KR100766768B1 - 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자, 그를 포함하는시스템 및 그를 이용한 방법 - Google Patents

호모시스테인 정량용 미세 유체 소자, 그를 포함하는시스템 및 그를 이용한 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 호모시스테인의 농도를 정량하기 위한 미세 유체 소자에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 미세 유체 소자는 a) 샘플로부터 호모시스테인이 환원되는 샘플 전처리부; b) 상기 샘플 전처리부에서 환원된 호모시스테인이 호모시스테인 전환 효소 및 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질과 반응이 일어나는 효소 반응부; c) 상기 효소 반응부에서 생성된 반응물이 면역학적 검정법에 의해 검출되는 면역검정부; 및 d) 상기 샘플 전처리부와 효소 반응부 사이 및 효소 반응부와 면역검정부 사이를 연결하는 미세유로부를 포함한다.
호모시스테인, 미세 유체 역학(microfluidics), 미세 유로, 모세관 유동

Description

호모시스테인 정량용 미세 유체 소자, 그를 포함하는 시스템 및 그를 이용한 방법{Microfluidic device for measuring the amount of homocysteine, system comprising the same, and method using the same}
도 1은 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 개략도이다.
도 2는 일반적인 미세 유로를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 유동 지연 모델을 개략적으로 도시한 것이다.
도 4는 도 3의 유동 지연 모델에서 유동의 변화 모습을 촬영한 사진들이다.
도 5는 본 발명에 따른 검출부가 포함된 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 개략도이다.
도 6은 본 발명에 따른 압력 구동 방식에 의한 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 개략도이다.
도 7은 본 발명에 따른 시스템의 개략도이다.
도 8은 본 발명의 제 1실시예에 따른 미세 유체 소자의 사진이다.
도 9는 본 발명의 제 2실시예에 따른 실험 결과이다.
도 10은 본 발명의 제 3실시예에 따른 실험 결과이다.
본 발명은 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자, 상기 미세 유체 소자를 포함하는 시스템, 및 상기 미세 유체 소자 또는 시스템을 이용한 호모시스테인 정량 방법에 관한 것이다.
호모시스테인은 티올기(-thiol)를 포함하는 아미노산으로서 필수아미노산인 메티오닌의 대사과정에서 생성되는　 물질이다. 신진대사의 이상으로 호모시스테인이 혈류에 축적되는 경우 동맥에 손상을 입히고　손상부위에 지방성 물질이 축적되어 동맥의 혈액순환을 방해한다. 따라서 호모시스테인의 증가는　뇌졸중이나 치매(알츠하이머형 치매), 심장 질환 및 말초혈관질환 등 혈관성 질환의 주된 원인이　된다. 따라서, 혈액내 호모시스테인의 양 또는 농도를 측정함으로써 혈관성 질환의 예후를 예측하고 이의 발병을 조기에 예방할 수 있다.
상기 호모시스테인의 양을 측정하기 위하여, 종래에는 고성능 액체 크로마토 그래피법(HPLC: High Performance Liquid Chromatography)과 질량분광법(MS: Mass Spectrometry) 등을 이용하여 왔다. 그러나, 상기 고성능 액체 크로마토 그래피법과 질량 분광법은 전처리 과정이 복잡하고 장비가 고가이어서 환자의 진단에 사용되기 어렵고, 또한 여러 개의 시료에 대해 동시 다분석이 어렵다는 문제점을 가진다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 미국 특허 제 6,562,298호 등과 같은 동시 다분석 기술을 활용함으로써, 다수의 샘플에 대한 호모시스테인 정량이 가능해졌다. 그러나 상기 기술은 고가의 복잡한 장비와 많은 양의 시료를 필요로 하는 단점이 있다.
한편, 최근에 극소량의 미세 유체를 이용하여 시료의 농도를 정량하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 극소량의 미세유체를 이송하고 제어하는 기술은, 진단/분석 장치의 구동을 가능하게 하는 핵심 기술로서, 이러한 기술은 다양한 구동 방식으로 구현될 수 있다. 예를 들면, 유체 주입 부분 또는 배출 부분에 압력을 가하는 압력 구동 방식(pressure-driven method)이나, 미세유로 사이에 전압을 인가하여 유체를 이송하는 전기 영동법(electrophoretic method)이나 전기 삼투압법(electroosmotic method), 그리고 모세관 현상을 이용한 모세관 유동 방식(capillary flow method) 등이 대표적으로 알려져 있다.
본 발명자들은 미세 유체 역학 기술을 이용하여 호모시스테인의 양을 짧은 시간 내에 간편하고 정확하게 측정하여 혈관성 질환의 조기 진단 및 예방을 가능하게 하는 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자 및 그를 이용한 호모시스테인 정량 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 압력 구동 방식 또는 모세관 유동 방식을 이용한 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자를 포함하는 호모시스테인 정량 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자 또는 상기 시스템을 이용하는 호모시스테인 정량 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 샘플로부터 호모시스테인이 환원되는 샘플 전처리부; b) 상기 샘플 전처리부에서 환원된 호모시스테인이 호모시스테인 전환 효소 및 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질과 반응이 일어나는 효소 반응부; c) 상기 효소 반응부에서 생성된 반응물이 면역학적 검정법에 의해 검출되는 면역검정부; 및 d) 상기 샘플 전처리부와 효소 반응부 사이 및 효소 반응부와 면역검정부 사이를 연결하는 미세유로부;를 포함하는 샘플 내의 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 신호 보정용 미세 유체 소자; 및 b) 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 신호 검출용 미세 유체 소자;를 포함하는 샘플 내의 호모시스테인 정량용 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 상기 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계; 및 b) 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계;를 포함하는 샘플 내 호모시스테인의 정량 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 상기 시스템의 신호 보정용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계; b) 상기 시스템의 신호 검출용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 단 계; c) 상기 신호 보정용 미세 유체 소자 및 신호 검출용 미세 유체 소자에서 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계; 및 d) 상기 검출 결과를 비교하여 상기 b) 단계의 샘플의 호모시스테인 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 샘플 내 호모시스테인의 정량 방법을 제공한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 유전자형 판별 방법의 실시예를 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 개략도이다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 샘플 내의 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자(100)는 샘플로부터 호모시스테인이 환원되는 샘플 전처리부(115), 상기 샘플 전처리부(115)에서 환원된 호모시스테인이 호모시스테인 전환 효소 및 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질과 반응이 일어나는 효소 반응부(120), 상기 효소 반응부(120)에서 생성된 반응물이 면역학적 검정법에 의해 검출되는 면역검정부(125); 및 상기 샘플 전처리부(115)와 효소 반응부(120) 사이 및 효소 반응부(120)와 면역검정부(125) 사이를 연결하는 미세유로부(145, 146)를 포함한다.
본 발명에 따른 미세 유체 소자(100)는 상기 샘플 전처리부(115) 상류에 혈액 필터(110)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 혈액 필터(110)는 혈액 내의 혈구 요소를 제거함으로써 혈장 또는 혈청을 추출한다. 상기 혈액 필터(110)와 샘플 전처리부(115)는 미세 유로로 연결된다.
또한, 본 발명에 따른 미세 유체 소자(100)는 상기 샘플 전처리부(115) 상류에, 바람직하게 상기 혈액 필터(110) 상류에 샘플 주입구(105)를 추가로 포함하 고, 상기 면역검정부(125) 하류에 샘플 배출부(130)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 각 구성요소들은 미세 유로로 연결된다. 상기 샘플 배출부(130)는 샘플 배출구(135)를 포함할 수 있다.
상기 샘플 전처리부(115)에는 환원제인 DTT가 포함되어 있을 수 있다.
상기 호모시스테인 전환 효소는 S-아데노실-호모시스테인-하이드롤라제(SAH-hydrolase)일 수 있다.
상기 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질은 아데노신일 수 있다.
호모시스테인을 포함한 샘플이 샘플 주입구(105)로 주입되면 샘플 전처리부(115)로 이송하게 된다. 한편, 혈액 샘플을 사용하는 경우, 샘플 주입구(105)와 샘플 전처리부(115)사이에 혈액 필터(110)를 삽입할 수 있다. 이 경우, 샘플 주입구(105)를 통해 유입된 혈액은 혈액 필터(110)에서 혈구 요소들이 제거되어 혈장만 샘플 전처리부(115)로 이송하게 된다.
도 1에서, 상기 샘플의 이송은 모세관 유동(capillary flow)에 의해 수행된다. 모세관 유동 방식은 미세 유로에서 자연적으로 발생하는 모세관 현상을 이용하는 것으로, 추가 장치 없이 유체 주입 부분에 놓여진 극소량의 유체가 자연적이고 즉각적으로 주어진 유로를 따라서 이동하게 되는 장점을 가진다. 모세관 유동은 기체-액체 계면에서 발생하는 압력의 불연속 변화에 기인하여 계면이 곡률을 가지며 휘어진 경우에 발생된다. 계면 곡률은 기체-액체 계면과 고체 벽면이 만나는 삼중점에서 계면과 벽면이 이루는 접촉각(θ)에 의하여 발생한다. 일반적으로 접촉각은 벽면과 계면이 이루는 액체 쪽으로의 각도로 정의하는데, 벽면이 기체보다 액체와 더 친밀한 경우 0〈θ〈π/2 이며, 반대의 경우 π/2〈θ〈π로 주어진다.
도 2는 일반적인 미세 유로를 개략적으로 도시한 것이다. 도 2를 참조하면, 유체가 흐르는 유로의 단면이 직사각형인 경우, 관의 모서리 효과를 무시하면 유동 효과를 제외한 압력 변화량은 다음과 같이 표현할 수 있다. 계면에서 발생한 압력 변화는 계면의 위치(a)와 연결되어 ΔP/a의 압력 경사를 발생시키고, 이는 유체의 움직임을 만들어 낸다.
ΔP = P0 - Pa = (1/b + 1/c)cos
상기와 같은 모세관 유동은 유동 지연 모델에 의해 지연될 수 있다.
도 3은 유동 지연 모델(10)을 개략적으로 도시한 것이다. 즉, 유체가 유입영역(11)으로 유입되었을 때, 유입영역(11)과 유동지연영역(13)의 경계 영역인 지연경계영역(12)에서 유동 지연 효과가 발생되며, 지연경계영역(12)을 통과하는 동안 지연 효과는 지속된다. 이후, 지연경계영역(12)을 통과한 모세관 유동은 유동지연영역(13)을 지나 유동지연영역(13)과 유동회복영역(15) 사이의 경계 영역인 회복경계영역(14)을 접하면서 계면 곡률이 증가하여 이전의 유속을 회복한다. 점차 회복되는 모세관 유동의 유속은 유동회복영역(15)에서 이전의 유속으로 완전히 회복되고, 유동이 지속된다.
도 4는 도 3의 유동 지연 모델에서 유동의 변화 모습을 촬영한 사진들이다. 모세관 유동에 의해 유입된 유체가 유동지연모델(10)에 의해 일정 시간 지연되는 것을 확인할 수 있다. 상기 모세관 유동에서의 유동지연모델(10)은 호모시스테인 의 정량을 위한 각 반응의 반응 시간을 확보하기 위하여 활용된다.
즉, 다시 도 1을 참조하면, 모세관 유동에 의해 샘플이 이송되는 본 미세 유체 소자에서, 각 반응부 사이를 연결하는 미세유로부(145, 146, 147)는 상기 샘플의 모세관 유동을 지연시킨다. 따라서, 상기 미세유로부를 조정함으로써 샘플의 반응 시간을 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 미세 유로는 음각의 패턴을 포함한 플레이트(150)를 평평하거나 양각 또는 음각이 포함된 플레이트로 덮어 제조한다. 이 플레이트는 폴리머, 금속, 실리콘, 유리, PCB(Printed Circuit Board) 등의 다양한 소재가 가능하며, 바람직하게는 폴리머 물질을 구비한다. 예를 들면 PMMA(polymethylmethacrylate), PC(polycarbonate), COC(cycloolefin copolymer), PDMS(polydimethylsiloxane), PA(polyamide), PE(polyethylene), PP(polypropylene), PPE(polyphenylene ether), PS(polystyrene), POM(polyoxymethylene), PEEK(polyetherketone), PTFE(polytetrafluoroethylene), PVC(polyvinylchloride), PVDF(polyvinylidene fluoride), PBT(polybutyleneterephthalate), FEP(fluorinated ethylenepropylene)과 같은 플라스틱을 말한다. 이와 같은 물질들은 사출 성형, 핫 엠보싱 또는 주조와 같은 주형 성형에 많이 이용되고 있다. 특히, 이와 같은 물질은 일반적으로 불활성 물질이면서 제작의 용이성, 저렴한 비용 및 일회성에 기인하여 상기 미세 유로에 바람직하다.
다시 도 1을 참조하면, 샘플 전처리부(115)에서는 샘플에 함유되어 있는 호모시스테인이 환원된다. 상기 샘플 전처리부(115)에는 환원제인 DTT가 포함되어 있다. 또한, 상기 샘플 전처리부(115)에는 아데노신이 추가적으로 포함될 수도 있다.
일반적으로 혈액으로부터 분리된 혈장 또는 혈청에는 호모시스테인이 산화된 형태로 존재하며, 구체적으로 다이설파이드에 결합된 형태(HCY-SS-HCY) 또는 단백질에 결합된 형태(Protein-SS-HCY) 등으로 존재하게 된다. 따라서, 본 발명에서 면역학적 검정법을 시행하기 위해서 상기 산화된 호모시스테인을 DTT(dithiothreitol) 등의 환원제를 이용하여 환원시킨다.
상기 샘플 전처리부(115)를 통과한 샘플은 모세관 유동 및 그를 지연시키는 미세유로에 의해 효소 반응부(120)에 유입된다. 효소 반응부(120)에서는 상기 환원된 호모시스테인이 호모시스테인 전환 효소 및 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질과 반응한다. 상기 효소 반응부(120)에는 호모시스테인 전환 효소, 예컨대 S-아데노실-호모시스테인-하이드롤라제(SAH-hydrolase)가 포함되어 있을 수 있다. 또한, 상기 효소 반응부(120)에는 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질, 예컨대 아데노신이 포함되어 있을 수 있다. 상기 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질, 예컨대 아데노신은 샘플 전처리부(115)가 아닌 효소 반응부(120)에 미리 포함될 수도 있다.
샘플 전처리부(115)에서, 상기에서 환원된 호모시스테인은 호모시스테인 전환 효소, 예컨대 S-아데노실-호모시스테인-하이드롤라제(SAH-hydrolase)에 의해 과량의 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질, 예컨대 아데노신과 반응하여 SAH(S-adenosyl-L-homocysteine)로 전환된다. 이 때, 일반적인 생리학적 조건에서 는 SAH-hydrolase에 의해 SAH가 호모시스테인으로 전환되지만, 과량의 아데노신에 의해 호모시스테인은 SAH로 유도된다.
SAH-hydrolase
Adenosine + HCY -----------→ S-adenosyl-homocysteine(SAH)
상기 효소 반응부(120)를 통과한 SAH를 함유하는 샘플은 모세관 유동 및 그를 지연시키는 미세유로에 의해 면역검정부(125)로 이송된다. 면역검정부(125)에서는 상기 효소 반응부(120)에서 생성된 반응물, 즉 SAH가 면역학적 검정법에 의해 검출된다.
상기 면역학적 검정법은 SAH와 항SAH의 면역 반응을 검출신호로 전환하여 정성 또는 정량적인 분석이 가능한 생체면역 검출법으로서, 예를 들면, 방사성 동위 원소나 발광(luminescence) 또는 발색 염료 등의 생체표지자(biolabel)를 이용한 검출법, 생체 효소를 이용한 면역 검출법(enzyme-linked immunoassay, ELISA), 전기화학적 검출법(electrochemical immunoassay) 또는 입자탁도를 이용한 검출법(particle turbidimetric immunoassay) 등을 포함한다. 바람직하게는, 검출감도가 높고 미세 유체 소자에 적용하기 쉬운 형광 발색단(fluorophore)을 이용한 검출법을 통해 수행되는 것이 바람직하다.
면역검정부(125)에는 인위적인 SAH가 미세 유로의 표면에 고정되어 있거나 미세 유로에 고정된 비드 등에 고정되어 있다. 또한, 상기 면역검정부(125)에는 항SAH-발색단 결합체가 함께 포함되어 있으며, 이는 효소 반응부(120)로부터 유입된 유체에 의해 용해된다. 효소 반응부(120)로부터 유입된 SAH는 면역검정부(125) 에 고정된 SAH와 함께 항SAH-발색단 결합체에 대해 경쟁적으로 항원-항체 반응을 일으키게 된다. 이 때, 샘플로부터 생성된 SAH의 양에 따라 항SAH-발색단과 고정된 SAH와의 결합량이 다르게 되며, 항원-항체 반응 이후, 샘플이 샘플 배출부(130)로 이송되면, 면역검정부(125)에 남아있는 고정된 SAH와 항SAH-발색단 결합체의 발색 신호를 측정함으로써, 샘플에서의 호모시스테인을 정량하게 된다.
도 5는 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 두 번째 개략도이다.
도 5를 참조하면, 본 발명의 두 번째 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자(200)는 샘플 주입구(205), 샘플 전처리부(215), 효소 반응부(220), 면역검정부(225), 검출부(230), 및 샘플 배출부(235)로 구성된다.
도 1과 달리, 도 5의 미세 유체 소자는 검출부(230)를 추가로 포함한다. 또한, 면역검정부(225)에 Biotin-SAH 결합체와 항SAH-발색단 결합체가 미리 포함되어 있으며, Biotin-SAH는 효소 반응부(220)로부터 유입된 SAH와 함께 항SAH-발색단 결합체에 대해 경쟁적으로 항원-항체 반응을 일으킨다. 이 때, 샘플로부터 생성된 SAH의 양에 따라 항SAH-발색단과 Biotin-SAH와의 결합량이 다르게 된다. 면역검정부(225)에서 생성된 SAH-항SAH-발색단 결합체와 Biotin-SAH-항SAH-발색단 결합체는 검출부(230)로 이송된다. 검출부(230)에는 Streptavidin이 미세 유로의 표면 또는 미세 유로에 고정된 비드 등에 고정되어 있다. 면역검정부(225)에서 이송된 Biotin-SAH-항SAH-발색단 결합체는 고정된 Streptavidin과 결합하여 검출부에 고정되며, 샘플이 샘플 배출부(235)로 이송되면 고정되지 않은 SAH-항SAH-발색단 결합 체는 샘플 배출부로 이동하여 검출부(230)에는 Biotin-SAH-항SAH-발색단 결합체만 남게 된다. 검출부(230)에 고정된 Biotin-SAH-항SAH-발색단 결합체를 측정함으로써 샘플의 호모시스테인의 양을 산출할 수 있다.
도 1과 동일하게, 모세관 유동에 의해 샘플이 이송될 경우, 각 반응부 사이에 유동지연용 미세유로(245, 246, 247, 248)를 삽입하여, 반응 시간을 조절할 수 있다. 또한, 혈액 샘플의 경우, 샘플 주입구(205)와 샘플 전처리부(215) 사이에 혈액 필터(210)를 삽입한다.
도 6은 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자의 세 번째 개략도이다.
도 6을 참조하면, 본 발명의 세 번째 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자(300)는 도 1의 첫 번째 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자(100)와 동일한 구조를 포함함을 알 수 있다. 즉, 샘플 주입구(305), 샘플 전처리부(315), 효소 반응부(320), 면역검정부(325), 샘플 배출부(330)를 포함한다.
하지만, 본 발명의 도 6의 미세 유체 소자는 도 1의 미세 유체 소자와는 달리 압력 구동 수단을 추가로 포함한다. 즉, 도 1의 모세관 유동 방식과 다르게, 본 발명의 도 6의 미세 유체 소자는 압력 구동 방식을 사용한다. 일반적으로, 압력 구동 방식은 외부 또는 내부에서 부가적인 압력 소스를 제공함으로써, 미세 유체가 이송되는 방식이다. 도 6을 참조하면, 상기 압력 구동 수단으로서 튜브(335) 및 펌프(340)를 사용하였다. 상기 튜브(335)의 한쪽 말단은 샘플 배출부(330)에 연결되며, 튜브의 다른 쪽 말단에는 펌프(340)가 연결된다. 샘플 주입구(305)에 샘플이 유입되면, 펌프(340)가 작동하여 미세 유로 및 각 반응부에는 음압이 생성되며, 샘플은 미세 유로를 따라 각 반응부로 이송된다. 이 때, 각 반응부에서의 반응 시간을 확보하기 위하여, 샘플이 정해진 위치로 이송되었을 때마다, 펌프(340)의 동작을 정지시킴으로써 샘플이 각 반응부에 머물게 한다.
도 7은 본 발명에 따른 시스템의 개략도이다.
도 7을 참조하면, 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 시스템(400)은 상기 본 발명의 도 1내지 도 6에 따른 미세 유체 소자 2개로 구성된다. 상기 2개의 미세 유체 소자는 동일한 구성을 갖는 것이 바람직하다. 상기 미세 유체 소자들 중 하나는 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 신호 보정용 미세 유체 소자(450)이고, 다른 하나는 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 신호 검출용 미세 유체 소자(460)이다.
상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450) 및 신호 검출용 미세 유체 소자(460)는 상기 도 1내지 도 6과 같은 구성을 이루며, 두 유로의 샘플 전처리부(405, 406), 효소 반응부(410, 411), 면역검정부(415, 416), 검출부(420, 421)는 서로 같은 양의 같은 시료를 포함하고 있다. 상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450)의 샘플 주입구(406)에는 이미 농도를 알고 있는 호모시스테인 용액이 주입되고, 상기 신호 검출용 미세 유체 소자(460)의 샘플 주입구(405)에는 호모시스테인의 양을 측정하고자 하는 샘플이 상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450)와 동일한 양으로 주입된다. 상기 도 1의 첫 번째 미세 유체 소자 내지 도 6의 세 번째 미세 유체 소자에서 설명된 것과 같은 과정을 통해 상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450) 및 신호 검출용 미세 유체 소자(460)에서의 신호를 측정할 수 있다. 이 때, 상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450)로 주입된 용액의 호모시스테인 농도를 미리 알고 있고 두 미세 유체 소자의 형상과 일어나는 반응이 동일하기 때문에, 상기 신호 보정용 미세 유체 소자(450)를 통해 검출된 신호와 상기 신호 검출용 미세 유체 소자(460)에서 검출된 신호를 비교함으로써, 각 반응부에 포함된 시료의 변성에 관계없이 측정하고자 하는 샘플의 호모시스테인 양을 정확하게 측정할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자를 이용하여 샘플 내 호모시스테인 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
예컨대, 상기 방법은 a) 상기 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계; 및 b) 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 호모시스테인 정량용 시스템을 이용하여 샘플 내 호모시스테인 농도를 측정하는 방법을 제공한다.
예컨대, 상기 방법은 a) 상기 시스템의 신호 보정용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계; b) 상기 시스템의 신호 검출용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 단계; c) 상기 신호 보정용 미세 유체 소자 및 신호 검출용 미세 유체 소자에서 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계; 및 d) 상기 검출 결과를 비교하여 상기 b) 단계의 샘플의 호모시스테인 농도를 결정하는 단계;를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
<실시예 1>
미세 유체 소자 제작
니켈 금속판 위에 SU-8(MicroChem Inc.) 감광제를 이용하여 사진 식각 공정(photolithography)으로 미세 유로의 형상을 패터닝하였다. 감광제가 패터닝된 니켈 금속판에 대해 니켈 전기 도금을 하고, 도금된 윗면을 경면으로 연마한 후, 70 C Remover PG(MicroChem Inc.)를 이용하여 감광제를 제거함으로써, 미세 유로 형상과 반대의 형상을 지니는 금속 형판을 완성하였다. 완성된 니켈 형판을 대해 PMMA를 사출 성형하여, 미세 유로가 형성된 플라스틱 기판을 얻었다. 미세 유로가 형성된 PMMA 기판에 대해 다음과 같은 방법으로 제 2의 기판을 접합하였다.
우선, 유리 기판 위에 UV 경화 접착제 NOA74(Norland Products Inc.)를 4500rpm의 속도로 스핀 코팅하였다. 코팅된 접착제에 대해, 미세 유로가 형성된 플라스틱 기판을 접촉시켜, 미세 유로의 벽면 윗면에 접착제가 전사되도록 하였다. 접착제가 전사된 미세 유로가 있는 플라스틱 기판 위에 TAC 필름을 얻고 적당한 압력을 가한 후, 365nm 파장의 UV를 조사하여 미세 유로가 포함된 플라스틱 기판과 TAC 필름 사이의 UV 경화 접착제를 경화하여 미세 유체 소자를 완성하였다.
도 7은 완성된 미세 유체 소자의 전체 모습이며, 아래의 네 사진은 각 유동 지연부의 확대 사진이다. 유로의 깊이는 50um이고, 반응부의 폭은 1.5mm이며 유동 지연부의 각 변의 길이는 100um이다. 도 7에서 확인할 수 있듯이, 위와 같은 공정을 통해 미세 유로가 완벽히 형성된 미세 유체 소자를 제작하였다.
<실시예 2>
압력 구동 미세 유체 소자에서 SAHase 효소 반응
실시예 1에서 제작된 미세 유로가 포함된 PMMA 기판의 각 반응부에 1% BSA 용액으로 blocking하였다. 0.01%의 아데노신과 0.23% DTT를 20mM 트리할로즈(trehalose)와 잘 혼합한 후 첫 번째 반응부에 1ul 스폿팅하여 동결 건조 하였고, SAHase (Abbott)를 세 번째, 네 번째 반응부에 500nl씩 스폿팅한 후, 실시예 1과 같은 접합 방법을 통해 미세 유체 소자를 완성하였다. NANOPORT(Upchurch)를 미세 유체 소자의 샘플 주입구에 붙인 후, 60uM의 호모시스테인이 포함된 human serum을 펌프에 연결된 주사기를 통해 흘려주었다. 유량은 3ul/min이었고, 아데노신 혼합물을 녹이기 위해 첫 번째 반응부에서 1분간 지연되었고, 효소 반응을 위해 네 번째 반응부에서 10분간 지연되도록 하였다. 실험의 Negative control은 호모시스테인이 희석되지 않은 serum만을 흘려주었다. 반응 종료 후, 50ul 반응물을 취하여 UV-LC와 LC-Mass를 통해 분석하였으며, 도 8과 같이 Negative control과 미세 유체 소자를 통한 반응을 비교했을 때, 미세 유체 소자에서의 SAHase 효소 반응을 통해 호모시스테인이 SAH로 변환되는 것을 확인하였다.
<실시예 3>
압력 구동 미세 유체 소자에서 면역학적 검정법을 통한 SAH 검출
실시예 1에서 제작된 미세 유로가 포함된 PMMA 기판의 네 번째 반응부에 0.5% BSA-SAH-conjugated Polystyrene bead를 500nl 스폿팅한 후, 50 C에서 1시간 건조하였다. 실시예 2와 같이 네 번째 반응부를 포함한, 모든 반응부를 1% BSA로 blocking한후, 첫 번째 반응부에는 anti-rabbit IgG-Cy3 (10ug/ml)를, 두 번째 반응부에는 polyclonal anti-SAH IgG (10ug/ml)을 각각 20mM 트리할로즈(trehalose)와 혼합하여 500nl씩 스폿팅한 후, 동결건조 하였다. 실시예 1과 같이 UV 경화 접착제를 이용하여 두께 80um의 TAC 필름을 접합함으로써 미세 유체 소자를 완성하였다. 미세 유체 소자 내에서의 반응을 위해 실시예 2와 같이 압력 구동 방식으로 1X PBS를 3ul/min으로 주입하였고, 네 번째 반응부에서 SAH, anti-SAH IgG, anti-rabbit-IgG-Cy3의 immunoreaction을 위하여 30분간 지연되도록 하였다. 실험의 Negative control은 BSA-conjugated Polystyrene bead를 고정한 미세 유체 소자를 이용하였고 같은 1X PBS를 흘려주었다. Immunoreaction을 통해 생성되는 형광 신호 검출을 위해 GenePix 4000B(Axon)를 이용하였으며, PMT 800, Focus position 25에서 측정하였다. 도 9는 immunoreaction이 후에, 미세 유체 소자를 통해 검출한 형광 신호이다. 도 9에서 알 수 있듯이, 오른쪽의 Negative control에 대해 왼쪽의 형광 신호를 비교했을 때, 미세 유체 소자에서 면역학적 검정법을 통해 SAH를 검출할 수 있음을 확인하였다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분양의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사실 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자, 그를 포함하는 시스템 및 그를 이용한 호모시스테인 정량 방법에 따르면, 극소량의 샘플만으로도 호모시스테인의 농도를 정량할 수 있고, 그 장치가 매우 간단하고, 복잡한 전처리를 필요로 하지 않는다. 또한, 미세 유체 소자에 고전압을 인가할 필요도 없다. 따라서, 본 발명을 이용하면 혈액내 호모시스테인의 양 또는 농도를 신속하고 간단하게 정확히 측정함으로써 혈관성 질환의 예후를 예측하고 그의 발병을 조기에 예방할 수 있다.

Claims (14)

  1. a) 샘플로부터 호모시스테인이 환원되는 샘플 전처리부;
    b) 상기 샘플 전처리부에서 환원된 호모시스테인이 호모시스테인 전환 효소 및 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질과 반응이 일어나는 효소 반응부;
    c) 상기 효소 반응부에서 생성된 반응물이 면역학적 검정법에 의해 검출되는 면역검정부; 및
    d) 상기 샘플 전처리부와 효소 반응부 사이 및 효소 반응부와 면역검정부 사이를 연결하는 미세유로부;를 포함하는 샘플 내의 호모시스테인 정량용 미세 유체 소자.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 면역검정부에서 생성된 반응물을 고정하고 반응물의 신호를 검출하기 위한 검출부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 샘플 전처리부 상류에 혈액 필터를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 샘플 전처리부 상류에 샘플 주입구 및 상기 면역검정부 하류에 샘플 배출부를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 샘플 전처리부에 환원제인 DTT가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 호모시스테인 전환 효소는 S-아데노실-호모시스테인-하이드롤라제(SAH-hydrolase)인 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 호모시스테인 이외의 상기 효소에 대한 기질은 아데노신인 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 샘플이 모세관 유동에 의해 이송되는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 면역검출부 하류에 압력 구동 수단을 추가로 포함하고, 상기 샘플은 압력 구동 방식에 의해 이송되는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 면역학적 검정법은 생체표지자(biolabel)를 이용한 검출법, 생체 효소를 이용한 면역 검출법(enzyme-linked immunoassay, ELISA), 전기화학적 검출법(electrochemical immunoassay) 및 입자탁도를 이용한 검출법(particle turbidimetric immunoassay)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 미세 유체 소자.
  11. a) 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 신호 보정용의 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미세 유체 소자; 및
    b) 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 신호 검출용의 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미세 유체 소자;를 포함하는 샘플 내의 호모시스테인 정량용 시스템.
  12. a) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계; 및
    b) 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계;를 포함하는 샘플 내 호모시스테인의 정량 방법.
  13. a) 제 11항에 따른 시스템의 신호 보정용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 이미 알고 있는 농도의 호모시스테인을 함유하는 샘플을 주입하는 단계;
    b) 제 11항에 따른 시스템의 신호 검출용 미세 유체 소자의 샘플 전처리부에 호모시스테인의 농도를 측정하고자 하는 샘플을 주입하는 단계;
    c) 상기 신호 보정용 미세 유체 소자 및 신호 검출용 미세 유체 소자에서 효소 반응에 의해 생성된 반응물을 면역학적 검정법에 의해 검출하는 단계; 및
    d) 상기 검출 결과를 비교하여 상기 b) 단계의 샘플의 호모시스테인 농도를 결정하는 단계;를 포함하는 샘플 내 호모시스테인의 정량 방법.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서,
    상기 면역학적 검정법은 생체표지자(biolabel)를 이용한 검출법, 생체 효소를 이용한 면역 검출법(enzyme-linked immunoassay, ELISA), 전기화학적 검출법(electrochemical immunoassay) 및 입자탁도를 이용한 검출법(particle turbidimetric immunoassay)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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