KR100742340B1

KR100742340B1 - 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 홍국균 배양조성물의제조방법.

Info

Publication number: KR100742340B1
Application number: KR1020060073927A
Authority: KR
Inventors: 김수동; 이용욱; 신미경; 최경미; 장이현
Original assignee: (주)에스에이치제약; 김수동
Priority date: 2006-08-04
Filing date: 2006-08-04
Publication date: 2007-07-24

Abstract

본원은 홍국균(Monascus sp .) 배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

더욱 구체적으로는 증자한 백미를 고체 배지로 Monascus sp . 균주를 배양하여 모나콜린-K를 생산하고, 이러한 방법에 의하여 제조된 홍국균(Monascus sp.)이 함유된 양질의 홍국분말을 생리활성 기능이 많은 쑥에 2차 배양 및 숙성하여 쑥의 기능성이 보강된 콜레스테롤 저하기능을 갖는 조성물을 얻고자 하는 것이다.

본원에서 개시되는 홍국균(Monascus sp.)배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법은, 분양균주를 배지를 이용, 배양하여 포자현탁액을 제조하는 제1단계; 증자한 백미를 자연 방냉 후 상기에서 제조한 포자현탁액을 접종하여 배양하는 제2단계; 2차 배양배지로서 쑥을 100℃에서 3 ~ 5분 동안 고온 살균처리 하여 쑥 배지를 형성하는 제3단계; 종균인 홍국균이 함유된 홍국분말을 이용하여 쑥 배지에 2차 배양 및 숙성하여 조성물을 수득하는 제4단계를 포함하여 이루어지는 홍국균(Monascus sp.) 배양 조성물의 제조방법에 의해 목적물을 수득할 수 있다.

홍국균(Monascus sp.), 모나콜린-K, 콜레스테롤 저하, 쑥 배지

Description

혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 홍국균 배양조성물의 제조방법.{The manufacturing method of culturing compositions of Monascus. sp. improving cholesterol in blood}

도 1 : 배양시간(일)에 따른 lactone form 모나콜린-K 양 측정그래프.

본 발명은 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 증자한 백미를 배지로 홍국균(Monascus sp.)을 배양하여 모나콜린-K를 생산하고 이러한 방법에 의하여 제조된 홍국균(Monascus sp.)이 함유된 양질의 홍국분말을 얻고, 이를 다시 생리활성 기능이 많은 쑥에 2차 배양 및 숙성시켜 쑥의 기능성이 보강되어 콜레스테롤 저하기능을 갖는 조성물의 제조방법을 찾고자 하는 것이다.

붉은 누룩이라는 뜻의 홍국은 혈행을 개선시키는 효과를 나타내는 한약재로서 본초강목 및 동의보감에 개시되어 있고, 주로 산후 어혈해소제 로서 사용되고 있음이 알려져 있다.

붉은 곰팡이는 반자낭균과(Hemiascomycetaceae) 중의 홍국균속(Monascaceae) 으로서 균사가 붉은색을 띠기 때문에 홍국균이라고 하며, Monascus purpureus, M. ruber, M. pilosus, M. kaoliang 등이 동정되어 알려져 있다.

Monascus sp. 균주에 관한 연구는 60년대 이후부터 시작되어 오늘날까지도 많은 연구가 진행되고 있는바, Monascus sp. 균주를 이용한 천연색소 및 그 밖의 이차 대사산물 생산은 현재 액체배양 및 쌀을 이용한 고체배양이 일반화되어 있다.

홍국에서 추출되는 물질인 모나콜린-K는 혈 중 콜레스테롤 수치를 저하시키는 것으로 알려져 있고, 머크사에서 이를 제품화하여 고지혈증 치료제인 '로바스타틴' 이라는 상품명으로 판매하고도 있다.

현재 시판되고 있는 로바스타틴은 체내에서 최소한 세 가지 이상의 효소에 의해 가수분해되어 락톤 링 구조가 변형되어야만 활성을 나타내는 비활성형 모나콜린-K로서 복용 시 생체에서 활성형으로 전환되는 인체 내 생물 이용도가 25% 정도에 불과하고, HMG-CoA환원효소 저해효과를 나타내는 활성형 모나콜린-K인 메비놀린산(mevalonate)으로 전환되는 과정에서, 간과 혈장에 존재하는 효소를 다량 소모하기 때문에 간 손상, 질환 등의 부작용을 야기할 수 있어, 구입 시 반드시 의사의 처방을 받아야만 하는 의약품으로 분류되어 있다.

로바스타틴과는 달리 홍국균(Monascus sp.) 균주가 쌀 등에서 증식하여 제조된 홍국에는 활성형 모나콜린-K와 비활성형 모나콜린-K를 모두 포함하고 있고 콜레스테롤의 합성을 저해한다는 점에서는 홍국이 로바스타틴보다 체내에서 안전하다고 알려져 있으며 체내에서 발생하는 부작용을 최소화하여 효과적인 고지혈증 예방제 및 치료제로서 활용할 수 있을 것으로 예측된다.

쑥은 엉거지과에 속하는 다년초인데 색소 뿐 아니라 특유의 향과 맛을 지니고 있으며 쑥의 효능으로는 해열과 진통작용, 해독과 구충작용, 혈압강하와 소염작용, 복통, 토사, 출혈의 치료에 많이 이용되어 왔다.

쑥에 관하여 선행 연구된 바에 의하면 쑥의 분말과 열수 추출물을 식이로 섭취시켰을 때 고지혈증 흰쥐의 혈청 지질성분 농도의 변화는 없었으나 흉부대동맥의 내피세포의 손상이 지연되고 혈관의 수축력이 감소되는 것으로 보고되어 있다.

동의보감과 본초강목에서는 인진쑥은 손상된 간 회복, 지방간, 간암, 황달 등의 간질환 치료 및 예방, 식욕증진, 소화불량, 위장병 등의 위장질환의 치료, 중풍, 혈액순환 등의 순환기계통 기능의 개선 및 당뇨병 치료 등에 그 효능이 있다고 기록하고 있다.

콜레스테롤은 간에서 합성되는 경로와 음식의 형태로 섭취되는 경로에 의하여 체내에서 생성되는데, 모나콜린-K는 콜레스테롤 생합성 조절 효소인 HMG-CoA 환원효소의 저해제(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitor)로서 작용하여, HMG-CoA가 메비놀린으로 환원되는 것을 저해하여 간에서 콜레스테롤의 합성을 감소시킨다.

본 발명자들은 증자한 백미를 배지로 홍국균(Monascus sp.)을 배양하여 모나콜린-K를 생산하고 이러한 방법에 의하여 제조된 홍국균(Monascus sp.)이 함유된 양질의 홍국분말을 생리활성 기능이 많은 쑥에 2차 배양 및 숙성하여 쑥의 기능성이 보강된 콜레스테롤 저하기능을 갖는 조성물을 얻는 방법의 가능성을 예상하여 발명을 착상하게 되었다.

따라서 본원 발명은 상기의 필요성을 충족시키기 위하여 발명된 것으로, 생물공학적인 방법을 도입하여 증자한 백미를 배지로 홍국균(Monascus sp.)을 배양하여 모나콜린-K를 생산하고 이러한 방법에 의하여 제조된 홍국균(Monascus sp.)이 함유된 양질의 홍국분말을 생리활성 기능이 많은 쑥에 2차 배양 및 숙성시켜 쑥의 기능성이 보강된 콜레스테롤 저하기능을 갖는 조성물을 실용 가능한 경제적 규모로 제조하는 방법을 찾고자 하는데 발명의 목적이 있다.

본원에서는 홍국균(Monascus sp.) 배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법으로서, 분양균주를 배지를 이용, 배양하여 포자현탁액을 제조하는 제1단계; 증자한 백미를 자연 방냉 후 상기에서 제조한 포자현탁액을 접종하여 배양하는 제2단계; 2차 배양배지로서 쑥을 100℃에서 3 ~ 5분 동안 고온 살균처리 하여 쑥 배지를 형성하는 제3단계; 종균인 홍국균이 함유된 홍국분말을 이용하여 쑥 배지에 2차 배양 및 숙성하여 조성물을 수득하는 제4단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍국균(Monascus sp.) 배양 조성물의 제조방법이 개시된다.

상기 제1단계에서 포자현탁액 제조는 분양균주를 PDA배지를 이용 온도 25 ~ 35℃에서 5 ~ 10일간 배양하여 포자 및 균사체를 현탁, 여과하여 포자현탁액을 제 조하여 사용할 수 있다.

또한 제2단계에서 포자현탁액 접종은 포자현탁액을 건조균체량으로 환산하여 0.1 ~1.0g/㎏을 25 ~ 35℃, 70 ~ 85% 습도로 15 ~ 25일간 접종하여 배양시키는 방법이 개시된다.

제3단계에서 제공된 살균된 쑥 배지에 70 ~ 95%의 홍국균을 포함하는 홍국분말을 균일하게 혼합하고 25 ~ 35℃, 70 ~ 85% 습도로 24 ~ 36시간 동안 배양 및 숙성하여 조성물을 수득하는 방법에 의해 홍국균 배양 조성물을 얻을 수 있다.

이하 본 발명의 구체적인 생산방법을 제시하기 위하여 발명의 실시 예를 들어 단계별로 설명하고자 하는바, 본 발명의 권리범위가 이들 실시 예에 한정되는 것이 아님은 당연하다.

실시예 1: [홍국균(Monascus sp.) 배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법]

1. 종균준비

본 발명에 사용한 홍국균은 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 Monascus kaoliang, Monascus pilosus, Monascus ruber, Monascus purpureus를 사용하였다. 특히 Monascus purpureus로부터 NTG로 변이처리하여 분리한 Monascus purpureus 변이주를 선별하여 사용하였다.

2. 배양배지의 제조 및 생육조건

분양 균주를 potato dextrose agar배지에서 25 내지 35℃, 바람직하게는 28℃에서 5 내지 10일간 배양하여 포자 및 균사체를 현탁 후 cotton filter로 여과하여 포자현탁액을 제조하였으며 배양배지는 백미를 정제수에 24 시간 침지 한 후 물을 제거하여 121℃에서 30분간 가압멸균으로 증자하였다.

3. 홍국의 제조

자외선 무균실로 옮겨서 자연 방냉 후 클린룸에서 살균된 도구로 증자한 백미에 상기에서 제조한 포자현탁액을 건조균체량으로 환산하여 0.1 내지 1.0g/㎏, 바람직하게는 0.15g/㎏이 되게 접종하여 25 내지 35℃, 70 내지 85% 습도로 21일간 배양하였으며 홍국균 배양체의 덩어리를 1일에 2번씩 흔들어 주어 덩어리 형성을 방지시켰다.

4. 2차 배양배지의 제조

상기에서 수득된 홍국균(Monascus sp.)을 포함하는 홍국분말을 상기의 배양배지의 제조와 같은 방법으로 쑥을 처리하여 배지를 제조하였다. 쑥은 건조물을 사용하였으며 바닥이 일정한 크기로 타공된 용기에 부직포를 깔고 쑥을 100℃에서 3 내지 5분 동안 고온 살균처리하여 오염된 박테리아를 제거하고 상기의 홍국분말의 홍국균(Monascus sp.)이 쑥의 영양분을 이용하기에 용이하도록 하였다.

5. 2차 배양 및 숙성

상기에서 제조한 쑥 배지를 상기의 홍국의 제조와 같은 방법으로 자외선 무균실에 옮겨서 자연 방냉 후 클린룸에서 살균된 도구로 70 내지 95%(700 내지 950g/㎏)의 홍국분말과 살균된 쑥 배지를 균일하게 혼합하고 바닥이 소정의 크기로 천공된 용기에 부직포를 깔고 혼합된 분말을 담아 배양실에서 약 24 내지 36시간 동안 배양시켰다.

접종에 사용된 도구류는 70% 에탄올을 이용하여 잡균의 오염을 억제하였고, 배양실은 실내 컨트롤러에 의하여 온도는 30 내지 35℃, 습도는 60 내지 75%를 유지시켜야 하며 벽면, 천장 및 바닥 등에 70% 에탄올을 골고루 살포하여 잡균의 오염을 억제하였으며 상기에서 설명한 바와 같이 접종 후 24시간 내지 36시간 동안 숙성시켰다.

최초의 수 시간은 유도기로서 홍국균(Monascus sp.) 균주가 증식하여 원료 쑥 배지의 품온이 상승하여 홍국균(Monascus sp.)균주의 증식은 완만해지게 되며 품온은 약간 떨어지게 된다.

실시예 2: [균주의 선별]

본 발명에 사용한 홍국균은 한국미생물보존센터(KCCM)에서 분양받은 Monascus kaoliang KCCM60154, Monascus pilosus KCCM60160, Monascus ruber KCCM60167, Monascus purpureus KCCM60016을 사용하였다. 특히 Monascus purpureus KCCM60016으로부터 NTG로 변이처리하여 분리한 Monascus purpureus mutant를 선별 하여 사용하였다. 분양균주 및 분리 변이주를 실시예 1의 방법으로 제조한 증자백미에 포자현탁액(4.6×10⁵spores/㎖)을 접종하여 30℃, 85% 습도에서 15일간 배양하여 각 균주가 생산하는 모나콜린-K 생산능을 비교, 검토하여 균주를 선별하고자 하였으며 상기와 같은 방법에 의한 실험 결과는 하기의 표 1과 같다.

[표 1]

균 주	모나콜린-K(㎎/㎏)
Monascus kaoliang KCCM60154	180
Monascus purpureus KCCM60016	180
Monascus pilosus KCCM60160	ND
Monascus ruber KCCM60167	ND
Monascus purpureus mutant	2,900

실시예 3: [모나콜린-K 정량]

실시예 1에서 얻은 조성물로 하기와 같은 방법으로 모나콜린-K를 정량하였다.

홍국분말 0.2g에 100% methanol 1㎖를 넣어 25℃에서 20분간 sonication한 후 8,000×g에서 10분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 원심분리하여 얻은 침전물에 1㎖의 추출용매를 첨가하여 위와 같은 방법으로 5회 반복하여 모나콜린-K를 추출하였으며 최종추출물을 5㎖로 되게 하였다. 추출물은 최종적으로 HPLC 분석을 위해 syringe filter로 여과하였다.

실험 균주는 미량의 acid form 모나콜린-K를 생산하며 lactone form 모나콜린-K를 다량 생산하므로 본 실험에서는 lactone form 모나콜린-K를 정량하였다. Lactone form 모나콜린-K의 정량을 위해 각각의 추출물 10㎕를 HPLC에 주입하여 분석하였다. 분석 컬럼은 Higgins Analytical CLIPEUS C ₁₈ column 과 Merck LiChrospher 100 RP-18 컬럼을 사용하였으며 전개용매는 acetonitrile :0.1% trifluoacetic acid (60:40)를 사용하여 1㎖/min의 유속으로 전개하여 분석하였다.

분석결과는 표준 모나콜린-K (Sigma-aldrich Co., USA)와 비교하여 각각의 홍국에 함유되어 있는 lactone form 모나콜린-K의 양을 측정하였다.

상기와 같은 방법에 의한 실험의 결과는 도면 1과 같은바, 도면 1로부터 모나콜린-K의 생성량은 배양 3일 이후 급격히 증가하여 배양 15일째 2,900㎎/㎏의 모나콜린-K가 생산되었으며 배양 15일 이후에는 그 함량이 조금씩 감소하는 실험결과를 확인할 수 있다.

실시예 4: [혈중 콜레스테롤 저하효과]

1. 혈중 지질의 함량에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실험동물로 체중 210g 내외의 SD rat을 실험실 환경에서 고지혈증 유발을 위하여 1% cholesterol과 0.25% sodium cholate를 함유한 사료로 4주간 사육한 다음 1주일간 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 1% Tween-80에 녹인 다음 3㎎/㎏, 10㎎/㎏ 및 30㎎/㎏이 되게 needle zone을 사용하여 구강으로 투여하였다.

투여실험이 끝난 rat을 CO₂로 가볍게 마취한 뒤 복부대동맥으로부터 혈액을 채취하고 실온에서 30분간 방치한 후 3000rpm에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분 리하였으며 혈청 중 HDL-C의 함량은 Noma 등의 효소법에 의하여 조제된 kit(sigma, USA)를 사용하여 측정하였고 LDL-C의 함량과 VLDL-C의 함량은 Fridewald 등의 방법에 따라 산출하였다.

2. 상기의 방법에 의한 실험의 결과는 하기 표 2와 같다.

[표 2]

처리농도 (㎎/㎏)	콜레스테롤(㎎/㎗)						동맥경화지수
	총콜레스테롤		HDL		LDL+VLDL		동맥경화지수
	1차 조성물	2차 조성물	1차 조성물	2차 조성물	1차 조성물	2차 조성물	1차 조성물	2차 조성물
정상군	69.8±2.11	69.8±2.11	35.4±2.09	35.4±2.09	41.7±3.46	41.7±3.46	0.97±0.06	0.97±0.06
대조군	110.6±3.40	110.6±3.40	30.1±2.53	30.1±2.53	68.9±13.5	68.9±13.5	2.67±0.20	2.67±0.20
투여군 3㎎/㎏	110.1±3.59	107.2±3.68	30.8±1.72	31.7±1.62	68.2±3.52	65.2±3.45	2.58±0.16	2.67±0.18
투여군 10㎎/㎏	102.3±2.31	93.5±2.12	32.7±1.95	33.9±2.03	53.6±2.67	49.1±2.59	2.13±0.07	1.76±0.06
투여군 30㎎/㎏	91.9±2.46	81.6±2.57	34.4±2.41	35.8±2.50	49.9±2.03	45.6±2.11	1.67±0.09	1.28±0.11

고콜레스테롤 식이를 섭취한 실험군에서는 총 콜레스테롤의 함량이 정상군에 비해 약 58.5% 증가하였으나 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 10㎎/㎏, 30㎎/㎏ 투여 시 고지혈증 유도군에 비하여 1차 배양 조성물의 경우 각각 7.5%, 16.9% 정도 감소하였고, 2차 배양 및 숙성한 조성물의 경우 각각 15.5%, 26.2% 정도 감소하였다.

LDL콜레스테롤 + VLDL콜레스테롤의 함량도 식이성 고지혈증 유도 시 약 65.2% 증가했으나 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 10㎎/㎏, 30 ㎎/㎏ 투여 시 고지혈증 유도군 대비 1차 배양 조성물의 경우 각각 22.2%, 27.6% 정도 감소하였고, 2차 배양 및 숙성한 조성물의 경우 각각 28.7% 및 33.8%가 감소하였으며 혈중 HDL콜레스테롤의 함량도 각각 34.4±2.41㎎/㎗, 35.8±2.50㎎/㎗로 정상군 수준으로 회복되었으며 동맥경화지수도 고지혈증 유도로 정상군에 비하여 약 2.7배 증가되던 것이 본 발명의 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물의 투여로 인하여 현저하게 감소하였음을 확인하였다.

실시예 5: [혈관 및 국소 뇌 혈류량 실험]

1. 혈관에 미치는 효과를 관찰하고자 norepinephrine(ED₅₀)으로 수축을 유발한 rat의 복부 대동맥과 대퇴부 동맥을 이용하여 실험을 수행하였다. 즉 체중 300g 내외의 SD rat을 실험실 환경에서 2주일 이상 사료를 충분히 공급하면서 적응시킨 후 이산화탄소가스를 주입시켜 질식사 시킨 다음 손상이 가지 않도록 절취한 후 혈관의 크기가 4~5㎜가 되게 하여 Magnus법에 따라 Kreb-Henseleit bicarbonate buffer solution이 들어있는 organ bath에 현수하였다. 혈관의 수축력을 측정하기 위하여 각 혈관을 isometric transduce에 연결하여 혈관에 1.5g의 resting tension을 가하였고 근수축력은 physograph로 측정하였다.

Norepinephrine(ED₅₀)에 의한 혈관수축에 상기의 조성물이 미치는 효과를 알아보기 위하여 각 혈관에 norepinephrine(ED₅₀)을 투여하고 organ bath내에는 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물의 농도가 각각 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 35 ㎎/㎏ 및 50㎎/㎏이 되도록 투여하였고 실험은 10회 반복하였다.

2. 국소 뇌 혈류량에 대한 조성물의 효과를 알아보기 위하여 300g 내외의 SD rat을 고형사료와 야채를 충분히 공급하면서 2주일 이상 실험실 환경에 적응시킨 후 stereotactic frame에 고정시키고 정중선을 따라 두피를 절개하여 두정골을 노출시킨 후 brema 4~6㎜ 측방, -2~1㎜ 전방에 직경 5~6㎜의 개두술을 시술하였으며

이때 두개골의 두께를 최대한 얇게 남겨 경막의 출혈을 방지토록 하였다.

Laser-Doppler flowmeter용 needle probe를 대뇌 피질 표면에 수직이 되도록하여 sterotactic micromanipulator를 사용하여 뇌연막 동맥에 조심스럽게 근접시키고 일정시간 안정시킨 후 국소 뇌혈류량을 측정하였다.

3. 국소 뇌혈류량에 대한 발명물의 효과를 살펴보기 위하여 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 각각 0.01㎎/㎏, 0.1㎎/㎏, 1.0㎎/㎏ 및 10.0㎎/㎏의 농도별로 투여하여 국소 뇌혈류량의 변동을 Laser-Doppler flowmeter로 측정하였다.

10마리의 rat을 이용하여 10회 반복 실험하였으며 상기의 방법에 의한 실험의 결과는 하기 표3, 표4와 같다.

[표 3]

처리농도(㎎/㎏)	혈관수축력(%)
	복부대동맥		대퇴동맥
	1차 배양조성물	2차 배양조성물 (숙성완료)	1차 배양조성물	2차 배양조성물 (숙성완료)
Norepinephrine(ED₅₀)	100.00±0.00	100.00±0.00	100.00±0.00	100.00±0.00
Norepinephrine + 5	99.93±1.03	99.88±1.01	100.00±3.10	100.00±2.61
Norepinephrine + 10	99.31±1.17	97.38±1.30	99.38±3.03	96.00±2.40
Norepinephrine + 35	97.28±1.96	86.00±2.17	90.38±4.71	79.17±5.50
Norepinephrine + 50	79.62±2.62	68.75±3.01	5.38±3.12	0.33±2.16

[표4 ]

처리농도(㎎/㎏)	국소 뇌혈류량(%)
처리농도(㎎/㎏)	1차 배양 조성물	2차 배양 조성물(숙성완료)
대조군	100.00±0.02	100.00±0.02
0.01	103.16±0.07	105.26±0.05
0.1	107.04±0.12	111.74±0.06
1.0	117.48±0.08	129.14±0.06
10.0	119.12±0.05	131.86±0.04

Norepinephrine만을 투여한 경우의 혈관 수축력을 100.00%로 했을 때 norepinephrine과 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 각각 5㎎/㎏, 10㎎/㎏, 35㎎/㎏ 및 50㎎/㎏ 혼합했을 때 혈관의 수축력을 감소시킴을 확인하였고 특히 35㎎/㎏ 이상일 때 유의적으로 혈관의 이완작용이 있음을 알 수 있었다.

대조군의 국소 뇌혈류량을 100.00%로 하였을 때 조성물 농도의 증가로 국소 뇌혈류량도 증가하였으며 특히 1.0㎎/㎏ 주사 시에는 국소 뇌혈류량이 유의적으로 증가됨을 알 수 있었다.

실시예 6: [혈압의 측정]

혈압의 측정은 체중 3㎏ 내외의 가토에 pentobarbital sodium(35㎎/㎏)으로 마취시킨 후 우측 경동맥과 좌측 경정맥에 cannular를 삽입하여 이를 transducer에 연결시켜 physiograph에 연결한 뒤, 좌측 경정맥에 삽입된 cannular를 통하여 시료 추출물을 주입하였다. 실험결과는 평균과 표준오차로 표시하였다.

가토를 pentobarbital sodium으로 마취시킨 후 1차 배양 조성물 또는 2차 배양 및 숙성한 조성물을 각각 3㎎/㎏, 10㎎/㎏ 및 30㎎/㎏ 농도로 경정맥에 주입하였을 때 혈압의 변화를 표5에 나타내었다. 조성물의 주입용량을 증가시킬수록 혈압은 용량의존적으로 하강하여 혈압 하강에 효과가 있음을 알 수 있었다.

[표 5]

처리농도(㎎/㎏)	혈압(mmHg)
처리농도(㎎/㎏)	1차 배양 조성물	2차 배양 조성물(숙성완료)
대조군	90.5±3.8	90.5±3.8
3.0	89.8±5.1	83.6±4.7
10.0	84.9±4.9	75.4±5.3
30.0	71.1±5.4	64.7±6.2

본원은 홍국균(Monascus sp.) 배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법이 제공되었는바, 증자한 백미를 배지로 홍국균(Monascus sp.)을 배양하여 모나콜린-K를 생산하고 이러한 방법에 의하여 제조된 홍국균(Monascus sp.)이 함유된 양질의 홍국분말을 생리활성 기능이 많은 쑥에 2차 배양 및 숙성하여 쑥의 기능성이 보강된 콜레스테롤 저하기능이 있는 조성물은 홍국균(Monascus sp.)이 생산한 모나콜린-K와 쑥의 특성을 동시에 지니고 있어 혈중 콜레스테롤 수치의 개선에 도움이 되는 유용한 물질로 활용될 수 있다.

Claims

홍국균(Monascus sp.) 배양에 의한 혈중 콜레스테롤 수치를 개선하는 조성물의 제조방법에 있어서,

분양균주를 배지를 이용, 배양하여 포자현탁액을 제조하는 제1단계;

증자한 백미를 자연 방냉 후 상기에서 제조한 포자현탁액을 접종하여 배양하는 제2단계;

2차 배양배지로서 쑥을 100℃에서 3 ~ 5분 동안 고온 살균처리 하여 쑥 배지를 형성하는 제3단계;

종균인 홍국균이 함유된 홍국분말을 이용하여 쑥 배지에 2차 배양 및 숙성하여 조성물을 수득하는 제4단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 홍국균(Monascus sp.) 배양 조성물의 제조방법.
1항에 있어서,

제1단계에서 포자현탁액 제조는 분양균주를 PDA배지를 이용, 온도 25 ~ 35℃에서 5 ~ 10일간 배양하여 포자 및 균사체를 현탁, 여과하여 포자현탁액을 제조하여 사용하는 것을 특징으로 하는 홍국균 배양 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

제2단계에서 포자현탁액 접종은 포자현탁액을 건조균체량으로 환산하여 0.1 ~ 1.0g/㎏을 25 ~ 35℃, 70 ~ 85% 습도로 15 ~ 25일간 접종하여 배양시키는 것을 특징으로 하는 홍국균 배양 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,

제3단계에서 제공된 살균된 쑥 배지에 70 ~ 95%의 홍국균을 포함하는 홍국분말을 균일하게 혼합하고 25 ~ 35℃의 온도, 70 ~ 85% 습도로 24 ~ 36시간 동안 배양 및 숙성하여 조성물을 수득하는 것을 특징으로 하는 홍국균 배양 조성물의 제조방법.