KR100801550B1 - 누에 수번데기로부터 아데노신 유도체 화합물을 정제하는방법 및 아데노신 유도체 화합물을 포함하는 발기부전치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 누에 수번데기로부터 아데노신 유도체 화합물을 추출, 정제하는 방법 및 추출된 아데노신 유도체 화합물을 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 누에 수번데기를 유기용매로 분획하여 농축추출한 후 다시 음이온교환 젤여과 크로마토그래피, 선택적으로 탈염과정 및 선택적으로 역상 HPLC를 수행함으로써 누에 수번데기로부터 아데노신 유도체 화합물을 추출정제하는 방법 및 이를 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이다.

누에 수번데기, 아데노신 유도체 화합물, 발기부전

Description

누에 수번데기로부터 아데노신 유도체 화합물을 정제하는 방법 및 아데노신 유도체 화합물을 포함하는 발기부전 치료용 조성물{A process for purifying adenosine derivatives derived from silkworm and a composition for treating vasculogenic impotence comprising the adenosine derivatives}

도1은 마우스 뇌 내피세포(bEND3)에서의 NO 산생에 대한 누에 수번데기 상족 시기별 알코올 추출물의 효과를 나타내는 그래프이며, 여기서 SNP는 양성 대조군으로서 사용된 소듐 니트로푸르사이드를 의미한다.

도2는 마우스 뇌 내피세포(bEND3)에서의 세포성장율에 대한 누에 수번데기 상족 시기별 알코올 추출물의 효과를 나타내는 그래프이며, 여기서 SNP는 양성 대조군으로서 사용된 소듐 니트로푸르사이드를 의미한다.

도3은 마크로파지(RAW264.7) 세포에서의 세포성장율에 대한 누에 수번데기 상족 시기별 알코올 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다.

도4는 마크로파지(RAW264.7) 세포에서의 NO 산생에 대한 누에수번데기상족 시기별 알코올 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다.

도5는 마크로파지(RAW264.7) 세포에서 누에(수)번데기상족 시기별 알코올 추 출물에 따른 분비형 포스포리파제A₂의 활성을 나타낸 그래프이다.

도6a 및 도6b는 각각 누에 수번데기 상족 시기별 알코올 추출물을 마우스에 3일간 투여했을 경우의 cGMP 및 이의 ED₅₀ (cGMP 50% 유효농도)를 나타낸 그래프이다.

도7은 비장세포에서 누에 수번데기 상족 시기별 알코올 추출물의 mTNF-α 산생을 나타내는 그래프이다.

도8은 누에 수번데기에 대한 유기분획의 모식도이다.

도9는 각 유기분획에 대한 소혈관 내피세포(CPAE)에서의 NO 산생량을 나타낸 그래프이다.

도10은 누에 수번데기에 대한 용매별 추출물(400mg)을 가지고 음이온교환젤여과크로마토그래피를 실시한 분획에 대한 DPPH 활성을 나타낸 그래프이다.

도11은 누에 수번데기의 용매별 추출물(2g)을 가지고 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 수행한 분획에 대한 소혈관 내피세포에서의 NO 활성을 나타낸 그래프이다.

도12는 누에 수번데기의 용매별 추출물에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피 및 탈염과정(Biogel P10)을 거친 분획에 대한 소혈관 내피세포에서의 NO 활성을 나타낸 그래프이다. x 좌표는 각 분획의 번호를 의미한다.

도13은 누에 수번데기의 용매별 추출물에 대하여 음이온 젤여과 크로마토그래피 및 탈염과정을 거친 분획에 대한 소혈관 내피세포에서의 세포독성을 조사한 결과를 나타낸 그래프이다. x 좌표는 각 분획의 번호를 의미한다.

도14는 역상 고성능액체크로마토그래피(RP-HPLC, RPC라고도 함)를 거친 분획에 대한 피크를 나타낸 그래프이며, II, III, IV 피크는 각각 RPC-II분획, RPC-III분획, RPC-IV분획을 나타낸다.

도15a 및 도15b는 각각 RPC-II분획의 MALDI-TOF MS 스펙트럼, RPC-IV분획의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다.

도16a 및 도16b는 각각 RPC-II분획의 적외선 흡광분석 스펙트럼, RPC-IV분획의 적외선 흡광분석 스펙트럼을 나타낸다.

도17a, 도17b, 도17c는 각각 RPC-II분획의 자외선 흡광분석, RPC-IV분획의 자외선 흡광분석, RPC-VI(18분 분획)의 자외선 흡광분석 스펙트럼을 나타낸다.

도18a, 도18b, 도18c는 각각 RPC-II분획의 ¹H-NMR 스펙트럼, RPC-II분획의 ¹³C-NMR 스펙트럼, RPC-II분획의 이차원 수소-수소 결합-고해상도핵자기공명분광분석(¹H-¹H COSY NMR) 스펙트럼을 나타낸다.

도19a, 도19b, 도19c는 각각 RPC-IV분획의 ¹H-NMR, RPC-IV분획의 ¹³C-NMR, RPC-IV의 ¹H-¹H COSY NMR을 나타낸다.

도20a 및 도20b는 x축의 범위를 달리하여 측정한 RPC-II분획의 전기이온 분자량 흡광분석(EI Mass)이며, 도20c 및 도20d는 RPC-IV분획에 대한 전기이온 분자량 흡광분석(EI Mass) 스펙트럼이다.

도21은 음이온교환 젤여과 크로마토그래피 정제분획(DX분획)과 역상 HPLC 정제분획(RPC 분획, 14.5~16분)의 농도변화에 따른 PDE [³H] cAMP SPA 분석 데이터를 나타낸다.

도22는 음이온교환 젤여과 크로마토그래피 정제분획(DX분획)과 기존의 상용화된 PDE 저해제(I, V, IV, III)을 병용투여할 경우에 PDE 타입 IV의 저해활성과 PDE 타입 V에 대한 저해활성을 나타낸 그래프이다.

도23은 음이온 젤여과 크로마토그래피 및 탈염과정을 거친 분획을 0.1 N HCl로 가수분해한 후 HPLC-ECD 검출기로 부가당 체류시간을 확인한 HPLC 그림이다.

본 발명은 누에 수번데기로부터 아데노신 유도체 화합물을 추출, 정제하는 방법 및 추출된 아데노신 유도체 화합물을 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이다.

발기부전의 원인은 크게 심인성(정신적 원인)과 기질성(신체적 원인)으로 구분 할 수 있다. 기질적인 원인으로는 신경계, 혈관계 또는 내분비계통의 이상을 포함하며 구체적으로 중추신경질환 또는 말초신경질환 등이 있으며, 발기부전을 일으키는 대표적인 질환으로는 당뇨병, 고혈압, 신장질환 등이 있다. 이러한 발기 부전을 치료하는 방법으로 종래에 심리적 요법, 비수술적 방법, 수술적 방법이 있으며, 비수술적 치료에는 약물복용, 음경해면체 내에 발기유발제 투입법, 진공 음경흡입기 등이 소개되어 왔다.

음경발기에 관여하는 신경전달 물질로는 아세틸콜린, ATP, VIP, NO(산화질소) 등이 알려져 있으며, 이중 NO가 발기기전에서 가장 중요한 물질임이 알려져 있다(Palmer 등, 1987). 음경발기 기전에 작용하는 NO는 혈관계 NO 합성효소(endothelial NOS; eNOS)와 신경계 NO 합성효소(neuronal NOS; nNOS)이 2가지 다른 NO 합성효소에 의해서 생성되며, 이들 두 가지 효소가 동시에 작용할 때 발기가 유발되는 것으로 알려져 있으며, 따라서 노화가 진행되면서 나타나는 NO 생성의 감소는 발기부전의 주요 원인으로 나타나게 된다.

음경의 발기와 수축 메커니즘으로는 성적흥분을 일으키는 심리적, 육체적 자극을 받게 되면 NO가 혈관을 확장시켜서 평소보다 5-6배 많은 다량의 혈액이 음경해면체로 흘러 들어오게 되어 좌우 두개의 음경해면체가 확장된다. 이때 팽창한 해면체가 혈관을 압박해 피가 정맥을 통해 다시 흘러나가는 것을 막아주면 음경이 단단해지고 커진 상태를 유지하게 된다. 음경의 발기는 사정이 끝나거나 성적인 자극이 중단되면 닫혀있던 정맥이 열려 혈액이 빠져나감으로써 포스포디에스터라제-V(phosphodiesterase-V, PDE-V)의 작용으로 이완상태로 돌아가게 된다. 발기는 발기에 관여하는 내분비계, 혈관계, 신경계가 모두 제대로 작용하고 음경자체에 이상이 없을 때 정상적으로 이루어진다.

현재 전세계적으로 가장 효과가 있는 발기부전 치료제는 NO-cGMP 경로에서 cGMP 농도를 높이기 위하여 cGMP 가수분해효소인 PDE-V의 활성을 억제하는 기전을 사용하는 비아그라로서, 그 외에도 동일한 경로를 차단하는 자프리나스트(zaprinast) 물질은 비아그라보다 다소 낮은 정도로 발기를 유도한다고 알려져 있다(Trigo-Rocha F, et al., Am J Physiol 264, H419-422, 1993; Taher A, et al., World J Urol 12, 289-291, 1994). 비아그라는 지난 5 년간 입증된 효능과 안전성을 평가받고 있고, 릴리의 시알리스는 최대 36시간의 약효지속을 인정받고 있으며, 바이엘과 GSK의 레비트라는 각종 임상시험과 긍정적 평가를 각각 자기 회사 제품을 우호적으로 평가받고 있다.

그러나 탁월한 발기부전 효과를 가지는 비아그라는 심장병 환자에게는 혈압이 떨어져 심장마비로 사망에 이르게 할 가능성이 있어 심근경색, 뇌졸증, 심혈관계질환 환자에게는 심각한 부작용이 발생할 수 있다는 문제점이 알려져 있고, 또한 레비트라는 발기지속시간을 당을 붙여 최대 36시간까지 확장시켜 놓았지만 이 또한 자연 산물보다는 많은 예기치 못한 부작용이 보고되고 있다.

또한 2005년 7월14일 약사공론에 의하면 미국FDA지 2005년 7월 8일자로 발기부전 치료제 비아그라, 시알리스와 레비트라에 대해서 그 포장지에 시력을 상실케 할 수 있다는 경고문을 부착하도록 지시한 바 있어, 이러한 부작용이 없는 천연물 유래 발기부전 개선제의 개발이 절실한 실정이다.

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명은 남성 성기능 장애에 대하 여 탁월한 치료효과가 있을 뿐 아니라 종래 약제들의 부작용을 최소화할 수 있는 활성물질을 천연 추출물에서 추출, 정제하는 방법 및 이 활성물질을 포함하는 발기부전 치료용 약학 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 일 측면은 누에 번데기로부터 상기 화학식1 및 화학식2의 화합물을 추출, 정제하는 방법에 관한 것이며, 구체적으로

(a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하고, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하고, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하고, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

(b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 NO 생성량 측정을 위한 자외선 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계,

(c) 선택적으로 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 NO 생성량 측정을 위한 자외선 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계, 및

(d) 선택적으로 상기 활성분획a 또는 활성분획b에 대해서 역상 HPLC를 수행 하여 NO 생성량을 위한 자외선 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계

를 포함하는 누에 번데기로부터 상기 화학식1 또는 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 용매화물을 추출하는 방법에 관한 것이다.

상기 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물은 비대칭 탄소를 포함하고 있어 광학 이성질체가 존재하며, 본 발명에 의한 화합물은 이러한 각각의 광학 이성질체 및 이러한 광학 이성질체의 라세믹 혼합물을 모두 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 상기 화학식2의 화합물에 수화물인 ·OH₂가 부가되거나 상기 화학식1의 화합물에 ·O가 부가되어 형성되는 아래 화학식3의 수화물도 포함한다.

·OH₂

본 발명에 있어서 활성물질은 산화와 관련된 반응성이 강하여 매우 불안정한 형태를 띠게 되며, 이러한 이유로 분리, 정제 및 구조 동정이 매우 어려웠으나, 본 발명자가 수많은 시행착오와 일련의 연구를 통해서 개발한 상기 추출방법에 의해서 활성물질을 추출, 분리할 수 있다.

디메틸아데노신 유도체는 리보스(5탄당)와 핵산을 함유한 산성 화합물로서 수용성 완충용액에서 음이온 교환수지에 결합된 후 염분의 농도구배에 따라 분리가능하므로 상기 (b) 음이온 교환 젤여과 크로마토그래피는 활성물질을 추출하는데 중요한 단계이며, 양이온 교환 젤여과 크로마토그래피 및 양이온 교환 크로마토그래피 등은 디메틸아데노신 유도체인 핵산인 산성화합물과 레진이 결합하지 않아 분리정제가 되지 않기 때문에 큰 효과를 볼 수 없다.

또한, 상기에서 (c) 탈염과정 및 (d) 역상 HPLC 과정은 생략하여도 발기부전 치료의 효과를 가지는 누에 수번데기 유래 활성물질을 포함하는 천연 추출물로서의 생약제제로 충분히 사용할 수 있다. 다만, 순수한 디메틸 아데노신 유도체 화합물을 얻고자 하는 등 단일 물질의 순수 약리효과를 얻고자 하는 목적으로 하는 경우에는 상기 (c) 및 (d)의 과정을 수행하는 것이 바람직하다.

또한, NO 산생량은 일반적인 자외선 분광법에 의해서 측정되며, Griess 시약을 사용하는 것이 바람직하다. 0.9 이상의 상기 흡광도는 약 25 μM (또는 mg/mL) 이상의 NO 산생량에 해당한다.

한편, 본 발명에서 누에 번데기로서 누에 수번데기를 사용하는 것이 바람직하며, 본 발명에서 사용된 '상족(上簇)'이란 누에를 누에섶에 올리는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 측면은 상기의 방법으로 누에 번데기로부터 추출된 화학식1 또는 화학식2를 포함하는 추출물을 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이며, 구체적으로 약학적 조성물 혹은 식품 조성물로 사용될 수 있다.

이러한 추출물을 순수한 화학식 1 또는 화학식2의 화합물로 분리, 정제하여 사용하는 대신 생리 활성을 지니고 있는 중간 추출물을 바로 사용할 수 있어, 분리 또는 정제에 따른 공정을 피할 수 있는 장점이 있다.

뿐만 아니라, 상기에서 (a) 유기분획 단계 및 (b) 음이온 젤여과 크로마토그래피 단계만을 수행하고 각 단계에서 NO 산생량 및 세포 생존율을 확인하는 비교적 간단한 공정만으로 생리활성을 지닌 분획을 선발할 수 있어 공정의 단순화에도 크 게 기여할 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 측면은 누에 번데기로부터 추출, 정제된 아데노신 유도체 화합물을 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이며, 구체적으로 화학식1 또는 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체, 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 이의 용매화물을 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물에 관한 것이며, 구체적으로 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 cGMP 가수분해효소인 PDE-V의 활성을 선택적으로 저해함으로써 cGMP의 농도를 높여 발기부전의 효과를 나타내게 되며, 종래의 기존 PDE 저해제와 병용하는 경우에도 별도의 부작용없이 발기부전 치료의 상승적 혹은 적어도 상가적 효과를 보일 수 있어, 기존의 PDE 저해제와 병용해서 투여하거나 제형화할 수 있는 장점이 있다.

본 화합물은 임상투여시 경구 또는 비경구가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있다. 이 때 제제화 단계에서 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 투약단위의 제형을 포함한다. 제형은 개별투약형태, 즉, 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별투약량의 분율(예:1/2, 1/3. 1/4.) 또는 배수(예: 2, 3, 4배)에 해당한다. 본 발명의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하나, 성인 일일 투여량은 10-100 mg/kg의 양을 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 약학적 조성물은 비독성이고 비활성인 약학적 부형물을 포함할 수 있는데, 비독성이고 불활성인 제약상 적합한 부형제는 고상, 준고상 또는 액상희석제, 충전제 및 모든 유형의 제형보조물이다. 바람직한 제형으로는 정제, 피복정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 액제, 현탁액제 및 에멀전제, 페이스트제(pastes), 연고제, 겔제, 크림제, 로션제, 산제 및 분무제 등이 포함된다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 통상의 부형제, 예를 들면(a) 충진제 및 중량제(예: 전분, 락토스, 슈크로스, 글루코오스, 만니톨과 규산) (b) 결합제(예: 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐피롤리돈) (c) 흡습제(예: 글리세롤), (d) 붕해제(예: 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨), (e) 용해지연제(예: 파라핀) (f) 흡수촉진제(예: 4급 암모늄 화합물), (g) 습윤제(예: 세틸알코올 및 글리세롤모노스테아레이트), (h)흡착제(예:고령토 및 벤토나이트), 및, (i) 윤활제(예: 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 마그네슘 스타레이트 탈크 및 고체 폴리에틸렌글리콜), 또는 상기 (a) 내지 (i)에서 기재한 물질의 혼합물 이외에 유효 화합물 또는 화합물들을 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제, 환제 및 과립제는 피막을 입힐 수 있으며, 장관특정부위에 유효화합물만 방출시키도록 할 수 있으며, 필요한 경우 polymer 또는 붕매제 조성물을 사용 서방형으로 제제화할 수도 있다고 미세 캡슐화할 수도 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 주사제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제 등이 포함된다. 좌제는 유제합물 이외에 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를들면 폴리에틸렌 글리콜, 카카오지방 등의 지방, 고급에스테르(예: C₁₆-지방산을 갖는 C₁₄-알코올), 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 라우린지 및 글리세롤젤라틴 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

연고제, 페이스트제, 크림제 및 겔제는 유효화합물 이외 통상의 부형제, 락토오스, 활석, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분제, 또는 이들 물질들의 혼합물을 함유할 수 있다. 분무제로는 통상의 포사제, 예를 들면 클로로풀루오로히드로카본을 더 함유할 수 있으며, PEG-4000과 글리세린을 함유하는 비강분무제로도 제제화할 수 있다.

액제 및 에멀젼제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 물, 에틸알코올, 이소프로필 알코올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 디메틸포롬아미드 오일, 특히 면실유, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨우, 글리세롤, 글리세롤 포름알코올, 테티라히드로푸로푸릴 알코올, 포리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 또는 이들 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 비경구 투여용 액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장성인 멸균형태로 제제할 수 있다.

현탁제는 유효 화합물 이외에 통상의 부형제, 예를 들면 액상희석제(예: 물, 에틸알코올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜) 및 현탁제(예: 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르), 미세결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸트, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 또는 이들 물질의 혼합물을 함유할 수 있다.

상기 제형들은 또한 발색제, 방부제 및 냄새나 맛을 개선시키는 첨가제, 예를 들면 박하유 및 유칼리유 및 감미제(예: 사카린)를 함유할 수 있으며, 본 발명에 의한 화합물 이외에 다른 제약상의 유효한 화합물을 함유할 수 있다.

상기 제형은 공지된 방법, 예를 들면 유효 화합물을 부형제와 혼합하는 통상의 방식으로 제조된다. 치료학적 유효 화합물은 상기 제약제형에 있어서 전체 혼합물의 약 0.1-99.5 중량%, 바람직하기로는 0.5-95 중량%의 양으로 함유되어야 하며, 이 양에 상당하는 화합물이 포함되어 있는 추출물이 직접 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수도 있으며, 이러한 유효량은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 결정할 수 있음은 자명하다.

뿐만 아니라, 더 나아가서 당해 분야의 적정한 방법 또는 Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA) 등에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 식품 조성물에는 본 발명에 따른 추출물 또는 화합물 이외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 이러한 식 품 조성물의 바람직한 제제예로는 분말, 과립, 환제, 고형, 편상, 캡슐, 정제 및 탕액, 음료 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 전체 식품을 기준으로 0.01-50 중량%가 바람직하며, 이에 포함되는 화합물의 양에 상당하는 양으로 화학식1 또는 화학식2의 화합물 또는 이의 염, 용매화물을 직접 첨가할 수도 있다.

본 발명의 건강 기능 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

기타의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그다지 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0-20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

실시예

하기의 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 이해하기 위하여 제공되는 것이며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 누에 수번데기 알코올 추출물의 내피세포 또는 혈액 중의 강정(强精)효과 및 기타의 활성 확인

가. NO 생성량, 세포독성유무, 분비형 포스포리파제 A ₂ (s-PLA2) 활성조사

상족 후 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15일 되는 누에 수번데기를 80% 에탄올을 이용하여 추출하고, 에탄올을 증발시켜 농도별(1 mg/mL 또는 3 mg/mL)로 시료를 조제하고 나서, 이를 내피세포(mouse brain endothelial cell; bEND3) 및 마크로파지 세포(RAW 264.7 cells)에 투여하고 CO₂ 배양기에서 12, 24, 48시간 동안 배양하였다.

NO 생성량 조사는 일반적인 NO 측정 발색법인 Nims 등(Nims, et al., Nims, R. W., Darbyshire, J. F., Saavedra, J.E., 1995. Colorimetric methods for the determination of nitric oxide concemtration in neutral aqueous solutions, Methods 7, 48-54. 1995)의 방법에 따라서 Griess 시약을 사용하여 실험하였다.

Roche 사의 XTT 검색법(Geldof, A. A., Mastbergen, S. C., Henrar, R. E. and Faircloth, G. T., Cytotoxicity and neurocytotoxicity of new marine anticancer agents evaluated using in vitro assays. Cancer Chemother. Pharmacol., 44, 312-318, 1999)으로 검사하였다.

또한, s-PLA₂ 활성은 Cayman kit를 사용하여 Reynolds 등의 방법(Reynolds, L.J., Hughes, L.L., and Dennis, E. A. Analysis of human synovial fluid phospholipase A₂ on short chain phosphatidylcholine-mixed micelles: development of a spectrophotometric assay suitable for a microtiterplate reader, Anal. Biochem. 204, 190-197, 1992)에 따라 조사하였다.

그 결과 우선 도1에 나타낸 바와 같이, 내피세포(bEND3)에서 상족 후 11일이 된 번데기에서 NO 생성량이 가장 높았다. 또한 도2에서 확인되는 바와 같이, 내피세포(bEND3)에서 시기 별 번데기, 누에, 수나방의 세포 생존율을 MTT assay로 조사한 결과 상족 후 11일에서 15일까지에서 세포독성이 없으며, 특히 15일에서 매우 높은 세포생장율을 확인할 수 있었다.

또한, 마크로파지 세포(RAW 264.7 cells)에서의 NO 생성량, 세포 생존율, s- PLA₂ 조사 결과를 도3 내지 도5 및 아래의 표1에 나타내었는데, 번데기 시기가 나방 쪽으로 갈수록 NO 생성량 증가하여 상족 후 14, 15일에 NO를 최대 생성하였으며, 마크로파지의 생존율이 수번데기 모든 시기에 걸쳐 증가하여 세포성장이 증가함을 알 수 있었고, 분비형 포스포리파제 A₂를 양성대조군인 벌독에 비하여 상당히 저조하게 분비하는 것을 보아 염증반응과 무관하다는 것을 확인할 수 있었다.

처리후 시간	12 시간		24 시간		48 시간
농도	1 mg/mL	3 mg/mL	1 mg/mL	3 mg/mL	3 mg/mL
대조군(vehicle)	1.77±0.09		1.15±0.09		12.24±0.24
SNP	8.71±0.06		12.84±0.26		63.56±1.39
상족 후 8일		6.29±0.06		5.18±0.24	8.98±0.28
상족 후 9일		5.44±0.10		5.70±0.25	4.74±0.16
상족 후 10일	4.55±0.04	12.01±0.21	3.98±0.06	18.50±0.54	15.93±0.41
상족 후 11일	3.53±0.04	6.75±0.10	4.10±0.12	6.45±0.23	32.66±0.33
상족 후 12일	3.78±0.10	8.34±0.15	2.03±0.07	9.41±0.43	9.30±0.16
상족 후 14일		8.92±0.26		9.69±0.42	8.16±0.29
상족 후 15일		8.75±0.04		7.57±0.27	7.13±0.17
누에	3.87±0.06	9.05±0.07	2.27±0.09	8.25±0.19	10.39±0.21
수나방		5.18±0.15		4.86±0.07	6.21±0.16

*SNP는 100 μM사용, NO 생성량 (x100 μM)

나. Cyclic GMP 측정

ICR 40±1 g 웅성마우스를 10 일간 적응시킨 후에 상족 후 시기별 수번데기 알코올 추출물 80 mg/kg을 3일 복강투여하고 나서, 마우스의 안와정맥에서 채혈하여 혈청을 분리하고 이를 질소로 치환, 아세틸화하여 cyclic GMP는 Pradelles 등(Pradelles, P. and Grassi, J. Enzyme Immunoassays of Adenosine cyclic 3',5'-monophosphate using acethylcholineesterase. Anal. Chem., 61, 447, 1989)의 방법으로 Cayman kit를 이용하여 분석하였다.

그 결과를 도6에 나타내었으며, 누에 수번데기 상족 후 15일째까지 단위 단백질당 cyclic GMP의 양은 비교적 증가된 고른 값을 보이는 것을 확인하였으며(도6a) Cyclic GMP의 50% 유효농도를 산출하였다(도6b).

다. 쥐 비장세포에서의 mTNF -α 활성조사

BALB/c, 6주령 자성 쥐에서 분리한 비장세포현탁액 200 uL 당 누에수번데기 상족시기별 에탄올 추출물(8mg/20ul)을 96well에 투여하여 16시간 5% CO2 배양기에 배양 후 mTNF-α의 활성(Vilcek J. and T. H. Lee을 , J. biol. Chem. 266, 7313, 1991)을 R&D kit로 조사한 결과를 도7에 나타내었다.

여기서 대조로 상품인 마우스 암괴사인자(mTNF-α)를 사용하여 분석한 결과 면역세포인 비장세포가 활성화되어서 분비되는 사이토카인의 일종인 암괴사인자가 상족시기 15일째 누에수번데기의 추출물의 약간 증가를 보일 뿐 사용농도에서는 미약한 세포면역활성증가를 보여, 심각한 세포면역 작용에 따른 부작용의 문제는 없음을 확인하였다.

실시예 2: 수번데기 강정물질 분리 동정

가. 강정분획의 수득 및 이의 생리활성 조사

유기-분획(organic fractionation)을 이용하여 상대적으로 세포독성이 적으면서 음경의 혈관내피세포의 확장을 일으켜 성기능을 개선하여 발기부전의 치료효능을 가질 수 있는 강정분획을 수득하였으며, 그 구체적인 방법은 아래와 같다.

도8의 누에 수번데기 분획추출 모식도에 기재한 바와 같이, 천연물화학 용매에 의한 추출법에 따라서 누에 수번데기 1kg을 마쇄하여 에탄올 80%에 침출한 후 감압농축한 후에, 차례로 헥산 수용액(헥산:물 부피비=50:1), 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 수용액(부탄올:물 부피비=50:1) 순으로 분획하였으며, 나오는 각 분획을 농축하였다.

얻어진 각각의 분획에 대해서 NO 생성량을 조사하였는데, 구체적으로 소혈관 내피세포(CPAE cell line)를 배양하여 100 μL를 96 웰(well)에 넣고 각 분획 건조물을 10 배수로 희석(10 mg/mL, 20 μL)하여 하루 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후에 총 질산양을 색으로 정량하는 Nims 등의 방법에 의해 NO 생성량을 측정하였다.

그 결과를 도9에 나타내었으며, 물(수용성) 분획에서 총(아)질산의 양이 156.87 μM로 가장 많음을 확인하였다. 도9에서 1그룹은 대조로 시료를 녹인 물, 2그룹은 클로로포름 추출물, 3그룹은 모식도에서 맨 아래에 있는 수용성 물분획, 4그룹은 부탄올추출물, 5그룹은 헥산 제1추출물, 6그룹은 헥산잔사, 7그룹은 에틸아세테이트 추출물 10mg/mL, 8그룹은 에틸아세테이트 추출물 50 mg/mL, 9그룹은 클로로포름 중간 유화층 추출물, 10그룹은 헥산 중간유화층 추출물, 11그룹은 포화 부탄올 추출물을 의미한다.

일반적으로 NO 산생은 혈관확장이라는 이로운 점도 있으나 경우에 따라서 수퍼옥사이드(superoxide)의 발생으로 세포의 손상을 주기도 하여, 혈관내피세포 확장능력의 지표인 NO 활성은 최대가 되는 한편 세포독성은 최소가 되는 분획을 찾는 것이 중요하다. 이에 따라 원하는 분획을 얻기 위하여 실험을 수행한 결과 수용성 물분획이 362.3 mg/mL의 50% 세포저해농도를 나타내어 무독성임을 확인할 수 있었다(표2).

누에수번데기 분획별 소내피세포(CPAE)에서의 세포독성(XTT assay)

유기-분획	1 (대조군)	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
IC50 (mg/mL)	>100	>100	362.3	2.31	1.35	3.73	>100	>100	>100	6.33	>100

상기 표2에서 각 그룹명은 도9의 그룹명과 일치하며, 각 시료는 10 mg/mL, 20 μL 첨가하였으며, 사용세포는 CPAE 세포이며, 24시간 5% 탄산가스 배양기에서 배양하였다.

나. 활성분획, 최대 활성분획의 수득 및 이의 활성 조사

(1) DPPH 활성조사(in vitro 방법) 대신 내피세포에서 NO 정량법 채택

상기에서 얻어진 최종 물분획인 유기-분획3에 대해서 음이온크로마토그래피로 정제하고 이를 가지고 DPPH (1,1-디페닐-2-피크릴히드라질) 정색반응을 수행한 결과 수많은 피크가 검출되어(도10 참조), 생체반응인 내피세포에서 NO 활성을 지표를 기준으로 강정성분을 정제하였다.

(2) 활성분획의 수득 및 이의 확인

상기에서 얻어진 유기-분획3에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피 및 탈염을 수행하여 활성분획을 얻을 수 있었으며, 그 구체적인 수득방법 및 확인방법은 다음과 같다.

A. 음이온교환 젤여과 크로마토그래피 수행 및 NO 활성 조사

유기-분획3에 대해서 음이온 젤여과 크로마토그래피를 수행하였으며, 구체적으로 2g의 유기-분획3에 대해서 염을 증가시키면서(0, 0.1, 0.5, 1, 2.5M NaCl) DEAE sepadex A25 레진을 1.6X70cm 컬럼에 충진하고 분획 당 10 mL/5분으로 50 mM 인산완충액(pH 7.4)의 용매로 흘리면서 정제를 실시하였으며, 각각에 대해서 NO 활성을 측정하여 도11에 나타내었으며, 이 중에서 활성이 우수한 활성분획인 DEAE-분획52-59를 취하였다.

B. 탈염 및 분자량별 분리 (선택적 단계)

그리고 나서 탈염 및 분자량별 분리과정을 위해 Biogel P10(BMS 사)(1.5 x80 cm)을 충진하고 전 단계에서 취한 분획을 농축하고 부어 3차 증류수를 용매로 흘려서 나오는 분획을 다시 UV 흡광도와 NO 활성을 조사하여 최대 NO 생성량을 보이는 활성분획인 탈염분획14-18을 수득하였다(도12). 그러나, 경우에 따라서는 이러한 탈염단계는 생략할 수도 있으며, 혹은 탈염 컬럼, 투석막 분자량 컷오프(cut off) 100을 사용하여 증류수에 투석(용매)으로 한 후 농축한 후 다음 단계를 수행할 수 있다.

C. 활성분획에 대한 세포독성 조사

상기에서 얻어진 활성분획에 대해서 세포독성을 조사한 결과, 도13에 나타낸 바와 같이 490 nm 흡광도가 0.4 이상으로서 세포독성이 없음을 확인할 수 있었다(무처치 세포에서 흡광도가 0.35를 기준).

(3) 역상 HPLC를 통한 최대활성분획의 수득 및 강정물질의 정제

상기에서 얻어진 활성분획에 대해서 HPLC-RPC(Thermo Spectra Products, San Jose, USA, P4000, Spectrasystem UV 3000 photodiode UV-Vis detector)을 이용하여 Luna 5μ C₁₈ 컬럼(25 cm X 1.0 cm, I. D., Phenomex, USA)을 가지고 용매 70% HPLC용 메탄올, 유속 1.0 mL/분으로 254 nm에서 자외선 흡광분석기를 사용하여 분리정제하였을 때 나오는 13분에서 18분까지의 피크별 분획을 받아 CPAE 내피세포의 산화질소의 양과 세포독성여부를 XTT 분석법으로 조사하였다. 그 결과를 표3에 나타내었으며, 그 중에서 NO 생성량 및 세포독성 면에서 우수한 분획인 14.5분, 15분, 16분에 대해서 이후의 구조동정을 위한 기기분석을 수행하였다.

또한 경우에 따라서는 RPC(Source 15RPC, amersham pharmacia biotech) 수지를 충진하여 극성인 에틸알코올 또는 메탄올을 0-100%의 범위로 그래디언트(gradient) 또는 이소크래틱(isocratic) 60% 이상으로 디메틸아데노신의 용출이 가능하다. 유속은 0.7-3.0 mL/min이 적당하다.

아래 표3에 나타낸 바와 같이, 15분(RPC-III분획) 및 16분(RPC-IV분획)이 혈관 내피세포에서의 NO 생성량을 최대로 방출하여 혈관을 이완, 확장하고 발기를 유도하면서 세포독성은 무처치 수준인 대조수준으로 무독성임을 알 수 있었다.

CPAE 세포에서 수번데기 분획 별 NO 생성량 및 세포독성 측정

분획	13분(대조군) (RPC-I)	14.5분 (RPC-II)	15분 (RPC-III)	16분 (RPC-IV)	17분 (RPC-V)	18분 (RPC-VI)
NO 생성량 (540 nm)	0.079	1.225	1.412	1.426	0.878	0.853
세포생존율 (%) (Cell viability)	82.4	23.3	93.6	86.9	107.0	93.9

실시예 3: 강정물질의 구조 확인

가. 분자량 측정

MALDI-TOF MS (Voyager DE-STR, Applied Biosystems, USA)을 사용하여 분자량을 측정하였다. 그 결과 활성분액 14.5분(II), 15분(III), 16분(IV)내의 활성물질의 분자량은 각각 451, 451, 432로서 14.5분과 15분은 각각 도15a로 동일한 물질로 확인되었다.

나. IR spectrum

각 분획에 대해서 IR을 측정하였으며, 그 결과 도16a, 도16b에 나타낸 바와 같이 다음과 같은 특성피크를 얻었다.

(1) 14.5분(II) 및 15분(III): υ_max cm^-1 (KBr) ; 3522(OH), 3441(NH), 2955(CH-CH₂), 2361(CH₃CO), 1572(C=O), 1141(glycosidic CO)

(2) 16분(IV) : υ_max cm^-1 (KBr) ; 3495(OH), 3227, 2874(CH-CH₂), 2361(CH₃CO), 1949, 1657(C=O), 1146(glycosidic CO)

다. 융점(Melting Point) 측정

각 분획을 대상으로 융점을 측정하였으며, 그 결과를 다음의 표4에 나타내었다.

	14.5분 (RPC-II분획)	16분 (RPC-IV분획)
타기 시작	188.5	172
탄 온도	189	173

라. 자외선 최대 흡광도 측정

자외선 최대 흡광도를 측정하였으며, 그 결과 도17a와 도17b에 각각 나타낸 바와 같이, 활성분액 14.5분획(II)과 16분획(IV)에서는 280 nm 피크가 없었으나 도17c의 18분에서는 NO활성이 16분에 비해 60%나 떨어지는 부분에서 단백질(펩티드) 파장이 잡혔으나 보조역할의 가능성을 가지는 생체분포흡수가 떨어지는 작은 부분으로 보인다.

마. 각종 정성 및 TLC 발색반응 시도

Fehling, ρ-Anisaldehyde, Ehrlich's 시약, Dragendorff's 시약, Serium oxide, Somogi 방법, silver 염색 등 시행하여 다음 결과를 얻었다.

백색 분말, TLC Ehrilich 시약 Rf 0.6 (CH₃Cl₃: MeOH: H₂O)=5:4:1

황색 분말, TLC Ehrilich 시약 Rf 0.6 (CH₃Cl₃: MeOH: H₂O)=5:4:1

바. NMR 분석

분획II에 대해서 ¹H-NMR,¹³C-NMR,¹H-¹H COSY을 수행하였으며, 이 결과를 각각 도18a, 도18b, 도18c에 나타내었다. 또한, 분획IV에 대해서도 수행하여 각각 도19a, 도19b, 도19c에 나타내었다.

특히, 분획IV에 대한 NMR을 측정결과는 다음과 같다:

¹H-NMR (600 MHz, D₂O) δ: 2.26 (1H, dd, J = 10.3, 15.3 Hz, H-2`a), 2.30 (6H, s, 2 x N-CH <sub>3</sub>), 2.57 (1H, dd, J = 2.9, 5.4 Hz, H-2`b), 3.91 (1H, br t, J = 3.5 Hz, H-5`a), 4.20 (1H, dd, J = 2.9, 10.3 Hz, H-3`), 4.27 (1H, br s, H-4`), 4.41 (1H, dd, J = 3.5, 4.9 Hz, H-5`b), 6.04 (1H, d, J = 5.95 Hz, H-1`), 8.16 (1H, s, H-8), 8.51 (1H, s, H-2)

¹³C-NMR (150 MHz, D₂O) δ : 34.9 (N-CH₃), 43.4 (C-2`), 63.2 (C-5`), 71.1 (C-3`), 85.4 (C-1`), 87.5 (C-4`), 116.6 (C-5), 141.0 (C-8), 151.6 (C-4), 153.6 (C-2), 156.4 (C-6)

이로부터 분획II의 구조에 [·OH₂] 가 부가되면 분획 IV가 됨을 확인할 수 있었다.

사. 전기이온 분자량 흡광분석

전기이온 분자량 흡광분석기(High resolution Tandem Mass spectrometer, Autospec OA-TOF, Micromass, UK, EI-mode, Electron 70eVDIP mode, Direct Inlet Probe)를 사용하여 떨어지는 이온들의 분자량을 측정한 결과 다음과 같았다(도20참조).

EI-MS m/z (Rel. int., %) [M]⁺ 182, 183[M+H]⁺, 267(84), 317(50), 432(19)

상기와 같은 물질의 구조 동정을 통해서 수번데기 추출물의 활성물질은 다음과 같은 디옥시디메틸아데노신 화합물임을 확인할 수 있었다.

<화학식 1>

위 화학식1의 화합물은 IUPAC 명명법에 따르면, 5-{6-(디메틸아미노)-9H-푸린-9-일}-테트라히드로-4'-(하이드로메틸)푸란-3'-올이다. 상기 화합물은 리보스 5탄당의 2번 탄소 위치에 수소 대신에 OH기가 결합된 형태(히드록시 아데노신 형태)로 존재할 수도 있다.

상기 화학식1의 화합물에는 단당류 1종이 붙을 수 있으며, 특히 RPC-IV 분획을 가지고 0.1N HCl 또는 엔도글리코시다제 F(Endoglycosidase F, Sigma)로 효소처리 배양 후 상등액을 주입하여 당의 구조를 HPLC-AU ECD(Dionex submmit HPLC, ED50, carbo pac PA1 컬럼, 수산화나트륨용매) 검출기로 확인한 결과, L(+)-아라비노스(Arabinose), 경우에 따라서 D(+)-자일로스(xylose)가 피크가 표준품의 체류시간(retention time 16.6분)과 일치하였다(그림23 참조).

즉, RPC-IV분획의 활성물질은 L(+)-아라비노스가 결합된 아래의 화학식2의 구조를 가짐을 확인할 수 있었으며(분자량 432), IUPAC 명명법에 따르면, 5-{6-(디메틸아미노)-9H-푸린-9-일}-테트라히드로-4'-푸란-3'-올-5'-o-테트라파이로(tetrapyro)-2H-피란-3'',4'',5''-트리올이다.

<화학식 2>

상기 화학식2의 화합물에 수화물인 ·OH₂가 부가될 수 있고, RPC-II분획이 이에 해당하며(분자량 451), 상기 화학식1의 화합물에 ·O가 부가되어 형성될 수도 있다.

<화학식 3>

·OH₂

실시예 4: 강정효과 확인

가. 포스포디에스테라제 저해 활성 조사

각 정제분획에 따른 포스포디에스테라제 저해 활성을 다음과 같이 조사하였으며, 그 결과를 아래 표5에 나타내었다.

사용된 포스포디에스테라제 I은 뱀독 (Crotalus atrox) 유래 PDE 타입 IV (Sigma사) 5mg/mL, 10μL, Phosphodiestrase[³H] cAMP SPA 효소 분석 키트 (Amersham Biosciences사)의 매뉴얼에 따라서 수행하였으며, 저해제는 정제분획의 농도별로 0, 2, 10, 20 μg 사용하였다(도21). 사용 킷트는 3'5'-[³H] cAMP가 PDE에 의해 '5'-[³H] cAMP가 되며, 섬광근접측정(Scintillation proximity assay, SPA) 비드에 흡수되어 트리티움방사선이 측정되는데, PDE 저해제가 있으면 '5'-[³H] cAMP가 생기지 않고 SPA count가 안 생기는 원리이다. RPC-II분획과 RPC-IV분획이 처치농도가 증가할수록 방사능이 적게 생기므로 포스포디에스터라제 용량의존적 저해를 확인할 수 있었다.

정제분획		IC50 (μg/mL)
음이온교환 젤여과 크로마토그래피	DX분획	2.8x10-3
역상 HPLC	RPC-II분획	용량 비의존적
	RPC-III분획	8.63
	RPC-IV분획	0.88

나. 기존의 저해제와 본 발명에 따른 분액의 PDE 타입 V의 저해성 비교

상품의 기존 저해제를 동량으로 가하고 음이온교환 젤여과 크로마토그래피만에 의한 정제분획인 DX분획을 20μg, 10μg, 4μg으로 용량을 변화시켜 기존저해제와 병용시 포스포디에스터라제 저해성을 비교하는 샌드위치 상대성 비교를 실시하였다. 또한 사용된 효소를 뱀독 (Crotalus atrox) 유래 포스포디에스터라제(PDE) 타입 IV (Sigma사, 5mg/mL, 10μL)와 비교하여 10 μL의 포스포디에스테라제 V (cGMP-특성, bovine, recombinant, Spodera frugiperda (Calbiochem사)를 사용하여 PDE Type V 저해성도 검토하였다.

도21에 나타낸 바와 같이, Cyclic GMP 선택적 포스포디에스테라제 타입 V에 대해서 DX 분액은 우수한 저해효과를 나타냈으며 기존의 상품인 포스포디에스터라제 I, V, IV, III 저해제보다도 우수한 효과를 보였다.

다. 본 발명에 따른 분액과 기존 PDE 저해제의 병용투여의 가능성 확인

또한, 대조상품으로 8-Methoymethyl-IBMX (PDE type I 저해제) 15μM, 10μl, Trequinsin, 하이드로클로라이드(PDE type III 저해제) 10 mM, 10μl,, Rolipiram (PDE type IV 저해제)10 mM, 10μl, 4-{[3',4'-(메틸렌디옥시)벤질]아미노}-6-메톡시퀴나졸린 (PDE type V 저해제)10 mM, 10μl를 사용하여 분석한 결과 Trequinsin, 하이드로클로라이드(PDE type III 저해제)와 병용투여 시 PDE 저해작용이 상승작용이 있으며 어느 PDE 저해제와 병용하여도 용량의존적으로 PDE 저해성을 나타내므로 본 실험에서 사용한 PDE 저해제와 병용투여가 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

또한 Cyclic GMP 선택적 포스포디에스테라제 타입 V 효소에 대해서도 DX 정제분획은 PDE 저해성을 기존 PDE 저해 상품과 비교하여 대등하거나 오히려 더욱 우수한 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 누에유래 (디메틸)아데노신 화합물 및 이의 유도체는 포스포디에스터라제-5 효소의 저해를 기전으로 실데나필 수준의 우수한 혈관내피세포에서 산화질소(NO)를 산생시켜 발기를 유도할 뿐만 아니라, 본 발명에 따른 추출, 정제방법에 따라서 이러한 물질을 분리하여 동정할 수 있었다. 이러한 누에유래 (디메틸) 아데노신 화합물 및 이의 유도체은 발기부전이나 남성력에 직접 관계가 되는 물질로 순수분리 하여 의약품소재로 이용 가능한 유용성을 가진다.

Claims (16)

1. 다음 화학식1로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.

   <화학식 1>

   
2. 다음 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.

   <화학식 2>

   
3. 발기부전 치료용 조성물에 있어서,

   (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하고, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하고, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하고, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계, 및

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계

   를 포함하는 방법에 의해서 추출된 활성분획a를 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.
4. 발기부전 치료용 조성물에 있어서,

   (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하고, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하고, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하고, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

   (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계

   를 포함하는 방법에 의해서 추출된 활성분획b를 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.
5. 발기부전 치료용 조성물에 있어서,

   (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하고, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하고, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하고, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

   (d) 상기 활성분획a에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계

   를 포함하는 방법에 의해서 수득한 활성분획c를 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.
6. 발기부전 치료용 조성물에 있어서,

   (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하고, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하고, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하고, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계,

   (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계, 및

   (d) 상기 활성분획b에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계

   를 포함하는 방법에 의해서 수득한 활성분획c를 유효성분으로 포함하는 발기부전 치료용 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 기존 포스포디에스터라제(PDE) 저해제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발기부전 치료용 조성물.
8. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계, 및

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계를 포함하는,

   누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획a가 포함하고 있는 다음 화학식1로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

   <화학식 1>

   
9. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

   (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

   (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계를 포함하는,

   누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획b가 포함하고 있는 다음 화학식1로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

   <화학식 1>

   
10. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계, 및

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획a 가 포함하고 있는 다음 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 2>

    
11. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

    (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획b가 포함하고 있는 다음 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 2>

    
12. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

    (d) 상기 활성분획a 에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획c가 포함하고 있는 다음 화학식1로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 1>

    
13. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계,

    (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계, 및

    (d) 상기 활성분획b에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획c가 포함하고 있는 다음 화학식1로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 1>

    
14. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계, 및

    (d) 상기 활성분획a 에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획c가 포함하고 있는 다음 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 2>

    
15. (a) (i) 누에 번데기의 에탄올 추출물에 대해서 헥산:물 부피비가 1:50~50:1인 헥산 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획a를 수득하는 단계, (ii) 상기 물분획a에 대해서 클로로포름으로 유기분획을 실시하여 물분획b를 수득하는 단계, (iii) 상기 물분획b에 대해서 에틸아세테이트로 유기분획을 실시하여 물분획c를 수득하는 단계, (iv) 상기 물분획c에 대해서 부탄올:물 부피비가 1:50~50:1인 부탄올 수용액으로 유기분획을 실시하여 물분획d를 수득하는 단계,

    (b) 상기 물분획d에 대해서 음이온교환 젤여과 크로마토그래피를 실시하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 80% 이상인 활성분획a를 선택하는 단계,

    (c) 상기 활성분획a에 대해서 탈염과정을 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 85% 이상인 활성분획b를 선택하는 단계, 및

    (d) 상기 활성분획b에 대해서 역상 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 수행하여 산화질소(NO) 생성량 측정을 위한 흡광도가 540 nm에서 0.9 이상이며 세포생존율이 20% 이상인 활성분획c를 선택하는 단계를 포함하는,

    누에번데기로부터 수득한 상기 활성분획c가 포함하고 있는 다음 화학식2로 표시되는 아데노신 화합물 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 이의 수화물의 추출방법.

    <화학식 2>

    
16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 누에 번데기는 누에 수번데기임을 특징으로 하는 추출방법.

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