KR100764482B1

KR100764482B1 - 식물체추출물 및 산내에서 분리한 활성성분을 포함하는살선충제

Info

Publication number: KR100764482B1
Application number: KR1020060028098A
Authority: KR
Inventors: 박일권; 신상철; 최광식
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2006-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2007-10-09
Also published as: KR20070097212A

Abstract

본 발명은 소나무에 큰 피해를 주는 해충인 소나무재선충(pine wood nematode)에 대해 살선충 활성을 가지는 산내(Kaempferia galanga), 세신(Asarum sieboldii), 팔각회향(Illicium verum) 그리고 석창포(Acours gramineus) 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate)와 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate) 중에서 선택된 화합물을 함유하는 살선충제에 관한 것이다.

본 발명의 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물들은 소나무재선충에 살선충활성을 가져 천연 살선충제로 이용될 수 있다.

살선충, 소나무재선충, 산내, 세신, 팔각회향, 석창포, 에틸트랜스신나메이트, 에틸파라메톡시신나메이트

Description

식물체추출물 및 산내에서 분리한 활성성분을 포함하는 살선충제 {Nematocides containing plant extracts and components isolated from Kaempferia galanga for the control of nematode}

도 1은 소나무재선충 분리방법이다.

도 2는 산내에서 분리한 화합물들의 구조이다.

본 발명은 소나무에 큰 피해를 주고 있는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충력을 가지는 산내(Kaempferia galanga), 세신(Asarum sieboldii), 팔각회향(Illicium verum) 그리고 석창포(Acorus gramineus) 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate)와 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)를 활성성분으로 포함하는 살선충제에 관한 것이다.

소나무재선충은 소나무(Pinus densiflora), 해송(P. thunbergii), 마미송(P. massoniana), 유구송(P. luchuensis), 대만이엽송(P. taiwanensis) 등에 병징을 일으켜 소나무를 죽게 한다. 우리나라에서는 부산광역시 동래구 온천2동 금정산 일원의 소나무와 해송에서 1988년 10월에 처음으로 이 선충에 의한 피해 발생이 확인된 이래, 피해가 계속 확산되고 있으며 현재는 울산, 포항, 경주 등 전국 47개 시군구에 발생하여 큰 피해를 주고 있다. 소나무재선충에 감염된 소나무와 해송은 대부분 감염된 지 불과 3개월 이내에 완전히 고사 되는데, 매개충인 솔수염하늘소는 고사목이나 쇠약목에 산란을 하고, 부화한 유충이 고사목 내에서 발육, 월동한 후에 이듬해 5월부터 성충으로 우화한다. 현재 우리나라의 소나무재선충병 방제는 주로 감염된 소나무를 벌채한 후, 메탐소디움액제로 훈증처리하거나, 소나무재선충을 매개하는 솔수염하늘소 성충의 후식을 방지하기 위하여 메프유제를 항공 살포하고 있다. 유기합성농약의 효과는 우수했지만 계속적인 사용과 무분별한 남용으로 인해 해충 천적의 감소, 저항성 발달, 잠재해충의 대발생 그리고 사람과 가축에 대한 독성을 유발하는 문제점이 발생하고 있다.

따라서 새로운 친환경적인 방제방법이 매우 필요하며, 특히 식물체로부터 살선충활성을 지닌 물질에 바탕을 두고 살선충제를 개발하기 위한 전략이 다른 어느 분야보다도 폭넓게 연구되고 있다. 광범위한 생리활성물질을 가지고 있는 자원으로서의 식물체는 선충방제제로 사용되어 현재 부작용 때문에 많은 사회문제를 야기하고 있는 유기합성 살선충제를 대체할 수 있을 대안으로 여겨지고 있어 이들을 이용한 상업적인 선충방제제의 잠재적인 자원 또는 선도화합물로써 식물체에서 유래한 물질들에 관심을 가지고 많은 연구가 이루어지고 있다. 산내, 세신, 팔각회향 그리 고 석창포 등 실험에 사용된 식물체추출물들은 향신료 혹은 의약용으로도 사용되고 있는 만큼 사람과 가축에는 안전한 식물로써 살선충제 개발을 위한 좋은 식물체 후보군에 속한다.

그러나 현재까지 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 두 가지 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate)와 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)를 대상으로 하는 소나무재선충에 대한 방제제로서의 이용 및 개발에 대한 연구는 전무하다.

본 발명자들은 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 두 가지 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate)와 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)의 소나무재선충에 대한 살선충성을 조사하여 소나무재선충 방제제로서의 메탄올 추출물 및 추출성분의 이용 가능성을 검증하고자 본 발명을 수행하였다.

따라서 본 발명은 인체에 무해하면서 소나무재선충에 대한 살선충력을 가지는 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate) 또는 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)를 함유하는 살선충제의 제공을 목적으로 한다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 산내(Kaempferia galanga), 세신(Asarum sieboldii), 팔각회향(Illicium verum) 그리고 석창포(Acours gramineus) 추출물로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 식물체 추출물을 포함하는 살선충제를 포함한다.

상기에서 살선충제는 소나무재선충에 대하여 살선충활성을 가지는 것을 특징으로 하며 상기 식물에서 추출한 살선충성 화합물을 포함한다.

또한, 본 발명은 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate) 또는 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)를 활성성분으로 함유하는 살선충제를 포함한다.

본 발명에서 살선충제의 유효성분으로 사용되는 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물은 메탄올 추출법을 이용하여 추출할 수 있다.

이하 본 발명에 대하여 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 산내, 팔각회향, 세신 및 석창포를 메탄올 추출에 의해 유효성분을 추출하여 소나무재선충에 대한 살선충활성 검정에 사용하였다.

본 발명에 사용된 소나무재선충은 소나무에 기생하는 소나무재선충으로 길이 1㎜ 내외로 소나무재선충을 지니고 있는 솔수염하늘소가 소나무 신초를 가해할 때 나무 조직의 내부로 침입하여 번식하면서 소나무를 고사시킨다.

상기 식물들의 메탄올추출물은 소나무재선충 수컷, 암컷 그리고 유선충에 대해 강한 살선충 활성을 나타내며, 특히 산내 메탄올추출물이 가장 강한 살선충 활 성을 나타낸다.

또한, 상기에서 살선충활성이 가장 우수한 산내 메탄올추출물로부터 살선충제의 유효성분으로 사용되는 산내의 성분을 분리하게 위하여 각종 칼럼크로마토그래피를 이용하여 살선충활성을 가지는 성분인 에틸트랜스신나메이트와 에틸파라메톡시신나메이트를 분리할 수 있다. 산내로부터 분리한 상기 성분을 질량분석기(Mass)와 핵자기공명장치(NMR)를 이용하여 구조를 동정하고, 살선충활성을 검정하였다.

소나무재선충 방제를 위한 살선충제로써 에틸트랜스신나메이트 또는 에틸파라메톡시신나메이트는 60~100㎍/㎖의 농도를 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 두 가지 화합물인, 에틸트랜스신나메이트와 에틸파라메톡시신나메이트는 소나무재선충에 대해 우수한 살선충 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 시험예에 의해 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 메탄올 추출물

산내, 팔각회향, 세신 및 석창포는 경동시장에서 구입하여 건조시키고 마쇄기로 마쇄하여, 시료 1kg 당 메탄올 5ℓ에 2일간 침지한 후, 진공회전농축기(N- 1000, EYELA)로 농축하여 메탄올 조추출물을 얻었다.

<실시예 2> 활성 검정에 사용된 선충 준비

살선충활성 검정에 사용된 선충은 소나무재선충으로 경상남도 함안 지역에서 채집하여 베르만 방법(Baermann funnel method)을 이용하여 추출하였다. 분리된 소나무재선충은 보트리스균(Botrytis cinerea)을 먹이로 온도 28℃, 상대습도 55%, 암조건 하에서 사육하고 살선충제 도태를 하지 않은 실험실 내 감수성 계통을 대상으로 하였다.

<시험예 1> 소나무재선충의 살선충활성 검정

소나무재선충에 대한 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물인, 에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate)와 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)의 살선충활성을 검정하기 위해 웰 마다 100㎕의 증류수로 채워져 있는 96 마이크로웰플레이트의 각 웰 마다 300마리씩의 암컷, 수컷, 유선충이 혼합된 소나무재선충을 넣었다. 살선충에 사용된 메탄추출물 및 산내에서 분리한 성분들은 에탄올에 각 농도별로 녹인 후 마이크로피펫으로 각 웰 마다 처리하였다. 처리 4시간 후 실체현미경하에서 암컷, 수컷 그리고 유선충의 살선충율을 조사하였다. 총 4회 반복 처리한 후, 측정한 살선충율 평균을 표 1에 나타내었다. 한편, 소나무재선충이 들어있는 웰에 에탄올만 처리한 웰을 대조구(control)로 하였다. 각각의 메탄올추출물의 소나무재선충에 대한 살선충 활성은 표 1에 나타내었다.

<표 1> 식물체추출물의 살선충 효과

식물체	농도 (㎍/㎖)	살선충율 (평균±표준편차, %)
식물체	농도 (㎍/㎖)	수컷	암컷	유선충
석창포	2000	100	100	100
	1000	69±15.6	81.9±4.6	82.8±4.7
	500	36.9±1.9	45.7±2.1b	32±5.3
세신	2000	82.2±9.7	91.6±8.3	92.3±4.4
세신	1000	41.1±4.8	27.7±2.7	43.1±0.3
팔각회향	2000	100	100	100
	1000	100	100	100
	500	0	0	36.9±5.2
산내	2000	100	100	100
	1000	100	100	100
	500	90.7±4.9	100	100
대조구		0	0	0

표 1에서 소나무재선충 수컷, 암컷 그리고 유선충에 대해 산내 메탄올추출물이 가장 강한 살선충 활성을 보였다. 산내 메탄올추출물의 경우, 500㎍/㎖ 농도에서 암컷, 수컷 그리고 유선충에 대해 90% 이상의 살선충 활성을 나타내었다. 팔각회향의 경우, 1000㎍/㎖ 농도에서는 100%의 살선충 활성을 나타내었으나, 500㎍/㎖ 농도에서는 살선충활성이 없거나 약했다. 석창포의 경우 2000㎍/㎖ 농도에서는 100%의 살선충활성을 보였고, 1000㎍/㎖ 농도에서는 80% 이상의 살선충 활성을 나타내었다. 세신의 경우 2000㎍/㎖ 농도에서는 살선충 활성이 높았으나, 1000㎍/㎖ 농도에서는 약한 살선충 활성을 나타내었다.

<시험예 2> 산내로부터 살선충 활성성분 분리

살선충 활성이 가장 우수하였던 산내로부터 살선충 성분을 분리하기 위하여 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 본 발명의 산내 유래 화합물을 추출하기 위하여 수행한 실험과정을 상세히 설명하면 하기와 같다.

산내(Kaempferia galanga) 뿌리 8㎏을 서울 경동시장에서 구입하여 건조시키고 마쇄기로 마쇄하여 메탄올에 2일간 침지한 후, 진공회전농축기로 농축하여 메탄올 조추출물을 얻었다. 얻어진 메탄올 조추출물의 수율은 5.7%였고, 이것을 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 층으로 분획한 후 소나무재선충에 대한 살선충활성을 확인하여 살선충 활성을 가지는 헥센(hexane)층을 분리하였다. 먼저, 실리카겔(70-230 mesh, 600g, Merck)로 채워진 유리칼럼(14cm i.d.×30cm)에 헥센층(307.6g)을 흡착시킨 후, hexane/ethyl acetate/acetone를 20:0.5:0.5(V:V:V) 비율로 흘려주었다. 칼럼에서 나온 층(fraction)들은 TLC(thin layer chromatography) 상에서 분석한 후, 비슷한 패턴을 보이는 층들을 합친 후 농축하였다. 이렇게 해서 얻어진 층은 총 3개 층(SHA1~SHA3)이었다. 이들 분리층 중 활성을 보인 SHA1층은 다시 hexane/chloroform/ethyl acetate를 20:1:0.5(V:V:V) 비율로 흘려주었다. SHA1층은 총 5개의 층(SHA1-1~SHA1-5)으로 분리되었다. 이들 층 중에서 살선충활성을 보인 SHA1-1층으로부터 에틸트랜스신나메이트(600㎎)가 분리되었고(화학식 1) SHA1-5로부터 에틸파라메톡시신나메이트(9.7g)가 분리되었다(화학식 2). 수득한 화합물 2 종은 각각 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, EI-MS 등의 분석기기를 이용하 여 구조를 동정하였다.

<화학식 1>

<화학식 2>

Ethyl trans-cinnamate (I). EI-MS m/z: 176 (M+, base ion), 147, 131, 103, 77. 1H-NMR (500MHz, CD3OD): δ1.27 (3H, t, J = 7.0 Hz, CH3-11), 4.20 (2H, dd, J = 7.0, 14.0 Hz, CH2-10), 6.44 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 7.34 (3H, m, H-3, 4, 5), 7.51 (2H, m, H-2, 6), 7.62 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ14.6 (CH3-11), 61.5 (CH2-10), 118.9 (C-8), 129.1 (C-2, 6), 129.9 (C-3, 5), 131.3 (C-4), 135.6 (C-1), 145.8 (C-7), 168.3 (C-9).

Ethyl p-methoxycinnamate (II). EI-MS m/z: 206 (M+, base ion), 178, 161, 134, 118, 89, 77. 1H-NMR (500MHz, CD3OD): δ1.31 (3H, t, J = 7.0 Hz, CH3-11), 3.82 (3H, s, OCH3), 4.84 (2H, s, CH2-10), 6.35 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-8), 6.95 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz, H-2, 6), 7.54 (2H, dd, J = 2.0, 7.0 Hz, H-3, 5), 7.62 (1H, d, J = 16.0 Hz, H-7). 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ14.62 (CH3-11), 55.85 (OCH3-10), 61.47 (CH2-10), 115.41 (C-3, 5), 116.29 (C-8), 128.35 (C-1), 130.93 (C-2, 6), 145.92 (C-7), 163.15 (C-4), 169.10 (C-9).

<시험예 3> 산내에서 분리한 성분의 살선충활성

시험예 2에서 동정된 각각의 성분인 에틸트랜스신나메이트와 에틸파라메톡시신나메이트의 살선충 활성은 시험예 1과 같은 방법을 사용하여 검정하였고, 결과는 표2에 나타내었다. 식물체성분의 살선충활성 검정 결과, 에틸트랜스신나메이트와 에틸파라메톡시신나메이트 모두 60㎍/㎖ 농도에서 100% 살선충 활성을 나타내었다. 에틸트랜스신나메이트는 30㎍/㎖ 농도에서 수컷, 암컷 그리고 유선충에 대해서 30%, 21% 그리고 18%의 살선충 활성을 나타내었고, 에틸파라메톡시신나메이트는 각각 12%, 13% 그리고 7.9%의 살선충 활성을 나타내었다.

<표 2> 산내 성분의 살선충 효과

성 분	농도 (㎍/㎖)	살선충율 (평균±표준편차, %)
성 분	농도 (㎍/㎖)	수컷	암컷	유선충
에틸트랜스신나메이트 (Ethyl trans-cinnamate)	120	100	100	100
	60	100	100	100
	30	30.4±6.6	21.4±3.6	18.5±2.9
에틸파라메톡시신나메이트 (Ethyl p-methoxycinnamate)	120	100	100	100
	60	100	100	100
	30	12.5±7.2	13.1±1.0	7.9±0.5

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명에서 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 두 가지 화합물인, 에틸트랜스신나메이트와 에틸파라메톡시신나메이트는 소나무재선충에 대해 우수한 살선충 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

따라서 산내, 세신, 팔각회향 그리고 석창포 메탄올추출물과 산내에서 분리한 화합물인, 에틸트랜스신나메이트 또는 에틸파라메톡시신나메이트는 소나무재선충에 살선충력을 가지고 있어, 소나무재선충에 대한 살선충성 모핵화합물로 제공할 수 있으므로 친환경적인 선충 방제제로 사용될 수 있다.

Claims

산내(Kaempferia galanga) 및 팔각회향(Illicium verum) 중에서 선택된 1종 이상의 추출물을 포함하는 살선충제.
제 1항에 있어서, 추출물은 산내 또는 팔각회향을 메탄올로 추출한 것임을 특징으로 하는 살선충제.
제 1항에 있어서, 살선충제는 소나무재선충에 대하여 살선충활성을 가지는 것을 특징으로 하는 살선충제.
제 1항의 산내에서 추출한 살선충성 화합물을 포함하는 살선충제.
삭제
에틸트랜스신나메이트(ethyl trans-cinnamate) 또는 에틸파라메톡시신나메이트(ethyl p-methoxycinnamate)를 활성성분으로 함유하는 살선충제.