KR100781056B1 - 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을나타내는 유전자 ｒｔｒ1 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자에 관한 것으로, 애기장대에서 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자를 연구함으로써, 병원균에 대한 기주의 방어 체계를 모델 식물에서 연구하여 유용 유전자를 발굴하고, 이를 작물에 적용하고자 하였다.
애기장대, 담배 링스팟 바이러스(TRSV), RTR1, 병 저항성

Description

담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자 ＲＴＲ1{RTR1 acts as a dominant negative regulator of systemic necrosis on Tobacco ring spot virus-infected Arabidopsis}
도 1은 담배 링스팟 바이러스에 감염된 대두와 애기장대의 병징 발현을 나타내는 사진이다.
도 2는 담배 링스팟 바이러스를 애기장대 생태형인 Col-O 와 Estland에 접종한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 애기장대 생태형인 Estland에 담배 링스팟 바이러스를 접종하여 온도에 따른 병징의 발현을 관찰한 사진이다.
도 4는 목표 유전자의 지도-기초 클로닝(map-based cloning)을 위해 작성한 지도이다.
도 5A는 목표 유전자의 클로닝을 위한 Fosmid 라이브러리 제작 과정을 나타내는 모식도이고, 5B는 BamHⅠ에 의해 절단된 Fosmid 클론의 전기영동 결과를 나타내는 사진이다(M; 1kb DNA ladder, 1-2; Uncut fosmid clone, 4-13; BamH I digested fosmid clones, 14; Uncut control fosmid clones containing 35 kb insert, 15-16; BamH I digested control clones).
도 6A는 클론의 풀링(pooling) 에 의한 라이브러리 스크린닝을 수행한 과정을 나타내는 모식도이고, 6B는 위양성(false positvie)을 검증하기 위해 Sau3 Al로 절단한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다(C: 대조구).
도 7은 선발된 Fosmid 클론들의 양말단의 염기서열 분석을 통해 콘티그 (contig)를 작성한 지도이다.
도 8은 RTR1의 mapping interval내에 존재하는 여러 유전자들을 ORF 및 데이타베이스의 어노테이션을 토대로 나타내는 그림이다.
도 9는 선발된 Fosmid 클론들을 부분 절단하여 5~7 kb의 인서트(insert)를 pPZP211에 클로닝 한 후 양말단의 연기서열 분석을 통해 콘티그(contig)를 작성한 지도이다.
도 10은 선발된 18개의 서브클론을 가지고 Col-0에 형질전환 후 TRSV에 대한 병징을 확인하여 7-21 클론이 RTR1 유전자를 포함하고 있음을 나타낸 사진이다.
도 11은 RTR1의 아미노산 서열과 도메인의 위치를 나타낸 사진이다.
도 12는 기존에 알려진 TIR-NBS-LRR type의 유전자와 RTR1의 도메인(domain) 구조를 비교한 모식도이다.
도 13은 RTR1의 보존 부위(conserved motif)를 나타내고있다. 식물에서 알려진 TIR-NBS-LRR type 유전자와 RTR1을 alignment를 보여주는 사진이다.
도 14는 Estand의 RTR1 과 Col-0의 rtr1의 아미노산 서열을 비교하여 나타내는 사진이다.
도 15는 애기장대의 여러 가지 생태형에서 가지고 있는 RTR1의 LRR 과 CNL 도메인 의 아미노산 서열을 나타내는 사진이다.
도 16는 Estand의 RTR1 과 Col-0의 rtr1의 LRR 영역의 예상되는 3차구조를 비교하여 나타내는 사진이다.
도 17은 Col-0와 Estland에서의 TRSV movement와 PR1 발현양상을 노던 하이브리다이제이션(Northern hybridization)을 통해 알아본 사진이다.
본 발명은 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자에 관한 것으로, 애기장대에서 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자를 연구함으로써, 병원균에 대한 기주의 방어 체계를 모델 식물에서 연구하여 유용 유전자를 발굴하고, 이를 작물에 적용하고자 하였다.
담배 링스팟 바이러스(Tobacco ringspot virus, TRSV)에 감염되면 초기 도관 조직의 괴사에 이어서 잎 전체로 세포사멸이 진전되어 괴사 증상이 식물체 전체로 확산되다. 대두를 포함하여 다른 콩과 작물과 자운영의 경우 성장 초기에 감염되면 생장점 또는 식물체 전체에 전신 사멸을 유도한다.
대두, 자운영 등의 주요 기주 작물에서 담배 링스팟 바이러스(Tobacco ringspot virus, TRSV)에 의해 나타나는 세포 사멸에 의한 괴사(necrosis)는 병원균에 의해 유도되는 초과민성 반응(hypersensitive response, HR)과 유사하며, 이는 작물의 저항성 유전자와 병원균 유전자의 상호작용 결과일 것으로 예상된다. 그러나 콩과 및 가지과 작물에서는 확보된 게놈(genome)의 정보나 마커(marker)가 분자생물학적인 연구를 위하여 풍부하지 않고 그 부재 등으로 인하여 병 발생에 결정적인 숙주인자(host factor)의 발굴이 어려운 실정이다.
따라서 본 발명에서는 담배 링스팟 바이러스의 자연적 숙주(natural host)는 아니지만 이러한 정보가 풍부한 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용하여, 병원균에 대한 기주의 방어 체계를 모델 식물에서 연구하여 유용 유전자를 발굴하고, 이를 작물에 적용하고자 하였다.
본 발명의 목적은 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자 RTR1을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 유전자 RTR1을 이용하여 형질전환된 바이러스성 병원균에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기의 유전자 RTR1으로 형질전환하여 바이러스성 병원 균에 저항성을 가지는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자 RTR1 을 제공한다.
본 발명은 상기의 유전자 RTR1을 이용하여 형질전환된 바이러스성 병원균에 저항성을 가지는 형질전환 식물체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 유전자 RTR1으로 형질전환하여 바이러스성 병원균에 저항성을 가지는 방법을 제공한다.
본 발명에서 Col-O, 에스트랜드, H55, Aa-O, Gr-3 및 Bsch-O는 각각 미국의 콜럼비아(Columbia), 독일, 체코슬로바키아, 독일의 Aua, 오스트리아의 Graz 및 독일에서 분리한 애기장대의 생태형(ecotype)을 나타낸다.
본 발명에서는 목표 유전자(target gene)를 RTR1 (Resistance to Tobacco ringspot virus)으로 명명하여 사용하였으며, 상기 유전자는 애기장대의 생태형인 Estland에서 분리하였으며, 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자이다. rtr1은 애기장대의 다른 생태형인 Col-O에서 분리한 유전자이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
대두, 자운영 등의 주요 기주 작물에서 담배 링스팟 바이러스(Tobacco ringspot virus, TRSV)에 의해 나타나는 세포 사멸에 의한 괴사(necrosis)는 병원균에 의해 유도되는 초과민성 반응(hypersensitive response, HR)과 유사하며, 이는 작물의 저항성 유전자와 병원균 유전자의 상호작용 결과일 것으로 예상된다. 그러나 콩과 및 가지과 작물에서는 확보된 게놈(genome)의 정보나 마커(marker)가 분자생물학적인 연구를 위하여 풍부하지 않고 그 부재 등으로 인하여 병 발생에 결정적인 숙주인자(host factor)의 발굴이 어려울 것으로 판단되었다. 그리하여 본 발명에서는 담배 링스팟 바이러스의 자연적 숙주(natural host)는 아니지만 이러한 정보가 풍부한 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 이용하였다. 애기장대의 게놈 정보를 이용하여 마커를 디자인 하고 이를 이용해 숙주 인자의 유전자 지도를 작성하였으며 이를 근거로 숙주 인자의 지도-기초 클로닝(map-based cloning)을 시도하였다.
본 발명에서는 애기장대를 가지고 담배 링스팟 바이러스를 접종한 결과 자운영 및 대두의 반응과 유사한 병징을 나타내어 전신사멸을 유발하는 생태형(eco-type)인 에스트랜드(Estland), Bsch-0 그리고 H55를 선발하고 바이러스에 대해 내성(Tolerance)을 나타내는 Col-0, Aa-0 그리고 Gr-3를 이에 대응하는 대조구로 하여 담배 링스팟 바이러스에 의해 유발되는 병징 발현을 제어하는 유전자의 클로 닝(cloning)을 시도하였다. 담배 링스팟 바이러스의 감염에 의해 작물에서 나타나는 병징의 발현이 애기장대에서 동일하게 나타난다는 것은 식물에 의한 바이러스의 인식 및 방어 체계가 유사하며, 매우 넓은 범위로 식물 전체에 존재하는 것으로 추정될 수 있다. 따라서 병원균에 대한 기주의 방어 체계를 모델 식물에서 연구하여 유용 유전자를 발굴하고, 이를 작물에 적용하는 것이 보다 더 효율적이다.
본 발명에서는 애기장대 생태형인 에스트랜드(Estland)와 Col-O를 4-way 상반교잡(4-way reciprocal cross)하여 담배 링스팟 바이러스에 대한 반응을 살펴보았다. 이들의 부모(parent)인 F1은 TRSV에 의해 모두 전신사멸을 일으켰고, F2 식물은 1:3으로 분리된 결과를 보임으로써, TRSV에 의한 병징 발현이 하나의 우성 유전자에 의해 조절됨을 알 수 있었다.
본 발명에서는 담배 링스팟 바이러스를 에스트랜드(Estland)에 접종하여 30℃에서 배양하였을 때는 바이러스에 의한 병징의 발현이 완전하게 억제되었으나, 온도를 25℃로 바꾸어 배양하였더니 이틀째에 점진적인 병징의 발현이 아닌 식물체 전체에 전신 세포 사멸이 관찰되었다. 이는 바이러스 인자(viral factor)의 인식이 30℃에서 억제되는 것으로 추정되며, 담배 모자이크 바이러스의 저항성 유전자인 N 유전자(N gene)에서 동일한 현상이 나타나는 것으로 보고되었다.
본 발명에서는 애기장대 게놈의 유전적 마커(genetic marker)들을 이용하여 유전자 지도를 작성한 결과, RTR1은 애기장대의 5번 염색체(chromosome 5)에 위치하고 DFR 마커와 nga129 마커사이에 위치하며, yUP5F5 YAC 클론의 말단에 위치한 yUP5F5LE 마커와 RTR1이 co-segregation 하는 것을 확인하였으며, 애기장대 데이타베이스의 뉴클레오티드 염기서열(nucleotide sequence)을 이용하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 마커인 SSR 마커와 CAPS 마커를 제작하여 현재 최종적으로 약 110kb 정도의 mapping interval을 확보하였다. 이를 바탕으로 에스트랜드(Estland) genomic DNA를 가지고 라이브러리(Library)를 만들고 mapping interval region을 포함하는 clone들을 Col-0 plant에 형질전환 시켜 TRSV를 접종했을때 에스트랜드(Estland)에서와 같은 symptom을 보이는 clone을 찾는 실험을(complementation test) 수행하였다.
본 발명에서는 병징 발현을 조절하는 유전자의 클로닝을 위하여 선행 연구결과를 토대로 하여 약 110 kb로 예상되는 map interval에 위치하는 게놈 DNA (genomic DNA, gDNA)를 확보하기 위하여 gDNA 라이브러리를 fosmid 벡터에 작성하였다. 라이브러리(Library)의 크기는 약 5 × 104으로 최종 확인되었다. 120,000 kb 정도의 애기장대의 게놈 크기를 기준으로 fosmid clone의 삽입 크기가 35~45 kb임을 감안한다면 최소 17배의 게놈을 커버(cover)할 수 있기 때문에 map interval을 포함하는 gDNA를 가진 클론을 선발하는데 어려움이 없을 것으로 판단되어 gDNA 라이브러리의 스크린닝(screening)을 수행하였다.
본 발명에서는 콜로니 잡종화(Colony hybridization)에 의한 클론의 선발은 매우 낮은 복제 수를 가진 fosmid의 특성으로 인하여 방대한 양의 서든 블랏팅(southern blotting)이 요구되고 성공 가능성이 매우 낮을 것으로 판단되어 클론의 풀링(pooling) 및 PCR에 의한 스크린닝이 수행되었다. 약 100kb의 게놈 영역에 7개의 탐침(probe)을 작성하여 PCR을 수행한 결과 13개의 양성 클론(positive clone)이 선발되었다.
본 발명에서는 선발된 13개의 클론 가운데 인서트(insert) 말단의 염기서열을 결정하여 콘티그(contig)를 완료하였다. 중복되거나 map interval의 좌우측 gDNA 영역이 과도하게 포함된 클론을 제외한 클론을 최종적으로 선발하여 서브클론의 제작에 사용하였다. 선발된 클론의 양 말단의 염기서열을 결정하여 콘티그(contig)를 작성하였고, 각각의 fosmid 클론을 Sau3AI으로 부분 절단(partial digestion)하여 약 5-7 kb 정도의 인서트를 바이너리 벡터(binary vector)에 클로닝하여 서브클론을 선발하였다.
형질 전환 및 검정을 위하여 5개의 클론으로 부터 제작된 서브클론들을 제작하였다. 평균 5~7 kb의 인서트를 가진 서브클론들을 pPZP211에 제작 및 선발하여 염기서열을 결정하고 이를 토대로 하여 Col-0에 형질전환 하였다. 선발된 서브클론의 인서트를 확인한 다음 map interval에 존재하는 ORF (open reading frame) 및 데이타베이스의 어노테이션(annotation)을 토대로 하여 병 저항성 및 병징 발현과 관련된 유전자를 포함하는 서브클론을 우선적으로 형질 전환하였다.
Fosmid 라이브러리를 스크린닝하여 선발된 4개의 fosmid 클론으로부터 약 220 여개의 서브클론들을 선발하였다. 인서트 양 말단의 염기서열을 확인하여 콘티그를 작성하였고 Col-0를 기준으로 Arabidopsis database의 annotation data를 참고하여 이들 가운데 약 8 kb < 인서트(insert)를 가진 클론들을 Col-0의 형질전환에 사용하였다.
최종적으로 18개의 서브클론들을 형질전환에 사용하였다. 유전적 데이타에 의하면 RTR1은 우성이기 때문에 이형접합체(heterozygote)인 T1 식물에 TRSV를 접종하여 나타나는 형질을 관찰하여 RTR1을 포함하고 있는 클론을 동정할 수 있다. 각각의 클론에 의하여 형질전환된 T1 식물 약 300여개를 접종한 결과 TRSV의 감염에 의하여 뚜렷한 형질의 변화를 나타내지 않은 클론은 모두 17개였으며 유일하게 7-21 클론에 의하여 형질전환된 Col-0 T1 plant는 Estland에서 보이는 전신적인 괴사반응(systemic necrosis)를 나타내었다. 따라서 7-21 클론에 RTR1이 포함되어 있을 것으로 추정되어, 이 클론이 가진 인서트의 염기서열을 확인한 결과 full length의 at5g44870과 truncated at5g44875가 포함되어 있었다. At5g44875는 TNP2-like transposable element이며 7-21 클론상에서 truncation이 되어 있기 때문에 이 유전자가 RTR1일 가능성은 없다. 따라서 at5g44870을 최종적으로 RTR1으로 동정하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 담배 링스팟 바이러스의 애기장대에서 병징 발현 여부 조사
애기장대에 담배 링스팟 바이러스를 접종한 결과, 자운영 및 대두의 반응과 유사한 병징을 나타내었다(도 1).
이들 중 전신사멸을 유발하는 생태형(eco-type)인 에스트랜드(Estland), Bsch-0 그리고 H55를 선발하고 바이러스에 대해 내성(Tolerance)을 나타내는 Col-0, Aa-0 그리고 Gr-3를 이에 대응하는 대조구로 하여 담배 링스팟 바이러스에 의해 유발되는 병징 발현을 제어하는 유전자의 클로닝(cloning)을 시도하였다.
실시예 2. 단일 우성 유전자에 의해 담배 링스팟 바이러스에 의한 초과민성 반응 표현형이 조절되는 증거
4-way 상반교잡(4-way reciprocal cross)에 의해 얻어진 F2 식물들의 TRSV에 대한 반응. 이들의 부모(parent)인 F1은 TRSV에 의해 모두 전신사멸을 일으켰으며 F2 식물은 1:3으로 분리된 결과로 보아 TRSV에 의한 병징 발현이 하나의 우성 유전자에 의해 조절됨을 알 수 있다.
[표 1]
교잡 타입 내성 민감성 비율
Col-0 x Estland F1 0 47 모두 민감성
F2 13 44 1 : 3
Estland x Col-0 F1 0 32 모두 민감성
F2 25 80 1 : 3
실시예 3. 온도 의존성을 나타내는 RTR1 에 의한 병징의 발현
담배 링스팟 바이러스를 에스트랜드(Estland)에 접종한 다음 30℃에서 7일 동안 배양하여 바이러스의 전신 감염을 유도하였다. 그 결과 바이러스에 의한 병징의 발현이 완전하게 억제되었다. 그 후, 온도를 25℃로 바꾸어 배양하였더니 이틀째에 전체 식물에 점진적인 병징의 발현이 아닌 식물체 전체에 전신 세포 사멸이 관찰되었다(도 3). 따라서 RTR1에 의한 바이러스 인자(viral factor)의 인식은 30℃에서 억제되는 것으로 추정된다. 담배모자이크 바이러스(TMV)의 저항성 유전자인 N gene에 서 동일한 현상이 나타나는 것으로 보고되었다.
실시예 4. 목표 유전자의 지도-기초 클로닝을 위한 최종적인 map interval의 결정
애기 장대의 마커들을 이용해서 유전자 지도를 작성한 결과 RTR1은 애기장대의 5번 염색체 (chromosome 5)에 위치하며, DFR 마커와 nga129 마커 사이에 위치하고 있음을 확인하였다. 또한 yUP5F5 YAC 클론의 말단에 위치한 yUP5F5LE 마커와 RTR1이 co-segregation 하는 것을 확인하였다(도 4). 애기장대 데이타베이스의 뉴클레오티드 염기서열을 이용하여 PCR 마커인 SSR 마커와 CAPS 마커를 제작하여 현재 최종적으로 약 110kb 정도의 mapping interval을 확보하고 상보성(complementation) 테스트를 수행하였다.
실시예 5. RTR1 클로닝을 위한 gDNA 라이브러리의 제작
병징 발현을 조절하는 유전자의 클로닝을 위하여 상기의 연구 결과를 토대로 하여 약 110 kb로 예상되는 map interval에 위치하는 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 확보하기 위하여 gDNA 라이브러리(gDNA library)를 fosmid 벡터(fosmid vector)로 제작하였다. 라이브러리의 크기는 약 5 × 104으로 최종 확인되었다. 120,000 kb 정도의 애기장대의 게놈 크기를 기준으로 fosmid 클론(clone)의 삽입 크기가 35~45 kb 임을 감안 한다면 최소 17배의 게놈을 커버(cover)할 수 있기 때문에 map interval을 포함하는 gDNA를 가진 클론을 선발하는데 어려움이 없을 것으로 판단되어 gDNA 라이브러리의 스크린닝(screening)을 수행하였다.
Fosmid 라이브러리의 제작은 게놈 DNA를 30~40kb 크기로 추출하여 말단 수선(end-repair)하고 평활말단(blunt-end)를 만들어 Fosmid vector인 pCC1FOS에 삽입한다. 삽입된 DNA를 Maxplax Lambda packaging extracts로 packaging하여 EPI300-T1 cell에 섞어준다. 12.5㎍/㎖ chloramphenicol이 들어있는 LB plate에서 코로니(colony)를 선별(selection)한다(도 5A). BamH I에 의해 절단(digestion)된 fosmid 클론의 인서트(insert) 크기는 8 kb 벡터를 제외하고 평균 약 40 kb로 확인되었다(도 5B).
실시예 6. gDNA 라이브러리 스크린닝 및 클론의 선발
콜로니 잡종화(Colony hybridization)에 의한 클론의 선발은 매우 낮은 copy number를 가진 fosmid의 특성으로 인하여 방대한 양의 서든 블랏팅(southern blotting)이 요구되고 성공 가능성이 매우 낮을 것으로 판단되어 클론의 풀링(pooling) 및 PCR에 의한 스크린닝을 수행하였다. 전체 라이브러리를 약 50개의 풀(pool)로 나누어 PCR에 의해 스크린닝한 다음 양성 풀(positive pool)은 다시 작은 크기의 서브풀(subpool)을 만들어 동일한 방법으로 전체 라이브러리를 스크린닝 하였다(도 6A). 그 결과, 약 100kb의 게놈 부위에 7개의 탐침(probe)을 작성하 여 PCR을 수행한 결과 13개의 양성 클론(positive clone)이 선발되었다. 그리고 양성 PCR 산물의 위양성(false positive)을 검증하기 위하여 PCR 산물의 제한효소 절편길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)을 수행하였다(도 6B). 대조구와 비교하여 PCR 산물 크기는 동일하나 RFLP 패턴(pattern)이 다른 것은 콘티그(contig) 작성시 위양성(false)으로 간주되어 제외되었다.
실시예 7. 선발된 클론의 말단 염기서열 결정
상기의 실시예에서 선발된 13개의 클론 가운데 인서트 말단의 염기서열을 결정하여 콘티그(contig)를 완료하였다. 중복이 되거나 map interval의 좌우측 gDNA 지역이 과도하게 포함된 클론을 제외한 클론을 최종적으로 5개 선발하여 서브클론(subclone)의 제작에 사용하였다. 선발된 fosmid 클론들의 콘티그 작성 및 서브클론의 제작은 선발된 클론의 양 말단의 염기서열을 결정하여 콘티그를 작성하였고(도 7), 각각의 fosmid 클론을 Sau3 AI으로 부분 절단하여 약 5~7 kb 정도의 인서트(insert)를 pPZP211 벡터에 클로닝하여 서브클론(subclone)을 선발하였다.
실시예 8. 상보성 테스트를 위한 형질 전환 및 검정
상기 실시예에서 제작된 평균 5~7 kb의 인서트를 가진 서브클론들을 선발하여 map interval에 존재하는 ORF(open reading frame) 및 데이타베이스의 어노테이 션(annotation)을 토대로 하여 병 저항성 및 병징 발현과 관련된 유전자를 포함하는 서브클론을 우선적으로 형질 전환하였다. 도 8은 RTR1의 mapping interval내에 존재하는 여러 유전자들을 나타낸다.
실시예 9. 상보성 테스트를 위한 서브클론 선발
Fosmid 라이브러리를 스크린닝하여 선발된 4개의 fosmid 클론으로부터 약 220 여개의 서브클론들을 선발하였다. 인서트 양 말단의 염기서열을 확인하여 콘티그를 작성하였고 Col-0를 기준으로 애기장대 데이타베이스의 어노테이션 데이타를 참고하여 이들 가운데 약 8 kb < 인서트(insert)를 가진 클론들을 Col-0의 형질전환에 사용하였다.
도 9는 서브클론들의 지도상에서의 상대적인 위치를 나타내며 붉은색, 초록색 및 녹색은 선발된 순서이며, 하나의 막대가 각각의 서브클론을 나타낸다. 약 110 kb 지도 영역에서 최종적으로 18개의 클론이 선발되었다. 크기가 큰 인서트를 가진 클론을 사용할 경우 지도 영역 내 약 27개의 ORFs가 있기 때문에 반복적인 상보성(complementation)이 필수적이다. 따라서 클론의 수를 늘리고 연구의 진행을 수월하게 하기 위하여 작은 인서트를 가진 클론을 선발하여 테스트(test)를 완료하였다.
실시예 10. 최종 18개 서브 클론들에 의하여 형질전환된 Col-0의 TRSV접종 결과
최종적으로 18개의 서브클론들을 형질전환에 사용하였다. 유전적 데이타에 의하면 RTR1은 우성이기 때문에 이형접합체(heterozygote)인 T1 식물에 TRSV를 접종하여 나타나는 형질을 관찰하여 RTR1을 포함하고 있는 클론을 동정할 수 있다. 각각의 클론에 의하여 형질전환된 T1 식물 약 300여개를 접종한 결과 TRSV의 감염에 의하여 뚜렷한 형질의 변화를 나타내지 않은 클론은 모두 17개였으며, 유일하게 7-21 클론에 의하여 형질전환된 Col-0 T1 식물은 에스트랜드(Estland)에서 보이는 시스템적인 괴사(systemic necrosis)를 나타내었다. 따라서 7-21 클론에 RTR1이 포함되어 있을 것으로 추정되었다. 이 클론이 가진 인서트의 염기서열을 확인한 결과 full length의 at5g44870과 truncated at5g44875가 포함되어 있었다. At5g44875는 TNP2-like transposable element이며 7-21 클론 상에서 truncation이 되어 있기 때문에 이 유전자가 RTR1일 가능성은 없으므로 at5g44870을 최종적으로 RTR1으로 동정 하였다.
도 10은 7-21 클론에 의해 형질전환된 T1 Col-0의 TRSV에 의한 병징의 발현 양상을 나타내며, 도 10A는 TRSV 접종 8일째 Col-0가 나타내는 병징으로 바이러스에 의한 병징이 전혀 나타나지 않았다. 도 10B 및 C는 TRSV 접종 8일째 T1 Col-0가 나타내는 병징으로 RTR1에 의해 유도되는 증상과 동일한 병징이 나타났으며 접종 2주가 되면 모든 조직에서 시스템적인 괴사가 발생했다.
실시예 11. RTR1의 동정 및 구조
RTR1은 전형적인 TIR-NBS-LRR 타입의 유전자로 밝혀졌다. 기능이 상실된 것으로 추정되는 rtr1과 아미노산 서열을 확인해 보면 LRR (leucine-rich repeat) 도메인(domain)에서 나타나는 20여개의 아미노산 서열의 변화로 인해 외부 신호의 인지 또는 다운스트림(downstream)으로의 신호 전달 기능이 상실된 것으로 보여진다.
RTR1의 암호화 영역(coding region)의 염기서열 및 아미노산 서열은 도 11과 같으며, 인트론(intron)을 제외하고 3,492개의 염기 또는 1,163개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 아미노 말단에서부터 TIR (toll-interleukin receptor), NBS (nucleotide binding site), LRR (leucine rich repeat), CNL (C-terminal non-LRR)이 위치해 있다. 기존에 알려진 TIR-NBS-LRR 타입의 유전자와 비교하면 RTR1의 암호화 구조는 5개의 엑손(exon) 및 4개의 인트론(intron)으로 구성된 RTR1은 N-gene, RPS4와 동일한 패턴의 구조를 가지고 있다(도 12).
또한 식물에서 알려진 TIR-NBS-LRR 타입 유전자와 RTR1 의 아미노산 서열을 정렬(alignment)하여 TIR domain (도 13 A), NBS domain의 P-loop (도 13B), LRR domain (도 13C)에서 보존된(conserved) 아미노산 서열이 확인되었다.
실시예 12.RTR1 (Estland)과 rtr1 (Col-0)의 아미노산 서열의 alignment.
RTR1과 rtr1의 개념적 번역(conceptual translation)에 의한 아미노산 서열 분석을 통하여 확인된 바에 따르면 LRR 도메인 일부에서의 아미노산 서열의 변화로 인하여 바이러스 감염시 병징의 발현이 전무하거나 식물체 전체에 시스템적인 괴사가 나타나는 극단적인 현상을 관찰하였다. 이러한 현상은 기존에 알려진 수 십 여개의 병 저항성 유전자에서는 확인되지 않은 것으로 식물체에서의 신호의 인식 및 전달 기작을 연구하는데 매우 가치가 큰 재료로 추정된다.
에스트랜드에서 분리된 RTR1 과 Col-O의 rtr1의 아미노산 서열을 정렬(alignment)하여 기능을 상실한 것으로 추정되는 rtr1을 RTR1과 비교해 보면 LRR의 일부 및 CNL 도메인에서 21개 아미노산 서열만 다를 뿐 TIR, NBS, 및 LRR의 대부분에서 동일한 서열임을 알 수 있었다. rtr1의 경우 총 21개 아미노산 서열의 변화 가운데 CNL 도메인의 두 지역에서 7개의 아미노산이 삽입된 것으로 나타났다(도 14). 여러 가지 생태형에서 예상되는 LRR 도메인의 아미노산 서열을 나타내보면 Col, Aa는 rtr1이며 Est, Bsch, H55는 RTR1으로, 기능이 상실된 단백질의 경우 공통적으로 나타나는 아미노산의 서열 변화를 확인하였으며(도 15), 이는 지정부위돌연변이(site-directed mutagenesis) 또는 도메인 스와핑(domain swapping)에 의한 키메라 유전자(chimeric gene)의 작성시 주요(key) 아미노산 동정에 활용되어질 예정이다.
도 16은 RTR1 LRR 도메인의 Cn3D에 의해 예측되는 구조를 나타내는데, RTR1(도 16A)과 rtr1 LRR 도메인(도 16B)의 예측된 3차원 구조의 비교한 것으로, 각각의 단백질이 가진 구조의 변화에 따른 기능적인 변화를 한국생명공학연구원 국가 유전체정보센터와 협력하여 아미노산 변화 조합에 따른 3차원 구조의 변화를 예측 분석하고 있다. 분석 결과에 따라 도메인의 3차 구조를 변화시키는 아미노산 서열의 조합을 도출하여 지정부위돌연변이(site-directed mutagenesis) 실험을 수행할 예정이다.
실시예 13. TRSV와 기주 식물간의 특이적인 인식에 의한 병징의 발현
Col-0와 Estland에 TRSV를 접종하고 0, 2, 4 그리고 6일 후에 접종한 잎과 접종하지 않은 잎(upper leaves)을 샘플링(sampling) 하여 각각 TRSV 역가(titer)와 PR -1의 발현양상을 확인한 결과 TRSV 역가(titer)는 Col-0와 에스트랜드(Estland)의 두 생태형에서 차이가 없음을 확인할 수 있었으며, PR -1은 Estland에서 Col-0 보다 발현양이 증가하는 것을 볼 수 있었다(도 17). TRSV의 감염에 따라 기주 식물이 나타내는 병징의 차이는 바이러스의 세포로의 침입, 복제 및 전사의 억제, cell-to-cell/long distance movement의 저해 등에 따라 병징의 발현 정도 및 시간이 결정되는 경우가 대부분을 차지하고 있다. TRSV의 감염에 의해 병징의 발현이 전혀 없는 Col-0와 전신 사멸이 일어나는 Estland의 바이러스 역가가 차이가 없는 것으로 보아 이는 바이러스 복제(replication)에 의해 나타나는 모자이크(mosaic) 또는 성장 저해에 의한 스턴팅(stunting)과 같은 바이러스에 의한 직접적인 피해가 아닌 기주 식물의 특정 인자들에 의해 병징의 발현이 조절됨을 알 수 있다. 따라서 Estland에서 볼 수 있는 TRSV에 대한 시스템적 사멸 표현형(systemic death phenotype)은 Etland가 가지고 있는 RTR1에 의해 바이러스에 대한 감수성(susceptibility)이 증가함에 따라 나타나는 것으로 생각되어진다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 RTR1유전자는 애기장대 생태형인 에스트랜드(Estland)에서 분리한 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 유전자로써, 병원균에 대한 기주의 방어 체계를 모델 식물에서 연구하여 유용 유전자를 발굴하여 제공하는 뛰어난 효과가 있다. 본 발명의 RTR1 유전자는 병 저항성에 관련한 작물 육종에 적용하여 유용하게 이용할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 담배 링스팟 바이러스에 의해 유도되는 초과민성 반응을 나타내는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 유전자 RTR1 .
  2. 제 1항의 상기 유전자는 애기장대 생태형인 에스트랜드(Estland)에서 분리하는 것을 특징으로 하는 유전자 RTR1.
  3. 제 1항의 상기 유전자를 이용하여 형질전환된 바이러스성 병원균에 저항성을 가지는 형질전환 식물체.
  4. 제 1항의 유전자로 형질전환하여 바이러스성 병원균에 대해 식물체가 저항성을 가지는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0199312A (ja) * 1987-10-13 1989-04-18 Oki Electric Ind Co Ltd 演算装置
US5840481A (en) 1985-03-21 1998-11-24 Cornell Research Foundation, Inc. Parasite-derived resistance

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Title
논문1993.12
논문1995.11.10
논문2004

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