KR100803628B1 - 기존의 새송이 버섯에 비하여 에린맛이 감소된 새송이 버섯 변이체의 육종방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새송이 버섯의 변이체를 재배하는 방법에 있어서, 1) 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리하는 단계, 2) 상기 분리된 원형질체를 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)로 처리하는 단계, 및 3) 상기 NQO로 처리된 원형질체를 재분화하는 단계를 포함하는 새송이 버섯 변이체의 육종방법을 제공한다.

이를 통해 종래의 새송이 버섯과 그 형태 및 단백질 발현수준에 있어서 명백히 구분될 뿐 아니라 향이 좋으며 이와 동시에 에린맛이 저하된 고품질의 새송이 버섯을 육종할 수 있다.

새송이 버섯, 변이체, 변이원, 원형질체, NQO(4-Nitroquinolene Oxide)

Description

기존의 새송이 버섯에 비하여 에린맛이 감소된 새송이 버섯 변이체의 육종방법{BREEDING METHOD OF MUTANT OF KING OYSTER MUSHROOM}

도 1a 및 도 1b는 본 발명의 새송이 버섯 변이체의 육종방법을 전체적으로 나타낸 사진이다.

도 2는 새송이 버섯의 원형질체를 NQO로 처리한 결과를 나타내는 사진이다.

도 3a 및 도 3b는 본 발명의 새송이 버섯 변이체의 육종방법에 의해 생산된 새송이 버섯 변이체의 사진이다.

도 4는 본 발명의 새송이 버섯 변이체의 추출물 및 종래 새송이 버섯 추출물로 처리한 인간 간세포 HepG2의 이차원 전기영동 결과를 나타내는 사진이다.

도 5는 상기 도 4의 이차원 전기영동 결과를 확대한 사진이다.

본 발명은 새송이 버섯 변이체의 육종방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 새송이 버섯 균사의 원형질체을 특수한 조건에서 변이원으로 처리하여 형태, 영양, 향, 맛 및 기능성의 특성이 우수한 새송이 버섯의 변이체의 육종방법에 관한 것이 다.

새송이 버섯은 분류학적으로 진정담자균강, 동담자균아강(모균아강), 주름버섯목, 느타리과에 속하는 담자균버섯으로서 백색목재부후균의 일종이며, 자연상태에서 떡갈나무와 벚나무의 그루터기에서 자생하는 사물기생균으로서 당근류에 속하는 몇몇 식물의 조직에서도 생장이 가능한 조건기생균(반환물기생균) 또는 산형과, 분과, 부처꽃과 등 초본식물의 뿌리에 질병을 유발시키는 병원균으로 보고되어 있고, 현재에는 널리 인공적으로 병버섯 재배를 통해 식용으로 사용되어지고 있는 실정이다.

이와 같이, 인공으로 재배한 새송이 버섯은 자실체의 균사조직이 치밀하여 육질감이 뛰어나 맛이 탁월하고 자연산 송이와 식미가 거의 유사하며, 영양적인 측면에서도 비타민 C가 풍부하고 필수아미노산을 다양하게 함유하고 있어 미식가들이 선호하는 건강용 식품이다.

일반적으로, 새송이 버섯을 재배용기에서 재배하는 방법은 먼저 재배용기에 배지를 채우게 되는데, 이때 사용되는 배지는 포플러나 버드나무의 톱밥과 첨가제(미강과 밀기율) 그리고 물을 배합하여 수분 약 65%로 조절하여 조성하게 되며, 살균과 냉각작업을 거친 재배용기의 배지표면에 종균을 접종하여 균사를 배양 및 번식하는 작업을 실시하게 된다.

이때, 균사배양이 완료되면 버섯을 발생시키게 되는데, 이를 발이유기라고 하고, 균사생장기를 영양생장기라 하면 자실체생육기는 생식생장기로 볼 수 있으므 로 이러한 균사배양이라는 영양생장에서 자실체생육인 생식생장으로 전환하기 위해서는 반드시 물리적 자극(균긁기 및 물축이기)이나 환경적인 자극(발이유기)이 필요하게 된다. 여기서, 자실체생육기에서는 어린자실체에서 성숙자실체로 생식생장을 하게 되는데, 이 과정에서 어린 자실체 중 6 ~ 10개 정도만 성숙자실체로 생장하게 되고 나머지는 고사하게 된다.

그러나, 이러한 새송이 버섯은 상기한 많은 장점을 가지고 있는 반면, 보다 나은 개체의 균질도, 수량성의 향상, 병해충 발생대비 등의 해결수단이 아직까지 제시되지 못하고 있는 실정이며, 특히, 적정 배지조성 및 재배환경조건 등 세부재배기술에 대한 대안이 제시되지 못하여 문제였다. 나아가, 상기 새송이 버섯의 단점을 보완할 수 있는 새송이 버섯의 변이체에 대한 연구도 제대로 이루어지지 않았다.

국내의 새송이 버섯은 1995년 일본의 사이신 종균개발 연구소에서 ‘에린기’를 도입하여, 1997년부터 ‘새송이’라는 상품명으로 시판되고 있다. 그러나 등록된 품종의 수가 극히 적어 대부분의 재배농가는 일본, 대만, 중국 등에서 검증되지 않은 균주를 도입하여 사용하고 있는 실정이다. 게다가 연작피해, 품종의 퇴화 등으로 안정적인 생산에 어려움을 겪고 있으며, 다수성 위주의 품종 선택과 유사업체의 증가로 다양한 품종 개량이 어려운 실정이다. 나아가, 새송이 버섯의 가장 큰 단점인 에린맛을 줄이는 것에는 한계가 있었다. 따라서 차별화된 제품 경쟁력 제고가 절실하고, 점차 고급화되고 있는 국내 수요와 수출을 목표로 고품질 신기능성 품종 육성이 절실히 요구된다.

본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로 본 발명의 목적은 형태, 영양, 향, 맛 및 기능성이 우수한 새송이 버섯 변이체의 육종방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 새송이 버섯 변이체의 육종방법에 의해 재배된 새송이 버섯 변이체를 제공하는 것이다.

상술한 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 한 특징에 따른 새송이 버섯 변이체의 육종방법은 새송이 버섯의 변이체를 재배하는 방법에 있어서, 1) 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리하는 단계, 2) 상기 분리된 원형질체를 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)로 처리하는 단계, 및 3) 상기 NQO로 처리된 원형질체를 재분화하는 단계를 포함한다.

상기 1)단계는 바람직하게는, 상기 새송이 버섯 균사를 키티나제와 용해효소를 포함하는 세포벽용해액에 넣은 후, 상기 세포벽용해액을 멸균탈지면이 들어있는 50ml 주사기를 통해 여과하는 단계를 포함하며, 상기 키티나제와 용해효소는 바람직하게는 상기 세포벽용해액에 대하여 상기 키티나제와 용해효소는 7 ~ 8 중량%가 함유되고. 상기 멸균탈지면의 면적은 바람직하게는 3.5×3.5 ~ 4.5×4.5 cm²인 것을 사용할 수 있다.

바람직하게는 상기 NQO의 농도는 0.05 ~ 0.75㎍/㎖ 이며, 15 ~ 45 분 동안 처리하는 것이 좋다.

본 발명의 다른 특징은, 상기 새송이 버섯 변이체의 육종방법에 의해 재배된 새송이 버섯 변이체를 포함한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 일실시예에 따른 새송이 버섯 변이체의 육종방법은 새송이 버섯의 변이체를 재배하는 방법에 있어서, 1) 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리하는 단계, 2) 상기 분리된 원형질체를 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)로 처리하는 단계, 및 3) 상기 NQO로 처리된 원형질체를 재분화하는 단계를 포함한다.

종래의 새송이 버섯은, 개체의 균질도, 수량성의 향상, 병해충 발생대비 등의 해결수단이 아직까지 제시되지 못하였으며, 특히, 적정 배지조성 및 재배환경조건 등 세부재배기술에 대한 대안이 제시되지 못하였다. 나아가, 새송이 버섯의 가 장 큰 단점인 에린 맛을 제거하기 위한 기술의 개발도 미비하였다.

이에 본 발명에서는 새송이 버섯 균사의 원형질체을 특수한 조건에서 NQO를 처리하여 배지에 도말 후, 재분화된 균사를 격리배양하고, 활력이 좋은 상태가 되면 플라스크에서 배양하여 접종 한 후, 자실체를 생산하였다. 자실체에서 추출물을 얻어 HEPG2 cell (인간 간 세포)에 처리하여 단백질체 변화를 분석하여 효과를 보이는 새송이 버섯 변이체를 육종하며 그 구체적인 내용은 도 1a 및 도 1b를 참조하여 설명한다.

먼저, 제1)단계로서 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리한다.

본 발명의 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리하는 방법은 통상의 변이체를 재배하기 위한 버섯 균사의 원형질체를 분리방법을 사용할 수 있으며, 이하에서는 본 발명에 적합한 버섯 균사의 원형질체를 분리방법을 설명한다.

본 발명에서 사용하는 새송이 버섯 균사는 통상의 재배에 사용하는 새송이 버섯 균사를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는 액체배지에 접종하여 2주정도 배양한 새송이 버섯 균사체 (pleurotus eryngii) 500㎖를 분양받아 사용하였다.

구체적으로, 본 발명에서는 상기 새송이 버섯 균사를 1 ~ 4주 정도 액체 배양을 한 후, 이를 원심분리하여 침전물을 형성하고 상등액을 버린다. 그 뒤 유기용 매에 넣어 재현탁하여 균사를 세척한다. 상기 유기용매는 버섯균사를 재현탁하여 세척할 수 있는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 보다 바람직하게는 0.6M 정도의 만니톨을 사용할 수 있다.

상기 재현탁한 새송이 버섯 균사액을 다시 원심분리하여 펠렛을 얻은 후 상등액을 버린 뒤 세포벽용해액에 넣고 교반한다.

세포벽용해액을 처리하여 원형질체를 분리하는 이유는 변이원을 처리하여 균사를 유도 하였을 때 각기 다르게 변이가 유도되어 발생한 유전적으로 균일한 균사집단을 얻을 수 있기 때문이다. 본 실험에서는 균사로부터 분리한 원형질체에 변이원을 처리하여 다양한 변이체 클론을 확립할 수 있었다. 원형질체의 분리정도는 효소용액의 양에 따라 크게 좌우된다. 본 발명에서 세포벽용해액은 통상의 버섯 균사체의 세포벽을 용해하기 위한 것이면 어느 것이든 사용가능하나 바람직하게는 0.5 ~ 4% 용해효소, 0.01 ~ 0.1% 키티나제를 0.6M 마니톨에 첨가한 것을 사용한다. 이 때, 상기 키티나제와 용해효소(세포용해액)는 전체 원형질체 용액에 대하여 7 ~ 8 중량% 범위가 포함되는 것이 바람직하며 그 중에서 7.4중량%일 때의 재분화율이 가장 우수하였다.

상기 세포벽용해액으로 처리한 새송이 버섯 균사액을 탈지면이 들어있는 30㎖ 상당의 주사기에 넣은 후 원형질체를 여과하면 피스톤을 밀어 넣는 압력에 의해 원형질체는 빠져나오면서 장착된 탈지면에 세포벽 등의 용해된 불순물이 남게 되어 원형질체의 분리가 가능하다. 이 경우 상기 멸균탈지면의 면적은 4×4 ~ 5×5 cm²인 것이 가장 재분화 효율이 좋다.

상기 분리한 원형질체는 원심분리하여 상등액을 버리고 0.6M 만니톨로 1 ~ 3회 세척을 반복하여 원형질체를 획득한다.

다음으로 제2단계로서 상기 새송이 버섯의 원형질체에 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)로 처리하여 재분화를 유도한다.

본 발명에서 새송이 버섯의 변이원으로서 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)를 사용한다.

구체적으로, 상기 새송이 버섯의 원형질체에 유기용매에 첨가된 NQO로 처리 하여 상기 새송이 버섯을 변이시키는 것으로 상기 유기용매는 NQO를 첨가할 수 있는 것이면 종류의 제한이 없으나 바람직하게는 0.6M KCl을 사용할 수 있다.

한편 본 발명에서 바람직하게는 상기 NQO의 농도는 0.05 ~ 0.75㎍/㎖ 인 것을 사용한다. 만일 NQO의 농도가 0.05㎍/㎖ 미만이면 첨가의의가 미미하고, 0.75㎍/㎖을 초과하면 하기 표 3에서 나타난 바와 같이 재분화율이 오히려 떨어지게 된다.

또한 상기 NQO의 처리시간은 바람직하게는 15 ~ 45 분 동안 처리한다. 만일 15분 미만이면 처리효과가 제대로 나타나지 않으며 45분을 초과하면 하기 표 !!에 서 나타난 바와 같이 재분화율이 떨어지게 된다.

회수한 원형질체는 원심분리(600g,10min)하여 펠렛화 하면서 0.6M 만니톨에 재현탁을 3회 연속적으로 반복하여 세척하며 그 결과는 도 2에 나타난 바와 같다.

마지막으로 제3)단계로서 상기 NQO로 처리된 새송이 버섯의 원형질체를 재분화시킨다.

상기 재분화 방법은 통상의 새송이 버섯의 원형질체를 재분화할 수 있는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 도 1에 도시된 바와 같은 방법으로 상기 NQO로 처리된 새송이 버섯의 원형질체를 재분화하여 새송이 버섯 변이체의 자실체를 재배한다.

구체적으로, 상기 NQO로 처리된 새송이 버섯의 원형질체를 격리하여 대략 1 ~ 2달간 격리배양 후 대략 1달간 암실배양을 실시한다. 그 뒤 활력이 좋은 것을 플라 플라스크 등에서 정치배양 후 보름정도 현탁배양을 실시한다. 상기 현탁배양된 새송이 버섯의 변이체를 종균용배지에 접종한 후 대략 1 ~ 2달간 배양하고 그 뒤 균 긁기를 실시한 후 새송이 버섯 변이체의 자실체 유도하여 이를 재배한다.

본 발명의 육종방법을 통해 생산된 새송이 버섯 변이체는 대길이가 짧은 난쟁이 모양과 갓 모양 평평하거나 갈라진 모양이며, 자연산 새송이 버섯에 비해 향이 우수하면서도 에린맛이 덜한 특징을 갖는다(도 3a 및 3b참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

(1) 새송이 버섯 원형질체의 분리

새송이 버섯 균사를 접종 후 2주간 액체 배양하였다. 상기 액체배양된 새송이 버섯 균사를 50㎖ 튜브에서 원심분리(800g,10min)하여 배지로부터 침전물로 만든 다음 상등액을 버렸다. 그 뒤 상기 튜브에 0.6M 만니톨을 넣어 태핑(tapping)으로 재현탁화하여 균사를 세척한 다음, 다시 원심분리(800g,10min)하여 펠렛을 얻었다. 그 뒤 상등액을 버리고 세포벽용해액(4% 용해효소, 0.03% 키티나제를 0.6M 만니톨에 용해)을 넣어 준 후, 28℃에서 2시간 동안 3 rpm 속도로 천천히 교반하였다. 첨가된 세포벽용해액의 부피는 하기 표 1과 같다.

그 뒤, 상기 새포벽용해액으로 처리된 균사를 하기 표 2와 같은 면적의 탈지면이 들어있는 50ml 주사기를 통해 여과하여 원형질체를 분리하였다. 그 뒤, 상기 분리된 원형질체를 원심분리(600g,10min)로 펠렛화한 후 상등액을 버리고 0.6M 만니톨로 2회 세척을 반복하였다.

최종적으로 얻은 원형질체는 0.6M 만니톨에 재현탁한 후, 혈구측정기(Haemacytometer)에 상기 원형질체가 포함된 현탁액 10㎕를 넣은 후 원형질체 농도를 확인하였다.

	투입된 세포벽용해액의 부피(ml)	원형질체의 수/ml
비교예 1	0	0.1*105
비교예 2	3	5*105
실시예 1	3.7	9*105
비교예 3	7.5	6*105

상기 표 1에서 살펴본 바와 같이, 전체 원형질체 용액 50ml에 포함된 세포벽용해액의 부피가 3.7ml일 때 재배되는 원형질체의 수가 가장 많은 것을 확인할 수 있었다.

	탈지면의 면적(cm*cm)	재분화율
실시예 2	4*4	251(0.68%)
비교예 4	5*5	117(0.57%)

단, 표 2는 NQO를 처리하지 않았다.

상기 표 2에서 알 수 있듯이, 탈지면의 면적이 4*4인 경우 재분화율이 가장 높았다.

(2) NQO 처리

상기 분리된 새송이 버섯 원형질체(10㎖ 0.6M 만니톨 용액에 포함됨)에 5㎕의 NQO 변이유도액을 0.6M KCl에 포함시키고 하기 표 3과 같이 NQO변이유도액의 농도를 조절하여 첨가한 후, 실온에서 60rpm으로 현탁배양하여 시간대별로 샘플링하였다.

회수한 원형질체는 원심분리(600g,10min)하여 펠렛화 하면서 0.6M 만니톨에 재현탁을 3회 연속적으로 반복하여 세척하였다. 최종적으로 NQO를 제거한 원형질체는 PDA배지 위에 도말하였다.

	NQO 농도(㎍/㎖)	처리시간(분)	재분화율(%)
비교예 5	1	15	0.004
비교예 6		30	0.002
비교예 7		46	0
비교예 8		60	0
실시예 3	0.5	15	0.281
실시예 4		30	0.145
실시예 5		45	0.047
비교예 9		60	0.023
실시예 6	0.05	15	0.398
실시예 7		30	0.173
실시예 8		45	0.011
비교예 10		60	0.006

상기 표 3에서 알 수 있듯이, 상기 NQO를 새송이 버섯의 변이체를 재배하기 위한 변이원으로 사용하는 경우, 농도는 0.05 ~ 0.75㎍/㎖, 처리시간은 15 ~ 45 분 인 것이 재분화율이 월등히 향상되었다.

<실험예>

새송이 버섯에 돌연변이원을 처리하여 생산된 변이 자실체는 시판되고 있는 것과는 달리 여러 다양한 생리활성 물질들을 함유하고 있을 것으로 기대하고 있다. 이를 확인하기 위하여 인간 간세포인 HepG2에 변이 자실체 추출물을 처리하여 이차원전기영동을 통해 전체 단백질 패턴의 변화를 비교하여 차이를 확인할 수 있는 지표(Marker)를 찾아내려고 한다.

1) 단백질 추출 및 정량

대조구로서 통상의 새송이 버섯 자실체(허니머쉬(주)에서 입수)와 상기 실시예 4의 자실체의 추출물(5×104 cell/㎖)을 인간 간세포인 HepG2 세포에 농도를 10㎎, 5㎎으로 48시간 처리하여 샘플을 얻었다. 단백질 추출방법은 각각의 윌(well)에 PBS를 이용하여 셀을 회수하여 원심분리 (5000rpm, 10min, 4℃)후, 2번 반복하여 셀을 회수한 후, 원심분리 (11000rpm, 5min, 4℃)한다. PBS 100㎕에 펠렛을 녹인 후, TCA 10㎕ 넣어주고 태핑한 후, 4℃에서 30min 침전시킨다. 침전 후 원심분리 (13000rpm, 10min, 4℃)하여 아세톤 70㎕넣고 교반하여 충분히 섞어준 후, -20℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 원심분리 (13000rpm, 10min, 4℃)후, 펠렛을 말려 용해 완충액(lysis buffer)에 녹인 후, 원심분리 (12000rpm, 10min, 4℃)하여 상등액만을 얻었다.

준비된 샘플은 단백질 정량키트 Ⅰ(Protein assay kitⅠ, Bio-rad)을 이용하여 정량하였다. 다이 리에이전트 컨센트레이트(Dye Reagent Concentrate)와 dd H₂O를 1:4 비율로 혼합하여 희석용액을 만들었다. 각각의 표준용액 100㎕와 희석용액 900㎕를 잘 혼합하여 상온에서 30-60분 둔 후 흡광기(spectrophotometer)를 이용, 595nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선 이용하여 정량하였다.

2) 이차원 전기영동(Two-dimensional Electrophoresis)

먼저 등전점 전기영동(Isoelectric focusing)을 하기 위해 단백질 샘플을 리하이드레이션 완충용액(Rehydration buffer)에 혼합하여 전체가 450㎕로 만든 후 트랙킹 다이(tracking dye)로서 0.001% 브로모페놀 블루(Brophenol Blue)를 첨가였다. 준비된 샘플은 리하이드레이션 트레이(Rehydration tray)의 웰(well)에 조심히 옮겨 담고 그 위에 IPG 스트립 (pH4-7, 24㎝)을 올려놓고 골고루 스며들도록 하였고 증발을 막기 위해 1800㎕의 Dry Strip Cover Fluid로 그 위를 덮었다. IPGphore (Amersham사)에서 상기 등전점 전기영동이 끝난 스트립은 SDS-PAGE 전에 2단계에 걸쳐 평형화하였다. 상기 스트립들은 평형 완충용액 1(Equilibration buffer 1)에서 15분간, 평형 완충용액 2(Equilibration buffer 2)에서 15분간 침지하여 교반기를 통해 천천히 흔들면서 평형화 하였다. SDS-PAGE를 하기 위해 평형화가 끝난 스트립들은 13%의 아크릴아미드 겔 위에 올려놓고 1% 저융점 아가로즈를 넣어 고정한 후 전기영동을 완료하였다. 그 뒤 각 겔들은 각각 실버-니트레이트(Silver-nitrate)를 이용하여 염색하여 분리된 단백질들을 가시화하였다.

염색이 끝난 겔은 스캔하여 이미지를 얻어내었다. 얻어진 이미지들 간의 차등발현 단백질들의 양적, 질적, 분석을 MelanieⅢ를 이용하여 수행하였다. 단백질들의 pI는 IEF에 이용된 IPG 스트립의 pH와 MelanieⅢ를 이용하여 계산하였으며, 정확한 분자량을 계산하기 위해서는 Low molecular weight protein standard를 같이 전기영동 하여 이를 통해 얻어진 분자량은 MelanieⅢ 상에서 단백질의 분자량을 계산하는데 지표로 이용하였다.

도 4는 본 발명의 새송이 버섯 변이체의 추출물 및 종래 새송이 버섯 추출물로 처리한 인간 간세포 HepG2의 이차원 전기영동 결과를 나타내는 사진이고 도 5는 상기 도 4의 이차원 전기영동 결과를 확대한 사진이다. 대조구와 실시예 4의 추출물에 대한 결과를 살펴보면 상기 실시예 4의 추출물로 처리한 인간 간세포 HepG2의 2차원 전기영동 결과는 1, 4, 6번 지점에서 대조군에 비해 3 ~ 6배 감소하였고 2, 5번 지점에서 2 ~ 6배 증가하였다. 그리고 3, 7번 지점에서는 발현하지 않았다. 이를 통해 본 발명의 새송이 버섯 변이체는 유전적으로 통상의 새송이 버섯과 단백질 발현 수준에서 차이가 나는 것을 확인할 수 있었다.

상술한 구성과 같이 본 발명은 NQO를 변이원으로 사용하여 새송이 버섯의 변이체를 육종하는 방법을 제공하며 이를 통해 종래의 새송이 버섯과 그 형태 및 단백질 발현수준에 있어서 명백히 구분될 뿐 아니라 향이 좋으며 이와 동시에 에린맛이 저하된 고품질의 새송이 버섯을 육종할 수 있다.

Claims (5)

1. 새송이 버섯의 변이체를 재배하는 방법에 있어서,

   1) 새송이 버섯 균사를 키티나제와 용해효소를 포함하는 세포벽용해액에 넣은 후, 상기 세포벽용해액을 멸균탈지면이 들어있는 50ml 주사기를 통해 여과하여 상기 새송이 버섯 균사의 원형질체를 분리하는 단계;

   2) 상기 분리된 원형질체를 변이원으로서 NQO(4-Nitroquinolene Oxide)로 처리하는 단계; 및

   3) 상기 NQO로 처리된 원형질체를 재분화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 기존의 새송이 버섯에 비하여 에린맛이 감소된 새송이 버섯 변이체의 육종방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,

   상기 멸균탈지면의 면적은 3.5×3.5 ~ 4.5×4.5 cm²인 것을 특징으로 하는 기존의 새송이 버섯에 비하여 에린맛이 감소된 새송이 버섯 변이체의 육종방법.
4. 제1항에 있어서,

   상기 NQO의 농도는 0.05 ~ 0.75㎍/㎖ 이며, 15 ~ 45 분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 기존의 새송이 버섯에 비하여 에린맛이 감소된 새송이 버섯 변이체의 육종방법.
5. 삭제

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