KR101079980B1 - 신이로부터 분리된 리그난 성분과 그 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목련(magnolia)속 약용식물인 ‘신이’ (Flos magnoliae, 목련과)로부터 분리된 리그난 성분과 그 용도에 관한 것이다. 본 발명에서는 신이로부터 분리된 항염증 활성을 갖는 7개의 리그난 성분이 제공되며, 이들의 NO, PGE₂의 생성억제활성 그리고 그 생성효소인 iNOS 및 COX-2의 발현저해활성이 확인된다. 본 발명에서 분리된 신이의 리그난 성분 화합물들은 과도한 NO 및 프로스타글란딘의 합성을 억제함으로써 이 염증성 매개인자로 인해 발생하는 각종 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다.

신이, 목련(magnolia)속, 리그난, NO, PGE2, 프로스타글란딘, 항염증

Description

신이로부터 분리된 리그난 성분과 그 용도 {Lignans from Flos Magnoliae and their Use}

본 발명은 목련(magnolia)속 식물로부터 분리된 생리활성 성분에 관한 것으로, 특히 신이(Flos magnoliae, 목련과)로부터 분리된 리그난 성분과 그 용도에 관한 것이다.

산화질소 (Nitric oxide, NO)는 NOS (nitric oxide synthase)효소에 의하여 L-아르기닌(L-arginine)의 산화에 의해 생성되며¹ NOS에는 3가지의 subtype이 알려져 있다. eNOS와 nNOS는 각각 혈압의 조절 및 신경전달을 위해 필요한 소량의 NO를 생성한다.² 충추신경계 (CNS)에서 신경전달체로서의 NO는 뇌발달, 고통인식, 기억 등에 관여한다.³ 한편 유도형 NOS (iNOS)는 여러 면역학적 자극⁴ 에 의해 유도되어 다량의 NO를 지속적으로 생산한다. ⁵ iNOS가 생성한 NO는 외부 병원균에 대하여 방어기전으로 작용하기도 하지만, 과도하게 생성된 NO는 만성 염증,⁶ 발암,⁷ 패혈 증, 뇌손상 등의⁹ 병리적인 현상의 원인이 된다.⁸ 또한 NO는 cyclooxygenase-2 (COX-2)를 활성화하여 프로스타글란딘 (PGs)의 생성을 현저하게 증가시킨다.¹⁰

프로스타글란딘류(PGs)는 COX 효소작용 경로를 통해 아라키돈산으로부터 합성된다. COX 효소 중 COX-1은 정상적인 조건에서 체내 항상성을 유지하기 위해 필요한 PGs를 생성하는 역할을 한다. 그러나 유도형인 COX-2는 각종 사이토카인 및 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)와 같은 내독소와 같은 염증매개인자들에 의해 발현되며, COX-2에 의해 대량의 프로스타글란딘을 생성하여 염증을 심화시킨다. 이와 같은 이유로 COX-2는 각종 염증성 질환, 발암, 암전이 및 각종 산화성 뇌질환의 원인을 제공한다.¹¹

소교세포 (microglial cells)는 중추신경계에서 면역조절역할을 하는 세포로서 각종 뇌손상 및 염증 조건에서 활성화된다. 활성화된 소교세포는 NO를 포함한 각종 염증성 매개체들을 포함한 뇌독소를 생성하여 뇌세포를 사멸케 한다.¹² 활성화된 소교세포에서는 COX-2의 발현도 증가하며,¹³ COX-2발현을 저해함으로써 뇌세포의 사멸을 억제할 수 있는 것으로 알려져 있다.¹⁴

‘신이’ (Flos magnoliae, 목련과)는 목련 (magnolia)속의 꽃봉우리를 말려서 사용하는 한약재로써, 전통적으로 알레르기성 비염, 부비동염 등의 각종 염증의 치료목적으로 사용되었다. ¹⁵ 신이로부터 분리된 화합물들은 항염증, 항알레르기, 항류마티스 관절염, 암전이 억제 활성 등이 보고되었다.¹⁶ 알려진 화합물들은 magnone A 및 B, fargesone A 및 B, denudatin B, magnolin, lirioresinol-B dimethylether 등이며, fargesin 와 aschantin 는 Ca²⁺ 길항작용 및 혈소판활성 억제작용을 가진다.¹⁷ 신이의 리그난성분은 단핵구세포 표면의 부착분자의 발현을 억제한다는 보고도 있다.¹⁸

목련속에서 분리된 유효성분에 관한 특허문헌으로 대한민국 공개특허 특2000-0066932호가 있다. 이 특허문헌에서는 목련속 식물의 잎에서 추출한 세스퀴테르펜 락톤(sesquiterpene lactone) 화합물로서, NO나 종양괴사인자-알파(TNF-α)의 생성을 억제하고 염증매개인자의 발현에 중요한 전사인자인 NF-κB의 활성화를 억제함으로써 염증관련 질환 및 면역질환의 치료에 이용될 수 있는 코스투놀라이드(costunolide) 화합물에 대해 기술하고 있다.

그러나 신이로부터 NO 및 프로스타글란딘 합성 억제와 관련된 효과를 가진 리그난 성분을 분리하여 그 구조를 확인한 연구결과는 아직까지 없다.

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본 발명은 약용식물 신이로부터 활성을 나타내는 리그난 성분을 분리하여 그 화학구조와 효과를 밝히는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 신이로부터 항염증 작용물질로 7개의 리그난 화합물을 분리하여 도 1과 같이 구조를 확인하였으며, 또한 이들의 NO, PGE₂의 생성억제활성 그리고 그 생성효소인 iNOS 및 COX-2의 발현저해활성을 확인하였다.

이 중 에피마그놀린(epimagnolin) B는 천연에서 새로운 구조임을 확인하였으며, 이들은 활성화한 소교세포에서 NO, PGE₂의 생성억제 및 이들의 합성효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하는 것으로 확인하였다.

또한, 본 발명에서 분리된 신이의 리그난 성분들은 과도한 NO 및 프로스타글란딘의 합성을 억제함으로써 이 염증성 매개인자로 인해 발생하는 각종 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 상기 질환에는 특히 관절염과 같은 각종 염증성 질환, 발암, 산화성 뇌질환 등이 포함되며, 산화성 뇌질환에는 알츠하이머병과 파킨슨병이 포함된다.

본 발명의 화합물들은 과도한 NO 및 프로스타글란딘의 합성을 억제함으로써 이 염증성 매개인자로 인해 발생하는 각종 염증성 질환 및 발암을 억제하고 특히 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 산화성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명에서는 신이로부터 LPS로 활성화한 소교세포에서 NO생성을 저해하는 활성성분으로, 7종의 리그난 성분: kobusin (1), aschantin (2), fargesin (3), (+)-eudesmin (4), (+)-magnolin (5), (+)-yangambin (6) 과 자연계에서 볼 수 없었던 새로운 화학구조를 갖는 성분 epimagnolin B (7) 를 분리하였다. 화합물 1, 2, 3은 NO생성효소인 iNOS의 발현을 억제하였으며, 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 소거하는 활성을 나타내었다. 화합물 7은 활성화한 소교세포에서 NO생성 및 PGE₂생성을 억제하였으며, 각각의 생성효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 억제하였다. 표 1에 신이로부터 분리된 7개의 리그난 성분을 나타내었다.

[실시예]

이하 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

시약 및 기기

¹H NMR spectra와 ¹³C NMR spectra는 Varian 400 스펙트로메터를 이용하여 테트라메틸실란을 내부 표준물질로 사용하여 측정하였으며, chemical shift는 δ 값 (ppm단위)으로, coupling constant는 Hz 단위로 나타내었다. IR spectra는 Jasco FT/IR-430으로 측정하였으며, frequency는 cm^-1 로 표시하였다. 박층크로마토그래피는 Kiesel gel 60 F₂₅₄ (Merck)를, 컬럼크로마토그래피용 실리카겔은 Kisel gel 60, 230-400 mesh (Merck)를 사용하였다. 본 실험에 사용된 시약들은 알드리치(Aldrich)사에서 구입하였으며 기타 용매는 1급 이상의 시약을 사용하였다.

신이로부터 활성물질의 분리

신이 시료 (Flos magnoliae, 3 kg)를 환류냉각하면서 메탄올을 용매로 3시간씩 3회 추출하여 추출물을 감압 하에서 농축하였다. 추출물 (710 g)을 물에 분산하고 에틸아세테이트로 추출하여 에틸아세테이트 가용분획 (382 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 가용분획 (10 g)을 n-헥산(hexane) : EtOAc를 이동상으로 10:1부터 1:1까지 기울기 용리하면서 실리카컬럼크로마토그래피하여 10개의 분획 (F1 ~ F10)을 얻었다.

분획 F4 (370 ㎎)를 n-헥산 : 아세톤을 이동상으로 30:1부터 10:1까지 기울기 용리하면서 실리카 컬럼 크로마토그래피하여 활성분획 F4-2(46 ㎎)를 얻었다. 분획 8 (559 ㎎)을 CHCl₃ : MeOH 을 이동상으로 100:1부터 10:1까지 기울기 용리하면서 활성분획 F8-2(61 ㎎), F8-3(13 ㎎) 을 얻었다. 소분획 F8-2, F8-3, F4-2를 semi-preparative HPLC (컬럼 μ-Bondapak C-18, 10 x 300 ㎜; 이동상 45% CH₃CN, 유속 2.0 ㎖/min, 검출기 UV 254 nm)를 시행하여 순수한 물질 kobusin (1, 30 ㎎), aschantin (2, 8 ㎎), fargesin (3, 16 ㎎)을 각각 얻었다.

분획 F9 중 일부 (450 ㎎)에 대해 역상컬럼을 이용한 semi-preparative HPLC (컬럼 Inertsil ODS-2, 10 x 250 mm; 이동상 45% CH₃CN, 유속 2.0 ㎖/min, 검출기 UV 254 nm)를 시행하여 (+)-eudesmin (4, 14 ㎎), (+)-magnolin (5, 38 ㎎), (+)-yangambin (6, 11 ㎎) 및 epimagnolin B (7, 14 ㎎)을 각각 순수하게 분리하였다.

활성물질의 구조 분석

신이에서 분리한 활성성분들의 구조는 도 1에 표시한 바와 같다.

화합물 1~6의 구조분석은 NMR 과 Mass 등의 각종 분광학적인 자료를 활용하였으며, 이 화합물들의 물리 화학적 자료들은 문헌에 보고된 값과 잘 일치하였다.^19-21

화합물 7 은 노란색 유상물질로 분리되었으며 HRMS 결과로부터 [M]⁺ m/z 416.1873 (이론값 416.1835) 분자식을 C₂₃H₂₈O₇로 확인하였다. ¹H-NMR에서 5개의 메톡시기의 피크 (3.83 - 3.89)와 단일피크로 관찰된 3가지 환경의 방향족 수소 5개 (δ 6.59, 6.86, 6.93)를 확인하였다. 전반적인 ¹H-¹H COSY와 HSQC 스펙트럼에서 관찰한 결과들로부터 화합물 7 이 furofuran계열의 2,6-diaryl-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octane²² 골격을 가진 리그난의 구조로 예상되었다. H-1(δ 3.34) 과 H-2 (δ 4.88)의 저자장에서 발견되는 것으로부터 C-2위치의 β-arl기를, H-5 (δ 2.92) 와 H-6 (δ 4.43)가 고자장에서 발견되는 것으로부터 C-6위치의 α-aryl기의 결합방식을 각각 확정하였다. H-2 (J = 5.2 Hz) 와 H-6 (J = 7.2 Hz)의 결합상수값이 이 구조해석을 뒷받침하였다.²³ 방향족환에 소속된 수소와 주변 탄소 간의 원거리 결합에 대한 정보 (HMBC)와 메톡시기가 원거리 결합하는 사급탄소와 연결함으로써 메톡시기의 결합위치와 방향족환의 수소를 정확하게 분석할 수 있었다. 또한 두 방향족의 결합위치도 방향족 환에 소속된 수소가 C-2 또는 C-6와 원거리 결합하는 현상을 이용해 환의 결합위치를 정확하게 동정하였다 (도 2 참조). 최종적으로 확정한 화합물 7의 구조는 3',5'-디메톡시페닐기가 dioxabicyclo-[3.3.0]octane 모핵으로 테트라하이드로푸란(tetrahydrofuran)의 C-2에 결합한 화합물이다. 지금까지 자연계로부터 3', 5'-이치환 페닐기를 가진 푸로푸란(furofuran) 계 리그난은 처음으로 발견된 것이다.

(+)-Epimagnolin B (7): yellow oil [α]_D + 92.9° (c 0.9, CHCl₃) UV (CHCl₃) max (log ε) 206.6 (4.84), 274.4 (3.85) nm; IR (KBr) max 3020, 1585, 1510, 1465, 1338, 1250 cm^-1; ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 6.93 (1H, s, H-4'), 6.86 (2H, s, H-2', 6'), 6.59 (2H, s, H-2", 6"), 4.88 (1H, d, J = 5.2 Hz, H-2), 4.43 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-6), 4.02 (1H, dd, J = 0.4, 9.6 Hz, H-4a), 3.91 (3H, s, OCH3-3'), 3.89 (2H, m, H-4b and H-8a), 3.88 (3H, s, OCH3-5'), 3.87 (6H, s, OCH3-3", 5"), 3.83 (3H, s, OCH3-4"), 3.34 (2H, m, H-1 와 H-8b), 2.92 (1H, m, H-5); ¹³C-NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 153.3 (C-3" and 5"), 148.7 (C-3'), 147.9 (C-5'), 137.4 (C-4"), 136.7 (C-1"), 130.7 (C-1'), 117.6 (C-6'), 110.9 (C-2'), 108.8 (C-4'), 102.8 (C-2" 와 6"), 88.0 (C-6), 82.0 (C-2), 71.0 (C-4), 69.8 (C-8), 60.8 (OCH3-4"), 56.2 (OCH3-3" 와 5"), 55.93 (OCH3-5'), 55.90 (OCH3-3'), 54.6 (C-5), 50.1 (C-1); EI-MS m/z 416 [M]⁺ (100), 249 (38), 195 (56), 165 (47); HREIMS m/z 416.1873 (계산값 C₂₃H₂₈O₇, 416.1835).

신이 리그난 화합물들의 in vitro 소염활성 검정

활성화한 소교세포로부터 생성되는 NO 및 PGE₂의 분석은 각각 발색법 및 EIA (enzyme immunoassay)법을 사용하였다.

자세하게는 NO생성저해활성은 소교세포주 BV-2세포에 LPS와 시료를 처리하여 20시간 배양한 배양액 100 ㎕를 96well plate에 취하고 그리스(Griess)시약 (2.5% H₃PO₄, 1 % sulfanilamide, 0.1% naphthylethylenediamine용액) 150 ㎕씩을 가하고 10분 동안 반응하여 발색시킨 다음 ELISA 판독기를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준검량선을 작성하기 위하여 아질산나트륨(sodium nitrite)을 NO₂ ^-의 표준품으로 사용하였다. 동일하게 처리한 세포의 배양액 중으로 유리된 PGE₂는 PGE₂분석용 EIA 키트를 사용하여 정량하였다. 화합물 7 이 활성화한 소교세포에서 PGE₂의 생성을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (EIA 실험 자료)는 도 6과 같다. NO 및 PGE₂ 생성 억제 활성의 기전을 밝히고자 LPS로 활성화된 소교세포에서 iNOS 또는 COX-2 단백질과 mRNA의 발현에 대한 본 발명의 화합물들의 효과를 검토하였다. 화합물들의 존재 하에 LPS로 처리한 소교세포를 20시간 배양하여 iNOS의 발현을 웨스턴블롯(Western blot)으로 검토하였다. 상세하게는, 소교세포를 LPS(0.1 ㎍/㎖)로 활성화하는 동안 본 발명의 화합물을 20시간 처리한 후, 세포를 회수하여 세포질 용액을 얻고 상법에 따라 웨스턴블롯으로 iNOS, COX-2 및 베타-액틴(β-actin) 단백질 양을 결정하였다. 일정한 베타-액틴양으로 표준화한 상대적인 iNOS 또는 COX-2 단백질의 양을 구했다. 단백질의 밴드 크기를 3회 분석하여 평균값 ± SD로 나타내었다. 화합물 1, 2, 3이 활성화한 소교세포에서 iNOS효소 단백질 발현을 억제하는 활성 자료 (Western blot 자료)를 도 3에 나타내었다. 또, 화합물 7이 활성화한 소교세포에서 iNOS 와 COX-2 효소 단백질 발현을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (Western blot 자료)는 도 7과 같다.

또한 본 발명의 화합물들은 LPS에 의해 유도된 iNOS 또는 COX-2의 mRNA의 발현에 미치는 영향을 RT-PCR법으로 분석하였다. 상세하게는, 소교세포를 LPS(0.1 ㎍/㎖)로 활성화하는 동안 본 발명의 화합물을 6시간 동안 처리한 후, 총 RNA 추출물로부터 RT-PCR로 iNOS, COX-2 및 베타-액틴(β-actin)의 mRNA의 양을 결정하였다. 일정한 베타-액틴 양으로 표준화한 상대적인 iNOS 또는 COX-2의 양을 구하였다. mRNA의 밴드 크기를 3회 분석하여 평균값 ± SD로 나타내었다. 화합물 1, 2, 3이 활성화한 소교세포에서 iNOS효소 mRNA 발현을 억제하는 활성 자료 (RT-PCR자료)를 도 4에 나타내었다. 화합물 7이 활성화한 소교세포에서 iNOS 와 COX-2효소 mRNA 발현을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (RT-PCR자료)는 도 8과 같다. 이와 같이 웨스턴블롯과 RT-PCR 분석을 통하여 본 발명의 화합물들의 NO 및 PGE₂ 생성 저해활성의 작용기전을 iNOS 또는 COX-2 단백질과 mRNA의 발현을 억제하는 것으로 확인하였다.

퍼옥시니트라이트 분석(Peroxynitrite assay)법

NO는 수퍼옥사이드(superoxide) 음이온과 반응하여 독성이 매우 강한 peroxynitrite 음이온 (ONOO^-)을 형성한다. 식물재료의 ONOO^- 소거활성을 측정하기 위하여, ONOO^-에 의해 디하이드로로다민 123(dihydrorhodamine 123, DHR 123)이 산화될 때 발생하는 형광을 측정하였다. 상세하게는, 5 μM DHR 123과 100 μM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA)을 포함한 분석 완충액 (50 mM sodium phosphate, 90 mM sodium chloride, 및 5 mM potassium chloride, pH 7.4) 에 시료용액 (10 μl) 과 10 μM의 ONOO^- 표준액을 가하여 5분간 반응시켰다. 형성된 형광을 여기파장 485nm, 방출파장 530 nm에서 측정하여 시료에 의해 감소한 형광의 세기를 측정함으로써 시료에 의한 ONOO^- 소거활성 (%)을 계산하였으며, 양성대조 시료로 페니실라민(penicillamine)을 이용하였다. 화합물 1, 2, 3이 농도의존적으로 peroxynitrite를 소거하는 활성을 도 5에 그래프로 나타내었다.

소염활성결과

소교세포주인 BV-2 세포를 20시간 동안 LPS로 자극하면서 다양한 농도의 시료를 처리한 후 생성된 NO 와 PGE₂의 생성량을 검토하였다. 화합물에 의한 이들 염증매개인자들의 합성을 50% 저해하는 농도 (IC₅₀ 값)를 구한 결과, 화합물 1-7의 NO생성저해를 위한 IC₅₀ 값은 각각 56, 37, 27, 30, 21, 28, 10 μM 이었다. 이들 화합물 중 화합물 1, 2, 3 은 iNOS효소 발현을 억제함으로써 NO생성을 저해하였고, 생성된 NO로부터 생성되는 강한 독성물질인 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 소거하는 활성을 보였으며 50% 소거활성을 보이는 농도 (SC₅₀)는 각각 9.2, 12.3, 16.7 μM 이었다. 가장 활성이 강한 신규 구조의 화합물 7은 활성화한 소교세포에 의한 PGE₂생성을 억제하였으며 iNOS 및 COX-2효소의 발현을 억제하는 활성을 보였다.

신이로부터 확인한 본 발명의 화합물들은 과도한 NO 및 프로스타글란딘의 합성을 억제함으로써 이 염증성 매개인자로 인해 발생하는 각종 염증성 질환 및 발암을 억제하고 특히 알츠하이머병 또는 파킨슨병과 같은 산화성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있다.

도 1은 신이로부터 분리한 활성성분들의 화학구조식을 나타낸 것이다.

도 2는 신규 화합물 7의 구조를 동정하기 위해 측정한 HMBC 스펙트럼에서 수소와 탄소간의 연결 관계를 나타낸 것이다.

도 3은 화합물 1, 2, 3이 활성화한 소교세포에서 iNOS효소 단백질 발현을 억제하는 활성 자료 (Western blot 자료)이다.

도 4는 화합물 1, 2, 3이 활성화한 소교세포에서 iNOS효소 mRNA 발현을 억제하는 활성 자료 (RT-PCR자료)이다.

도 5는 화합물 1, 2, 3이 peroxynitrite를 농도의존적으로 소거하는 활성을 그래프로 나타낸 것이다.

도 6은 화합물 7이 활성화한 소교세포에서 PGE₂의 생성을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (EIA 실험 자료)이다.

도 7은 화합물 7이 활성화한 소교세포에서 iNOS 와 COX-2 효소 단백질 발현을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (Western blot 자료)이다.

도 8은 화합물 7이 활성화한 소교세포에서 iNOS 와 COX-2효소 mRNA 발현을 농도의존적으로 억제하는 활성 자료 (RT-PCR자료)이다.

Claims (5)

1. 신이로부터 분리된 리그난 성분으로서 하기 화학식 1로 표시되고, 활성화된 소교세포(microglial cell)에서 iNOS 및 COX-2의 발현저해활성을 갖는 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염.

   [화학식 1]

   
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3. 소교세포의 활성화 조절에 의해 산화성 뇌질환을 예방 및 치료하기 위한 약학적 조성물로서, 제1항의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 이의 염을 유효성분으로 하며, 상기 산화성 뇌질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 약학적 조성물.
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