가 노출되어 있고, 체내순환시간의 연장을 위해 상기한 지질나노입자의 표면을 헤파린으로 개질시킨 것을 특징으로 하는 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 음이온성 인지질은 소수성기의 탄소수 16 ~ 18의 알킬사슬을 갖는 포스파티딜산인 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 음이온성 인지질은 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 조성에 대하여 5 ~ 20 중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 노출되도록 하기 위하여 디스테로일글리세로포스포에탄올아민메틸옥시에틸렌글라이콜(DSPE-mPEG), 폴리옥시에틸렌 소비탄 모노팔미테이트 및 폴리에틸렌폴리프로필렌 글리콜(poloxamer) 중에서 선택된 1종 또는 2 종 이상인 PEG 그룹을 갖는 고분자를 사용하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 헤파린은 중량 평균 분자량이 500 ~ 50,000인 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 헤파린이 상기 지질나노입자를 형성하는 전체 지질 100 중량부에 대하여 0.1 ~ 10 중량부로 개질된 것을 특징으로 하는 지질나노입자.
  7. (1) 포스파티딜콜린, 음이온성 인지질, 스테롤류 및 폴리에틸렌글리콜(PEG) 그룹을 갖는 고분자를 40~70 : 5~20 : 10~40 : 10~30의 중량비로 혼합하여 유기용매에 용해시키는 단계;
    (2) 암포테리신 B를 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 용해시키는 단계;
    (3) 상기 (1) 및 (2) 단계의 용액을 1:1 ~ 1:9의 부피비로 혼합하는 단계;
    (4) 상기 (3) 단계의 혼합용액을 수상에 2:1 ~ 1:10의 부피비로 분산시켜 지질나노입자를 형성시키는 단계;
    (5) 상기 (4) 단계의 지질나노입자 용액을 20 ~ 50 ℃에서 감압 증류하여 유기용매를 제거하고, 여과하여 암포테리신 B를 봉입한 음이온성 지질나노입자를 제조하는 단계;
    (6) 상기 (5) 단계의 지질나노입자를 형성하는 지질과 헤파린의 중량비가 100:0.1 ~ 100:10이 되도록 혼합하는 단계; 및
    (7) 상기 (6) 단계의 혼합용액에서 지질나노입자에 수식되지 않은 헤파린 또는 그 유도체를 제거하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B가 봉입된 지질나노입자의 제조방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 (2) 단계에서 암포테리신 B를 탄소수 1 ~ 6의 직쇄형 또는 분지형 알코올에 0.1 ~ 1 ㎎/㎖ 농도로 용해시키는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된 지질나노입자의 제조방법.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 (4) 단계에서 팁 소니케이션(tip sonication)을 사용하여 1 ~ 5 ㎖/min 속도로 주사기를 이용하여 (3) 단계의 혼합용액을 분산시키는 것을 특징으로 하는 지질나노입자의 제조방법.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 (5) 단계에서 상기 유기용매와 함께 유기용매 부피의 0.5 ~ 5배의 물을 제거하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자의 제조방법.
  11. 제 7 항에 있어서, 입자의 크기분포를 균일하게 하기 위하여 상기 (5) 단계에서 기공크기가 0.1 ~ 0.5 ㎛인 여과막을 사용해 여과하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자의 제조방법.
  12. 제 7 항에 있어서, 상기 (7) 단계에서 투석, 겔 투과 크로마토그래피 또는 고압여과기를 이용하여 지질나노입자에 수식되지 않은 헤파린을 제거하는 것을 특징으로 하는 지질나노입자의 제조방법.
KR1020060128139A 2006-12-14 2006-12-14 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법 KR100832553B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060128139A KR100832553B1 (ko) 2006-12-14 2006-12-14 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020060128139A KR100832553B1 (ko) 2006-12-14 2006-12-14 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100832553B1 true KR100832553B1 (ko) 2008-05-26

Family

ID=39665298

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020060128139A KR100832553B1 (ko) 2006-12-14 2006-12-14 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100832553B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020119170A1 (en) * 1987-03-05 2002-08-29 Janoff Andrew S. Low toxicity drug-lipid systems

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020119170A1 (en) * 1987-03-05 2002-08-29 Janoff Andrew S. Low toxicity drug-lipid systems

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Antimicrob. Ag. Chemother., Vol.38, pp713-718.
J. Controlled Release, Vol,37, pp123-129.
US 2002/0119170 A1.

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3571335B2 (ja) リポゾームマイクロレシーバー組成物および方法
JP4786105B2 (ja) リポソーム
JP4885715B2 (ja) イリノテカン製剤
KR100869824B1 (ko) Ｓｎ-38 지질 복합체 및 사용 방법
KR20080094473A (ko) 음이온성 지질나노입자 및 이의 제조방법
RU2391966C1 (ru) Наносистема на основе растительных фосфолипидов для включения биологически активных соединений и способ ее получения (варианты)
DE3852961T2 (de) Arzneistoff-Lipid-Systeme mit geringer Toxizität.
WO2016015522A1 (zh) 脂肪酸结合型白蛋白-药物纳米粒子冻干制剂及制备方法
JPH07505408A (ja) 治療及び診断用組成物及びその製造方法，ならびにその用途
JP2007511545A (ja) 安定リポソーム組成物
CN106821987B (zh) 一种载含酚羟基难溶性药物的脂质体及制备方法和应用
DE69820861T2 (de) Teilchenförmige arzneimittelträger
JP4874097B2 (ja) 水難溶性カンプトテシン含有リポソーム製剤
CN117750943A (zh) 靶向动脉粥样硬化脂质体纳米载体递送系统及其制备方法
EP3616726B1 (en) Protein particle wrapped with medicine insoluble in water and preparation method therefor
JP2008518925A (ja) リポソーム製剤の製造プロセス
CN104324007B (zh) 一种天然重组纳米脂质载体制备技术与应用
AU2003224796A1 (en) Cochleates made with purified soy phosphatidylserine
CN102188378B (zh) 包载水溶性药物脂质体的制备方法
KR100832553B1 (ko) 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된지질나노입자 및 이의 제조방법
CN102188379A (zh) 载药脂质体的制备方法
Jain et al. Elastic liposomes bearing meloxicam-β-cyclodextrin for transdermal delivery
WO2005021012A1 (ja) ゲムシタビン封入薬剤担体
RU2275899C2 (ru) Структурированная эмульсия амфотерицина b с низкой токсичностью для парентерального введения и способ ее получения
KR100795221B1 (ko) 암포테리신 β를 봉입하고 표면이 헤파린으로 수식된리포솜 및 그 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120305

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee