KR100768674B1

KR100768674B1 - 킬레이트화된 철분 펩타이드의 제조방법

Info

Publication number: KR100768674B1
Application number: KR1020040014988A
Authority: KR
Inventors: 서형주
Original assignee: (주)새롬바이오; 서형주
Priority date: 2004-03-05
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2007-10-19
Also published as: KR20050089525A

Abstract

본 발명은 안정성과 흡수성이 뛰어나며 생체 이용률이 높은 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 효모를 효소 분해하여 펩타이드를 형성한 다음, 철분과 펩타이드를 킬레이트화하는 철분 펩타이드의 제조방법을 개시한다.

효모, 철분, 킬레이트, 펩타이드, 효소분해

Description

킬레이트화된 철분 펩타이드의 제조방법{PROCESS FOR PREPARING OF YEAST-PEPTIDE CONTAINING CHELATED FERRIC OR FERROUS COMPOUNDS}

도 1은 본 발명에 따른 철분 펩타이드의 생체이용률을 나타낸 도면이다.

본 발명은 철분 펩타이드의 제조방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 안정성과 흡수성이 뛰어나며 생체 이용률이 향상된 철분 펩타이드의 제조에 관한 것이다. 본 발명은 또한 안전하고 검증된 미생물인 효모의 효소 분해를 통해 철분 펩타이드를 킬레이트화법으로 제조한 것으로서, 상기 철분 펩타이드는 기존 철분 제재의 단점인 변비를 최소화 하는 것을 특징으로 한다.

생명체에게 있어 미네랄의 중요성은 아주 오래 전부터 인식되어져 왔고, 이들 성분의 특이성에 대한 것은 최근에 생명과학 안에서 놀랄만한 발전을 이루어 왔으며, 또한 몇몇 미네랄 원소(Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn, Se, Cr, Cu)의 생물학적 중요성은 예전부터 인식되어져 왔다. 오늘날 17가지 이상의 미량 원소들이 생명 시스템에 필수적인 것으로 알려져 있으며, 대부분의 미네랄의 형태는 금속성 효소(metalloenzyme)형태로 이루어져 있다.

철분은 생명유지에 필요한 미량 광물질의 하나로서, 철분의 생리적 기능에 관한 연구가 활발히 진행되어왔다. 생체내의 철분은 체내에 약 0.04%가 함유되어 있으며 이중 약 70%는 적혈구 중에 포함되어 산소 운반을 하는 헤모글로빈 형태로 존재하고, 나머지 약 30%정도는 간, 지라, 골수 등에 존재하면서 산소운반과 생체에너지 획득에 중요한 전자 전달효소인 시토크롬, 카탈라아제 및 옥시다아제 및 면역기능 강화에 관련된 락토페린(lactoferrin,유즙철)의 구성성분 등으로 생명 유지에 필수 불가결한 요소로 존재한다. 이러한 철분의 흡수는 체내철분 저장상태에 따라 다르지만 정상적인 성인의 경우 섭취한 철분의 약 5-10%만이 흡수되는데,(Cotran RS, Kumar V and Robbins SL. Iron deficiency anemia. In Pathologic Basis of Disease, Philadelphias, p.610, 1994) 그 과정은 장점막 세포의 융모에서 분비되는 특정 영양소 흡수부위에서 일어나며, 흡수된 철은 장점막을 통과한 후 아포페리틴(apoferritin)과 결합하여 페리틴을 형성하고, 이 페리틴은 세포내 철과 평형관계를 유지하고 그 후 혈장내 트랜스페린(transferrin)형태의 철분과 평형관계를 유지한다.(강창원, 미량광물질의 생리작용, 1996; 하종규, 비타민 광물질 영양학, 1985)

이러한 철분의 결핍은 세계에서 가장 흔한 영양 결핍 중 하나로 50억의 사람들이 음식에서 체내로의 낮은 흡수율로 인한 철분 결핍성 빈혈을 가지고 있다고 한다.(Meyer EM and Adiles-Tegman M. The prevalence of anemia in the world. World Health State Q, 38: 302, 1985) 철분 결핍은 체내 철분요구량보다 철분흡수율이 낮을 경우 음식으로부터 낮은 철분흡수율, 성장률이 높은 시기, 계속되는 만성출혈시, serum ferritin 농도감소 등의 원인으로 인하여 일어난다.(FAO/WHO, Requirments of vitamin A, iron, folate and vitamin B-12, Report of a Joint FAO/WHO Expert Group. Geneva, Switzerland, 1989)
철분결핍은 성장기의 어린이들과 여성들에게 주로 일어나며 철분결핍으로 인하여 빈혈, 식욕부진, 설사, 호흡곤란, 성장부진, 일에 대한 수용능력의 감소를 유발하고 피로가 빨리 오며 지능적인 일의 수행력 감소, 어린이의 경우 행동 장애, 면역기능의 저하(스트레스와 질병에 대한 감수성의 증가) 등의 생체내의 신진대사에 문제점을 야기시킨다. 특히 우유만 먹는 유아의 경우, 우유 중에 많이 함유된 칼슘에 의하여 철분이 결핍되기 쉬우며 이로 인하여 정상적인 성장에 장애가 될 수도 있다.(Dallman PR. Iron deficiency: Does it matter? J. Int. Med. 226: 367-381, 1989)
철분이 체내에 흡수되기 위해서는 철분이 가용성의 상태가 되어야 하며 특정한 음식이나 식이성분이 십이지장의 조건에서 철분의 용해성을 높인다면 이들이 철분의 체내로의 흡수를 증가시킬 가능성이 매우 높다.

철분은 생체 내에서 이루어지는 거의 모든 대사에 필수적인 성분으로 다른 영양소와 비교하여 비교적 소량이 필요하다. 식품에 함유되어 있는 철분은 그 함량도 중요하지만 실제적으로 이용되는 정도를 평가하는 생체이용률이 매우 중요하다.(Hellberg L. Bioavailability of dietaary iron in man. Ann. Rev. Nutr., 1: 123-129, 1981) 이것은 철분의 소화 흡수율이 다른 영양소보다 매우 낮으며 또한 다른 성분들과의 상호작용이 복잡하고 다양하여 식품의 조합에 따라 매우 다양한 생체이용률을 보이기 때문이다.
생체이용률(Bioavailability)이라는 용어는 학문의 영역에 따라 약간씩 다르게 정의되고 있다. 인체영양학자들에게 있어서 생체이용률이란 개념은 체내에서 영양소가 이용되는 효율로 정의 내려지고 동물영양학에서는 이와 비슷한 개념이기는 하지만, 주로 ‘특정 동물의 성장과 유지를 위한 사료의 영양가’로 표현하고 있다. 한편, 약리학에서는 생체이용률이라는 개념을 ‘경구 투여 후 혈액에 도달되는 약물의 용량’으로 정의 내린다. 영양학적 생체이용률은 소화율(digestibility), 소장에서의 흡수율(absorbability), 세포 또는 조직으로의 운반(transport), 그리고 대사적 기능을 위한 영양소가 이용되는 율(the ability to use a nutrition for metabolic function)을 포함하고 있다.
철분의 생체이용률은 크게 세 가지 단계로 나누어 볼 수 있는 데, (1) 첫 번째 단계는 소화율, 식품성분 또는 장 내용물에서 철분의 용해도이고, (2) 두 번째 단계는 소장 상피벽 을 통해 철분이 흡수되어 혈액으로 합류하는 과정이고, (3) 세 번째 단계는 일단 혈액으로 들어온 철분이 processing과정을 거쳐 생리기능을 나타내는 물질(예,hemoglobin)에 포함되는 과정이다.

철분의 생체이용률에 영향을 미치는 가장 중요한 요인은 용해도로서 이는 소장의 점막(mucosa)에서 효과적으로 흡수되기 위한 전제조건이기 때문이다.(Ostrloh KRS, Simpson RJ, Snap S, and Peters TJ. Intestinal iron absorption and mucosal transferrin in rats subjected to hypoxia. Blut, 55: 421-431, 1987) 철분의 용해도는 식품의 가공, 저장 중 소요되는 시간뿐만 아니라 pH, 산화환원작용 등의 환경에 따라서 달라지며, 또한 형성되는 복합체 종류, 착화, 결합의 종류, 결합력 등에 따라 차이를 보이지만,(Johnson PE. What can in vitro methods tell us about mineral availability? Bio Trace Element Res, 19: 3-10, 1989) 생체환경에서 일어날 수 있는 모든 작용이 충분히 이해되고 있지 않다는 것도 인지하여야 한다. 철분과 다른 무기질간의 상호작용은 소장에서 흡수될 때 경쟁관계로 이해할 수 있으며 식품중의 다른 성분과의 결합에 있어서도 경쟁적인 관계가 될 수 있다.(Layrisse M, Martinez-Torres C and Roche M. Effect of interaction of various foods on iron absorption. Am J Clin Nutr, 21: 11754-1183, 1968) 또한 생체에 흡수된 후에도 생리적인 측면에서 무기질간의 상승, 보완, 저해작용이 있다. 이와 같은 무기질간의 여러 작용은 아직 충분히 이해되고 있지 않으나, 무기질간의 상호작용은 네 가지, 즉 (1) 다른 무기질과 결합되어 있는 복합체의 무기질을 대체하여 용해성 또는 비용해성 복합체로의 변화, (2) 용해성 복합체에 제2, 제3의 무기질이 결합하여 침전을 일으키는 변화, (3) 무기질 ligand에 다른 무기질을 첨가함으로서 여러 개의 무기질과 기질이 복합체를 형성,(4) 무기질 ligand 복합체 형성으로 소화효소 작용의 변화로 분류된다.(Clydesdale FM. Physicochemical determinants of iron bioavailability. Food Tech, 37: 133-138, 1983)

철분은 산화상태에 따라 ferrous(2가), ferric(3가) 형태로 존재하며 생체에서는 거의 대부분이 복합체를 형성한 생태로 존재하며, pH가 3 이상일 경우 용해도가 매우 낮은 ferric hydroxides를 형성하기 때문에 ferric iron의 용해도가 감소하는 문제점을 갖고 있다.(Camire AL and Clydesdale FM. Effect of pH and heat treatment on the binding of calcium, magnesium, zinc, and iron to wheat bran and fractions of dietary fiber. J Food Sci, 46: 548-551, 1981) 소화 흡수시 이와 같이 용해도가 낮은 하이드로 옥사이드들이나 포스페이트 복합체가 형성되는 것을 방지하기 위하여 어떤 복합체나 킬레이트들을 형성할 수 있는데, 철분의 경우 결합된 복합체로부터의 생체이용률은 복합체의 안정성에 따라 달라진다. 위장 계(Gastrointestinal tract)를 통과하는 동안 여러 가지 다른 환경에 노출되는 경우 안정된 염들이 흡수에 가장 유용할 것이다. 복합체의 안정성이 낮을 경우 복합체로부터 철분이 분리되기 쉬워서 다른 복합체를 형성하기 쉽고, 장내에서 어느 정도 철분이 분리되느냐에 따라 그 이용도가 달라진다.(Berner LA, Miller DD, and Van Campen D. Availability to rats of iron in ferric hydroxide polymers. J Nutr. 115: 1042-1049, 1985)

일반적으로 철분의 흡수의 증가는 (1) 식품에 헴 단백철이 많을수록 증가하고, (2) 성장, 월경(menstruation), 임신 등 철분이 필요할 때, (3) Fe3+이 Fe2+로 전환하게 하는 비타민 C와 위 염산이 존재할 때, (4) 미량철이 소장점막 페리틴 커어튼에 부착될 때, (5) 출혈이나 빈혈상태에서 헤모글로빈 합성이 증가될 때 철 흡수가 증가되는 경향을 나타낸다. 반면에 철의 흡수에 장애를 일으키는 경우는, (1)식품에 비헴철이 많을 경우, (2) 많은 철이 소장 점막 페리틴 커어튼에 부착되었을 경우, (3) 과량의 인산, 피틴염, 옥살산염, 탄닌산이 존재하는 경우이다.

철분은 크게 유기태 및 무기태 철분의 두 가지 형태로 분류할 수 있다. 유기태 철 분은 유기물질과 결합된 형태의 철분으로서 흡수 이용부위인 장점막을 그대로 통과하게 되어 체내흡수가 용이하지만, 무기태 철분은 여러 흡수 저해인자와 결합하여 섭취 후 장점막 통과가 용이하지 않으므로 생체이용율이 유기태 철분에 비해 현저히 떨어지는 것으로 알려져 있다. 그러나, 현재까지 국내에서는 이러한 생체이용율이 높은 유기태 철분이 개발되어 있지 않아 이의 필요성이 절실이 요구되고 있다.

많은 연구자들에 의해 단백질이나 펩타이드 등이 철분의 가용화를 돕는다는 연구결과가 발표되고 있다. 슬라트카비츠(Slatkavitz)와 크리데스달(Clydesdale) (Slakavitz CA and Clydesdale FM. Solubility of inorganic iron as affected by proteolytic digestion. Am J Clin Nutr, 47: 487-495, 1988)은 닭 근육질의 산에 용해되지 않는 추출물이 철분을 가용화시키는 능력이 뛰어나다고 보고한 바 있으며 수용성의 추출물이나 산추출물에서는 가용화 능이 나타나지 않았다. 반 카펜(Van Canpen)과 그로스(Gross)(Van Campen D and Gross E. Effect of histidine and certain other amino acids on the absorption of iron-59 by rat. J Nutr. 99: 68-74, 1969)는 쥐를 이용한 혈관을 양쪽에서 묶어 분절로 만든(ligated duodenal segments)실험에서 아미노산 중에서도 히스티딘과 라이신이 철분의 체내흡수를 현저히 증가시킨다는 것을 발견하였다. 헴 단백철과 같은 단백질과의 킬레이트 화합물은 장애요소인 인산염이나 산화성 물질과의 접촉이 어렵기 때문에 흡수에 장애가 일어나지 않으며 단백질은 철이온의 결합량을 증가시키기 위하여 가수분해를 하여 올리고 펩타이드(Oligo peptide)형태까지 진행시킨 다음 결합시키므로 올리고 펩타이드 분자는 세포막을 통과할 수 있게 되므로 동시에 철 성분도 통과 흡수될 수 있 는 상태가 된다. 단백철의 분자 분포상태를 보면 단백질을 구성하고 있는 아미노산(Amino Acid )의 망상(net shape)구조 내에 결합되어 있는 형태이므로 철이온을 중심으로 펩티드 결합이 에워싸고 있으며 외각에 분포되어 있는 아민기는 철이온의 장애요인인 음이온과 결합하게 되어 철이온과의 반응을 방어할 수 있기 때문에 철이온이 안정한 상태를 유지하면서 흡수될 수 있게 한다.

이에 본 발명자들은 안정성과 흡수성이 뛰어나며 생체 이용률이 기존의 헴 철보다 높은 것을 특징으로 하는 유기 철분을 함유한 펩타이드를 안전하고 검증된 미생물인 효모의 효소분해를 통한 킬레이트화법으로 제조하여 기존 철분 제재의 단점인 변비를 최소화 하는 철분제재에 관한 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 안정성과 흡수성이 뛰어나며 생체 이용률이 높으며, 변비라는 부작용이 없는 것을 특징으로 하는 킬레이트화된 철분 펩타이드의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 효모를 효소 분해하여 펩타이드를 형성한 다음, 철분과 펩타이드를 킬레이트화하는 철분 펩타이드의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 효모의 배양

생산배지는 요소 0.616%, 황산암모늄 0.194%, 당밀17.6%, 인산 0.146%, 염화칼륨 0.0554%, 황산마그네슘 0.0428%, 황산칼슘 0.0286%, 황산아연 0.001592%, 티아민 0.000214%를 탈 이온수 500㎖에 충분히 용해시키고 121℃에서 15분 동안 가압 멸균하여 제조하였다. 500㎖의 배양액을 함유한 1000㎖ 플라스크에 잘 자란 종균(KCTC-7904) 20~50㎖를 넣은 뒤 26℃~30℃, 200rpm의 조건에서 24~27시간 진탕 배양하였다. 이 배양액을 초 원심 분리기를 이용하여 5000×g, 4℃의 조건하에서 15분간 원심 분리하여 셀(cell)을 모아, 이것을 탈 이온수로 3회 이상 세척하여 배양된 효모 78~87g을 얻었다.

실시예 2: 철분 펩타이드 제조

멸균된 1000㎖ 플라스크에 탈 이온수 350㎖와 효모 150g을 넣은 뒤 30℃, 200rpm에서 4~6시간동안 진탕 배양 한 후, 황산철을 1.12g~11.2g과 프로테아제(Collupulin MG DSM사) 360~450mg도 함께 넣은 다음, 50~52℃, 200rpm의 조건에서 48~72시간 반응시킨 후 동결건조하여 철분 펩타이드 49.52~56.33g을 얻었다.

실시예 3: 철분 펩타이드의 철 농도분석

시료 내에 포함된 철분은 ICP-AES로 측정하였다. 철분 농도를 측정하기 위하여 시료들을 전처리 해야 하는데, 전처리는 시료 건조 중량 0.1g을 vial (50㎖)에 넣은 후 산 분해(질산 30%, 과산화수소 20%, 탈 이온수 50%)법으로 유기물을 분해하고 약 100℃~120℃에서 2시간 정도 가열하여 실시하였다. 이러한 전처리를 통해 시료 용액을 맑게 하여 ICP에 도입하여 미네랄의 농도를 측정하였다. 이 때 철분의 농도는 4,865~39,943 ppm으로 정량되었으며, 자세한 내용은 표 1에 나타내었다.

효모 (g)	Fe weight(mg)	FeSO₄ㆍ7H₂O(g)	Enzyme (mg)	ICP-AES 농도(ppm)	yield(g)
150	225	1.120	360	4865	46.52
150	450	2.240	360	9461	47.56
150	675	3.360	360	13883	48.62
150	900	4.480	360	18098	49.73
150	1350	6.721	360	26224	51.48
150	1800	8.961	360	33790	53.27
150	2250	11.201	360	39943	56.33

실시예 4: 생체이용률 실험

12 마리의 랫트(60g, 2주령)를 아래의 철 결핍 사료로 약 2주간 사육하여 안정화 시킨 후 랫트(120g) 12마리를 3마리씩 네 군 즉, 대조군, 페릭암모늄 시트레이트군, 헴군, 철분 펩타이드군으로 나누어 실험동물로 사용하였다. 4 개군의 실험군 모두 철 결핍 사료(마리당 25g)로 1주일간 사육한 후, 철분의 하루 권장량(12mg/60kg)의 10배(2mg/kg)를 경구 투여하여 7 일간 사육한 후 혈액에서 혈청을 분리(3000rpm, 30min)하였다. 분리한 혈청을 산 분해(황산60%, 질산30%, 염산 적량, 300℃, 2시간)하여 용액을 맑게 한 후 ICP-AES로 정량분석 하였다. 철 결핍사료에 대한 구성성분의 양은 표 2에 나타내었으며, 또한 ICP-AES로 정량분석한 결과를 표 3에 나타내었다.

성분	중량(g)
카제인	392
옥수수 전분	1132
설탕	200
콩기름	160
셀룰로오스	100
엘-메티오닌	6
비타민 혼합물	20
광물질 혼합물	70

* 광물질 혼합물(200g 기준)

CaHPO₄ㆍ2H₂O:29.12g, KH₂PO₄: 51.44g, NaH₂PO ₄: 18.7g, NaCl: 9.32g, Calcium lactate: 70.18g, MgSO₄: 14.34g, ZnCO₃: 220mg, MnSO₄ㆍ4H₂O: 240mg, CuSO₄ㆍ5H₂O: 60mg, KI: 20mg

실험군	혈청내의 ICP 농도(ppm)
대조군	1.50 ± 0.29
페릭암모늄시트레이트	1.80 ± 0.66
헴철	2.88 ± 0.32
철분펩타이드	3.21 ± 0.27

실시예 5: 변비 테스트

건강한 성인 남녀 20명 (남 12명, 여 12명)을 대상으로 본 발명의 방법에 의해 제조한 유기철분을 함유한 캡슐 (250mg/캡슐)을 1일 2회, 15일 동안 복용하게 한 후 다음과 같은 항목에 대해 평가하였다. 평가항목은 배변량, 배변상태, 복부긴장감, 식욕 등에 대하여 실시하였으며, 그 결과는 표 4와 같다.

평가항목	복용후 상태
배변량	22% 감소
배변상태	33% 개선
복부긴장감	22% 개선
식욕	변화 없음

본 발명의 방법에서는 기존의 화학적 합성방법으로 만들어진 철 화합물과 부작용이 많은 다른 철분제재를 대체 할 수 있는 단백질 함량이 높은 효모를 이용하여 제조하기가 간편하고 영양학적으로 우수한 철분 펩타이드로 흡수성과 생체이용률이 높아 경제적, 건강학적으로 우수하고, 빈혈 및 여성들의 생리기간에도 유용한 철분제재가 될 수 있는 장점을 갖고 있다. 또한 변비를 발생시키지 않아 철분제재에 과민성이 있는 사람들도 복용할 수 있는 광범위한 철분제재이다.

Claims

효모를 효소 분해하여 효모 펩타이드를 형성한 다음, 상기 효모 펩타이드와 철분을 킬레이트화하는 철분 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 효소 분해는 48 내지 72시간 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 효소 분해는 프로테아제를 첨가하여 수행하는 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 철분과 상기 펩타이드의 중량비는 0.5:100 내지 1:20인 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법.
제 1 항에 있어서,

상기 효소 분해는 50 내지 52℃로 수행하는 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법.
제 3 항에 있어서,

상기 프로타아제는 상기 효모의 건조 중량비를 기준으로 0.8 내지 1.0 중량%를 첨가하는 것을 특징으로 하는 철분 펩타이드의 제조방법.