KR100781570B1 - 표면 처리 - Google Patents
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Abstract
스탬프(stamp)로 시드 분자(seed molecules)를 로딩하는 단계, 스탬프로부터 표면으로 시드 분자를 전사하는 단계 및 단일계층을 생성하기 위해서 증폭 반응을 통해 상기 시드 분자를 증폭하는 단계를 포함하는, 표면에 분자의 단일계층을 생성하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법은 표면에 초기에 인쇄된 불완전하거나 성긴 단일계층으로부터 완전한 단일계층의 생성을 가능하게 한다.
Description
본 발명은 일반적으로 표면처리에 관한 것이고, 특히 분자 단일계층(molecular monolayers)을 갖는 표면 영역을 코팅하기 위한 방법에 관한 것이다.
표면에 있는 분자 단일계층은 표면의 부식(corrosion), 습식(wetting) 또는 접착성을 제어하는 것, 혼성 촉매작용(heterogeneous catalysis)을 수행하는 것, 용액으로부터 분석물질(analyte)을 추출 또는 정제하는 것을 포함하는 많은 애플리케이션에 있어서 그리고 바이오센서 또는 바이오칩을 생산하기 위해서 유용하다.
기판 표면에 분자를 증착하기 위한 종래의 방법은, 기판 상에 자기-완성 단일계층(self-completing monolayer)을 형성하기 위해 과도한 분자를 갖는 용액에 표면을 담그는 단계를 수반한다. 단일계층 처리 기법에 기초하는 종래의 담그는 단계의 단점은 패터닝이 가능하지 않다는 점이다. 또한, 복잡하고, 고가이며, 느리고 화학적으로 및 기하학적으로 부정확하다. DNA 기능화된 바이오칩의 종래의 제조에 있어서는 DNA 템플릿으로 스포팅(spotting)하는 단계가 수반된다. 지점 기하구조(spot geometry)를 정의하기 위해서 지점에서의 표면 장력이 활용된다. 건조 효과(drying effect)로 인해 지점에서의 농도가 빠르게 변경되어서 제어를 어렵게 만든다.
표면상에 분자를 증착하기 위한 다른 종래의 프로세스는, 폴리 디메틸 실로사인(poly demethyl siloxane: PDMS)에서의 스탬프(stamp)와 같은 스탬프로부터 표면상의 분자를 인쇄하는 단계를 수반한다. 인쇄하는 단계에서는 미세한 양의 분자를 갖는 표면의 패터닝이 가능하다. 그러나, 그러한 인쇄와 연관되어서 가변 전사(variable transfer)라는 것이 있다. 기판상의 주어진 지점(spot)에서의 포괄범위(coverage)는 잉크 밀도(inking density) 및 인쇄 효율에 따른다. 이것이 특히 문제가 될 수 있는 경우는, 예컨대 촉매 또는 생물학적 분자의 인쇄에 있어서, 분자가 스탬프 상에 단일계층으로서만 위치될 수 있는 경우이다. 여기서, 단일 분자가 존재 또는 결여됨으로 인해 수동 및 기능 표면간이 서로 대비된다. 분실 분자(missing molecule)가 하나라도 결함(defect)이 생긴다. 통상적으로, 스탬프로부터 표면으로 단일계층을 전사하는데 있어 결함이 전혀 생기지 않는 것은 아니며, 전사율은 인쇄 싸이클마다 달라진다. 이것은 대량 생산 환경에서 바람직하지 않다. 예컨대, A. Bernard et al.이 지은 Adv. Mater. 2000 (12), 1067 (2000)의 "Microcontact Printing of Proteins"을 참조해 보자.
유전자 활동의 조사 및 유전자 돌연변이의 식별을 포함하는 유전자 분석과 같은 애플리케이션에 있어서, 소위 바이오칩 또는 마이크로 어레이 기술은 그 중요성이 날로 커지고 있다. 약 선별(drug screening), 진단, 진료 및 식별을 향상시키기 위해 유전자 정보가 사용될 수 있다. 그러한 애플리케이션을 위한 전형적인 바이오칩은 유리 표면에 부착된 유전자 단편(fragments) 또는 단백질의 소형 어레이를 포함한다. 전형적으로 그러한 바이오칩 및 형광 표본(fluorescent sample)의 표면상에서의 시퀀스들간의 교배 반응(hybridization research)이 분석을 위해 사용된다. 교배이후에, 바이오칩은 전형적으로 형광 검출기로 판독되고, 표면상에서 지점의 형광 밀도가 정량화되도록 한다. 단백질 마커(protein markers), 바이러스 및 단백질 표현 프로파일은 단백질 고유의 포획 에이젼트(protein specific capture agent)를 통해 유사하게 검출될 수 있다. 바이오칩 상에서 생물학적 분자를 패터닝하기 위한 종래의 방법은 M. Schena가 지은 Eaton Publishing, Natick MA, (2000)의 "Micro array Biochip Technology" 및 G. Ramsay가 지은 Nature Biotech, 16, 40 (1998)의 "DNA chips: State of the Art"에 설명되어 있다. 종래의 방법은 순차 및 병렬 패터닝 기법을 포함한다. 순차 기법은 표면상의 지점들을 직렬로 처리한다. 이러한 기법은 피펫팅(pipetting) 단계, 모세관 인쇄 단계, 잉크젯 인쇄 단계 및 핀 스포팅(pin spotting) 단계를 포함한다. 병렬 기법은 분자의 다수 영역을 표면상에 동시에 패터닝한다. 이러한 기법은 미세유체 네트워크(microfluidic network) 전사 단계, 모세관 어레이 인쇄 단계 및 마이크로콘택트 인쇄(microcontact printing) 단계를 포함한다. 마이크로콘택트 인쇄 단계는 패터닝된 스탬프에 잉킹하는 단계를 수반한다. 그러한 잉킹은 미세유체 네트워크를 통해 수행될 수 있다.
소정의 애플리케이션에서, 바이오칩 표면에 디옥시리보핵산(DNA)을 적용할 수 있다. DNA에 인코딩된 정보에 의해서, 생체의 세포 및 생화학적 기능이 수립되고 유지된다. 대부분의 생체에서, DNA는 연장된 이중 가닥 폴리머(extended double stranded polymer)이다. 하나의 DNA의 디옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotides) 열은 다른 가닥의 그것에 대해 상보적이다. 이로 인해서, 원래의 DNA 분자와 같은, 각 가닥에서의 디옥시리보뉴클레오타이드의 선형 어레이로 새로운 DNA 분자가 합성될 수 있다. 일반적으로, 이러한 프로세스는 DNA 복제(replication)라고 지칭된다. DNA 코드는 네 개의 베이스, 즉 아데닌(adenine: A), 구아닌(guanine: G), 시토신(cytosine: C) 및 티민(thymine: T)으로 구성된다. 뉴클레오티드는 네 개의 생체 베이스 중 하나, 5 탄당(five carbon sugar: pentose) 및 인산염 그룹으로 구성된다. 인산염 그룹 및 생체 베이스는 당 모이어티(sugar moiety)의 5'탄소 및 1'탄소 원자에 각각 부착된다. DNA의 당은 3'탄소에서만 수산기 그룹(htdroxyl group)을 갖기 때문에, 2'디옥시리보스(deoxyribose)이다. DNA의 뉴클레오티드는, 인접한 뉴클레오티드 당의 디옥시리보스의 3'OH에 연결된 하나의 뉴클레오티드의 5'탄소의 인산염 그룹과 인산디에스테르 결합(phosphodiester bond)된다. 따라서, 폴리뉴클레오티드는 일단(3'단)에서 3'OH를 갖고 다른 단(5'단)에서 5'인산염 그룹을 갖는다. 각각 두 개 및 세 개의 수소 결합에 의해 베이스 A가 T와, 베이스 G가 C와 짝지어진 이중 가닥 나선을 DNA가 형성한다. 이중 DNA의 두 개 가닥은 반대 방향으로 진행하며, 통상적으로 이중 가닥 DNA는 상위 가닥의 5'단이 항상 좌측에 작성된다. 효소 복제 프로세스(enzymatic replication process)동안에, 추가된 뉴클레오티드의 인산염이 현재 시퀀스의 3'OH에 연결된다. 따라서, B. R. Glick et al이 지은 American Society for Microbiology, Washington 1998의 "Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA"에 설명된 바와 같이, DNA는 항상 5'에서 3'방향으로 복제된다.
일반적으로, DNA 기능화된 바이오칩의 제조는 DNA 목표를 형성하기 위해 상이한 DNA 템플릿으로 지점을 순차적으로 잉킹하는 단계를 수반한다. 이것은 복잡하고, 느리며 따라서 비용이 많이 드는 프로세스이다.
통상적으로, 유전자 분석은, 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 나일론 막(nylon membrane) 또는 리신 코팅된 유리 슬라이드(lysine coated glass slides)와 같은 표면을 지지하기 위해 수동적으로 흡수되었던 DNA 목표에 라벨링된 프로브를 교배함으로써 수행된다. 표면에 대한 DNA의 공유 결합에 의해, 교배 조건 하에서 안정적으로 부착된다. DNA 올리고머(oligomer)는 3'-단 또는 5'-단으로부터 인 시츄로 부착되거나 합성될 수 있다. 5'-단 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)를 유리에 부착하기 위한 프로세스는, K. L. Beattie et al이 지은 Clin. Chem.41, 700-706 (1995)에 설명된 것과 같은 에폭시 실란 결합형 유리(epoxy silane derivatized glass)에 대한 에폭시 개방 반응(epoxy opening reaction), Joos, B. et al이 지은 Anal. Biochem. 247, 96-101 (1997)에 설명된 바와 같은 아미노 결합형 유리에 고정된 5'-숙신 목표 올리고뉴클레오티드(5'-succinylated target oligonuclotides) 및 Rogers, Y. H.가 지은 Anal. Biochem. 266, 23-30 (1999)에 설명된 바와 같은 싸이올 결합형 유리(thiol derivatized glass)에 대한 이황화 결합을 통한 5'-이황화 변형 올리고뉴클레오티드 결합을 포함한다. 다른 프로세스는 pehyldiisocynate, maleic anhydride 또는 carbodiimides와 같은 크로스 결합기(cross linker)를 사용하며, 예컨대 Chrisey, L. A et al이 지은 Nucleic Acids Res. 24, 3031-3039 (1996), O'Donnel, M. J. et al이 지은 Anal. Chem. 69, 2438-2443 (1997), CHee, M. et al이 지은 Science 274, 610-614 (1996)의 "Accessing genetic information with high-density DNA arrays"에 설명되어 있다. 부착 화학의 개요는 G. T. Hermanson이 지은 Academic Press, San Diego, 1996의 "Bioconjugate Techniques"에 공개되어 있다. 특히 올리고머의 재생 가능한 화학흡착은 Adessi, C. et al이 지은 Nucleic Acid Res. 28 (e87) 1-8 (2000), Kawashima, E., et al이 지은 WO98/44151의 "Method of nucleic acid amplification" 및 Adessi, C., et al이 지은 WO00/18957의 "Method of nucleic acid amplification and sequencing"에 설명되어 있다.
폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR)은, 알려진 DNA 시퀀스의 두 영역 사이에 있는 특정 RNA 또는 DNA 영역의 지수적인 증폭을 가능하게 하는 인 비트로(in vitro) 기법이다. PCR의 종래의 애플리케이션은 유전자 특징화, 클로닝, 병원체 검출을 위한 DNA 진단, 유전병의 원인인 돌연변이의 식별 및 DNA 지문확인을 포함한다. PCR 증폭은, 앰플리프리머(ampliprimer)로 알려진 올리고뉴클레오티드 프리머(primer)를 통해 달성된다. 이것은 DNA 템플릿의 정의된 시퀀스의 말단에 대해 상보적인 짧은 단일 가닥 DNA 분자이다. 적절한 반응 조건하에서 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트(deoxynucleoside triphosphates: dNTPs)가 존재할 때 열적 안정 DNA 폴리머라제에 의해 단일 가닥 변성 DNA에서 3' 방향으로 프리머가 신장된다. 가닥 합성은 이중 가닥 DNA의 열적 변성에 의해서 반복될 수 있고, 혼합물을 냉각함으로써 프리머를 단련하고 효소 반응에 적합한 온도에서 DNA 폴리머라제에 의해 프리머를 신장한다. 가닥 합성의 각각의 반복은 증폭의 싸이클을 포함한다. 합성된 각 새로운 DNA 가닥은 임의의 추가적인 증폭 싸이클을 위한 템플릿이 된다. 따라서, 증폭된 목표 DNA는 지수적으로 증폭된다. PCR에 관련된 추가적인 정보에 대해서는, C. R. Newton et al이 지은 Bios Scientific Publishers, Oxon, U. K. 2000의 "PCR", E. Southern et al이 지은 Nature Genetics 21, 5 (1999)의 "Molecular Interactions on Microarrays", U. Maskos et al이 지은 Nucleic Acid Res. 20(7), 1679-1684 (1992)의 "Oligonucleotide hybridizations on glass supports", Z. Guo et al.이 지은 Nucleic Acid Res. 22 (24), 5456-5465 (1994)의 "Direct Fluorescence Analusis of Genetic Polymophism by Hydrization with Oligonucleotide Arrays on Glass Supports", J. Lamture et al.이 지은 Nucleic Acid Res. 22(11), 2121-2125 (1994)의 "Direct Fluorescence of Nucleic Acid Hybridization on the Surface of a Charge Coupled Device", M. Sjoeroos et al.이 지은 Clinical Chem. 47(3), 498 (2001)의 "Solid-Phase PCR with Hybridization and Time-Resolved Fluorometry for Detection of HLA-B27"을 참조하라.
표면의 단일계층을 패터닝하기 위한 모든 전술한 방법은 많은 한계를 가지며 패터닝 단계이후에 패턴이 최적화될 수 없다. 그러한 문제점을 해결하기 위해서는, 잉크를 덜 소비해서 덜 빈번한 잉킹을 요구하며, 분자 전사를 위해 필요한 콘택트 시간이 더 짧아짐으로 인해서 더 빠른 동작을 가능하게 하는 인쇄 프로세스를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 따라서, 표면에 단일계층의 분자를 생성하기 위한 방법을 이하 제공하며, 상기 방법은 시드 분자(seed molecules)를 스탬프로 로딩하는 단계, 스탬프로부터 표면으로 시드 분자를 전사하는 단계, 단일계층을 생성하기 위해 증폭 반응을 통해 시드 분자를 증폭하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 전사하는 단계는 스탬프에 로딩된 시드 분자의 조작을 표면으로 전사하는 단계를 포함한다. 이것은, 시드 분자의 스탬프로의 흡수가 시드 분자의 표면으로의 흡수보다 강력한, 시드 분자를 스탬프로 흡수하는 단계 및 시드 분자를 표면으로 흡수하는 단계를 포함하는 전사하는 단계에 의해 달성되는 것이 바람직하다. 증폭하는 단계는 단일계층의 단백질을 생성하기 위한 인 비트로 변환 시스템(in vitro translation system)을 포함할 수 있다. 시드 분자는 무전해 증착(electroless deposition)을 위한 촉매 중심을 포함할 수 있다. 본 방법은 촉매를 무전해 증착을 위한 시드 분자에 결합하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 애플리케이션에서, 단일계층은 표면을 식각액(etchant)으로부터 보호한다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 단일계층은 DNA를 포함한다. 본 방법의 바람직한 예는 스탬프로 시드 분자를 다시 로딩하기 전에 복수의 표면에서 전사하는 단계 및 증폭하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함한다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 전술된 방법으로 처리된 표면을 포함하는 바이오센서로 확장된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 불완전한 분자 단일계층을 표면으로 전사하는 단계, 및 따라서 증폭 반응에 의해 단일계층을 완성하기 위한 기초로서 불완전한 계층을 이용하는 단계를 포함하는 표면 처리 방법이 제공된다. 표면을 용액에 담그는 단계를 수반할 수 있는 증폭 반응은, 원치 않는 표면 포괄범위를 방지하기 위해서 표면의 미리 정의된 영역에 대해 선택적인 것이 바람직하다. 표면 패터닝의 과도한 왜곡을 회피하기 위해 영역의 반응 유도된 확장이 제한되는 것이 바람직하다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 프로세스는 자기 완성되어서(self completing), 전술된 가변 전사율 문제를 해결한다. 이는 재-잉킹 사이의 더 많은 인쇄를 가능하게 하여서, 표면 패턴을 상당하게 왜곡함 없이 잉크를 절약하고 더 빨리 인쇄하게 한다. 연이은 반응에 의해, 다른 방법으로는 인쇄될 수 없는 다른 종으로 인쇄된 종을 변환할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 본 발명은 성긴 DNA 단일계층과 같은 성긴 단일계층을 증폭하는데 한해서 독점적으로 유용한 것은 아니다.
단일계층을 완성하기 위한 증폭 기법의 예는, 선형 증폭, PCR 증폭과 같은 지수 증폭(exponential amplification) 및 지향 증폭을 포함한다. 그러한 기법이 패터닝 방법에 대해 일반적으로 독립적인 것이 유용하다. 선형 증폭은 결함 있는 단일계층을 완성하는데 유용하다. 그러나, 지수 증폭이 상대적으로 빠르기 때문에, 성긴 분자로부터 단일계층을 구축하기 위해서는 지수 증폭이 바람직하다. 본질적으로 지향성이 있거나 외부 필드의 애플리케이션에 의존하는 지향 증폭으로 인해 작은 갭을 중개하는 나노 구조(nanostructures)가 형성되는 것이 가능하다. 그러한 증폭 기법은 비생체, 생체 및 생물학적 시스템에서 구현될 수 있다. 이러한 시스템 각각을 이어서 상세하게 설명할 것이다. 이러한 기법은 DNA 올리고머(oligomers)를 이용하여 구현될 수 있는 것이 유용하다. DNA는 PCR과 같은 복사 프로세스를 이용하여 검출되고 증폭될 수 있다. 대량 생산을 위하여 다수의 DNA를 병렬적으로 증폭하는 것이 바람직하다. 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 대량 생산을 단순화하고 비용을 감소하기 위해서, 병렬 증폭이 소프트 리소그래피 인쇄(soft lithography printing)와 결합된다. 특히, 올리고머가 스탬프를 통해 표면에 패터닝된다. 패터닝 품질은 스탬프에의 포획 올리고머의 화학 흡착 및 표면에의 프리머 올리고머의 화학흡착의 효율에 의존한다. 템플릿 올리고머는, 표면의 프리머에게 보다는 스탬프의 포획 올리고머에게 더 강하게 결합되는 제어되며 가역인 교배를 갖는 것이 바람직하다. 대안적으로, 스탬프상의 템플릿은 폴리리신(polylysine)을 이용하여 비특이적으로 포획될 수 있다. 효율적으로 표면 결합된 PCR을 위해서, 올리고머가 스페이서(spacer) 시퀀스(9T)를 갖는 것이 바람직하고, 생체교합 가능한 스페이서 층(PEG)에 결합되는 것이 바람직하며, 열적 싸이클 동안에 올리고머를 표면에 보유하는 열적으로 안적적인 공유 상호 결합을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 스탬프 상의 지점 피처로부터 인쇄된 DNA는 각 인쇄 싸이클동안 양적으로 감소된다. 이로 인해 재-잉킹 없이도 스탬프를 반복적으로 사용 가능하게 된다. 가능한 인쇄 싸이클의 회수는 각 인쇄 싸이클 동안에 이동되는 역 분수에 비례한다. 예컨대 인쇄 싸이클 당 0.1%보다 작은 인쇄의 경우에는, 교체 또는 재-잉킹 이전에 약 1000번 정도 스탬프를 재사용 할 수 있다. 평방 마이크로미터 당 25 DNA 분자 이상의 인쇄가 가능하다. 이것은 표면 결합 프리머를 사용하여 PCR 증폭에서 사용되기에 충분하다. 공통 프리머 영역 및 가변 시퀀스를 갖는 PCR 복제는 수천 개의 다른 분자를 병렬적으로 복제 가능하게 한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 도전성 구조를 형성하기 위하여 시드 분자가 지향적으로 증폭된다. 지향적으로 증폭된 시드 분자는 금속으로 전기 도금될 수 있다. 지향 증폭은 시드 분자의 기하구조에 의해 제어될 수 있다. 대안적으로, 지향 증폭은 외력(external force)을 적용함으로써 제어될 수 있다. 적용 가능한 외력의 예는 전기력, 자기력 및 유체력(hydrodynamic force)을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시예가 단지 예로써 첨부된 도면을 참조하여 이하 설명될 것이다.
도 1은 본 발명을 구현하는 표면 처리 프로세스의 블록도.
도 2a는 선형 증폭의 블록도.
도 2b는 지수 증폭의 블록도.
도 2a는 지향 증폭의 블록도.
도 3a 내지 도 3h는 PCR 표면 프리머 증폭을 위한 방법에서의 단계를 도시하는 블록도.
도 4a 내지 도 4e는 PCR 가용성(soluble) 프리머 증폭을 위한 방법에서의 단계를 도시하는 블록도.
도 5a 내지 도 5e는 본 발명을 구현하는 표면 처리 방법을 위한 스탬핑 동작(stamping operation)의 단면도.
먼저 도 1을 참조하면, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 표면(1)에 분자 단일 계층을 형성하기 위한 방법이 제공된다. 본 방법은 분자의 시드계층(seed layers: 3, 4)을 스탬프(2)를 통해 표면으로 전사하는 단계를 포함한다. 시드계층은 분자(3, 4)가 희박한 분자 단일계층을 포함한다. 표면(1)에 적층된 시드계층은 표면(1)에 단일계층을 완성하기 위하여 증폭 반응에 의해 이후 성장된다. 다른 종류의 분자(3, 4)가 스탬프(2)의 상이한 활성 영역(5, 6)에 배치될 수 있다. 이러한 기술은, 적어도 분자의 촉매작용 양을 전달하고 이어서 표면(1)에 인쇄된 분자를 포화 밀도까지 증폭함으로써 스탬프(2)로부터의 불완전한 분자 전사라는 문제를 해결한다. 상세하게, 단계(50)에서, 분자(3, 4)로 부분적으로 잉킹된 스탬프(2)가 표면(1)과 접촉되도록 된다. 이러한 예에서, 분자의 제1 그룹(3)이 스탬프(2)의 피처(5)로 잉킹되고 분자의 제2 그룹(4)은 스탬프(6)의 피처(6)로 잉킹된다. 분자(3 및 4)는 상이한 종일 수 있다. 스탬프(2)는 잉킹된 분자(3, 4)의 일부를 표면(1)으로 전사한다. 단계(55)에서, 증폭 반응이 수행된다. 증폭 반응은 완전한 단일계층을 생성하기 위하여 인쇄된 분자(3, 4)를 증폭한다. 한편, 단계(51)에서, 남아있는 분자(3, 4)의 다른 일부를 다른 표면(1')으로 인쇄하는데 스탬프(2)가 재사용된다. 다시, 단계(55)에서, 완전한 단일계층을 생성하기 위하여, 증폭 반응에 의해 다른 표면(1')에 인쇄된 분자(3, 4)가 증폭된다. 유사하게, 단계(52)에서, 남아있는 분자(3, 4)의 또 다른 일부를 또 다른 표면(1'')으로 인쇄하는데 스탬프(2)가 재사용된다. 다시, 단계(55)에서, 완전한 단일계층을 생성하기 위하여, 증폭 반응에 의해 표면(1'')에 인쇄된 분자(3, 4)를 증폭된다. 배치 프로세서에서는, N번째 인쇄에서 스탬프(2)에 남아있는 분자(3, 4)가 더 이상 없을 때까지 추가적인 표면이 유사하게 처리될 수 있다. 단계(53)에서, 스탬프가 재잉킹될 수 있고 프로세스는 반복될 수 있다. 단계(55)에서의 증폭 반응은 단백질의 단일계층을 생산하기 위한 인 비트로 변환 시스템을 포함할 수 있다. 시드 분자(3, 4)는 무전해 증착을 위한 촉매 중심을 포함할 수 있다. 무전해 증착을 위해서 촉매가 분자(3, 4)에 결합될 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에서, 단일계층은 식각액으로부터 표면(1)을 보호한다. 분자(3, 4)는 DNA 올리고머일 수 있다.
또한, 인쇄 가능한 DNA 분자의 증폭이 스탬프(2)에 된 이후에 완전한 단일계층이 전사된다. 그러나, 이러한 방법은, 리소그래피 스탬프가 고가이며 열적으로 민감한 물품이기 때문에 불리하다. 경제적으로, 이러한 방법은, 적어도 하나의 증폭 싸이클 동안에 스탬프를 점유하기 때문에 유용하지 못하다. 기판 표면에 증폭이 수행되는 경우, 동일한 스탬프로 인쇄되는 다수의 기판을 수반하는 배치 프로세스로 수행될 수 있다.
증폭 반응은 선형 증폭 반응, 지수 증폭 반응 또는 지향 증폭 반응일 수 있다. 기타의 증폭 반응도 가능하다. 헤드그룹 X, 백본(backbone) 및 테일그룹 Y를 갖는 불완전하게 인쇄된 분자 단일계층의 선형 증폭의 예는 이하 도 2a를 참조해서 설명될 것이다. 표면(1)에 결합된 그룹 X를 또한 갖는 분자의 V부분에 대해 그룹 Y는 앵커를 제공한다. 반응은, X 및 Y가 표면(1)에 대해 불충분한 친화력(affinity)을 갖는 인쇄의 에지(edge)에서 중단된다. 상세하게는, 단계(10)에서, X-Y 분자의 불완전한 단일계층이 표면(1)에 인쇄된다. 단계(20)에서, 테일그룹 Y는 분자가 V 기능, 백본 및 프리커서 화학 흡착 그룹 (X)을 갖는 용액(solution)으로부터 표면(1)에 결합한다. 단계(30)에서, 화학 흡착 그룹 (X)은 보호가 제거되어 X가 노출된다. 단계(40)에서, 이것은 결합 분자가 표면으로 화학 흡착되도록 한다. 화학 흡착은 표면(1)이 이미 덥혀져 있지 않은 경우에만 발생한다. 표면(1)이 덥혀질 때까지, 결합, 보호 제거 및 증폭 단계가 반복되어서 초기 인쇄를 점진적으로 증폭한다. 따라서, 이러한 프로세스는 자기-제한적(self-limiting)이다. 이는 단일계층이 완성되거나 또는 Y 테일에 결합된 분자 범위에 빈 자리가 표면(1)에 남아있지 않은 경우에 정지한다. 단일계층이 패터닝된 경우, 프로세스는 무시할 만큼 확산시키고, 따라서 해상도를 유지하며, m 증폭 싸이클 이후 추가된 분자의 최대치는 m이고 이는 선형 증폭에 대응한다.
이하 도 2b를 참조하면, 헤드그룹 X 및 테일그룹 Y를 포함하는 불완전한 인쇄된 단일계층의 지수 증폭의 예에서, 복합체(complex) 또는 중재자(mediator) M은 더 많은 분자가 결합되도록 하고 표면(1)으로의 흡착을 촉진시킨다. 또한 새로이 결합된 테일그룹 Y가 M에 대한 결합 장소로서 작용하기 때문에, 분자 N의 개수는 2N으로 증가한다. 이러한 프로세스는 선형 증폭과 유사하다. 그러나, 인쇄 단계(10) 이후에, Y 테일은 단계(21)에서 원자 또는 분자 M과 복합된다. 단계(22)에 서, 헤드그룹 (X) 및 테일그룹 Y를 갖는 제2 분자가 M에 결합된다. 단계(31)에서, 제2 분자의 헤드그룹 (X)은 X로 보호 제거되고 표면(1)으로 화학 흡착된다. 그 이후 증폭은 제1 결합 단계(21), 제2 결합 단계(22) 및 보호 제거 단계(31)를 반복함으로써 진행한다. 표면에 증착된 모든 분자는 단일계층을 증폭하기 위해 작용할 수 있다.
지향 증폭이 이하 도 2c를 참조하여 설명될 것이다. 지향 증폭은 이하 단계(32)에서 복합체 YMY의 기하 구조에 의하여 설정되는 지향 방식으로 제2 결합 분자가 표면에 화학 흡착된다는 점을 제외하고는 선형 증폭과 유사하거나 또는 그보다 빠르다. 도전성 구조를 형성하기 위해서 시드 분자가 지향 증폭될 수 있다. 지향 증폭된 시드 분자는 금속으로 전기 도금될 수 있다. 지향 증폭은 시드 분자의 기하 구조에 의해서 제어될 수 있다. 대안적으로, 지향 증폭은 외력을 적용함으로써 제어될 수 있다. 적용 가능한 외력의 예는 전기력, 자기력 및 유체력을 포함한다.
세 가지 증폭 기법은 DNA 올리고머로 표면을 코팅하기 위해 사용될 수 있다. 지수 증폭은 특히 DNA로 표면을 유도하는데 유용하다. PCR 증폭은 지수 증폭 기법의 예이다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, DNA 분자는 도 1을 참조하여 본 명세서에 전술된 바와 같이 스탬프로부터 표면으로 성기게 인쇄되고 이후 증폭되어서 고체 상태 PCR을 통하여 완전한 단일계층을 생성한다. 또한, 본 명세서에 전술된 세 가지 증폭 기법은 일반적으로 단일계층 및 특히 인쇄된 단일계층을 증폭하기에 적합하거나 예컨대 나노구조를 만들기 위해서 표면의 선별적인 방향을 따라 분자를 성장시키는데 사용될 수 있다.
표면 프리머 PCR 복제를 위한 방법이 이하 도 3a 내지 도 3h를 참조하여 설명될 것이다. 도 3a를 참조하면, 초기에는 템플릿 올리고머(8)가 포획 올리고머(7)에 의해 스탬프(2)에 잡혀있다. 스탬프(2)는 이후 제1 및 제2 프리머 올리고머가 고정되는 표면에 접촉하도록 된다. 템플릿(8)의 일부가 프리머(9)와 교배하며, 따라서 스탬프(2)로부터 표면(1)으로 전사된다. 도 3b를 참조하면, 인산염 버퍼링된 살인(phosphate buffered saline: PBS)의 완충 용액(buffer solution)내에 DNA 폴리머라제 및 네 개의 PCR 뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 PCR 혼합물(11)이 이어서 추가된다. DNA 템플릿으로 교배된 각각의 고정된 프리머는 PCR 혼합물(11)에서 DNA 폴리머라제에 의해 표면(1)에서의 최대 길이로 증폭된다. 이것은 합성된 보충 또는 이중 DNA 가닥을 생성한다. 도 3c를 참조하면, 열이 인가된다. 이중 DNA 가닥은 녹아서 표면(1)의 다른 프리머(9)와 재교배함으로써 연결된 분자(bridged molecule)를 생성한다. 이하 도 3d를 참조하면, 추가적으로 열을 가하여서 연결된 분자를 녹인다. 따라서, 표면(1)에 결합된 두 개의 이중 DNA 가닥이 생성된다. 이하 도 3e를 참조하면, 온도가 감소한다. 두 개의 이중 가닥의 각각은 매칭 프리머(matching primer: 9)와 재교배하고 프리머(9)가 신장된다. 따라서, 두 개의 연결 분자가 생성된다. 이하 도 3f를 참조하면, 추가적으로 열을 가하여서 연결된 분자를 녹인다. 현재 네 개의 이중 DNA 가닥이 표면(1)에 결합되어 있다. 이하 도 3g를 참조하면, 모든 프리머(9)가 신장될 때까지, 녹이는 단계 및 재교배 단계가 반복된다. 도 3h를 참조하면, 이어서 보충 분자가 화학적으로 또는 제한 효소를 통하여 표면(1)으로부터 쪼개진다.
본 명세서에 전술된 PCR 기법의 수정(modification)에 있어서, DNA는 용액 내의 안티센스(antisense) DNA 프리머를 적용함으로써 선형 증폭될 수 있다. 본 수정은 이하 도 4a 내지 도 4e를 참조하여 설명될 것이다. 도 4a를 참조하면, 초기에는 템플릿 올리고머(8)가 포획 올리고머(7)에 의해 스탬프(2)에 잡혀있다. 스탬프(2)는 이후 제1 프리머만이 고정되는 표면에 접촉하도록 된다. 템플릿(8)의 일부가 고정된 프리머(9)와 교배하고 따라서 스탬프(2)로부터 표면(1)으로 전사된다. 도 4b를 참조하면, 인산염 버퍼링된 살인(phosphate buffered saline: PBS)의 완충 용액(buffer solution)내에 DNA 폴리머라제 및 네 개의 PCR 뉴클레오티드(dNTPs)를 포함하는 PCR 혼합물(11)이 이어서 추가된다. DNA 템플릿으로 교배된 각각의 고정된 프리머가 PCR 혼합물(11)에서 DNA 폴리머라제에 의해 표면(1)에서의 최대 길이로 증폭된다. 이것은 합성된 보충 또는 이중 DNA 가닥을 생성한다. 도 4c를 참조하면, 제2 프리머가 용액에 추가되고 열이 인가된다. 합성된 가닥은 녹아서 재교배된다. 도 4d를 참조하면, 제2 세대 보충 가닥이 이후 합성된다. 도 4e를 참조하면, 모든 올리고머가 신장될 때까지 합성이 반복된다. 이러한 방법은 생성 및 분리된 템플릿 가닥의 상호 오염을 회피하기 위해서 봉인된 컨테이너(sealed container)에서 수행되는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 건조 또는 젖은 상태에서 분자의 일부 또는 촉매량(catalytic amount)의 분자가 표면(1)과의 기계적인 접촉을 통해서 스탬프(2)로부터 표면(1)으로 전사된다. 이것은 표면(1)보다 스탬프(2)에 더 강하게 결합되는 전사될 분자에 의해서 달성된다.
표면(1)에서 또는 스탬프(2)에서 비특유 흡착(nonspecific adsorption)을 방지하는 제어 가능한 화학 흡착 프로토콜을 채용하는 것이 바람직하다. 그러한 반응의 예는, ATPS로부터의 NHS-PEG-triethoxysilane와 같은 헤테로이중기능 시약(heterobifunctional reagent) 및 (a, w)NHS-PEG 2000과 같은 호모이중기능 PEG, 증가된 온도에서 유리 면간의 갭을 채움으로써 유리 표면에 노출되는 Rapp Polymere의 준비를 수반한다. 화학 흡착은, NHS-활성 표면에 적용되는 PDMA 미세유체 시스템을 아미노-기능화된 올리고머의 수용액으로 채움으로써 수행될 수 있다.
PCR 증폭은, 도 3을 참조하며 본 명세서에 전술된 바와 같이 두 개의 표면 결합 프리머를 사용하거나 도 4를 참조하며 본 명세서에 전술된 바와 같이 하나의 표면 결합 프리머 및 하나의 가용성 프리머를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 후자의 경우에는, 초미량의 중간 템플릿이 그 합성 위치에서 확산될 수 있고 인접한 영역으로 확산될 수 있다. 따라서, 가용성 프리머 기반 PCR 증폭으로 한정하는 것이 바람직하다. 바이오센서 애플리케이션에 대해, 안티센스 가닥(antisense strand)이 아닌 단지 하나의 센스 가닥(sense strand)이 표면(1)에 존재하여야 한다. 따라서, 다른 가닥은 표면으로부터 쪼개지거나 예컨대 가용성 프리머를 사용함으로써 화학적 부착을 방지하는 것이 바람직하다.
다시 도 1을 참조하면, 먼저 설명한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예에서, 스탬프(2)의 활성 영역(5, 6)이 템플릿 가닥과 같은 잉킹 분자 및 포획 분자로 선택적으로 코팅된다. 그러한 선택적인 코팅은 다양한 범위의 상이한 방법을 통해 수행될 수 있으며, 이는 본 명세서에 전술된 바와 같이 피펫팅 단계, 모세관 인쇄 단계, 잉크젯 단계 및 핀 스포팅 단계를 포함한다. 미세 유체 네트워크를 통한 또는 선택적 개구를 갖는 스텐실(stencil)을 통해 잉크를 적용하는 것과 같은 다른 코팅 기법도 동일하게 가능하다. 지형학적으로 패터닝된 스템프는 잉크로 패터닝된 평면 스탬프보다 더욱 더 정확한 패턴을 일반적으로 생산한다. 이것은 활성 영역(5, 6)이 지형학적으로 분리되어 있기 때문이다. 활성 영역(5, 6)이 돌출하는 경우 및 움푹 파인 경우 양자에 대하여 경계를 정하는 것이 효과적이다.
이하 도 5를 참조하면, 본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 스탬프(2)는 기공(pore: 42)의 형태로 복수의 활성 영역을 갖는 보디(body: 41)를 포함한다. 기공(42)은 각 단에서 개방되거나 또는 일단에서 폐쇄될 수 있다. 도 5b를 참조하면, 각 기공(42)은 친수성 폴리머 젤 매트릭스(43)로 채워진다. 도 5c를 참조하면, 각각의 기공(42)은 상이한 종의 분자(44)로 채워질 수 있다. 스텐실(45) 또는 미세유체 네트워크가, 채우는 단계동안에 다른 기공으로부터 각각의 기공(42)을 마스킹하기 위해 채용될 수 있어서, 기공(42)의 상호 오염을 방지할 수 있다. 채우는 단계는 확산에 의해 또는 전기장에 의한 것일 수 있다. 도 5d를 참조하면, 동작 중에, 스템프(2)가 표면(1)과 접촉한다. 분자가 기공(42)의 젤(gel)로부터 표면(1)상에 인쇄된다. 도 5e를 참조하면, 분자의 인쇄된 영역(56)이 표면(1)의 좌측에 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시예에서, 기공(42)은 각각 다른 종의 템플릿 DNA로서 로딩된다. 물(47) 또는 버퍼를 빨아올림으로써, 젤(43)은 100% 습도 환경 에서 그 평형(equilibrium)으로 팽창한다. 스탬프(2)는 이후의 젤(42)의 건조를 방지하기 위해서 습한 환경에서 저장될 수 있다. 약 1W%의 DNA를 젤에 로딩함으로써, 매번 전사되는 DNA의 촉매 작용 양으로서 수만 개의 표면이 동일한 스탬프(2)로부터 인쇄될 수 있다. 촉매 작용 시드계층의 연이은 증폭이 DNA 단일계층을 완성하기 위해서 채용될 수 있다. 스탬프(2)를 다시 채우는 것은, 스탬프(2)가 더 이상 시드계층을 전사할 수 없을 경우에만 수행되는 것이 바람직하다. 시드계층을 증착하기 위해서, 스탬프(2)가 표면(1)과 접촉하게 되어서 바람직한 양의 시드 분자를 전사한다. 스탬프(2)는 액체에 담가질 필요가 있어서, 인쇄 복잡도를 감소시킨다. 젤(43)은 분자의 완전 수화(hydration)를 가능하게 해서 분자의 표면(1)으로의 화학 흡착을 개선시킨다. 젤(43)은 투과성이 있어서 트랩된(trapped) 물이 빠져나가도록 한다. 이것은 제3 매체의 존재 시에 인쇄 표면의 분리를 방지한다. DNA는 젤(43) 내부보다는 기공(42)의 표면에 보관될 수 있다. 여기서, 기공(42)이 서로로부터 고립된 채로 제3 매체에서 스탬프(2) 및 표면(1)간의 접촉을 이루는 것이 바람직하다. 접촉 이후에, 온도가 증가되어서 초미량의 템플릿 DNA 가닥이 스탬프(2)로부터 해리되는 것 및 표면(1)에 증착되는 것을 촉진한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 도 1을 참조하여 본명세서에서 전술된 스탬프(2)의 활성 영역(5, 6)에 템플릿 DNA 가닥을 포획하기 위해서 올리고머가 제공된다. DNA 가닥은 이후 표면(1)에 노출되어서, 전형적으로 <0.1%인 단지 작은 조작의 DNA 단일계층만이 전사된다. 이것은, 표면에 더 짧은 길이를 갖는 교배 앵커를 제공함으로써 달성된다. 전사된 DNA 가닥의 개수는, 0.1%의 전사율 및 2nm의 DNA 직경에서 평방 마이크로미터 당 약 25 개이다. 따라서, 재잉킹이 필요로 되기 전에 스탬프(2)가 수백회의 인쇄 동작에 사용될 수 있다. 표면 결합 프리머를 수반하는 본 명세서에 전술된 PCR 증폭 기법을 통하여, 표면의 DNA 가닥의 밀도는 이후 포화되게 된다. 스탬프(2)의 활성 영역(5, 6)은 크기에 있어서 마이크론(micron)에서 밀리미터에 이를 수 있다.
또한, PCR에 대한 템플릿을 프리머로 패터닝하는 것은 미세유체 네트워크에 의해 달성될 수 있다. 낮은 농도의 템플릿을 갖는 용액의 사용 및 템플릿의 표면으로의 빠른 결합에 불리한 조건은 템플릿의 절약 및 표면에서의 균일 영역(homogeneous area)의 패터닝을 가능하게 한다. 또한, 인쇄된 단일계층에서의 결함의 수정 및 자동촉매작용 중심(autocatalytic center)이 인쇄되고 촉매작용 반응이 시작되는 상황에 대해 복제가 적용될 수 있다.
Claims (23)
- 표면에 분자의 단일계층(monolayer)을 생성하기 위한 방법에 있어서,스탬프(stamp)로 시드 분자(seed molecules)를 로딩하는 단계;상기 스탬프로부터 상기 표면으로 시드 분자를 전사하는 단계; 및상기 단일계층을 생성하기 위해서 증폭 반응을 통해 상기 시드 분자를 증폭하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 2은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제1항에 있어서,상기 전사하는 단계는 상기 스탬프에 로딩된 상기 시드 분자의 일부를 상기 표면으로 전사하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 전사하는 단계는 상기 시드 분자를 상기 스탬프로 흡수하는 단계 및 상기 시드 분자를 상기 표면으로 흡수하는 단계를 포함하고, 상기 시드 분자의 상기 스탬프로의 흡수가 상기 시드 분자의 상기 표면으로의 흡수보다 더 강력한 방법.
- 제1항에 있어서,상기 증폭하는 단계는 상기 시드 분자의 선형 증폭(linear amplification)을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 증폭하는 단계는 상기 시드 분자의 지수 증폭(exponential amplification)을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 증폭하는 단계는 상기 시드 분자의 지향 증폭(directional amplification)을 포함하는 방법.
- 청구항 7은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제6항에 있어서,상기 시드 분자는 지향 증폭되어 도전성 구조를 형성하는 방법.
- 청구항 8은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제6항에 있어서,상기 지향 증폭된 시드 분자를 금속으로 무전해 도금(electroless plating)하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 9은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제6항에 있어서,상기 지향 증폭은 상기 표면에 대해 수평 방향을 이루는 복합체(complex)의 기하구조(geometry)에 의해 설정되는 지향 방식으로 시드 분자가 증폭되는 방법.
- 삭제
- 청구항 11은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제6항에 있어서,상기 지향 증폭은 전기력(electrical force), 자기력(magnetic force) 및 유체력(hydrodynamic force) 중 어느 하나의 외력에 의해 시드 분자가 증폭되는 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,상기 증폭하는 단계는 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)을 포함하는 방법.
- 청구항 15은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제14항에 있어서,상기 폴리머라제 연쇄 반응은 적어도 하나의 프리머(primer)를 상기 표면에 결합하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 16은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제15항에 있어서,상기 폴리머라제 연쇄 반응은 용액에 프리머를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 증폭하는 단계는 단백질의 단일계층을 생성하기 위해 인 비트로 변환 시스템(in vitro translation system)을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서,상기 시드 분자는 무전해 증착(electroless deposition)을 위한 촉매 중심(catalyst center)을 포함하는 방법.
- 청구항 19은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제1항에 있어서,무전해 증착을 위해 촉매를 상기 시드 분자에 결합하는 단계를 포함하는 방법.
- 청구항 20은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제1항에 있어서,상기 단일계층이 상기 표면을 식각액(etchants)으로부터 보호하는 방법.
- 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,상기 단일계층은 DNA를 포함하는 방법.
- 청구항 22은(는) 설정등록료 납부시 포기되었습니다.제1항 내지 제9항, 제11항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,상기 스탬프로 시드 분자를 재로딩하기 전에, 복수의 표면에 대해 상기 전사하는 단계 및 상기 증폭하는 단계를 반복하는 단계를 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제9항, 제11항 및 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 처리된 표면을 포함하는 바이오센서(biosensor).
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