KR100770968B1 - 2,3-디하이드록시프로필12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 형광 표지된 합성 아실글리세라이드를 사용하여, 방향족 물질의 배열에 원조하여 인지질/지질 복합 구조물[이층, 단층, 응집체, 마이셀(micelle)] 등의 전하 이동 복합체를 생성시키는 구조물을 동정하기 위한 간단한 연속 시험법, 리파제/리파제 억제인자의 활성을 측정하기 위한 이의 용도, 당해 시험법에 사용되는 모노아실글리세라이드 및 이의 제조방법, 이로부터 수득한 기질 및 당해 기질의 제조방법에 관한 것이다.
형광 표지, 아실글리세라이드, 지방산, 인지질, 리파제

Description

2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트 및 이의 제조방법{2,3-Dihydroxypropyl 12-(7-nitrobenzo[1,2,3]oxadiazol-4-ylamino)dodecanoates and a process for the preparation thereof}
본 발명은 형광 표지된 합성 아실글리세라이드를 사용하여, 방향족 물질의 배열에 원조하여, 예를 들면, 인지질/지질 복합 구조물[이층, 단층, 응집체, 마이셀(micelle)] 등의 전하 이동 복합체를 생성시키는 구조물을 동정하기 위한 간단한 연속 시험법 및 리파제/리파제 억제인자의 활성을 측정하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.
리파제, 포스포리파제 및 기타 지질분해 효소는 생명공학 및 의학 분야에서 매우 중요하다. 특정한 대사 장애에서, 이러한 질환의 병인에 부분적으로 관여하는, 지방 조직에서의 리파제 활성 증가가 감지될 수 있다. 생체의 에너지 저장량의 대부분은 지방 조직의 세포 속에 트리글리세라이드의 지방산으로서 저장되어 있다. 인슐린에 의해 유발되는 필수적인 동화작용 경로는 트리글리세라이드 합성을 위한 기질 흡수의 자극 및 지질생성반응의 증가를 포함한다. 인슐린에 의해 유발되는 또 다른 중요한 과정은 지질분해반응의 억제이며, 이로 인해 이화작용 호르몬, 주로 카테콜아민이 트리글리세라이드의 가수분해를 자극하여 지방산의 방출을 유도한다. 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)과 연관된 중요한 문제점은 지방 세포의 비억제 지질분해에 이의 원인이 있는 것이며, 이는 혈장 속의 에스테르화되지 않은 지방산의 농도를 증가시킨다. 기존의 발상에 따르면, 지방산은 간에서의 글루코즈신합성을 자극하고, 여전히 특성이 밝혀지지 않은 분자 메카니즘에 의해 골격근에서의 글루코즈 활용을 저하시킨다. 사실상, 지질분해반응의 억제인자, 예를 들어, 지방 세포의 니코틴산 수용체의 효능제에 의한 지방 세포에서의 지질분해반응의 억제는 혈장에서의 지방산 농도와 당뇨병 동물 및 환자에서의 상승된 혈당을 모두 감소시킨다. 불행하게도, 유익한 이들 효과는 특별히 강하게 나타나지 않으며, 비교적 단기적이다. 이는, 지질분해반응의 속도 결정 효소인, 호르몬 민감성 리파제(HSL)의 조절 메카니즘에 있어서의 간섭으로 유발되는 생리학적 반대조절에 기초할 수 있다. 적어도 지방 세포로부터의 지방산 방출의 억제와 관련하여, 지질분해반응의 억제가 NIDDM의 치료를 개선시킬 수 있는 것으로 추정하는 좋은 이유가 된다. 적당한 억제인자에 의한 HSL의 직접 억제는 이러한 경우에 HSL의 복잡한 조절로의 간섭이라는 명백한 난점을 피해가야 한다.
지질분해 효소의 활성은 통상적으로 방사선측정법, 적정법, 효소법 또는 형광 측정법/광도 측정법을 사용하여 연구된다. 방사선측정 분석법이 가장 민감하나, 이는 고가의 방사선표지 기질을 필요로 하고, 불연속적이며, 방사선표지 기질 을 방사선표지 제품으로부터 분리시킬 필요가 있다. 이러한 분리법은 종종 곤란하며, 방사선활성 폐기물의 회피/감소가 점점 중요해진다(다수의 시험이 존재할 경우에 특히 관련된다). 적정 시험법은 연속적이며, 천연 기질 및 합성 기질 둘 다를 사용하여 수행할 수 있으나, 종종 매우 낮은 감도를 나타내며, 방출된 양성자의 양에 영향을 미치는 조건에 민감하다. 지질분해반응의 생성물 중의 하나(예: 글리세롤)를 검출하기 위한 효소법이나 크로마토그래피법은 매우 민감하며 비교적 강하나, 실제로 효소법/크로마토그래피 검출법을 실행하기 전에 리파제 반응물의 항온처리 배치를 후처리할 필요가 있기 때문에 취급하기가 복잡하다. 효소 시험법의 커플링으로는 종말점 측정법("시간 정지" 측정법)만이 허용된다. 또한, 알려지지 않은 물질을 연구(예: 강력한 억제인자에 관한 탐색)할 경우, 검출 반응이 효소에 미치는 효과를 원칙적으로 배제할 수 없으므로, 적합한 대조군이 필요하다. 이들 사안은 형광 측정법/광도 측정법을 발전시키는 기동력이 된다. 원칙적으로, 이로 인해 방사선측정법의 감도가 수득되나, 발형광단(fluorophore) 또는 발색단(chromophore)을 사용하여 개질시킨 합성 기질이나 샘플을 사용할 필요가 있다. 전형적인 형광 측정법/광도 측정법은 방사선측정법과 동일하게 경로가 불연속적이며, 기질을 생성물로부터 분리시킬 필요가 있다. 최근에는, 기질과 비교하여 생성물의 형광도 또는 흡광도 최대치에서의 이동을 기본으로 하는, 연속적인 형광 측정 분석법/광도 측정 분석법이 개발되고 있다[참조: S. Hendrickson, Analyt. Biochem. 219(1994) 1-8]. 그러나, 이들 방법은 모두 포스포리파제, 지단백질 리파제, 콜레스테롤 에스테라제, 스핑고마이엘린아제 및 글루코실세라마이드 글루코 시다제의 검출로 한정된다. 트리글리세라이드 분해 효소(예: 호르몬 민감성 리파제, 모노글리세라이드 리파제, 디글리세라이드 리파제, 트리글리세라이드 리파제, 지단백질 리파제, 췌장 리파제, 간장 리파제, 세균성 리파제, PLA2, PLC, 콜레스테롤 에스테라제)의 연속적인 활성 측정에 적합한, 발형광단/발색단 그룹을 갖는 기질은 아직까지 알려지지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 형광 표지된 합성 아실글리세라이드를 사용하여, 방향족 물질의 배열에 원조하여, 예를 들면, 인지질/지질 복합 구조물(이층, 단층, 응집체, 마이셀) 등의 전하 이동 복합체를 생성하기 위한 구조물을 동정하기 위한 간단한 연속 시험법 및 리파제와 같은 지질 결합 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법을 개발하는 것이다.
지질 수송체는 지질을 인식하고, 리파제처럼 절단하지 않고, 대신에 생물학적 막을 통해 수송하는 단백질이다. 본원에서, 리파제는, 예를 들어, 문헌[참조: R. D. Schmid, R. Verger, Angew. Chem. 110(1998) 1694-1720]에 정의되어 있는 바와 같이, 생물학적으로 관련된 내인성 리파제를 의미하는 것으로 이해된다.
호르몬 민감성 효소는 의존성 인산화의 제2 메신저(예: cAMP) 또는 호르몬 조절하에 있는 기타 알로스테릭 메카니즘(예: 단백질-단백질 상호작용)에 의해 활 성에 영향을 미치는 효소를 의미하는 것으로 이해된다. cAMP 농도를 조절하는 호르몬으로는, 예를 들면, 아드레날린, 노르아드레날린, 글루카곤 및 인슐린이 있다.
본 발명은
a) 형광 표지가 부착된 지방산을 실온에서, 예를 들면, 비친핵성 무기 염기, 바람직하게는 알칼리 금속 탄산염 및 알칼리 금속 C1-C4-알칸올레이트, 특히 바람직하게는 메탄올레이트(예: 나트륨 메탄올레이트 또는 칼륨 메탄올레이트) 등의 염기를 첨가하면서 2,3-에폭시프로판올과 반응시켜, 예를 들면, C1-C4-알칸올, 바람직하게는 메탄올 등의 알콜 용액 중의 모노아실글리세라이드를 생성시키는 단계 및
b) 당해 모노아실글리세라이드를, 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 1:2 내지 3:1, 특히 바람직하게는 1:1 내지 1.5:1의 비(mg/mL)로 인지질과 함께 초음파 처리하여, 이로부터 황색에서 적색으로의 색상 변화로 인지 가능한 기질을 수득하는 단계를 포함하는, 기질의 제조방법에 관한 것이다.
형광 표지는 빛에 의한 여기상태 후에 스스로 발광할 수 있는 분자내 화학적 그룹인 것으로 정의된다. 본원에서, 이러한 그룹은 약 1nM의 최저 농도에서도 자체가 검출 가능한 물질을 제조하는 데 사용된다. 예를 들면, N,N-디메틸아미노설폰산(단실) 또는 NBD를 언급할 수 있고, NBD가 바람직하다.
지방산은, 예를 들면, 포화 또는 불포화되고 쇄 길이가 C-8 내지 C-20이며, 바람직하게는 포화 또는 불포화 C-12, C-14, C-16 및 C-18이며, 특히 바람직하게는 C-12이고 포화된 장쇄 카복실산을 의미하는 것으로 여겨진다.
형광 표지가 부착된 지방산은 2,3-에폭시프로판올을 사용하여 모노아실글리세라이드에 커플링된다. 예를 들면, 포스파티딜이노시톨 및 포스파티딜콜린 등의 이러한 합성 기질 및 인지질 각각 또는 둘 다로부터, 임의로 10:1 내지 1:10, 바람직하게는 3:1 내지 1:3, 특히 바람직하게는 2:1의 중량비로, 연구되는 리파제의 기질로서 작용하는 마이셀 또는 소포가, 예를 들면, 약 1 내지 10분, 바람직하게는 1 내지 6분, 특히 바람직하게는 4분 동안 지속되는 초음파 처리로 형성된다. 마이셀 또는 소포로의 이러한 통합은, 이들 구조물에 공간상으로 근접해 있는 방향족 물질의 전하 이동 복합체를 기본으로 하는, 황색에서 적색으로의 색상 변화와 관련이 있다. 리파제를 사용한 항온처리를 통해, 표지 지방산 및 글리세롤이 방출되면서 지방산이 제거된다.
인지질로서, 예를 들면, 포스파티딜콜린(6mg)과 포스파티딜이노시톨(6mg)을 클로로포름(각 1mL) 속에 용해시킨다. 기질을 제조하기 위해, 포스파티딜이노시톨 용액 2부(예: 83.5㎕)와 포스파티딜콜린 용액 1부(예: 41.5㎕) 및 NAG 용액 100㎕(클로로포름 1mL 중의 10mg)를 함께 피펫팅한다(시험에서의 최종 농도: 인지질 0.0375mg/mL; NAG 0.05mg/mL). 클로로포름을 제거한 후, 20ml의 25mM Tris/HCl, pH 7.4; 150mM NaCl을 가하고, 초음파 프로브[브란슨 소니파이어(Branson Sonifier) II형, 표준 마이크로팁, 25W]를 사용하여 초음파 처리를 2회 수행한다(제1 처리: 설정 2, 2×1분, 빙상에서 각각 1분; 제2 처리: 설정 4, 2×1분, 빙상에서 각각 1분). 이러한 공정 동안, 기질 용액의 색상은 소포/마이셀의 인지질 분자들 사이에 NAG를 삽입시킴으로 인해 황색(최대 흡광도 481nm)에서 적색(최대 흡 광도 550nm)으로 변한다.
유리 지방산은 마이셀 또는 소포를 형성하지 않는다. 따라서, 지방산을 마이셀/소포로부터 제거하는 동안에 적색에서 황색으로의 색상 변화가 관찰된다. 따라서, 마이셀/소포의 파괴 및 리파제의 효소 활성은 큐벳(cuvette) 광도계[예: DU-640, 제조원: 벡크만(Beckman)(뮌헨)] 또는 미세적정판 판독기[예: 마이크로베타(Microβeta), 제조원: 왈락(Wallac)(핀란드, 투르쿠)]를 사용하여 적색에서 황색으로의 색상 변화에 의해 육안으로(481nm 또는 550nm에서), 또는 인 화상기(phosphoimager)[예: 스톰(Storm) 840, 제조원: 몰레큘라 다이나믹스(Molecular Dynamics)(크레펠트)], 형광 스캐너[예: DA-2, 제조원: 시마드즈(Shimadzu)(일본, 오사카)] 또는, 정보가 전기 전하의 형태로 저장되고 전송되는 전자 신호 및 광학 신호 처리용 집적 회로가 장착되어 있는 CCD 카메라(전하 커플링 장치)를 기본으로 한 화상 분석 방법[예: 어레이스캔(ArrayScan), 제조원: 몰레큘라 디바이스(Molecular Device)(미국)]을 사용하여 형광측정적으로 측정 가능하다.
이들 방법은 모두 바람직하게는 고속 처리 스크리닝(HTS)과 병행하여 사용된다. 이러한 개념을 바탕으로 하는 추가의 방법은 화합물의 세포독성 및 세제 작용의 측정법이다.
본 발명은 또한, 위에서 기재한 방법으로 제조된 기질 및, 위에서 기재한 바와 같이, 방향족 물질의 배열에 원조하여 전하 이동 복합체를 생성하는 구조물을 동정하는 방법에, 바람직하게는 인지질/지질 구조물의 동정방법에, 특히 바람직하게는 리파제/리파제 억제인자의 동정방법에 사용하기 위한 기질에 관한 것이다. 또한, 당해 방법은 색상 변화를 수반하는, 곡선(예: 마이셀 또는 소포)이거나 평면적(예: 인공적으로 제조된 직선상 이층)인 단층 또는 이층 구조물의 분해에 사용될 수도 있다. 색상 변화는, 위에서 기재한 바와 같이, 육안으로/광학적으로 모니터링되거나 형광측정적으로 측정 가능한 방식으로 모니터링될 수 있다.
또한, 본 발명은 먼저 12-아미노라우르산을 7-클로로-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시키고, 이어서 수득한 중간체를 실온에서 알칼리 금속 탄산염 및 알칼리 금속 C1-C4-알칸올레이트, 바람직하게는 메탄올레이트(예: 나트륨 메탄올레이트 또는 칼륨 메탄올레이트) 등의 염기를 첨가하면서 알콜 용액 중의 2,3-에폭시프로판올과 반응시키는, 모노아실글리세라이드인 2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트의 제조방법 및 모노아실글리세라이드인 2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트 그 자체에 관한 것이다.
본 발명의 목적은
a) 위에서 기재한 바와 같은 기질을 제조하는 단계,
b) 당해 기질을 리파제(예: 호르몬 민감성 리파제, 모노글리세라이드 리파제, 디글리세라이드 리파제, 트리글리세라이드 리파제, 지단백질 리파제, 췌장 리파제, 간장 리파제, 세균성 리파제, PLA2, PLC, 콜레스테롤 에스테라제, 바람직하게는 호르몬 민감성 리파제 및 췌장 리파제, 특히 바람직하게는 호르몬 민감성 리파제)와 함께 항온처리하는 단계 및
c) 색상 변화를, 예를 들면, 육안/광학적으로 측정하거나 형광측정적으로 측정하는 단계를 포함하는, 존재시에 색상 변화를 일으키는 리파제/리파제 억제인자의 동정방법으로 달성된다.
본 발명은 또한, 위에서 기재한 방법으로 동정되어진 리파제 및 리파제 억제인자에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 위에서 기재한 바와 같은 기질이 제조되고, 당해 기질이 리파제로 항온처리되며, 적색에서 황색으로 또는 역으로 황색에서 적색으로의 색상 변화 속도가 측정되고, 활성이, 예를 들면, 광도계를 사용한 흡광도 측정이나 형광측정계를 사용한 형광 측정에 의해 확인되는, 리파제/리파제 억제인자 활성의 측정방법에 관한 것이다.
전형적인 반응은 30℃에서 60분 동안, 예를 들면, 1.5mL들이 에펜도르프(Eppendorf) 용기 또는 96홀 플레이트 속에서 수행된다. 시험 물질(예: HSL 억제인자) 10㎕를 16.6% DMSO 존재하에 분석 완충액(25mM Tris/HCl, pH 7.4; 150mM NaCl) 속으로 유입시킨다. 기질 용액(분석 완충액 중의 포스파티딜콜린 20㎍/mL, 포스파티딜이노시톨 10㎍/mL, NAG 50㎍/mL) 180㎕를 첨가한다. 30℃에서 15분 동안 예비항온처리한 후, 분석 완충액 중의 HSL 20㎕를 피펫팅하고, 흡광도를 481nm에서 큐벳 광도계(큐벳 0.5mL) 또는 미세적정판 판독기로 즉시 측정한다(상기 참조). 가변적이고, 선택된 효소 농도에 좌우되며, 2 내지 240분일 수 있는 특정한 항온처리 시간 후, 이러한 경우에는 30℃에서 60분 동안 항온처리한 후, 흡광도를 다시 측정한다. 이러한 경우, 481nm에서 황색 영역에서의 흡광도 증가는 효소 활 성의 척도이다.
리파제 억제인자를 동정하거나 리파제/리파제 억제인자의 활성을 측정하기 위한 분석 시스템도 또한 본 발명의 주제이다. 이들은 상기와 같은 기질, 초음파 장치 및, 임의로, 적색에서 황색으로의 색상 변화를 육안/광학적으로 측정하고/하거나 형광측정적으로 측정하기 위한 장치 또는, 상기와 같은 기질 및 초음파 장치 이외에, 색상 변화속도 측정용 장치 및 흡광도 또는 형광 측정용 장치를 포함한다.
또한, 분석 시스템은 키트 형태로 존재할 수도 있고, 분석은 리파제 분석이다.
당해 키트는 임의로 분석 완충액 중의 상기와 같은 기질 및 당해 시험을 수행하기 위한 용기, 예를 들어, 에펜도르프 용기 또는 미세적정판, 바람직하게는 미세적정판을 함유한다.
본 발명의 추가의 목적은 상기와 같은 기질과 포스포리파제, 예를 들어, 포스포리파제 A2(뱀 독에서) 또는 포스포리파제 C[바실러스 세레우스(Bacillus cereus)]를 포함하는 분자 수송/이동 시스템의 측정방법, 화합물의 세제 작용의 측정방법 또는 화합물(의약 등)의 세포독성 측정방법에 관한 것이다.
수송체/이동 단백질은 탄수화물, 지질 및 단백질과 같은 주요 영양소를 스스로 인식하고, 이들을 생물학적 막을 통해 수송하거나 특정한 생물학적 막에서 다른 막으로 이동시키는 단백질을 의미하는 것으로 여겨진다. 예를 들면, 랫트 소장으로부터 분리시킨 수송체/이동 단백질은 인지질 소포(리포좀)에서 기능적으로 재구성되거나(단백질리포좀), 가용성 폴리펩타이드로서 리포좀과 함께 항온처리된 다 음, 상기와 같은 인지질과 NBD-글리세라이드의 혼합물 속에 첨가되고, 초음파로 처리된다. NBD-글리세라이드가 수송체를 사용하여 NBD-글리세라이드 함유 마이셀/소포로부터 단백질리포좀 루멘으로 또는 이동 단백질을 사용하여 NBD-글리세라이드 함유 마이셀/소포로부터 리포좀 막으로 수송되는 과정 또는 이동되는 과정은 마이셀 구조물을 용해/파괴시키고, 또한 상기와 같이 광도적으로 또는 형광측정적으로 측정하여 모니터링할 수도 있다.
화학적 화합물의 세제 작용은 마이셀/소포의 직접 파괴를 바탕으로 한다. 생물학적 막이 이러한 방식으로 구성되기도 하므로, 이러한 화합물은 통상적으로 세포독성이다. 마이셀의 파괴는 당해 방법을 사용하여 상기된 색상 변화에 의해 쉽게 감지될 수 있다.
합성법:
12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸산(1)과 같은 소수의 NBD 표지된 지방산은 실제로 시판되고 있으나, 가격이 비싸다. 또한, 첫 번째 실험이 시판 중인 재료로 수행되었지만, 12-아미노라우르산과 MeOH 중의 4-클로로-7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸을 반응시켜 화합물(1)을 양호한 수율로 수득할 수 있었다.
화합물 1 내지 9의 목록:
Figure 112006087999192-pat00001
1: 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸산
2: 2,3-에폭시프로판올
3: R1=OH, R2=OH
4: R1=OAc, R2=OAc
5: R1=OOC(CH2)3CH3, R2=OOC(CH2)3CH3
6: R1=OOC(CH2)14CH3, R2=OH
7: R1=OOC(CH2)14CH3, R2=OAc
8: R1=O(CH2)17CH3, R2=O(CH2)17CH3
Figure 112006087999192-pat00002
9a: R1, R2=이소프로필리덴
3a: R1, R2=OH
Figure 112006087999192-pat00003
9b: R1, R2=이소프로필리덴
3b: R1, R2=OH
화합물(1)을 2,3-에폭시프로판올(2)에 친핵성 첨가하여, 모노아실글리세라이드(3)를 양호한 수율로 수득할 수 있다. 이어서, 화합물(3)을 아실화시켜 트리글리세라이드(4 및 5)를 수득한다. 화합물(1)과 팔미틴과의 에스테르화반응으로 디아실글리세라이드(6)를 수득한다. 또한, 당해 화합물을 반응시켜 상응하는 트리아실글리세라이드(7)를 수득한다. 동일한 방법을 사용하여 글리세롤 디에테르(8)를 반응시키고 슈도트리아실글리세라이드(9)를 수득하며, 이때 두 개의 아실 라디칼은 장쇄 에테르로 대체되어 있다.
합성된 화합물은 모두 리파제, 바람직하게는 HSL의 기질인 것으로 입증되었으나, 상당한 활성 차이를 나타낸다. 리파제의 "최상"의 기질은 모노아실글리세라이드(3)인 것으로 밝혀졌다. 화합물(4, 5, 6 및 7)에서와 같이, 추가의 아실 그룹을 유입시키면 활성이 감소된다.
이는 새롭게 유입된 아실 라디칼에 의한 NBD 아실 그룹의 제거시의 경쟁으로 용이하게 설명될 수 있다. 이러한 가설을 확인하기 위해, 두 개의 아실 그룹이 헥사데실 에테르 단위에 의해 대체된 슈도트리아실글리세라이드(9)를 합성한다. 이들은 리파제로부터 제거될 수 없으므로, NBD 지방산 에스테르와 경쟁하지 않는다. 생물학적 시험에서, 이들 화합물은 실제로 기질이지만 활성이 낮은 것으로 밝혀졌다. 명백하게, 촉매 영역 외에, 리파제는 장쇄 에테르 그룹에 접근 가능한 연장된 소수성 결합 영역을 가지므로, 지방산 단위의 첨가가 지체된다.
모노아실글리세라이드(3)가 리파제의 양호한 기질인 것으로 밝혀짐에 따라, 1위치 또는 3위치에 대한 레지오선택적(regioselective) 우열성을 가리기 위해 연구하였다. 이들 연구를 위해, 엔안티오머성 레지오이성체(3a 및 3b)를 합성하였다.
에난티오머(3a 및 3b)의 합성은 디사이클로헥실카보디이미드 활성화에 의해 NBD 표지 지방산과 에스테르화되는 D-1,2-O-이소프로필리덴글리세롤 및 L-1,2-O-이소프로필리덴글리세롤로부터 출발한다. 1N 메탄올성 HCl을 사용하여 보호 그룹을 제거한다. 이들 화합물은 둘 다 동일한 생물학적 활성을 나타내므로, 에난티오머적으로 순수한 화합물을 사용하는 이점은 없다.
1. 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸산(1)
30% 농도의 나트륨 메탄올레이트 용액(14.5mL, 76mmol)을 교반하면서 MeOH(300mL) 중의 12-아미노라우르산(18g, 83.7mmol) 용액에 가한다. 5분 후, 반 응 혼합물은 투명해지며, MeOH(300mL) 중의 7-클로로-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸(15g, 75mmol) 용액을 가한다. 즉시 암색이 된 반응 혼합물을 25℃에서 18시간 동안 교반한다. 이어서, 1M 메탄올성 HCl(100mL, 100mmol)을 가하고, 용매를 진공하에 증발 제거시킨다. 잔사를 MeOH 속에 용해시키고, 혼합물을 실리카 겔을 통해 여과시키며, 여액을 건조 농축시키고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(1:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(1)을 적색 고체(26.4g, 93%)로서 수득한다.
RF: 0.16(1:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 3.48(dt, 2H, CH 2 NH2), 2.36(t, 2H, CH 2 COOH), 1.9-1.2(m, 18H, 9CH2).
MS(ESI-MS) 379.2(M+1).
2. 2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(3)
이소프로판올(50mL) 중의 화합물(1)(12g, 31.7mmol)과 2,3-에폭시프로판올(50mL)의 용액을 50℃에서 16시간 동안 교반한다. 용매를 진공하에 증발 제거하고, 잔사를 0.01토르에서 건조시키고, 섬광 크로마토그래피(디이소프로필 에테르, 에테르, EtOAc)로 정제한다. 화합물(3)을 적색 오일(10.3g, 71.8%)로서 수득한다.
RF: 0.18(1:1 톨루엔/EtOAc); RF: 0.5(30:5:1 CH2Cl2-MeOH-NH3), 이는 EtOAc/디에틸 에테르로부터 결정화된다.
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.35(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 4.19(dd, 2H, H-1, H-1'), 3.94(m, 1H, H-2), 3.65(dd, 2H, H-3, H-3'), 3.48(dt, 2H, CH 2 NH2), 2.35(t, 2H, CH 2 COOH), 1.8(m, 2H, CH2), 1.6(m, 2H, CH2), 1.27-1.15(m, 14H, 7CH2).
MS(ESI-MS) 453.4(M+1).
3. (S)-2,2-디메틸[1,3]디옥솔란-4-일메틸 12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(9a)
CH2Cl2(2mL) 중의 화합물(1)(60mg, 159μmol)의 용액을 디사이클로헥실카보디이미드(160mg, 770μmol)로 처리하고, 25℃에서 30분 동안 교반한다. 이어서, CH2Cl2(2mL) 중의 (R)-(2,2-디메틸[1,3]디옥솔란-4-일)메탄올(100mg, 760μmol)과 디메틸아미노피리딘(94mg, 770μmol)의 용액을 가하고, 반응액을 25℃에서 4시간 동안 추가로 교반한다. 용매를 진공하에 증발 제거하고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(15:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(9a)을 황색 형광유(46mg, 58%)로서 수득한다.
RF: 0.29(4:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(CDCl3): δ 8.5(d, 1H, 방향족), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, 방향족), 4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH 2 NH2), 2.35(t, 2H, CO-CH 2 ), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH2), 1.42(s, 3H, CMe2), 1.37(s, 3H, CMe2).
4. (R)-2,2-디메틸[1,3]디옥솔란-4-일메틸 12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(9b)
화합물(9b)을 화합물(9a)에 대해 기재한 바와 같이 제조한다. 화합물(9b)을 황색 형광유(51.4mg, 65%)로서 수득한다.
RF: 0.29(4:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.2(m, 1H, NH), 6.16(d, 1H, ArH), 4.31(m, 1H), 4.1(m, 3H), 3.73(dd, 1H), 3.48(dt, 2H, CH 2 NH2), 2.32(t, 2H, CO-CH 2 ), 2.0-1.2(m, 18H, 9CH2), 1.42(s, 3H, CMe2), 1.37(s, 3H, CMe2).
5. (S)-2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(3a) 및 (R)-2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(3b)
메탄올성 HCl(1M, 200㎕)을 메탄올 25mL 중의 화합물(9a) 13.9mg(28.2μmol) 또는 화합물(9b) 17.8mg(36.1μmol)의 용액에 가하고, 혼합물을 25℃에서 1.5시간 동안 교반한다. 용매를 진공하에 증발 제거하고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(2:1, 1:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 지방산 에스테르(3a)와 지방산 에스테르(3b)를 각각 10.5mg(82%) 및 9.3mg(57%)의 수율로 수득한다.
1H-NMR(CDCl3) 데이타 및 질량 스펙트럼은 화합물(3)과 동일하다.
6. 2-아세톡시-3-[12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸오일옥시]프로필 아세테이트(4)
화합물(3)(12mg, 26.5μmol)을 2:1의 피리딘/아세트산 무수물(3mL)로 아세틸화한다. 8시간 후, 혼합물을 건조 농축시키고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(1:2 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(4)을 황색 형광유(13mg, 91%)로서 수득한다.
RF 0.66(1:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 5.24(m, 1H), 4.92(m, 1H), 4.34(m), 4.28, 4.16, 3.48(dt, 2H, CH 2 NH2), 2.32(CH2COOH), 2.1(2s, 6H, 2OAc), 2.0-1.0(m, 18H, 9CH2).
MS(ESI-MS): 537.4(M+1).
7. 2-헥산오일옥시-3-[12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸오일 옥시]프로필 헥사노에이트(5)
헥산산 무수물(100㎕)을 피리딘(300㎕) 중의 화합물(2)(5mg, 11μmol)의 용액에 가하고, 반응 혼합물을 25℃에서 16시간 동안 정치시킨다. 용매를 진공하에 증류 제거시키고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(9:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(5)을 황색 형광유(1.8mg, 25%)로서 수득한다.
RF 0.73(1:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.18(d, 1H, ArH), 5.26(m, 1H, H-2), 4.29(dd, 2H, H-3, H-3'), 4.15(dd, 2H, H-1, H-1'), 3.46(dt, 2H, CH 2 -NH), 2.34(t, 6H, 3CH 2 COO), 1.63-1.2(m, 12H, 6CH2), 0.88(m, 6H, 2CH3).
MS(ESI-MS): 649.5(M+1).
8. 2-하이드록시-3-[12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸오일옥시]프로필 헥사데카노에이트(6)
CH2Cl2(5mL) 중의 화합물(1)(25mg, 66μmol), 4-디메틸아미노피리딘(9mg, 73μmol) 및 1,1-카보닐디이미다졸(15mg, 73μmol)의 용액을 25℃에서 30분 동안 교반한다. 용매를 진공하에 증류 제거하고, 잔사를 섬광 크로마토그래피(9:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(6)을 황색 형광유(9.5mg, 21%)로서 수득한다.
RF 0.25(5:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.54(d, 1H, ArH), 6.3(m, 1H, NH), 6.19(d, 1H, ArH), 4.20(dd, 2H, H-1, H-1'), 4.15(dd, 2H, H-3, H-3'), 4.12(m, 1H, H-2), 3.5(dt, 2H, CH 2 -NH), 2.36(t, 4H, 2CH 2 COO), 1.82(m, 2H, CH2-CH2-NH), 1.63(m, 4H, 2CH2CH2COO), 1.47(m, 2H, CH2-(CH2)2-NH), 1.31-1.26(m, 22H, 11CH2), 1.287(m, 2H, CH2), 1.26(m, 2H, CH2), (m, 4H, 2CH2CH2CH2COO), 1.31-1.26(m, 18H, 9CH2), 1.3(m, 2H, CH2), 1.26(m, 2H, CH2), 0.89(t, 3H, CH3).
MS(ESI-MS): 649.5(M+1).
9. 2-아세틸옥시-3-[12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데칸오일옥시]프로필 헥사데카노에이트(7)
화합물(6)(6mg, 8.7μmol)을 아세틸화하고, 화합물(4)에 대해 기재한 바와 같이 후처리한다. 조 생성물을 섬광 크로마토그래피(9:1 톨루엔/EtOAc)로 정제한다. 화합물(7)을 황색 형광유(5.1mg, 95%)로서 수득한다.
RF 0.71(5:1 톨루엔/EtOAc).
1H-NMR(250MHz, CDCl3): δ 8.5(d, 1H, ArH), 6.25(m, 1H, NH), 6.17(d, 1H, ArH), 5.25(m, 1H, H-2), 4.27(dd, 2H, H-1, H-3), 4.15(dd, 2H, H-1', H-3'), 3.73(dt, 4H, CH2-NH), 2.3(t, 2H, CH2COO), 2.08(s, 3H, OAc), 1.8(m, 2H, CH2-CH2-NH), 1.6(m, 8H, 4CH2), 1.4-1(m, 32H, 16CH2), 0.85(t, 3H, CH3).
MS(FAB-MS): 739(M+Li).
10. 2,3-비스-옥타데실옥시-프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,5]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트(8)
2,3-비스-옥타데실옥시프로판-1-올(5mg, 8.37μmol)을 CH2Cl2 중의 화합물(1)(3mg, 7.9μmol), 디메틸아미노피리딘(5mg, 41μmol) 및 디사이클로헥실카보디이미드(5mg, 24μmol)의 용액에 가한다. 반응 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 교반하고, 용매를 진공하에 증류 제거하며, 잔사를 섬광 크로마토그래피(2:1 석유 에테르/디에틸 에테르)로 정제한다. 화합물(8)을 황색 형광유(3.5mg, 46%)로서 수득한다.
RF 0.55(3:7 디에틸 에테르/석유 에테르).
MS(FAB-MS): 957.8(M+1).
효소 제조법:
부분 정제된 HSL의 제조
단리된 랫트 지방 세포를 미처리 수컷 랫트[위스타(Wistar), 220 내지 250g]로부터의 부고환 지방 조직으로부터, 공개되어 있는 방법에 따른 콜라겐아제 처리로 수득한다. 랫트 10마리로부터의 지방 세포를 매회 균질화 완충액(25mL Tris/HCl, pH 7.4, 0.25M 수크로즈, 1mM EDTA, 1mM DTT, 류펩틴 10㎍/mL, 안티페인 10㎍/mL, 펩스타틴 20㎍/mL) 50mL로 부유시켜 3회 세척하고, 최종적으로 균질화 완충액 10mL 속에 용해시킨다. 지방 세포를 1500rpm 및 15℃에서 10회 타격을 가해 테플론-인-글라스(Teflon-in-glass) 균질화기[브라운-멜순겐(Braun-Melsungen)]로 균질화시킨다. 균질화물을 원심분리시킨다[소르발 에스엠24 튜브(Sorvall SM24 tube), 5000rpm, 10분, 4℃]. 상부의 지방 층과 펠렛 사이의 저부 층을 제거하고, 반복하여 원심분리시킨다. 이로부터 수득한 저부층을 다시 원심분리시킨다(소르발 에스엠24 튜브, 20,000rpm, 45분, 4℃). 저부층을 제거하고, 헤파린-세파로즈[파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), CL-6B, 25mM Tris/HCl, pH 7.4, 150mM NaCl로 5회 세척] 1g으로 처리한다. 4℃에서 60분 동안 항온처리(15분 간격으로 진탕시킴)한 후, 배치를 원심분리시킨다(소르발 에스엠24 튜브, 3000rpm, 10분, 4℃). 빙초산을 가하여 상등액이 pH 5.2가 되도록 하고, 4℃에서 30분 동안 항온처리한다. 침전액을 원심분리(소르발 에스에스34, 12,000rpm, 10분, 4℃)시켜 수집하고, 2.5mL의 20mM Tris/HCl, pH 7.0, 1mM EDTA, 65mM NaCl, 13% 수크로즈, 1mM DTT, 류펩틴/펩스타틴/안티페인 10㎍/mL 속에 현탁시킨다. 현탁액을 25mM Tris/HCl, pH 7.4, 50% 글리세롤, 1mM DTT, 류펩틴, 펩스타틴, 안티페인 10㎍/mL에 대해 4℃에서 밤새 투석시킨 다음, 하이드록실아파타이트 칼럼(현탁액 1mL당 0.1g, 인산칼륨 10mM으로 평형시킴, pH 7.0, 30% 글리세롤, 1mM DTT)에 적용시킨다. 칼럼을 20 내지 30mL/h의 유속으로 네 가지 평형 완충액 용적으로 세척한다. 0.5M 인산칼륨을 함유하는 평형 완충액의 용적으로 HSL을 용출시킨 다음, 투석시키고(상 기 참조), 4℃에서 한외여과[아미콘 디아플로 피엠(Amicon Diaflo PM) 10 필터]로 5 내지 10배 농축시킨다. 부분 정제된 HSL을 -70℃에서 4 내지 6주 동안 저장할 수 있다.
NAG(NBD-모노아실글리세라이드) 기질의 제조
포스파티딜콜린 6mg과 포스파티딜이노시톨 6mg을 각각 클로로포름 1mL 속에 용해시킨다. NAG 10mg을 클로로포름 1mL 속에 용해시킨다. 포스파티딜이노시톨 용액 2부(예: 83.5㎕), 포스파티딜콜린 용액 1부(예: 41.5㎕) 및 NAG 용액 100㎕를 플라스틱 신틸레이션 용기 속으로 함께 피펫팅시킨다(당해 시험에서의 최종 농도: 1mL당 인지질 0.0375mg; 1mL당 NAG 0.05mg). N2 스트림으로 부풀려 클로로포름(전체 용적 225㎕)을 완전히 제거한다. 건조시킨 기질을 4℃에서 3일 이하 동안 저장할 수 있다. NAG를 삽입(시험 당일)시킨 인지질 소포/마이셀을 제조하기 위해, 건조시킨 기질을 분석 완충액(25mM Tris/HCl, pH 7.4; 150mM NaCl) 20mL 속에 용해시키고, 초음파 프로브(브란슨 소니파이어 II형, 표준 마이크로팁)로 2회 초음파처리한다(제1 처리: 설정 2, 2×1분, 빙상에서 각각 1분; 제2 처리: 설정 4, 2×1분, 빙상에서 각각 1분). 이러한 과정 동안, 기질 용액의 색상은 소포/마이셀의 인지질 분자 사이에 NAG를 삽입시킴으로 인해 황색(최대 흡광도 481nm)에서 적색(최대 흡광도 550nm)으로 변한다. 기질로서 사용하기 전에(이후 2시간 이내), 용액을 빙상에서 15분 동안 추가로 항온처리한다.
간접적 NAG 분석
당해 분석을 1.5mL들이 에펜도르프 용기 또는 96홀 플레이트로 30℃에서 60분 동안 실시한다. HSL의 억제인자를 발견하기 위해, 분석 완충액(25mM Tris/HCl, pH 7.4; 150mM NaCl) 중의 시험 물질 10㎕를 16.6% DMSO의 존재하에 유입시킨다. 기질 용액(분석 완충액 중의 포스파티딜콜린 20㎍/mL, 포스파티딜이노시톨 10㎍/mL, NAG 50㎍/mL) 180㎕를 가한다. 30℃에서 15분 동안 예비항온처리한 후, 분석 완충액 중의 효소 용액(1 내지 4배로 희석시킴) 20㎕를 피펫팅하고, 흡광도를 480nm에서 큐벳 광도계(0.5mL 큐벳) 또는 미세적정판 판독기(마이크로베타, 제조원: 왈락)로 즉시 측정한다. 30℃에서 60분 동안 항온처리한 후, 흡광도를 다시 측정한다. 480nm에서의 흡광도 증가는 효소 활성의 척도이다. 표준 조건하에, 부분 정제된 HSL 20㎍으로 인해 4000arb. 단위의 흡광도 변화가 발생한다.
직접적 NAG 분석
기질 용액의 흡광도 변화 측정 이외에, 상 분리/박층 크로마토그래피로 HSL 반응의 생성물을 조사한다. 이를 위해, 항온처리 배치(전체 용적 200㎕, 간접적 NAG 분석 참조)를 2mL들이 에펜도르프 용기 속에서 메탄올/클로로포름/헵탄(10:9:7) 1.3mL와 혼합한 다음, 0.1M NaOH 0.4mL와 혼합한다. 집중적으로 혼합한 후(10초), 원심분리(800×g, 20분, 실온)로 상 분리를 시작한다. 수성 상부 상으로부터 등가 용적(예: 0.4mL)을 회수하고, 481nm에서 광도계로 흡광도를 측정한다. 박층 크로마토그래피를 위해, 수성 상을 건조시킨[스피드박(SpeedVac)] 다음, 테트라하이드로푸란 50㎕ 속에 용해시킨다. 샘플 5㎕를 실리카 겔 Si-60 플레이트[제조원: 머크(Merck), 다름슈타트]에 적용시킨다. 디에틸 에테르 78mL/석유 에테르 22mL/빙초산 1mL를 용출제로서 사용하여 크로마토그래피시킨다. 방출된 형광 NBD 지방산의 양을 460nm의 여기 파장과 540 내지 560nm의 발광 파장에서 인 화상화[몰레큘라 다이나믹스, 스톰 840 및 이미지콴트 소프트웨어(ImageQuant software)]에 의해 측정한다.
TAG 분석
기질을 제조하기 위해, [3H]트리올레오일글리세롤(톨루엔 중) 25 내지 50μCi, 미표지 트리올레오일글리세롤 6.8μMol 및 인지질(포스파티딜콜린/포스파티딜이노시톨 3:1 w/v) 0.6mg을 혼합하고, N2로 건조시킨 후, 초음파 처리(브란슨 250, 마이크로팁, 설정 1 내지 2, 1분 간격으로 1분씩 2회)로 0.1M KPi(pH 7.0) 2mL 속에 용해시킨다. KPi 1mL를 첨가하고 새로운 초음파 처리(30초 간격으로 빙상에서 30초씩 4회)한 후, 20% BSA(KPi 중) 1mL를 가한다(트리올레오일글리세롤의 최종 농도 1.7mM). 당해 반응을 위해, 기질 용액 100㎕를 HSL 용액(상기와 같이 제조된 HSL, 20mM KPi, pH 7.0, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.02% BSA, 펩스타틴 20㎍/mL, 류펩틴 10㎍/mL 속에 희석시킴) 100㎕ 속에 피펫팅하고, 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 메탄올/클로로포름/헵탄(10:9:7) 3.25mL와 0.1M K2CO3 1.05mL 및 0.1M 붕산(pH 10.5)을 첨가한 후, 배치를 충분히 혼합하고, 최종적으로 원심분리시킨다(800×g, 20분). 상 분리 후, 상부 상 1당량(1mL)을 회수하고, 액체 신틸레이션 측정으로 방사능을 측정한다.
PNPB 분석
p-니트로페닐 부티레이트(PNPB)(아세토니트릴 2mM 중) 10㎕, 890㎕의 0.1M KPi(pH 7.25), 0.9% NaCl, 1mM DTT 및 100㎕의 HSL(상기와 같이 제조됨, 당해 완충액 속에 희석시킴)을 37℃에서 10분 동안 항온처리한다. 메탄올/클로로포름/헵탄(10:9:7, w/v) 3.25mL를 첨가하고 격렬하게 진탕한 후, 배치를 원심분리시키고(800×g, 20분), 42℃에서 3분 동안 항온처리한다. 이어서, 동일 용적의 상부 상을 회수하고, 400nm에서 흡광도를 측정한다.
트리부티린 분석
기질을 제조하기 위해, [1-14C]트리부티린(톨루엔 중) 5μCi를 20mM 미표지 트리부티린(아세토니트릴 중) 1mL에 가한다. 당해 기질 용액 10㎕를 390㎕의 0.1M KPi(pH 7.25), 0.9% NaCl, 1mM DTT, 2% BSA 및 100㎕의 HSL(상기와 같이 제조됨, 당해 완충액 속에 희석시킴)과 함께 37℃에서 30분 동안 항온처리한다. 메탄올/클로로포름/헵탄(10:9:7, w/v) 3.25mL와 0.1M NaOH 1mL를 첨가한 후, 배치를 격렬하게 혼합하고, 최종적으로 원심분리시킨다(800×g, 20분). 동일 용적(1ml)의 상부 상을 회수하고, 액체 신틸레이션 측정으로 방사능을 측정한다.
분석
당해 물질을 통상적으로 네 가지 독립 배치로 시험한다. 억제되지 않은 대조군 반응과 비교하여, 시험 물질에 의한 HSL의 효소 활성 억제를 측정한다. 시험 물질의 농도를 10가지 이상으로 하는 억제 곡선으로 IC50값을 산출한다. 데이타 분석을 위해, 소프트웨어 팩키지 GRAPHIT, 엘세비어-바이오소프트(Elsevier-BIOSOFT)(버젼 3.0)를 사용한다.
실시예
실시예 1
HSL에 의한 NAG 절단의 동력학
NAG(0.05mg/mL)를 소정량의 부분 정제된 HSL 단백질과 함께 항온처리하고(온도 조절 광도계), 481nm에서의 흡광도를 특정 시간에 측정한다. 불활성화를 위해, HSL을 100℃에서 15분 동안 항온처리한다(n=8, 평균±SD).
결과: 20㎍ 이내의 단백질 양으로, 반응을 60분 이내에 선형으로 진행시킨다. 이러한 경우, 흡광도 차이는 0.8 내지 0.9OD이다. 보다 적은 양의 단백질의 경우, 선형성은 180분 이내에 수득된다.
481nm에서의 흡광도 증가(arb. 단위)
시간[분] HSL 없음 불활성 HSL HSL[5㎍] HSL[10㎍] HSL[20㎍] HSL[40㎍]
0 0 0 0 0 0 0
1 5±2 4±1 12±2 19±4 5±7 91±14
2 7±2 5±2 23±4 51±9 78±12 89±32
5 13±4 10±4 45±9 102±19 193±36 395±62
10 15±3 12±3 105±18 185±26 423±62 784±88
15 17±5 15±4 155±20 288±39 617±70 1060±144
20 19±5 20±5 219±31 395±36 865±93 477±182
30 19±6 24±7 295±47 517±67 1143±216 2249±286
45 23±6 32±6 453±52 830±57 1877±206 2968±321
60 25±8 37±9 677±70 1179±110 2510±295 4065±399
75 28±9 39±10 831±92 1487±104 3067±310 4834±462
90 31±8 41±13 995±82 1844±130 3527±188 5472±613
120 35±7 45±11 1455±102 2745±195 4941±410 5702±531
180 39±11 52±15 1937±121 3521±254 5712±399 5961±560
실시예 2
HSL의 양에 대한 NAG 절단의 의존도
NAG(0.05mg/mL)를 소정량의 부분 정제된 HSL 단백질과 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도 증가(HSL 반응 생성물로서의 유리 NBD 지방산의 형성 = 간접적 NAG 분석) 또는 550nm에서의 흡광도 감소(HSL 반응 기질로서의 NAG의 소비)를 분량의 반응 배치로 측정한다. 또는, 추가의 분량을 메탄올/클로로포름으로 추출하고, 유기 상 속에 함유되어 있는 방출된 NBD 지방산을 TLC 분석 또는 형광측정법(인 화상기 스톰 840, 몰레큘라 다이나믹스)으로 측정한다(= 직접적 NAG 분석)(n=6, 평균±SD).
결과: 20㎍ 이내의 단백질 양으로, 반응을 생성물 형성(481nm에서의 흡광도 증가 또는 TLC 분석에 따른 유리 NBD 지방산의 발생) 및 기질 소비(550nm에서의 흡광도 감소)에 대해 선형으로 진행시킨다. 간접적 NAG 분석과 직접적 NAG 분석 사이의 일치는 간접적 분석에서의 NAG 전달의 분석을 지지한다.
흡광도 변화(arb. 단위)
HSL 양 [㎍] 증가 [481nm] 감소 [550nm] 방출된 NBD-FA [550nm]
0 0 885±80 0
1 156±21 866±94 17±2
2 347±40 841±78 44±5
5 791±88 779±82 103±11
7.5 1066±120 759±69 157±21
10 1255±141 650±61 215±24
15 2351±205 540±55 320±29
20 2867±199 287±51 432±53
25 3428±270 198±44 544±61
30 3973±244 115±35 616±56
40 4623±511 91±19 693±67
60 5466±602 62±17 733±80
80 5913±485 54±15 746±98
실시예 3
기질 농도에 대한 HSL에 의한 NAG 절단의 의존도
상이한 양의 NAG(인지질에 대한 비가 일정함)를 소정량의 부분 정제된 HSL과 함께 60분 동안 항온처리한 다음, 481nm에서 흡광도를 측정한다(n=5, 평균±SD).
결과: 세 가지 양의 효소 모두에 있어, 절단률은 전형적인 포화 곡선의 경로를 나타낸다. 그러나, HSL 반응의 효소적 특이성("2차원적" 기질 제공, "계면 활성화") 때문에, 단백질 5㎍과 최저 기질 농도만으로 거의 선형 의존성을 측정할 수 있다. 단백질 20㎍과 NAG 0.05mg/mL과의 조합은 기질 의존성과 신호 강도(OD 0.6 내지 0.7) 사이의 이상적인 절충안을 제시한다.
481nm에서의 흡광도 증가(arb. 단위)
NAG[mg/mL] HSL[5㎍] HSL[20㎍] HSL[40㎍]
0.002 61±9 194±23 525±77
0.005 109±17 342±58 1420±122
0.01 227±31 852±77 2745±264
0.02 388±45 1758±195 6705±532
0.05 705±61 3002±409 11547±912
0.075 1121±107 768±502 15502±1077
0.1 1521±119 6124±577 19223±1599
0.15 1983±155 7544±603 26730±2069
0.2 2242±186 8898±961 31641±2304
0.3 2489±213 9734±825 35953±3355
실시예 4
NAG 및 인지질의 비에 대한 HSL에 의한 NAG 절단의 의존도
포스파티딜콜린에 대한 포스파티딜이노시톨의 비가 정해진 상이한 양의 인지질(전체량)을 사용하여 초음파 처리하여 기질로서 NAG(0.05mg/mL)를 제조한 다음, 부분 정제된 HSL(20㎍)과 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도 증가를 측정한다(n=4, 평균±SD).
결과: PI/PC 비(중량에 따름)가 3:1이며 0.0375 내지 0.075의 전체 인지질을 가지므로 효소 속도는 최대이다. 인지질의 전체 농도 및 이의 조성에 대한 현저한 최적 경로는 인지질 마이셀 및/또는 소포에서의 HSL 기질(이러한 경우, NAG)의 제공 또는 기질의 (중성) 코어에서의 인지질 단층의 형성에 대한 중요성을 지지한다.
481nm에서의 흡광도 증가(arb. 단위)
포스파티딜이노시톨/콜린(mg/mL) PI:PC 3:1 PI:PC 1:1 PI:PC 1:3
0 173±42 134±23 89±12
0.009 1437±132 548±76 289±77
0.018 2610±306 1430±188 692±94
0.025 2980±254 1879±205 1158±121
0.0375 3144±277 1649±170 1230±105
0.075 3365±402 1138±125 1679±143
0.15 2108±256 745±97 912±103
0.3 913±102 335±47 427±56
실시예 5
각종 억제인자에 대한 IC50값의 측정에 의한 간접적/직접적 NAG 분석과 통상의 HSL 분석과의 비교
상이한 농도(0.1 내지 100μM)의 각종 물질의 존재하에 NAG(0.05mg/mL)를 부분 정제된 HSL 20㎍과 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서 분량의 배치로 흡광도를 측정(간접적 분석)하거나, 방출된 NBD-FA를 클로로포름/메탄올로 추출하고, TLC 분석 및 형광측정법으로 측정(직접적 분석)한다. 또는, [3H]트리올레오일글리세롤을 공개되어 있는 조건에 따라 부분 정제된 HSL로 항온처리하고, 방출된 방사선표지된 올레에이트를 클로로포름/메탄올로 추출한 후에 액체 신틸레이션 측정으로 측정한다. 억제 곡선으로부터 IC50값을 결정한다(n=6, 평균±SD).
결과: 시험한 모든 물질에 있어, 세 가지 공정을 사용하여 전형적인 S자형 억제 곡선을 측정한다. 간접적/직접적 NAG 분석(481nm에서의 흡광도 증가/NBD 지방산의 방출)에서, IC50값은 일반적으로 HSL에 의한 트리올레오일글리세롤의 절단에 비해 4 내지 10배 정도 적으나, 억제인자의 순위(IC50값에 따름)는 세 가지 공정 모두에 있어 동일하다. 이를 통해, HSL 억제인자의 작용은 기질의 특성 및 기질 제공에 좌우된다고 하는 공개된 사실을 확증한다. 또한, 효과적인 기질 농도(NAG 및 트리올레오일글리세라이드)는 또한 두 가지 분석(마이셀 또는 소포로서의 기질 제조때문에 거의 측정 불가능) 사이에서 상이할 수 있으므로, 경쟁적인 억제인자의 경우에 이들 차이점을 설명한다. 흡광도의 변화 및 NBD 지방산 방출에 따라 측정된, 거의 동일한 IC50값은 HSL에 의한 NAG의 절단을 제시하고, 따라서 481nm에서의 흡광도 증가의 원인인 NBD 지방산 방출, 즉 NAG 분석은 지질의 지방분해적 절단을 검출한다.
IC50[μM]
화합물 NAG 분석 방출된 eNBD-FA TAG 분석
1 0.78±0.24 0.78±0.15 5.21±1.44
2 0.75±0.18 0.81±0.27 12.12±3.20
3 1.52±0.33 1.02±0.25 15.34±2.43
4 2.45±0.41 2.98±0.49 18.25±3.54
5 2.79±0.59 3.58±0.39 18.95±2.31
6 3.42±0.78 4.45±0.22 21.45±3.06
7 3.82±0.61 4.51±0.34 33.13±2.88
8 4.29±0.58 5.09±0.94 35.94±3.18
9 6.37±0.72 6.94±0.55 39.82±2.95
10 7.51±1.22 7.77±1.19 47.85±4.12
11 17.94±2.15 21.33±2.83 78.91±5.66
12 22.38±2.47 26.10±3.82 116.34±9.42
실시예 6
간접적 NAG 분석과 TAG, PNPB 및 트리부티린에 대한 분석의 비교
NAG(0.05mg/mL)를 부분 정제된 HSL 20㎍과 함께 상이한 농도(0.1 내지 100μM)의 각종 물질의 존재하에 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도를 분량의 배치 속에서 측정한다(간접적 분석). 또는, [3H]트리올레오일글리세롤(TAG), p-니트로페닐 부티레이트(PNPB) 또는 [14C]트리부티린을 부분 정제된 HSL과 함께 항온처리하고, 방출된 방사선표지된 올레에이트, p-니트로페놀 또는 부티레이트를 클로로포름/메탄올로 추출한 후에 액체 신틸레이션 측정 또는 광도 측정으로 측정한다. IC50값을 억제 곡선으로부터 측정한다(n=5, 평균±SD).
결과: IC50값으로 입증된 억제인자의 상대적 순위는 지질(NAG 및 TAG)을 사용한 분석 둘 다에 대해 동일한다.
이는 기본적으로 수용성 기질, 트리부티린 및 PNPB에도 적용되나, NAG와 TAG에 비해 HSL 활성을 두드러지게 감소시키는 일부 활성 화합물은 트리부티린과 PNPB에 비해 HSL 억제에 있어 불활성이다. 이는 HSL의 지질 결합(지질 결합 도메인을 통함)에 대한 이들 억제인자의 방해에 의해 설명될 수 있는 반면, 촉매성 메카니즘은 악영향을 받지 않는다. 따라서, 수용성 기질은 이들 억제인자의 존재하에서도 HSL로부터 절단된다. 수용성 기질의 경우에도 작용하는 억제인자에 대한 IC50값은 일반적으로 기질로서의 NAG와 TAG의 IC50 값 사이이다. 이는 NAG가 확실한 트리글리세라이드와 유사하게 "지질형" 기질로서 행동하고, NAG 분석이 HSL의 지질 결합(및 촉매성 메카니즘)을 차단하는 억제인자의 발견을 위해 사용될 수 있음을 보여준다.
IC50[μM]
화합물 NAG 분석 트리부티린 분석 PNPB 분석 TAG 분석
1 0.85±0.19 2.56±0.45 3.56±0.67 7.45±1.36
2 1.06±0.22 3.14±0.38 5.03±0.93 13.42±2.44
3 2.14±0.29 ＞100 ＞100 17.32±1.96
4 3.18±0.51 ＞100 93.61±7.92 20.45±2.45
5 2.96±0.47 4.09±0.59 10.45±0.66 25.34±3.60
6 3.89±0.38 65.54±7.12 ＞100 27.31±4.05
7 4.56±0.61 37.99±6.35 75.34±6.93 30.23±3.66
8 4.94±0.51 7.88±1.12 12.55±2.13 35.47±4.05
9 7.24±0.64 12.56±3.05 19.87±3.44 40.56±3.55
10 8.55±0.59 92.56±8.45 ＞100 52.38±4.98
11 20.45±3.05 ＞100 90.45±8.52 85.67±7.34
12 26.78±3.67 88.93±7.75 ＞100 ＞100
실시예 7
각종 세제 및 용매가 기질 안정성에 미치는 영향
NAG(0.05mg/mL)를 각종 세제 및 용매의 농도 증가하에 37℃에서 180분 동안 항온처리한 다음, 550nm에서의 흡광도 감소(특정한 기질 구조물의 용해)를 측정한다(n=4, 평균±SD).
결과: 당해 기질(인지질 소포 또는 마이셀)은 사용된 시약에 비해 상이한 감도를 나타낸다. 흡광도(즉: 기질의 양)는 1% DMS0의 존재하에는 10%, 에탄올 또는 메탄올의 경우에는 최대 20%, 1% TX-100 또는 SDS의 경우에는 최대 30% 감소한다. DMF가 마이셀/소포를 용해시키는 데 가장 효과적이었으며, 1%에서 80% 이상의 NAG를 인지질/소포 구조물로부터 방출시킨다. 기질 구조물 용해시에 사용되는 용매 및 세제의 효능 순위는 NAG에 의하거나, 또는 발색단 그룹(NBD) 또는 인지질 마이셀/소포의 비극성 환경으로 유입되고, 이로 인해 발생되는 수성 환경으로부터 당해 발색단 그룹의 제거에 의한 흡광 최대치에서의 이동(481nm에서 550nm로)에 필적할 만하다. 마이셀/소포의 용해에 의한(예를 들어, 세제에 의한) 수성 매체에서 이들 구조물로부터의 NAG의 방출 또는 NAG의 지방분해적 절단에 의한(HSL에 의한) NBD 지방산으로서의 발색단 그룹의 방출로 인해, 550nm에서 흡광도가 감소되고 481nm에서 흡광도가 증가한다. 1% DMSO에서의 안정성과 함께, NAG 기질은 강한 HTS 분석에 대한 기본적 필요 요건 중의 하나를 충족시킨다.
550nm에서의 흡광도(arb. 단위)
농도[%] DMSO DMF TX-100 SDS 에탄올 메탄올
0 3102±288 3204±259 3067±284 3150±321 3096±241 3199±280
0.05 3003±259 3121±294 3166±308 3063±288 3147±288 3056±243
0.1 3199±302 2655±308 3247±253 2935±254 3056±213 3102±276
0.2 2984±273 1952±299 3119±277 2769±275 3097±253 2945±241
0.5 3055±289 1234±234 2954±248 2506±301 2995±231 2683±210
1 2845±254 654±112 2154±199 2296±252 2834±256 2534±191
2 2317±266 251±82 956±101 1413±178 2510±194 1985±165
5 1432±187 105±42 489±77 603±89 1935±163 1438±121
10 372±51 38±10 167±45 102±12 873±103 475±92
실시예 8
각종 세제 및 용매가 HSL의 활성에 미치는 영향
NAG(0.05mg/mL)를 각종 시약의 농도 증가하에 HSL(20㎍)과 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도를 측정한다(n=4, 평균±SD).
결과: 1% 이하의 DMSO는 방출된 NBD-FA의 양을 약 10% 감소시킨다. 이 DMSO 농도에서 10% 이하의 NAG가 구조물의 용해로 인지질 소포/마이셀로부터 방출됨에 따라, 효소 활성이 산술적으로 20% 감소한다. 0.5% DMSO의 경우, 감소율은 여전히 10%이다. 0.1 내지 1%의 TX-100, 아세톤, 에탄올 및 메탄올은 HSL 활성을 증가시키고, 이는 가능하다면 보다 효율적인 기질 제공으로 생성된다. 고농도에서, 이는 활성을 방해한다. DMF는 심지어 0.1%로부터의 농도에서도 HSL의 활성을 상당히 손실시킨다.
481nm에서의 흡광도(arb. 단위)
농도[%] DMSO DMF TX-100 아세톤 에탄올 메탄올
0 3534±310 3427±213 3451±231 3325±300 3510±329 3523±358
0.05 3423±286 3365±256 3642±296 3948±325 3776±253 3421±290
0.1 3320±319 2576±278 4164±366 4487±376 4093±387 3341±265
0.2 3301±276 1321±154 4976±403 5876±452 4894±325 3150±302
0.5 3199±235 657±102 4065±312 6924±537 4231±296 2317±194
1 3156±196 210±78 2156±214 5421±325 3541±294 1948±164
2 1488±213 134±55 1254±143 2956±132 2143±215 1537±78
5 945±169 87±32 548±77 1523±72 1327±143 932±93
10 272±42 14±5 315±39 505±49 423±55 675±70
실시예 9
특이성이 상이한 리파제에 의한 NAG의 절단
NAG(0.05mg/mL)를 부분 정제된 HSL 20㎍, 랫트 지방세포로부터의 부분 정제된 LPL 75㎍, 세균성 리파제 20mU, 췌장성 리파제 50mU, 뱀의 독으로부터의 PLA2 100mU 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)로부터의 PC 특이성 포스포리파제 0.5U와 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도 증가를 측정한다(n=5, 평균±SD ).
결과: HSL에 대해 제공된 최적 조건하에, 예측했던 바와 같이 HSL(100%)과 LPL(약 70%)은 최대 활성을 나타냈다. 세균성 및 췌장성 리파제는 활성이 훨씬 적은(25% 또는 1%) 반면, 세균성 PC 특이성 포스포리파제는 거의 불활성이었다. 이들 매우 상이한 활성은 HSL에 대한 간접적 NAG 분석의 선택 조건의 특이성을 나타내므로, 예를 들면, 가능하다면 조악한 세포 추출물에 함유된 포스포리파제는 검출되지 않는다. 그러나, 이들 데이타는 또한 이러한 분석 원리가 다른 리파제에 원칙적으로 적용 가능함을 보여준다.
481nm에서의 흡광도 증가(arb. 단위)
효소 [arb. 단위] HSL LPL 세균성 리파제 췌장 리파제 PLA2 PLC
0 0 0 0 0 0 0
10 143±18 105±14 36±7 9±2 1±1 0
20 321±28 187±17 81±10 14±4 3±2 1±1
50 744±58 489±31 148±18 39±7 5±1 2±2
75 1023±95 773±56 238±29 64±10 8±2 2±1
100 1287±165 948±72 341±39 92±14 10±2 3±1
150 2106±183 1487±132 467±57 140±18 26±6 3±1
200 2697±231 1952±173 748±70 188±21 35±9 5±2
250 3321±349 2638±213 904±83 234±30 46±12 5±2
300 3855±288 2945±250 1056±143 265±34 54±9 7±3
400 4427±402 3512±288 1270±187 286±32 75±11 10±3
실시예 10
NBD 지방산으로 개질된 각종 아실글리세라이드의 HSL에 의한 절단
상이한 농도의 NAG(0.05mg/mL) 또는 각종 NBD 지방산 개질된 지질을 부분 정제된 HSL 20㎍과 함께 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도를 특정한 시간에 측정한다(n=5, 평균±SD).
결과:
481nm에서의 흡광도 증가(arb. 단위)
시간[분] NAG 0 NAG 1 NAG 2 NAG 3 NAG 4 NAG 5 NAG 6
0 0 0 0 0 0 0 0
1 39±5 33±4 13±3 6±2 2±2 2±2 1±1
2 67±9 59±5 28±6 15±4 3±2 5±2 2±1
5 158±19 149±15 69±7 34±5 5±2 13±3 2±1
10 378±41 341±37 132±18 61±8 8±3 28±4 2±2
15 561±51 502±49 234±32 106±18 13±3 47±7 3±1
20 789±93 711±84 358±49 149±16 21±4 63±8 3±1
30 1210±193 1097±143 603±69 286±21 32±4 85±10 4±2
45 1784±204 1690±173 826±55 405±53 49±5 132±16 5±2
60 2386±234 2207±231 1253±186 577±61 65±9 173±19 7±3
75 2873±259 2714±269 1528±162 734±83 81±11 226±29 8±3
90 3607±402 3396±376 1820±197 1005±125 105±13 268±38 10±3
120 4312±389 4056±411 2496±243 1384±206 148±19 325±42 21±3
180 4905±423 4562±496 3045±412 1623±188 227±31 503±51 24±5
실시예 11
디이소프로필 포스포플루오리데이트에 의한 HSL의 억제
디이소프로필 포스포플루오리데이트의 농도를 증가시키면서, NAG(0.05mg/mL)를 부분 정제된 HSL 20㎍과 함께 60분 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도 증가를 분량의 반응 배치로 측정하거나(간접적 NAG 분석), 클로로포름/메탄올로 추출한 후에 유기 상의 방출된 NBD-FA의 양을 형광측정법으로 측정한다(직접적 NAG 분석). 또는, [3H]트리올레오일글리세롤을 기질로서 사용하여 HSL을 항온처리(상기 참조)하여, 클로로포름/메탄올로 추출한 후에 방출된 방사선 표지된 올레산의 양을 측정한다. 억제인자 부재하의 절단 활성을 각각의 분석에 대해 100%로 설정한다(n=7, 평균±SD).
결과: 세 가지 분석 모두에서, 디이소프로필 포스포플루오리데이트에 대해 전형적인 S자형 억제 곡선을 나타낸다. 이로부터 산출된 IC50값은 간접적 NAG 분석(0.8mM)이나 직접적 NAG 분석(1.1mM)에 있어 서로 그다지 상이하지 않다. 트리올레오일글리세라이드 절단에 대해 다소 높은 2.1mM의 IC50값이 산출된다. 이는, 이들 분석으로 관찰된 각종 억제인자의 억제 작용에 있어 위에서 밝혀진 차이점에 따른 것이다(가능한 설명에 대해서는 실시예 6 참조). 이와는 별도로, 디이소프로필 포스포플루오리데이트에 의한 HSL 억제에 대해 간접적 NAG 분석으로 측정한 IC50값은 공개된 데이터에 상당 부분 따른다[참조: P. Stralfors, H. Olsson, P. Belfrage, The Enzymes XVIII, 1987, 147-177; P. Stralfors, P. Belfrage, J. Biol. Chem. 258, 1983, 15146-15151; P. Belfrage, B. Jergil, P. Stralfors, H. Tornquist, FEBS Lett. 75, 1977, 259-263].
HSL 최대 활성(%)
농도[mM] NAG 분석 NBD-FA 방출 TAG 분석
0 100 100 100
0.01 98.9±5.3 99.6±4.6 99.4±6.2
0.02 96.2±5.1 97.4±5.0 98.8±5.9
0.05 92.1±4.1 94.3±4.4 97.5±5.1
0.1 84.3±5.1 88.4±5.1 95.1±4.5
0.2 74.5±6.3 79.2±4.9 89.5±5.3
0.5 61.5±5.7 67.4±5.3 78.9±6.4
1 44.6±4.4 53.8±4.9 66.3±5.7
2 27.8±3.1 38.6±3.4 51.9±4.4
5 16.5±2.5 24.7±2.8 36.7±4.9
10 10.6±1.7 13.6±1.9 22.6±3.5
20 5.7±1.3 7.7±1.5 11.8±1.9
50 3.5±1.1 4.5±1.2 6.4±1.3
100 2.5±0.8 2.7±0.6 3.1±0.4
실시예 12
미세적정판 포맷에서의 간접적 NAG 분석의 실시 가능성
NAG를 96홀 미세적정판의 웰 중의 분석 용적 200㎕의 부분 정제된 HSL과 함께 상이한 시간 동안 항온처리한다. 481nm에서의 흡광도를 미세적정판 판독기로 측정한다.
결과: 선택된 조건하에, 반응을 약 60분 이하까지 선형이다. 이러한 경우에 분산(SD)은 4 내지 7%이다. 따라서, 간접적 NAG 분석은 HT 스크리닝용으로 적합하다.
481nm에서의 흡광도 증가(arb.단위)
시간[분] 시험:1 2 3 4 5 6 7 8
0 0 0 0 0 0 0 0 0
1 50 48 61 49 56 52 57 49
2 97 89 107 95 101 116 93 89
5 238 269 278 243 277 248 235 241
10 487 534 462 458 552 508 488 460
15 713 768 709 712 789 780 735 718
20 978 1013 967 979 1097 1121 1045 966
30 1413 1579 1625 1690 1523 1688 1452 1410
45 2045 2134 2239 2106 2106 2238 1967 2145
60 2367 2541 2658 2755 2534 2608 2536 2690
75 2611 2894 2973 3023 2871 2879 2982 2895
90 2985 3244 3310 3355 3260 3122 3240 3125
120 3127 3469 3577 3601 3489 3378 3507 3320
사용된 약어:
arb. 단위: 임의의 단위
BSA: 소 혈청 알부민
cAMP: 환형 아데노신 모노포스페이트
DCC: 디사이클로헥실카보디이미드
DMF: N,N-디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸 설폭사이드
DTT: 디티오트레이톨
EDTA: 에틸렌디아민-N,N,N',N'-테트라아세트산
FAB-MS: 고속 원자 충격 질량 분석
HSL: 호르몬 민감성 리파제
Kpi: 인산이수소화칼륨/인산칼륨 완충액
LPL: 지단백질 리파제
NAG: NBD-모노아실글리세라이드: 2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트
NBD: 4-클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸
NBD-FA: NBD 지방산: 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)-도데칸산
NIDDM: 비인슐린 의존성 당뇨병
PLA2: 포스포리파제 A2
PLC: 포스포리파제 C
PNPB: p-니트로페닐 부티레이트
SD: 표준 편차
SDS: 나트륨 도데실 설페이트
TAG: [3H]-트리올레오일글리세롤
Tris: 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄
TLC: 박층 크로마토그래피
TX-100: 트리톤(TritonR) X-100
본 발명에 따라서, 형광 표지된 합성 아실글리세라이드를 사용하여, 방향족 물질의 배열에 원조하여, 예를 들면, 인지질/지질 복합 구조물(이층, 단층, 응집체, 마이셀) 등의 전하 이동 복합체를 생성하기 위한 구조물을 동정하기 위한 간단한 연속 시험법 및 리파제와 같은 지질 결합 단백질의 활성을 측정하기 위한 방법이 개발되었다.

Claims (2)

12-아미노라우르산을 먼저 실온에서 염기를 첨가하면서 알콜 용액 중의 7-클로로-4-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시키고, 이어서 수득한 중간체를 50℃에서 알콜 용액 중의 2,3-에폭시프로판올과 반응시킴을 포함하는, 모노아실글리세라이드인 2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트의 제조방법.
2,3-디하이드록시프로필 12-(7-니트로벤조[1,2,3]옥사디아졸-4-일아미노)도데카노에이트.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2824334B1 (fr) * 2001-05-03 2003-10-10 Coletica Procede pour tester une substance eventuellement active dans le domaine de la lipolyse et son utilisation principalement cosmetique
WO2003069305A2 (en) * 2002-02-13 2003-08-21 Wisconsin Alumni Research Foundation Fluorescent phospholipase assay, phospholipase a2 inhibitor and stimulator, and the use thereof
US7968306B2 (en) 2002-02-13 2011-06-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Method for measuring activity of a specific fraction of albumin
FR2870741B1 (fr) * 2004-05-25 2008-03-14 Coletica Sa Phase lamellaires hydratees ou liposomes, contenant une monoamine grasse ou un polymere cationique favorisant la penetration intercellulaire, et composition cosmetique ou pharmaceutique la contenant.
KR101041808B1 (ko) * 2004-06-01 2011-06-17 엘지전자 주식회사 디엘피 프로젝터의 ｄｍｄ 칩 냉각용 히트싱크의 구조
AU2005259218B2 (en) * 2004-07-01 2010-07-08 Dsm Ip Assets B.V. Novel method for screening and selecting enzymes
EP1868989A2 (en) * 2005-03-30 2007-12-26 University of Zurich Inhibitors of neurotrypsin and determination thereof
CN113109479A (zh) * 2021-04-19 2021-07-13 湖北浩华生物技术有限公司 一种高效液相色谱检测三丁酸甘油酯的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0253271A1 (en) * 1986-07-15 1988-01-20 Abbott Laboratories Fluorescence polarization method for monitoring fetal lung maturity

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI63064C (fi) * 1980-04-09 1983-04-11 Ksv Chemicals Oy Foerfarande foer fluorometrisk bestaemning av aktiviteten av fettspjaelkande enzymer och medel foer att genomfoera foerfarandet

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0253271A1 (en) * 1986-07-15 1988-01-20 Abbott Laboratories Fluorescence polarization method for monitoring fetal lung maturity

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TING et al; CHEM. PHYS. LIPIDS, 60(1), pp. 83-91, 1991

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