KR100760684B1 - 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 이용한핵산 및 단백질의 선택적 분리 정제 방법 - Google Patents

아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 이용한핵산 및 단백질의 선택적 분리 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 DNA의 선택적 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 DNA 및/또는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있도록 메조포러스 실리카에 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기가 치환되어 DNA 및/또는 단백질을 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있는 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카, 그의 제조방법 및 이를 이용한 DNA 및/또는 단백질의 분리정제 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라, 메조포어 분자체인 메조포러스 실리카에 유기 작용기를 부여하고, 목적 분자의 특성에 따라 메조포러스 실리카를 제조하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 획기적으로 개선할 수 있다.
메조포러스 실리카, 아미노 치환된 메조포러스 실리카, DNA 분리정제

Description

아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 핵산 및 단백질의 선택적 분리 정제 방법 {Selective Purification of Nucleotide and Protein with Amino-functionalized Self-Assembled Mesoporous Silicas}
도 1은 본 발명에 따라 제조된 기공의 크기가 10 nm인 메조포러스 실리카(Mesoporous silicas)를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 비표면적[m2/g]을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에 따라 제조된 순수 메조포러스 실리카와 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 비표면적[mL/g]을 오버레이(overlay)한 그래프이다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카 즉, 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 BET로 측정한 비표면적[m2/g]을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카 즉, 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포 러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 기공 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따라 제조된 순수 메조포러스 실리카와 기능성 메조포러스 실리카의 열중량 분석(Thermal-Gravimetric Analysis) 결과를 오버레이한 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 비표면적[m2/g] 및 기공 크기 분포와 열중량분석(Thermal Gravimetric Analysis)의 결과를 나타낸 표이다(D/a : Diameter of adsorption, D/d: Diameter of desorption).
도 7은 본 발명에 따라 제조된 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 FT-IR로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카를 Solid state NMR(Nuclear Magnetic Resonance)로 분석하여 29Si와 13C의 결과를 오버레이한 그래프이다.
도 9는 순수한 사람 DNA(R), 순수 메조포러스 실리카(MS), 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카(1), 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카(2), 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카(3)를 이용하여 사람 DNA를 흡착실험을 실시한 후의 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.
도 10은 순수한 사람 DNA(R), 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 이용하여 사람 DNA를 흡착실험한 후의 전기영동사진 결과로 분석한 흡착효율을 나타낸 그래프이다.
도 11은 아민의 수 증가에 따른 Zeta-potential 변화를 측정한 것으로서 아민의 수가 많을수록 양전하를 갖게 되는데, 측정결과 아민의 수에 따라서 양전하가 증가하는 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 핵산 및 단백질의 선택적 분리 정제 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 핵산 및/또는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있도록 메조포러스 실리카에 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기가 치환되어 고순도 및 고용량으로 핵산 및/또는 단백질을 분리 정제할 수 있는 아미노 치환기를 가지는 메조포러스 실리카, 그의 제조방법 및 상기 메조포러스 실리카를 이용하여 핵산 및/또는 단백질을 고순도 및 고용량으로 분리, 정제하는 방법에 관한 것이다.
1992년 Mobil사에 의해 M41S군이라고 명명된 메조포러스 미세기공 물질이 합성되었다. Mobil사에서 처음 합성을 발표한 메조포어 실리카 분자체 M41S계의 물 질은, 제올라이트와 같은 결정형 알루미노실리케이트에 비하여 훨씬 크면서도 규칙적인 20 내지 100Å의 세공들로 구성되어 있고, 세공의 직경이 1.5 내지 10 nm 정도의 크기를 가지며, 약 700 m2g-1 이상의 표면적을 가진다. 이러한 거대 표면적을 가지는 메조포러스 실리카 분자체는 큰 흡착력을 이용하여 거대분자반응의 촉매로서 이용 가능할 뿐 아니라, 전자 및 광학용 기반재료, 의용재료 등의 분야에 새로운 나노소재로서의 응용이 활발히 모색되고 있고 앞으로는 기존의 기술 이외의 많은 응용분야로의 확장이 요구된다.
정밀화학에서 중요한 큰 유기분자의 흡착 및 촉매로서 많은 연구가 진행되고 있는 이러한 메조포어 분자체는 수용액 상에 녹인 다양한 종류(TEOS, TMOS, Ludox, Carbosil, sodium silicate 등)의 실리카 음이온 양이온 계면활성제의 액정 또는 교질 입자(micelle) 외피에 결합하여 복합구(supermolecular assembly)를 이루고, 수열반응 과정에서 실리카 원의 수화 및 축합이 진행되어 대표적으로 층상(lamella, MCM-50), 육각형(hexagonal, MCM-41) 및 입방(cubic, MCM-48) 구조의 물질이 합성된다.
본 발명에서는 메조포어 분자체인 메조포러스 실리카를 여러 반응들 중에서도 그래프팅을 이용하여 메조포러스 실리카에 유기 기능화를 부여하였다. 본 발명에 따라 메조포어 분자체에 유기 작용기를 치환함으로서 촉매 이외에도 DNA를 포함한 생물학적 분자들을 고순도 및 고용량으로 분리, 정제할 수 있다.
본 발명의 목적은 기존의 메조포러스 실리카 소재에 아미노기가 분자자기조립된 기능성 메조포러스 실리카 및 그 제조방법을 제공하는 것으로서, 핵산 및/또는 단백질을 선택적으로 고순도 및 고용량으로 분리 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은
메조포러스 실리카를 제조하고; 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 화합물을 상기 메조포러스 실리카 용액에 첨가한 다음; 온도를 100 내지 130 ℃로 승온하고 상기 혼합물을 교반하면서 환류시키고; 반응이 끝난 후 세척하고, 얻어진 분말을 상온에서 건조시키는 것을 특징으로 하는 기능성 메조포러스 실리카의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 폴리(알킬렌옥사이드)블록 코폴리머와 테트라에틸 오쏘 실리케이트(Tetraethyl ortho silicate, TEOS)를 반응시켜 메조포러스 실리카를 합성한 다음, 얻어진 메조포러스 실리카와 아미노 작용기 치환 화합물을 반응시켜 메조포러스 실리카에 아미노기를 도입한다.
본 발명에 있어서, 메조포러스 실리카는 합동주형 메카니즘과 액정주형 메카 니즘으로 합성될 수 있으며, 본 발명에서는 주로 액정주형 메카니즘을 이용하여 메조포러스 실리카를 합성한다.
본 발명에 있어서, 메조포러스 실리카를 제조하기 위하여는 폴리(알킬렌옥사이드)블록 코폴리머, 예를 들면 Pluronic P123(BASF사 제품)과 테트라에틸 오쏘 실리케이트(TEOS)가 전구물질로 사용된다.
폴리(알킬렌옥사이드)블록 코폴리머를 물과 혼합하고 산을 첨가하여 용해시킨 다음, TEOS를 첨가하여 가온 가압 하에 에이징(ageing)하여 메조포러스 실리카를 제조한다. 일정압력과 온도 하에서 메조포러스 실리카를 에이징하므로써 보다 균일한 기공크기를 가지는 메조포러스 실리카를 얻을 수 있다.
바람직한 양태로서, 상기 메조포러스 실리카는 기공 크기에 따라 10 nm, 17 nm, 30 nm로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으며, 기공 크기가 3 nm 이하인 메조포러스 실리카도 사용될 수 있다.
메조포러스 실리카의 기공 크기는 이 분야에서 알려진 종래 기술에 의해 조절가능하며, 특별히 제한되지는 않는다. 본 발명에서는 메조포러스 실리카의 기공 크기를 늘리기 위해 기공확장제로서 1,3,5-트리메틸벤젠(1,3,5-trimethylbenzene, TMB)을 첨가하는데, 용액 상태의 메조포러스 실리카에 TMB를 첨가하여 메조포러스 실리카의 기공 크기를 임의로 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 하나의 구현예에 있어서, 메조포러스 실리카는 Pluronic P123, HCl 그리고 물을 혼합하여 제조할 수 있다. 혼합 용액은 교반 되면서 점점 투명한 용액으로 되는데 약 40 ℃에서 약 24시간 교반을 시켜준 다음 테트라에틸 오쏘 실리케이트(Tetraethyl ortho silicate, TEOS)를 첨가하고 교반한다. 교반하는 동안 불투명한 용액이 되는데 불투명한 메조포러스 실리카 용액을 스틸 가압기에 투여한 후 고온의 오븐에 넣고 하룻밤 동안 에이징(ageing) 시킨다. 에이징한 메조포러스 실리카를 상온으로 식힌 후 물로 세척을 하고, 세척한 메조포러스 실리카를 상온에서 건조시키고 소결하여 미세 기공이 생성된 메조포러스 실리카를 제조한다. 얻어진 메조포러스 실리카는 아미노기를 제공할 수 있는 화합물과 반응시켜 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카를 제조하는데 이용된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 또한 메조포러스 실리카는 1,3,5-트리메틸벤젠을 첨가하여 임의로 기공크기를 조절할 수 있다. 예를 들면, Pluronic P123과 HCl 및 물을 혼합하고, 혼합 용액을 약 40 ℃에서 약 24시간 교반한다. 24시간 동안 교반된 용액에 1,3,5-트리메틸벤젠을 첨가한 후 약 40 ℃에서 추가로 교반한다. 여기서 TMB는 메조포러스 실리카의 기공 크기를 키워주는 작용을 한다. 교반이 끝나면 테트라에틸 오쏘 실리케이트 25.5 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간을 교반한다. 교반하는 동안 불투명한 용액이 된다. 이때 TEOS를 첨가하여 교반함으로서 마이셀들의 소수성 부분으로 TEOS가 침투하여 가수분해가 일어나서 미세 기공들이 형성될 수 있다. 8시간 후 교반한 불투명한 메조포러스 실리카 용액을 스틸 가압기에 투여한 후 고온의 오븐에 넣고 하룻밤 동안 에이징한다. 이렇게 일정한 온도와 압력에서 에이징을 함으로서 보다 균일한 크기의 기공을 가지는 메조포러스 실리카를 만들 수 있다. 에이징한 메조포러스 실리카를 상온으로 식힌 후 물로 세척하고, 세척한 메조포러스 실리카를 상온에서 건조시킨다. 건조된 메조포러스 실리카를 소결하여 목적하는 크기의 미세 기공을 가지는 메조포러스 실리카를 제조한다.
또한, 상기 공정에서는 균일한 미세 기공의 생성을 위해 NH4F를 촉매로 사용할 수 있다.
도 1은 기공크기가 10 nm인 메조포러스 실리카의 BET (Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 비표면적[m2/g]을 나타낸 그래프이다.
문헌에서 볼 수 있는 기본적인 기공크기가 10 nm인 메조포러스 실리카의 Isotherm을 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기한 방법으로 제조된 미세 기공을 가지는 메조포러스 실리카에 기능성을 제공하기 위해 아미노 작용기가 치환된다.
메조포러스 실리카에 아미노 작용기를 치환하기 위하여 메조포러스 실리카를 유기용매, 바람직하기로는 톨루엔에 분산시킨 후, 분산된 용액에 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 화합물을 첨가하여 온도를 100 내지 130 ℃까지 승온한다. 교반 하에 상기 혼합물을 6 내지 24시간 동안 환류시킨다. 반응이 끝나면 유기용매, 바람직하기로는 톨루엔으로 세척하고, 얻어진 분말을 상온에서 건조시켜서 아미노기가 치환된 메조포러스 실리카를 제조한다.
본 발명에서 제조되는 아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카(amino functionaloized mesoporous silicas)는 결합제(coupling agent)로서 활성화 물질의 고정에 사용될 수 있다. 실리카 표면에 형성된 수산기는 Si-O-Si와 같은 고유결합 형식에 의해 적당히 여러 실란기들 중 하나와 결합한다.
도 2는 3종류의 아미노 치환기 기능성 메조포러스 실리카를 BET로 측정한 비표면적[m2/g] Isotherm을 오버레이한 그래프이다. 순수 메조포러스 실리카와 모노아민기를 치환한 메조포러스 실리카, 다이아민기를 치환한 메조포러스 실리카 그리고 트라이아민기를 치환한 메조포러스 실리카의 BET Isotherm의 차이를 확인할 수 있다.
도 3은 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카 (Mesoporous silicas) 즉, 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 비표면적[m2/g]을 나타낸 그래프이다. 순수 메조포러스 실리카와 비교하여 모노아민기 치환한 메조포러스에서 트라이아민기 치환한 메조포러스 실리카로 갈수록 비표면적이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명에 따라 제조된 기능성 메조포러스 실리카 (Mesoporous silicas) 즉, 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 BET(Bruner-Emmet-Teller)로 측정한 기공 크기 분포를 나타낸 그래프이다.
도 5는 상기의 아미노 치환기 기능성 메조포러스 실리카의 열중량분 석(Thermal Gravimetric Analysis) 결과를 오버레이한 그래프이다. 1300 ℃(5 ℃/min)까지 열분석을 통하여 순수 메조포러스 실리카와 기능성 아민기 치환 메조포러스 실리카의 손실 중량 값의 차이를 확인할 수 있다. 순수 메조포러스 실리카에서는 중량감소가 거의 없다. 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카에서 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카로 갈수록 중량감소가 증가함을 확인 할 수 있다.
아민기가 증가할수록 탄소 사슬도 증가하는데, 늘어남을 알 수 있다. 이는 트라이 아민기가 치환된 메조포러스 실리카가 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카보다 보다 더 많은 탄소가 있기 때문이다. 이는 열중량 감소로 보았을 때도 탄소가 많은 메조포러스 실리카의 중량감소가 클 수밖에 없는 이유이다.
도 6은 도 2와 도 5의 결과 값을 비교할 수 있도록 나타낸 표이다. 이결과로부터 각각의 아미노 치환기에 따른 값의 차이와 경향성을 확인할 수 있다.
도 7은 아미노 치환기 기능성 메조포러스 실리카를 FT-IR로 분석하여 오버레이한 그래프이다. 먼저 1000 내지 1100 cm-1에서 Si-O의 강한 결합을 확인할 수 있다. 또한, 3000 내지 2850 cm- 1 에서는 C-H 결합을, 1640 내지 1550 cm- 1 에서는 N-H 결합을 확인할 수 있고, 또한 1500 cm-1 근방에서 C-N기의 피크를 확인할 수 있다.
도 8은 기능성 메조포러스 실리카 (Meso-porous silicas)를 Solid state NMR(Nuclear Magnetic Resonance)로 분석한 29Si와 13C의 결과를 오버레이한 그래프이다. Solid-State 29Si NMR을 통해서 순수 메조포러스 실리카와 아민기 치환한 메조포러스 실리카의 결합의 특성을 조사하였다. 측정 결과에서 약 -90 ppm(Q2), 약 -100 ppm(Q3), 약 -110 ppm(Q4)의 3개 피크를 나타낸다. Q2는 (OH)2Si(OSi)2, Q3는 (OH)2Si(OSi)3, Q4는 (OH)2Si(OSi)4의 화학적 특성을 나타낸다. 이들 피크는 순수 메조포러스 실리카와 아민기 치환한 메조포러스 실리카에 따라 각기 다른 피크를 나타낸다.
다른 양태에 있어서, 본 발명은 상기한 방법으로 제조된 기능성 메조포러스 실리카를 이용하여 핵산 또는 단백질을 흡착하고, 상기 흡착물로부터 메조포러스 실리카와 핵산 또는 단백질을 분리하여서 되는 것을 특징으로 하는 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 핵산 및 단백질의 분리 정제방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 의해 제조되는 기능성 메조포러스 실리카는 생물학적 분자에 대한 흡착능을 가지므로 각종 생물학적 분자를 분리 정제하는데 이용될 수 있다. 특히 핵산, 바람직하기로는 사람 DNA와 메조포러스 실리카의 결합은 정전기적 상호작용(Electrostatic interaction)으로 흡착이 일어나게 된다. DNA는 전체적으로 5' 말단의 인산기로 인하여 음전하를 띠며 아민기가 치환된 메조포러스 실리카는 양전하를 띠게 된다. 이러한 두 전하의 차이로 인해 서로 끌어 당겨서 실리카 표면에 DNA가 흡착하게 된다. 실제 이 둘 사이의 전위차가 많이 날수록 상호 정전기적 인력은 더욱 강해져서 흡착 효율 크게 나타나게 된다. 따라서 치환된 아민기가 많을수록, 즉 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카의 흡착 효율이 더 높아져서 DNA 흡착률이 높아질 수 있다. 도 11에는 본 발명에 따른 아미노 작용기가 치환된 메조포러스 실리카의 전위차를 나타내었다.
아미노기가 치환된 메조포러스 실리카를 이용한 DNA 분리, 정제에 있어서는 메조포러스 실리카와 완충액, 아가로스 겔, DNA, Primer, Premix, 멸균증류수를 필요로 한다. 완충액으로는 TAE 완충액을 사용한다. TAE 완충액은 H2O에 트리스 염기, 아세트산 및 EDTA를 첨가하여 제조된다.
완충액을 제조하고, TAE 완충액에 아가로스를 녹인 후, 전자레인지를 이용하여 아가로스를 완전히 용해한다. 상온에서 식힌 후 EtBr(Ethidium bromide)를 넣는다. 제조한 용액을 컴(comb)이 꽂아진 틀에 넣고 굳힌다. 그 후 완벽한 겔 상태가 되면 전기영동을 시작한다. 완충액을 부은 상태에서 겔을 넣고 그 안에 대조용 DNA를 로딩하고 그 다음부터 준비된 시료를 로딩한다. 전류를 100V로 걸어주고 전기영동을 시작한다. 전류는 로딩 염료가 아가로스 젤의 중간위치에 올 때까지 흘려준다. 그 후 전기영동이 끝나면 형광분석기로 DNA의 흡착결과를 본다. EtBr로 인해 UV 램프에서 하얀색을 나타내어 육안으로 구별이 가능하게 되는데 이때 아가로스 젤의 중간부분을 보았을 때 하얀색이 나타나지 않았으면 메조포러스 실리카에 흡착이 된 것으로 본다.
본 발명의 실험에 따르면, 처음 로딩한 DNA와 순수 메조포러스 실리카에는 DNA가 흡착이 되지 않았고 나머지 각각의 아민합성 시료에 관해서는 트라이 아민, 다이아민, 모노아민 순으로 흡착효율이 우수한 것으로 나타났다. 시료와 DNA의 비율이 1 μL : 10 μL일 때에는 모두 흡착이 되지는 않았지만 시료와 DNA의 비율이 5 μL : 10 μL일 때에는 트라이 아민이 흡착을 먼저 보이고 10 μL : 10 μL, 15 μL : 10 μL, 20 μL : 10 μL로 갈수록 다이아민, 모노아민 순으로 흡착을 보였다. 따라서 DNA 이미지로 보아서도 트라이아민에서 모노아민으로 갈수록 DNA와의 흡착효율이 높은 것이 확인되었다.
도 9는 순수한 사람 DNA(R), 순수 메조포러스 실리카(MS), 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카(1), 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카(2), 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카(3)를 이용하여 사람 DNA 흡착실험을 실시한 후의 전기영동 사진이다.
도 10은 순수한 사람 DNA(R), 순수 메조포러스 실리카, 모노아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 다이아민기가 치환된 메조포러스 실리카, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카를 이용하여 사람 DNA의 흡착실험을 한 후의 전기영동사진을 가지고 분석한 흡착효율을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
메조포러스 실리카의 합성
1-1) 10 nm의 기공 크기를 가지는 메조포러스 실리카의 합성
Pluronic P123 4 g, HCl 120 g 및 물 30 g을 혼합하였다. 혼합한 용액은 교반되면서 점점 투명한 용액으로 되는데 40 ℃에서 약 24시간 동안 교반한 다음, 테트라에틸 오쏘 실리케이트 8.5 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간 동안 다시 교반하였다. 교반하는 동안 불투명한 용액이 되는데, 8시간 교반한 후의 불투명한 메조포러스 실리카 용액을 일정한 압력과 온도 하에서 메조포러스 실리카가 보다 균일한 기공 크기를 가지도록 하기 위하여 스틸 가압기에 투여한 후 120 ℃ 오븐에서 하룻밤 동안 방치하였다. 에이징 처리한 메조포러스 실리카를 상온으로 식힌 후 물로 세척하였다. 세척한 메조포러스 실리카를 상온에서 건조시키고, 건조된 메조포러스 실리카를 550 ℃에서 6시간 동안 소결하여 기공크기가 10 nm인 메조포러스 실리카 분말을 제조하였다.
1-2) 17 nm의 기공 크기를 가지는 메조포러스 실리카의 합성
Pluronic P123 12 g, HCl 360 g 및 물 90 g을 혼합하였다. 혼합한 용액은 교반되면서 점점 투명한 용액으로 되는데 40 ℃에서 약 24시간 동안 교반하였다. 교반한 다음, 1,3,5-트리메틸벤젠 4.5 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간 동안 교반하였다. 다음으로, 테트라에틸 오쏘 실리케이트 25.5 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간 동안 다시 교반하였다. 교반하는 동안 불투명한 용액이 되는데, 8시간 교반한 후의 불투명한 메조포러스 실리카 용액을 스틸 가압기에 넣은 후 120 ℃ 오븐에서 하룻밤 동안 방치하였다. 에이징 처리한 메조포러스 실리카를 상온으로 식힌 후 물로 세척하였다. 세척한 메조포러스 실리카를 상온에서 건조시키고, 건조된 메조포러스 실리카를 550 ℃에서 6시간 동안 소결하여 기공크기가 17 nm인 메조포러스 실리카 분말을 제조하였다.
1-3) 30 nm의 기공 크기를 가지는 메조포러스 실리카의 합성
Pluronic P123 10 g과 HCl 375 g 그리고 물 90g 그리고 NH4F 0.115g을 혼합하였다. 혼합한 용액은 교반되면서 점점 투명한 용액으로 되는데 40 ℃에서 약 24시간 동안 교반하였다. 교반한 다음, 1,3,5-트리메틸벤젠 10.5 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간 동안 교반하였다. 다음으로, 테트라에틸 오쏘 실리케이트(Tetraethyl ortho silicate) 22.0 g을 첨가하고 40 ℃에서 8시간 동안 다시 교반하였다. 교반하는 동안 불투명한 용액이 되는데, 8시간 교반한 후의 불투명한 메조포러스 실리카 용액을 스틸 가압기에 넣은 후 120 ℃ 오븐에서 하룻밤 동안 방치하였다. 에이징 처리한 메조포러스 실리카를 상온으로 식힌 후 물로 세척하였다. 세척한 메조포러스 실리카를 상온에서 건조시키고, 건조된 메조포러스 실리카를 550 ℃에서 6시간 동안 소결하여 기공크기가 30 nm인 메조포러스 실리카 분말을 제조하였다.
상기 실시예에서 제조되는 기공 크기가 10, 17 및 30 nm인 메조포러스 실리카를 제조하기 위한 각각의 실험적 조성을 하기 표 1에 기재하였다.
Pore(Å) Pluronic P123(g) HCl (g) H 2 O (g) TEOS (g) TMB (g)
10 4 120 30 8.5 -
17 12 360 90 25.5 4.5
30 10 375 NH4F 0.115 22.0 10.0
실시예 2
기능성 메조포러스 실리카의 합성
2-1) 모노아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카의 합성
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 메조포러스 실리카를 톨루엔에 분산시킨 후 온도를 110℃로 승온하였다. 그 후 3-아미노프로필트라이에톡시실란을 첨가하고 이 혼합물을 6 내지 8시간 동안 질소분위기에서 교반하면서 환류시켰다. 반응이 끝나면 톨루엔으로 세척하고, 얻어진 분말은 상온에서 72시간 동안 건조시킨 후 모노아미노기가 치환된 메조포러스 실리카를 제조하였다.
2-2) 다이아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카의 합성
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 메조포러스 실리카를 톨루엔에 분산시킨 후 온도를 110℃로 승온하였다. 그 후 N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민을 첨가하고, 이 혼합물을 10 내지 12시간 동안 질소분위기에서 교반하면서 환류시켰다. 반응이 끝나면 톨루엔으로 세척하고, 얻어진 분말은 상온에서 72시간 동안 건조시켜 다이아미노기가 치환된 메조포러스 실리카를 제조하였다.
2-3) 트라이아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카의 합성
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 메조포러스 실리카를 톨루엔에 분산시킨 후 온도를 110℃로 승온하였다. 그 후 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민을 첨가하고, 이. 혼합물을 20 내지 24시간 동안 질소분위기에서 교반하면서 환류시켰다. 반응이 끝나면, 톨루엔으로 세척하고, 얻어진 분말은 상온에서 72시간 동안 건조시켜 트라이아미노기가 치환된 메조포러스 실리카를 제조하였다.
실시예 3
DNA에 대한 흡착/탈착 정량적 평가
1) DNA 분리
DNA와 메조포러스 실리카의 결합력을 비교하기 위하여 먼저 박테리아(E.coli)로부터 하기한 방법으로 게놈 DNA를 추출하였다. 먼저 멸균한 LB 배지에 균주를 접종한 후 37 ℃, 200 rpm에서 하루 동안 배양하고, 충분히 배양된 균주 1 mL를 취하여 1.5 mL 마이크로 튜브로 옮긴 후 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리 하였다. 상등액을 버린 다음, 여기에 세포 용해 완충액 300 μL를 첨가하고 피펫으로 침전된 펠릿을 고르게 현탁하였다. 또한 세포를 완전히 분해하기 위하여 80 ℃에서 5분 동안 반응시켰다.
5분 후 용액을 실온에서 냉각하고 용액 속의 RNA를 제거하기 위하여 3 μL의 RNase A(5 mg/gL)를 첨가하여 37 ℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 다음 100 μL의 PPT 용액을 첨가하고 20초 동안 고르게 섞이도록 교반하였으며 교반 후 빙냉 하에 5분 동안 정치하였다. 반응이 끝난 튜브를 다시 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다.
원심분리 후 펠릿을 제외한 상층액을 조심스럽게 취하여 새로운 1.5mL 마이크로 튜브에 옮기고 600μL의 DNA 결합용 완충액을 첨가하여 고르게 교반하였다. 미리 준비된 스핀 컬럼을 수집 용기에 넣고 DNA 결합 완충액이 혼합된 샘플 650μL를 취하여 스핀 컬럼의 중앙부에 조심스럽게 첨가한 후12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리 하였다. 이때 용액은 스핀 컬럼의 멤브레인을 통과하게 되고 용액 속의 DNA는 필터 멤브레인에 결합하게 된다.
원심분리가 끝난 후 수집 용기에 담신 용액을 제거하고 스핀 컬럼을 다시 장착한 다음 준비된 세척용액 600 μL를 넣은 후 동일하게 12,000 rpm에서 2분 동안 원심분리하여 멤브레인에 존재하는 염을 제거하였으며 이를 2회 반복하였다.
세척이 끝난 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣은 후 100μL의 멸균 증류수 또는 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)을 멤브레인의 중앙에 조심스럽게 넣고 12,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 멤브레인에 결합된 DNA를 용출하였다. 얻어진 DNA는 다음 실험까지 4℃에 보관하였다.
2) 메조포러스 실리카와 DNA의 결합
상기 실시예 1의 방법으로 얻어진 순수 메조포러스 실리카와 실시예 2의 방법으로 얻어진 기능성 메조포러스 실리카 10 mg을 정확하게 취하여 각각 1.5mL 마이크로 튜브에 투여하고 멸균 증류수 1000 μL를 첨가하여 메조포러스 실리카 용액을 준비하였다.
상기한 1)의 방법으로 준비된 DNA 용액을 96웰 플레이트에 일정량을 각각 첨가하고 메조포러스 실리카 용액과 DNA는 Primer, Premix, 멸균증류수와 각각의 비율에 맞춰 웰에 접종한 후 증폭하였다. 증폭된 용액을 1.5 mL 마이크로 튜브에 모았다. 모아진 용액은 메조포러스 실리카와 DNA의 결합력을 확인하기 위해서 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 실시하였다.
전기영동을 위한 완충액으로는 TAE 완충액을 사용하였다. TAE 완충액은 H2O 2 L에 트리스 염기 4.84 g, 아세트산 1.142 mL, EDTA 0.292 g을 넣어서 제조되었다.
TAE 완충액 100 mL에 아가로스 1 g을 녹인 후, 전자레인지에 약 1분에서 1분 30초 동안 녹였다. 상온에서 냉각하여 EtBr(Ethidium bromide) 10 μL를 첨가하였다. 제조한 아가로스 용액을 컴이 꽂아진 틀에 넣고 굳혀서 완벽한 겔 상태가 되면 전기영동을 개시하였다.
완충액을 부은 상태에서 겔을 넣고 그 안에 대조군으로 DNA를 로딩하고 그 다음부터 준비된 시료를 로딩하였다. 전류를 100 V로 하여 전기영동을 시작하고, 전류는 로딩 염료가 아가로스 젤의 중간위치에 올 때까지 흘려주었다. 전기영동을 종료한 후 형광분석기로 DNA의 흡착결과를 관찰하였다. EtBr로 인해 DNA는 UV 램프에서 흰색을 나타내어 육안으로 구별이 가능하게 되는데, 이때 아가로스 젤의 중간부분을 보았을 때 흰색이 나타나지 않았으면 흡착된 것이다.
전기영동 결과, 처음 로딩한 DNA와 순수 메조포러스 실리카에는 DNA가 흡착되지 않았고 나머지 각각의 아민 합성 시료에서는 트라이아민, 다이아민, 모노아민 순으로 우수한 흡착효율이 나타났다.
아미노기가 치환된 메조포러스 실리카의 DNA 흡착효과를 시험한 상기 전기영동 결과를 도 11에 그래프로 나타내었다. 도 11에서 보이는 바와 같이 모노아민기, 다이아민기, 트라이아민기가 치환된 메조포러스 실리카의 순으로 흡착효율이 증가하였다.
본 발명에 따른 아미노기가 치환된 메조포러스 실리카는 종래의 메조포러스 실리카 보다 목적 DNA에 대한 결합성 및 DNA 수득률이 높아 단위 시간당 필요로 한 시료 DNA를 많이 확보할 수 있으며, 목적 분자의 특성에 따라 메조포러스 실리카를 가공하면 DNA를 고순도로 정제할 수 있으므로 기존의 HPLC, FPLC, 전기영동 등과 같은 시간 소모가 많은 생화학적 방법의 속도를 획기적으로 개선할 수 있다.

Claims (5)

  1. 메조포러스 실리카를 제조하고; 3-아미노프로필트라이에톡시실란, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아민 및 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아민으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 화합물을 상기 메조포러스 실리카 용액에 첨가한 다음; 온도를 100 내지 130 ℃로 승온하고 상기 혼합물을 교반하면서 환류시키고; 반응이 끝난 후 세척하고, 얻어진 분말을 상온에서 건조시키는 것을 특징으로 하는 기능성 메조포러스 실리카의 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 메조포러스 실리카가 폴리(알킬렌옥사이드)블록 코폴리머와 테트라에틸 오쏘 실리케이트를 반응시켜서 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 따른 방법에 의해 제조되는 3-아미노프로필트라이에톡시실라노기, N-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]에틸렌 다이아미노기, 또는 N'-[3-(트라이메톡시실릴)프로필]다이에틸렌 트라이아미노기가 치환된 기능성 메조포러스 실리카.
  4. 제 3항에 따른 기능성 메조포러스 실리카를 이용하여 핵산 또는 단백질을 흡착하고, 상기 흡착물로부터 메조포러스 실리카와 핵산 또는 단백질을 분리하여서 되는 것을 특징으로 하는 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 핵산 및 단백질의 분 리 정제방법.
  5. 제 4항에 있어서, DNA를 흡착하여 분리하는 것을 특징으로 하는 기능성 메조포러스 실리카를 이용한 핵산 및 단백질의 분리 정제방법.
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