KR100735800B1

KR100735800B1 - 세포간 부착을 억제하는 분자

Info

Publication number: KR100735800B1
Application number: KR1020050126311A
Authority: KR
Inventors: 김명경; 정재항
Original assignee: 이수앱지스 주식회사
Priority date: 2004-12-20
Filing date: 2005-12-20
Publication date: 2007-07-06
Also published as: WO2006068398A1; EP1957526A4; AU2005319925B2; EP1957526A1; CA2620626A1; AU2005319925A1; CA2620626C; EP1957526B1; KR20060070474A

Abstract

본 발명은 염증 과정에서 세포간 부착을 억제하는 분자 및 이의 염증 관련 질환 치료에의 이용에 관한 것이다.

Bst2 단백질, Damp1 단백질, 가용성 단편, siRNA, 염증 질환

Description

세포간 부착을 억제하는 분자{Molecules inhibiting intercellular adhesion}

도 1은 인간 Bst2와 마우스 Damp1의 서열 유사성을 비교한 도표이다.

도 2는 인간 Bst2 가용성 단편과 마우스 Damp1 가용성 단편의 발현벡터 클로닝과정에 사용된 PCR 프라이머 맵이다.

도 3은 인간 Bst2 가용성 단편과 마우스 Damp1 가용성 단편 단백질을 전기영동한 결과를 보여준다.

도 4는 U937 세포의 동종간 군집 형성 (homotypic aggregation)이 일어나는 동안 Bst2 유전자의 발현 양상을 보여준다.

도 5는 Bst2 과발현이 U937 세포의 동종간 군집 형성 (homotypic aggregation)을 촉진시킴을 보여준다.

도 6은 Bst2 가용성 단편이 U937 세포의 동종간 군집 형성에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 7은 Bst2 가용성 단편이 혈관내피세포인 HUVEC 세포와 U937 세포 간의 부착에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 8은 Bst2 가용성 단편의 HUVEC 세포와 U937 세포 간의 부착에 미치는 농 도의존적 영향을 보여주는 도면이다.

도 9는 Bst2 siRNA가 HUVEC 세포와 U937 세포 간의 부착에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 10은 Bst2 과발현시, Bst2 siRNA 처리가 HUVEC 세포와 U937 세포 간의 부착에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 11은 Bst2 과발현이 Jurkat 세포에서의 군집형성과 인터루킨-2 생산에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 12는 Bst2 가용성 단편과 siRNA가 Jurkat 세포에서의 군집형성에 미치는 영향을 보여주는 도면이다.

도 13은 Bst2 가용성 단편이 Jurkat세포에서 군집형성과 인터루킨-2 생산에 미치는 영향을 그래프화한 도면이다.

도 14는 Bst2 가용성 단편 처리에 의한 침윤면역세포 수의 변화를 보여주는 도면이다

도 15는 Bst2 가용성 단편 처리에 의한 시토카인의 감소를 보여주는 도면이다.

도 16는 인간 Bst2와 마우스 Damp1 단백질간의 기능의 유사성을 살펴본 도면이다.

도 17은 마우스 천식 모델에서 마우스 Damp1 가용성 단편에 의한 사이토카인의 생성 추이를 살펴본 도면이다.

도 18은 Bst2 가용성 단편의 PEG 접합형을 도식한 것이다.

도 19는 PEG 접합형 Bst2의 대사속도 개선을 효과를 살펴본 도면이다.

도 20은 염증관련 질환에서 Bst2 발현 분포를 살펴본 도면이다.

본 발명은 염증 과정에서 세포간 부착을 억제하는 분자 및 이의 이용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 염증에 관여하는 세포의 세포간부착을 억제하는 Bst2 또는 Damp1 단백질과 이들의 단편, siRNA, 이를 포함하는 염증 관련 질환의 예방 또는 치료 조성물 및 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.

염증은 감염, 상처 또는 질병에 의해 조직을 보호하기 위해 체내에서 일어나는 정상적인 반응이다. 염증 반응의 첫 단계는 자극을 받은 조직 내의 세포에서 화학적 물질의 생산과 분비 과정이다. 이들 화학 물질은 홍반, 부종, 통증, 발열 및 기존 기능 상실을 유도한다. 염증 반응을 보이는 조직 내 세포들으로부터의 신호에 의해 백혈구 (leukocytes)들이 염증 부위로 모여들게 된다. 백혈구는 순환계로부터 염증진행 부위로 이주할 수 있도록 내피세포에 부착할 수 있어야 한다. 또한, 백혈구는 정상의 특이적인 면역반응이 일어날 수 있도록 항원 제공세포 (antigen-presenting cells)에 부착하여야 하며 최종적으로 백혈구는 병원균 감염세포 또는 암세포 등의 용해가 일어날 수 있도록 적절한 표적세포에 부착하여야 한 다. 모여든 백혈구들은 상처받은 조직에서 감염원 또는 상처 유발원을 제거하고 공격받은 세포들의 잔해를 제거하게 된다.

정상적인 염증의 경우 침윤한 백혈구는 공격한 미생물 또는 죽은 세포들을 잡아먹음으로써 조직 재생과 면역반응에 중요한 역할을 수행한다. 그러나, 병적인 만성 염증에서는 침윤한 백혈구들이 심각하거나 치명적인 상태를 유발하게 된다. 자기 세포를 외부체로 비정상적인 인식을 하거나 염증반응의 지속적인 유지 등에 의한 과도한 염증은 당뇨, 동맥경화, 백내장, 재관류 손상 (reperfusion injury), 감염성 수막염 (infectious meaningitis), 류마티스 관절염, 천식, 패혈증, 염증장병, 다발성경화증 등의 다양한 염증성 질환을 유발하게 된다.

백혈구 (leukocytes)와 내피세포간의 상호작용을 살펴보면 다음과 같다:

백혈구는 혈액에서 순환하거나 특정 세포에 부착하는 형태로 작용하는 이중 기능을 가지고 있다. 특히 부착형태의 백혈구의 작용은 내피세포 (endotherlial cells)와 상호 작용하거나 항원제공세포와의 세포간의 부착을 안정화시키거나 또는 작동 세포 (effector cell)로서 작용함으로써 염증 또는 감염 부위로 이동하게 된다. 백혈구는 정상의 특이적인 면역반응이 일어날 수 있도록 항원 제공세포에 부착하여야 하며 최종적으로 백혈구는 병원균 감염세포 또는 암세포 등의 용해가 일어날 수 있도록 적절한 표적세포에 부착하여야 한다. 광범위한 백혈구 침윤은 동 종이식 거부 (allograft rejection), 피부 감염 또는 상처 부위에서 일어나며 또한 골관절염 등의 퇴행성 관절 질환, 건선, 다발성경화증, 천식, 류마티스성 관절염, 접촉성 피부염, 염증 장염 등의 질환에서 관찰되어진다.

이들 질환에서 골수세포 (myeloid cell)의 95% 이상이 염증부위로 이동하여 모이게 된다. 백혈구는 염증반응에서 중요한 역할자로서 항균, 분비 및 포식세포 활성을 수행한다. 이들은 수용성 매개체의 생산 또는 다양한 각 세포 특이적 부착을 통해 염증 반응이 일어나거나 필요한 조직으로 모여들게 된다. 실제로 비스테로이드계 항염증 약제 (nonsteroidal anti-inflammatory drugs: NSAIDs) 또는 글루코코티코이드와 같은 소염제들은 백혈구의 부착 및 유입을 막음으로써 치료작용을 보인다. 동물 모델에서의 이들 세포간부착 억제는 자가면역 동물모델에서의 질환 또는 동종이식 거부를 개선하거나 막는다. 최근에 LFA-1/ICAM-1 또는 VLA-4/ VCAM-1 상호작용을 억제하는 인간화 단클론 항체의 임상연구는 건선, 다발성 경화증 또는 염증장병 등의 자가면역질환의 유의성 있는 효능과 좋은 안정성 양상을 보여주고 있다.

백혈구의 내피세포 침윤은 염증 관련 병리학의 원인으로 백혈구 부착과 내피세포 표면과의 결합으로 시작되는 다단계 과정에 의해 일어난다. 백혈구와 내피세포 표면의 결합은 백혈구와 내피세포 표면에 있는 세포 표면 분자들에 의해 이루어지는데 [Bevilacqua, J. Clin . Invest . 11:767-804, 1993] 이들은 혈류로부터 백혈구 이동의 결과로 과발현되어진다.

백혈구의 내피세포와의 상호작용은 많은 염증질환에서 중요한 요인이다. 예 를 들면, 간의 미세관류 (microperfusion) 질환을 유도하는 백혈구와 내피세포 간의 상호작용의 증가는 패혈증 환자에서 간 기능 상실의 중요한 요인으로 제시되어지고 있다 [Croner 외., Microvasc . Res . 67:182-191, 2004]. 예를 들어 동맥경화는 전형적인 염증 질환으로 동맥경화 부위에서는 T 림프구와 활성화된 대식세포를 포함한 염증세포 수가 많이 밀집되어 있다. 동맥 내피의 특정 부위에서 단핵구(monocyte)의 축적과 부착은 동맥생성 (atherogenesis)에서 초기에 인지할 수 있는 여러 현상 중 하나로서 동맥 경화 발병기전의 가장 중요한 현상이다 [Ross, Nature 362:801-809, 1993]. 이 부위에서는 지엽적인 염증반응을 조절하는 인터페론 감마와 종양괴사인자 알파 (tumor necrosis factor-α)를 포함한 염증 유발 (proinflammatory) 시토카인이 풍부하기도 하다. 단핵구세포 표면에는 여러 부착 분자가 상당수 발현되어 있으며 [Valente 외, Circulation 86:III20-25, 1992] 동맥경화 부위 내피세포들도 혈관성 리간드를 다수 발현하고 있다 [Poston 외, Am . J. Pathol , 140:665-673, 1992].

백혈구의 내피 장벽을 통한 혈관 밖 유출 (extravasation)은 류마티스성 관절염과 같은 염증 질환의 발병 기전에서 중요하다. 내피세포들은 관절염의 기본 기전에 관여하며 다양한 염증 매개체인 종양괴사인자 알파와 인터루킨-1 베타와 같은 염증 유발 시토카인이 내피세포들을 활성화시킨다. 류마티스성 관절염에서 그 반응으로 내피세포 분자들 (endothelial cell adhesion molecule)의 발현 증가로 백혈구-내피세포 간의 상호작용이 증가하게 된다. 천식 소견의 중요한 단계 또한 백혈구의 혈관 내피세포로의 동원(recruitment)이다.

천식에서 기도에서의 단핵구세포의 표현상 특성과 함께 활성화된 호산구 (eosinophil), CD25 양성 T 림프구 (CD25-positive T lymphocytes), 미성숙한 대식세포의 수가 증가한다. 내피세포, 대식세포와 다른 침윤 세포에서 HLA 클래스 II의 발현이 증가되어진다 [Arm 외, Adv. Immunol . 51:323-382, 1992].

혈뇌장벽(blood-brain barrier)을 관통하는 백혈구 이동의 증가 비율은 다발성 경화증의 현저한 증상이다. 백혈구 치밀이음부 (tight junction)와 내피세포 치밀이음부 단백질 사이의 상호작용이 생리학적 조건에서 중추신경계로의 백혈구 혈관 밖 유출 (extravasation)에 기여하고 치밀이음부 단백질의 변화된 발현이 다발성 경화증의 병리학적 조건에 있음이 제시되어지고 있다 [Worthylake 외, Curr . Opin . Cell Biol . 13:569-577, 2001].

이와 같이 다양한 질환에서 백혈구와 내피세포의 부착이 중요하기 때문에 항체 또는 펩티드 억제제를 사용한 세포간 부착 억제 치료법은 많은 염증 및 면역 질환에서 새로운 치료전략으로 떠오르고 있다.

염증현상을 분자생물학적 측면에서 살펴보면 다음과 같은 분자들이 관여한다:

시토카인 ( cytokines ): 전신성 염증은 심각한 박테리아 감염 또는 외상에 대한 일반적인 반응으로 초기 손상으로부터 원거리에 있는 조직 시스템에 영향을 미칠 수 있다 [Lush 및 Kvietys, Microcirculation 7:83-101, 2000]. 영향을 받은 조직으로부터 분비된 박테리아 산물과 다른 염증유발 매개체가 종양괴사인자 알파, 인터루킨 1 베타, 감마 인터페론, 인터루킨 6 등의 염증유발 매개체 형성을 유도한다. 패혈증에서 혈관 내피 상처는 종양괴사인자와 인터루킨 1 베타의 생산을 촉진한다. 이들 시토카인은 내피세포에 직접 작용함으로써 백혈구 부착을 증진시킨다 [Pober 외, J. Immunol. 137:1893-1896, 1986; Dustin 및 Springer, J. Cell Biol . 107:321-331, 1988; Cotran and Pober, J. Am . Soc . Nephrol . 1:225-235, 1988]. 또한 이들 시토카인은 혈중 호중구 (neutrophil)와 혈관 내피를 활성화시킨다 [Arai 외, Annu Rev Biochem , 59:783=836, 1990]. 예를 들면, 종양괴사인자 알파는 자가분비 또는 국소 분비 경로를 통하여 일련의 시토카인, 케모카인 및 단백질 분해 효소들을 유도한다 [Ghezzi 및 Cerami, Methods Mol . Med . 98:1-8. 2004]. 인터루킨 6는 부착분자 발현을 통한 단핵구세포-내피세포간상호작용 및 염증 상처를 유도함으로써 동맥경화를 일으키는 과정들을 발생시킨다. 인터루킨 6의 증가한 혈중 농도는 혈관 염증과 동맥경화의 발달과 관계되어진다 [Rader, N. Engl . J. Med. 343:1179-1182, 2000]. 인터루킨 17은 염증반응의 많은 매개체들의 발현을 유도하는데 이들 매개체는 호중구의 분화, 성숙 및 화학주성 (chemotaxis)에 관여한다 [Witowski 외, Cell Mol Life Sci . 61:567-579, 2004]. 인터루킨 17의 증가된 양은 기도 염증, 류마티스성 관절염, 복강농 (intraperitoneal abscesses)과 유착, 염증장병, 동종이식 거부, 건선, 암 및 다발성 경화증 등의 병증과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있다.

세포표면유착분자 (cell surface adhesion molecules): 다수의 염증 유발성 시토카인은 내피 세포 표면에 내피-백혈구 유착분자들 (ELAMs: Endothelial cell-lymphocyte adhesion molecules)의 발현을 유도한다 [Nortamo 외, Eur . J. Immunol . 21:2629-2632, 1991]. 이들은 크게 세포간 유착분자 1 (ICAM 1: Intercellular adhesion molecule 1)군과 내피-백혈구 유착분자 1 (ELAM 1: Endothelial cell-lymphocyte adhesion molecule 1)군의 두 가지 범주로 나누어진다 [Staunton 외, Cell 52:925-933, 1988]. 다양한 매개체 작용의 결과로 이들 특정 세포 표면 당단백질들은 혈관 내피에 발현되어진다. 백혈구 세포의 결합과 혈관 밖 유출은 특정 리간드 또는 상대 수용체 (counter receptor)와의 상호작용을 통해 이루어진다 [Bevilacqua 외, 1993, 1994]. 이 과정에 관여하는 분자들로는 CD18 분자 (CD18)의 리간드인 세포간 유착분자 1 (ICAM 1: Intercellular adhesion molecule 1), 백혈구 표면 당 접합체를 인식하는 셀렉틴 (selectins)과 백혈구 인티그린 분자 (integrin)와 작용하는 면역글로블린 슈퍼패밀리 (상과, superfamily)에 속하는 분자들이 있다 [Panes 외, J. Physiol . 269:H1955-1964, 1995; Khan 외, Microcirculation 10:351-358, 2003; Nelson 외, Blood 82:3253-3258, 1993, Bevilacqua 및 Nelson, J. Clin . Invest . 91:379-387, 1993]. 백혈구 로울링 (rolling)은 셀렉틴에 의해 조절되며 백혈구의 내피 이행 (transmigration)과 내피 부착작용은 베타2 인티그린 분자인 맥1 (Mac-1; CD11b/CD18, aMb2, CR3)와 LFA-1분자에 의해 이루어진다. Mac-1과 LFA-1 분자는 내피 세포 표면에 발현되는 상대 수용체인 세포간 유착분자 1 (ICAM 1)과 상호 작용한다.

현재 개발 중인 염증 치료법을 살펴보면 다음과 같다:

최근 리뷰에 의하면 [Ohmori 외, Nippon Yakuraigaku Zasshi 123:335-348, 2004], 새로운 항 알레르기 치료법 개발이 소개되고 있다. 각 치료제로는 T 보조세포 서브타입 2 시토카인에 대한 항체, 디코이 수용체 (decoy receptor), 항 수용체 항체, 항 면역글로블린 E 항체, 항 세포 부착 분자 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 각질세포 조정자 (keratinocyte modulator), 세포내 조절효소의 억제제, 항 히스타민 제제 등이 소개되고 있다. 이들 대부분은 알레르기성 염증의 다양한 구성요소들을 억제하는 것을 기본원리로 삼고 있다. 현재 의사들은 류마티스성 관절염 1차 처방으로 아스피린과 이부프로펜과 같은 항염증제제의 간헐적 또는 정기적 처방을 내리며 처방에 저항성을 보이는 환자들에게 신체의 면역시스템에 영향을 주는 항 류마티즘 제제 (DMARDS: disease-modifying anti-rheumatic drugs)인 독성 제제를 처방하는 단계별 상승법 치료를 시행하고 있다.

Nakashima 박사는 염증성 질환인 AAA (abdominal aortic aneurysm)의 진전이 NF-κB와 Ets의 두 유전자에 대한 카이메라 올리고 데옥시뉴클리오티드 처리에 의해 억제될 수 있음을 쥐 모델에서 보여주었다. FasL분자에 의한 폐 염증의 마우스 모델에서 재조합 FasL을 폐로 주입하였을때 호중구 침윤과 염증 전구매개체의 급속한 증가 등이 관찰되어졌다. 또한 FasL 억제제인 DcR3 analogue (decoy receptor 3 analogue)등의 전처리는 기도로의 호중구 침윤을 감소시키고 결과적으로 기관지 폐포세척 (BAL: bronchoalveolar lavage)에서 GM-CSF (granulocyte macrophage colony stimulating factor)와 MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2)의 발현이 현저히 감소되어졌다.

염증치료 관련 선행기술을 살펴보면 다음과 같다:

US5367056 특허는 ELAM 수용체 또는 리간드의 결합을 막는 분자 또는 분자의 단편을 처리함으로써 PMN 세포의 내피세포의 결합 억제에 관한 기술을 제시하고 있다. 이 기술은 ELAM 발현을 억제하기 위한 안티센스 핵산과 리보자임의 용도 또한 언급하고 있다. 이 발명은 ELAM과 그 리간드의 결합을 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법도 포함하고 있으며 ELAM과 그 리간드에 대한 항체의 개발도 포함되어져 있다.

US5863540 특허는 T 세포의 활성을 억제할 정량의 CD44 단백질 펩티드 또는 유도체를 투약하여 T 세포의 활성을 억제하는 기술이 관련되어져 있다. 또한 CD44 단백질 펩티드 또는 유도체의 정량을 투약하여 CD44분자가 매개하는 세포 부착 또는 단핵구의 인터루킨 1 분비를 억제하는 기술도 제시되어져 있다. 아울러 CD44 단백질 펩티드 또는 유도체와 접합된 제제 및 세포독성 물질을 투약함으로써 염증부위로 특정 제제 및 세포독성 물질을 전달하는 방법이 포함되어져 있다.

US5912266 특허는 세포 표면 분자인 베타 서브2 인티그린에 의해 매개되는 세포간 부착을 억제하는 기술에 관한 것이다. 이 억제 작용을 통하여 당 발명의 용도와 약제 성분이 세포부착에 관련된 염증 또는 다른 병리학적 반응을 억제하거나 치료하는 데 유용하게 작용하게 된다. 또한 당 발명은 백혈구와 림프구가 세포/조직의 상처를 유도하는 병리학적 상태를 억제 또는 치료하는 것과 밀접한 관계가 있다.

WO03026692 특허는 만성적인 관절 염증과 류마티스성 관절염 환자에서 CD3항원복합체에 대한 항체의 치료적 용도에 관한 것이다.

EP1304379 특허는 CD18항원과 결합할 수 있는 항원결정기의 일부 또는 전체를 포함하는 인간화된 항 CD18 항체에 관한 기술이다.

US6689869 특허는 패혈증 및 감염성/비감염성 외상에서 백혈구의 폐와 다른 기관 내 침투를 억제하는 치료에 있어서의 항 CD18 인간화 항체의 용도에 관한 것이다. 항 CD18 인간화 항체는 내독소성 쇼크 또는 성인 호흡기 곤란증후군 환자에서 백혈구의 폐 또는 다른 기관으로의 침투를 억제하는 데 사용될 수 있다. 이 항체는 천식 또는 혈전용해 치료 후 백혈구 매개 재관류 손상 (reperfusion damage)의 경우 치료용도로 투여될 수 있다. 또한 이 항체는 항암 화학적 요법 중 환자에게 치료제의 투여를 돕거나 항 감염 제제를 투여받는 환자에서 염증을 경감시키거 나 없애는 용도로 투여될 수도 있다.

US5821336 특허의 발명은 염증 매개체의 전구체 또는 매개체인 160kDa 분자량의 폴리펩티드, 돌연변이 및 단편을 포함한 유도체 및 그 생산 공정에 관한 것이다. 이 폴리펩티드를 코딩하는 염기서열과 그를 포함한 벡터, 이 폴리펩티드 또는 각 유도체에 대한 항체 및 항체 유도체 등이 권리범위에 포함되어 있다. 아울러 상기 항체 및 항체 유도체를 이용한 염증 증상과 호지킨 림프종의 진단 및 치료용도가 포함되어져 있다.

염증반응에서는 백혈구를 비롯한 면역세포들이 반응부위로 모여들기 위해 (1) 면역세포들 간 부착을 통한 군집형성이 필요하며, (2) 군집 형성된 면역세포들이 이동하여 모여든 염증부위에서 면역세포와 내피세포간의 부착을 통해 침윤된 내피세포로 관련 신호들을 증폭시키고, (3) 마지막으로 염증반응을 증폭시키기 위해 T 림프구의 활성으로 인터루킨-2 등의 시토카인 분비가 일어난다.

본 발명자는 염증 현상에 중요한 면역세포 동종간 또는 면역세포와 내피세포 이종간의 결합을 Bst2 또는 Damp1 단백질이 매개한다는 것을 밝혀내었으며, 앞서 기술한 염증반응의 주요 3 단계에서 이들 단백질의 안타고니스트가 염증 관련 질환의 치료에 사용될 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

발명의 요약

본 발명의 하나의 목적은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Bst2 단백질 또는 이의 단편을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Damp1 단백질 또는 이의 단편을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Bst2 단백질, Damp1 단백질 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 핵산을 포함하는 벡터를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하여 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Bst2 또는 Damp1 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하고 Bst2 또는 Damp1 특이적 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하여, 세포간 결합을 억제하여 염증 억제효과를 가지는 siRNA 핵산 분자를 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 siRNA 핵산 분자를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료 조성물을 제공하기 위함이다.

본 발명의 또 다른 목적은 Bst2 또는 Damp1 단백질에 의한 세포간 결합을 억제하는 물질을 투여하여 염증 반응을 억제시키는 방법을 제공하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 염증 과정에서 세포간 결합에 관여하는 Bst2 (Bone marrow Stromal Antigen-2) 단백질 및 Damp1 단백질에 대한 안타고니스트를 제공한다.

본 발명자는 Bst2 유전자가 (1) 면역세포간의 군집형성에 미치는 영향을 보기 위해서 인간 단핵성 세포주인 U937 세포의 동종간 군집형성모델을 이용하고, (2) 면역세포와 내피세포 간의 상호결합에 미치는 영향력을 보기 위해 U937세포와 HUVEC 세포 이종 간 군집형성모델을 이용하며, (3) T 림프구의 활성에 미치는 Bst2 유전자의 영향을 관찰하기 위해서 T 림프구 Jurkat 세포 모델을 도입하였다. 그 결과 임파구가 염증 반응 동안에 염증 부위로 이주하여 세포와 상호작용할 수 있도록 세포의 기질을 인지하고 이에 부착하는 과정에 Bst2 단백질이 관여한다는 것을 밝혔으며, 나아가 Bst2 단백질의 안타고니스트가 이러한 세포간부착을 효과적으로 억제하여 염증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 밝혔다.

Bst2 단백질은 골수 간질세포 (bone marrow stromal cell)에서 최초로 밝혀졌으며 세포의 분화 및 증식에 관여할 것으로 추정하고 있다. 1995년 Bst2의 cDNA가 클로닝되었으며 인간 염색체 상 19p13.2에 위치하고 있다 [Ishikawa 외, Genomics 26:527-534, 1995]. Bst2 유전자는 5개의 엑손과 4개의 인트론으로 구성되어져 있으며 180개의 아미노산으로 구성된 30 내지 36 kDa 크기의 제 2 형 막 단백질이다 [Ohtomo 외, Biochem . Biophys . Res . Commun . 258:583-591, 1999]. 인간 Bst2 유전자의 마우스 유사체 Damp1 유전자는 인간 유전자와 45%의 DNA 서열 동일성을 보이고 있으며 40% 이하의 아미노산 서열 유사성을 보이고 있다. Bst2 단백질은 간, 폐, 심장 및 태반에서 주로 발현되며 췌장, 신장, 뼈/근육 및 뇌에서 소량 발현되어지는 것으로 알려져 있다. 섬유모 세포주에서 Bst2의 발현은 마우스 골수 유도 B 전구세포에서 간질세포 의존적 성장을 가속화시킨다. 이 결과는 Bst2가 B 전구세포의 성장을 조절하거나 류마티스성 관절염에서 B 세포의 활성화에서 중요한 역할을 수행할 수 있음을 제시하고 있다. 또한 Bst2는 구강암, 유방암, 샘종 (adenoma) 및 자궁경부암과 같은 일련의 암종에서 과발현되어지는 것으로 알려져 있다.

Bst2 단백질과 관련하여 이의 유전자의 분리와 발현 (EP1033401), 이의 암진단에의 이용 (WO01/57207 및 WO 01/51513)이 보고되어 있다.

본 발명에서 용어, “Bst2 또는 Damp1 안타고니스트”는 Bst2 또는 Damp1 단백질이 염증을 유도하는 기작에 작용하는 활성을 억제, 차단, 감소시키는 물질을 의미한다. 안타고니스트가 작용하는 기작은 특별히 한정되지 않는다. Bst2 또는 Damp1의 전사, 번역 등 유전자 발현에 영향을 주는 물질, 활성형 단백질을 비활성형의 형태로 전환시키는 물질 등을 예로 들 수 있다. 이런 안타고니스트에는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 고분자 화합물; 및 복수 화합물의 복합체 등이 있다.

하나의 구체적 양태에서, 안타고니스트는 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 또 다른 구체적 양태에서, 안타고니스트는 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Damp1 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

Bst2 또는 Damp1 단백질은 세포질 (cytoplasm) 도메인, 트랜스막 (transmembrane) 도메인 및 세포막 외부 도메인으로 구분되며, 세포막 내부 도메인은 세포질 및 트랜스막 도메인을 포함한다. “Bst2 단백질 단편” 또는 “Damp1 단백질 단편”은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 한 이의 형태는 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 세포막 내부 도메인 (intracelllular domain) 전부 또는 일부가 결실된 Bst2 또는 Damp1 단백질이다. Bst2 단백질 단편의 구체적인 예시로서, 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 Bst2 단백질 단편을 들 수 있다. 또한, Damp1 단백질 단편의 구체적인 예시로서, 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 Damp1 단백질 단편을 들 수 있다. 상기의 가용성 Bst2 단백질 단편 및 Damp1 단백질 단편이 Bst2 또는 Damp1에 의해 유도되는 세포간 결합을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 본 명세서에서, “가용성 단편”, “가용성 단백질”, “가용성 단백질 단편” 및 “데코이(decoy) 단백질"는 상호교환적으로 사용되었다.

본 발명의 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 변이체란 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편이 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질 또는 이에서 유래한 단편을 의미한다. 예들 들어, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

또한, 본 발명에서 제공하는 단백질 또는 이의 단편은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 단백질의 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다.

경우에 따라 단백질 또는 단편은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

이러한 변이체는 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 등가물 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다.

세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 또는 Damp1 단백질, 이들의 단편, 또는 이들의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer . chem . Soc . 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook 외, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989). 유전자 재조합 기술을 이용할 경 우, 상기 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 이들의 단편, 또는 이들의 변이체를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 단백질 또는 이의 단편이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 단백질 또는 단편을 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

본 발명에서 제공하는, 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편은 단량체 또는 다량체 형태이다. 다량체는 당 분야에서 통상적으로 제공하는 다양한 방법으로 형성될 수 있으며, 다량체를 형성하는 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예들 들어, 다량체는 다량체 형성을 유도하는 여러 가지 서열, 구체적으로, trimer 형을 유도하는 isoleucine zipper(ILZ) 서열, dodecamer 형성을 유도하는 SP-D(surfactant protien-D) 등의 서열을 이용하여 제조할 수도 있다, 또는, 다량체는 링커 등을 이용하여 단량체로 제조된 폴리펩타이드를 2 이상의 다량체로 결합시키는 방법으로 제조될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 또한, 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다.

상술한 바와 같은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질 또는 단편을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, “벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.

본 발명에서 용어, “작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열, tPA(tissue plasminogen activator) 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO₄) 침전, 염화 칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.

숙주 세포에서의 단백질 발현을 위한 시스템은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균 (예를 들어, 아스페르길러스 (Aspergillus)), 효모 (예: 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애 (Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 (Schizo saccharomyces), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 또한, 유전공학적으로 조작된 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 예들 들어, 인간화된 당쇄를 가지도록 단백질의 프로세싱에 관여하는 효소를 조작시켜 유전적으로 변형된 당쇄 수식경로를 보유하는 균주를 숙주세포로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하여 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 제조하는 방법을 제공하기 위함이다.

Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

숙주세포에서 발현시킨 단백질 또는 이의 단편은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편을 정제할 수 있다.

상기 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편은 비펩타이드성 중합체로 개질될 수 있다.

하나의 다른 구체적 양태로서, 안타고니스트는 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

또 다른 구체적 양태로서, 안타고니스트는 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어, “개질”이란 비펩타이드성 중합체가 Bst2 단백질, Damp1단백질 또는, 이들의 단편에 결합되는 과정을 일컫는다.

본 발명에서 사용된 용어, “비펩타이드성 중합체”란 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 의미하며, 이러한 비펩타이드성 중합체의 예로는, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG: polypropylene glycol), 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체(co-poly(ethylene/propylene) glycol), 폴리옥시에틸렌 (POE: polyoxyethylene), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리포스파젠 (polyphosphazene), 폴리사카리드 (polysaccharide), 덱스트란 (dextran), 폴리비닐 알코올 (polyvinyl alcohol), 폴리비닐 피로리돈 (polyvinyl pyrrolidones), 폴리비닐 에틸 에테르 (polyvinyl ethyl ether) 폴리아크릴 아미드 (polyacryl amide), 폴리아크릴레이트(polyacrylate), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산(hyaluronic acid), 헤파린 (heparin) 등이 있다. 바람직한 비펩타이드성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다.

비펩타이드성 중합체와 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편과의 결합은, 공유 결합과 수소결합, 이온결합, 반데르발스 친화력, 소수성 상호작용 같은 종류의 모든 종류의 비공유 결합을 포함한다. 바람직하게는, 중합체는 특정 반응기를 통하여 단백질과 연결되며, 중합체의 이러한 반응기에는 알데히드(aldehyde) 그룹, 프로피온 알데히드 그룹, 부틸 알데히드 그룹, 말레이미드(maleimide) 그룹, 케톤 (ketone) 그룹, 비닐 설폰 (vinyl sulfones) 그룹, 티올 (thiol) 그룹, 하이드라지드 (hydrazide) 그룹, 카르복닐디미다졸 (CDI: carbonyldimidazole) 그룹, 니트로페닐 카르보네이트 (NPC: nitrophenyl carbonate) 그룹, 트리실레이트 (trysylate) 그룹, 이소시네이트(isocyanate) 그룹, 석시니미드 (succinimide) 유도체 등이 있다. 비펩타이성 중합체는 폴리펩타이드의 아미노 말단, 카르복실산 말단, 아미노산 잔기 측쇄의 반응기(예들 들어, 라이신 잔기, 히스티딘 잔기 또는 시스테인 잔기의 반응기)와 반응하게 된다.

세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편은 비펩타이드성 중합체와 1: 1 이상의 몰비로 결합된다. 바람직하게는, 1: 1 내지 1: 10, 보다 바람직하게는 1: 1 내지 1: 2의 몰비로 결합된다. 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2, Damp1 단백질, 또는 이들의 단편이 하나 이상의 비펩타이드성 중합체로 개질되는 경우 비펩타이드성 중합체는 상이한 종류의 것일 수 있다.

비펩타이드성 중합체의 개질을 통하여 단백질은 생체내 안정성 및 대사속도를 개선시킬 수 있다.

또 다른 구체적 양태에서, 안타고니스트는 Bst2 또는 Damp1 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하고 Bst2 또는 Damp1 특이적 RNA 간섭(RNA interference)을 유도하여, 세포간 결합을 억제하여 염증 억제효과를 가지는 siRNA 핵산 분자를 포함한다.

본 발명에서 용어, "siRNA“란 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 Bst2 또는 Damp1 특이적인 siRNA를 제공한다.

상기 siRNA는 바람직하게는 10 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이를 가지는 핵산 분자이다. 보다 바람직하게는 20 내지 30개, 보다 더 바람직하게는 19 내지 25개 뉴클레오타이드 염기쌍을 갖는다.

본 발명의 구체적인 양태에서는, 서열번호 18 내지 40의 염기 서열을 가진 서열에 의해 발현되는 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하는 Bst2 특이적 siRNA 를 제작하였다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 일반적으로, Bst2 또는 Damp1의 mRNA과 90% 이상의 상보성을 갖는 것이 바람직하다.

siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기 , 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적 유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 트란스펙션 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 siRNA는 이의 유입을 촉진시키는 제제 예를 들어, 리포좀 (미국특허 제4,897,355호, 제4,394,448호, 제4,235,871호, 제4,231,877호, 제4,224,179호, 제4,753,788호, 제4,673,567호, 제4,247,411호, 제4,814,270)을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다.

또 다른 구체적 양태에서, 안타고니스트는 Bst2 또는 Damp1의 mRNA에 특이적인 안티센스 핵산 분자를 포함한다.

본 발명에서 용어 "안티센스 핵산”이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 특징이 있다. 본 발명의 안티센스 서열은 Bst2 또는 Damp1의 mRNA에 상보적이고 Bst2 또는 Damp1의 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고 Bst2 또는 Damp1의 mRNA의 번역, 세포질내로의 전위 (translocation), 성숙 (maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 활성을 저해할 수 있다.

상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다 (De Mesmaeker 외, Curr Opin Struct Biol., 5(3):343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-me 피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다 (미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 RNA의 경우 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 RNA를 합성하는 한 예는 RNA 폴리머라제Ⅰ을 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편; 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편; Bst2 또는 Damp1 특이적인 siRNA 핵산 분자; 및 Bst2 또는 Damp1 특이적인 안티센스 핵산 분자에서 하나 이상 선택되는 물질을 포함하는 염증 질환을 예방 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "예방"이란 조성물의 투여로 염증 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에서 용어, "치료"란 조성물의 투여로 염증 질환이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, “염증 질환”은 홍반, 부종, 압통, 통증, 열, 및 기능상 실의 증후를 갖는 상태(물리적, 화학적 및 생물학적 상태)의 유해한 영향에 대한 생체의 방어 반응 또는 염증성 반응에 의해 유발된 모든 질환을 의미한다. 본 발명의 조성물을 이용하여 Bst2의 과발현이 유도되는 모든 염증 질환의 예방 또는 치료가 가능하다. 실제 Bst2가 천식, 아테롬성 동맥경화, 류마티스성 관정염, 건선, 크론씨병, 궤양성 대장염 등의 다양한 염증 질환에서 과발현되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 조성물로 예방 및 치료가 가능한 질환은 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 패혈증, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 급성 심근경색, 심장 발작, 건선, 접촉성 피부염, 골관절염, 비염, 크론씨병 및 자가면역질환 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 인간뿐만 아니라 염증 질환을 가지고 Bst2 또는 Damp1의 투여에 의해 염증 질환이 억제 또는 감소될 수 있는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 가축에게도 사용될 수 있다. 이런 맥락에서, 본 발명자는 인간 Bst2와 마우스 Damp1이 기능적 유사성을 보이고 동일한 기원의 세포뿐만 아니라 다른 기원의 세포에서도 작용하는 것을 확인하였다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질병 종류, 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 투여될 수 있으며, 경구 투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소 투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릴시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 조성물은 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등에 비경구적으로 사람과 동물에게 투여된다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사 및 정맥주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다. 이외의 본 발명 약제학적 조성물은 각종 제형의 형태로 통용되는 기법에 따라 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 Bst2 또는 Damp1 단백질에 의한 세포간 결합을 억제하는 물질을 투여하여 염증 반응을 억제시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 용어, Bst2 또는 Damp1 단백질에 의한 세포간 결합을 억제하는 물질은 Bst2 또는 Damp1 단백질의 안타고니스트를 의미하며, 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물; 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 고분자 화합물; 및 복수의 화합물의 복합체 등을 포함한다. 구체적으로 물질은 상기한, 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편; 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편; Bst2 또는 Damp1 특이적인 siRNA 핵산 분자; 및 Bst2 또는 Damp1 특이적인 안티센스 핵산 분자를 모두 포함한다.

염증 반응의 억제를 통하여 상기에서 언급한 염증 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편; 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Bst2 단백질 또는 이의 단편; 및 비펩타이드성 중합체로 개질된 세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는 Damp1 단백질 또는 이의 단편 중에서 하나 이상 선택되는 단백질을 환자에게 투여하여 염증 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

또 다른 구체적인 양태로서 본 발명은 Bst2 또는 Damp1 mRNA에 상보적인 안티센스 가닥의 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥을 포함하는 Bst2 또는 Damp1 특이적 RNA 간섭을 유도하는 siRNA 핵산 분자; 또는 Bst2 또는 Damp1 mRNA에 특이적인 안티센스 핵산 중에서 하나 이상 선택되는 핵산을 환자에게 투여하여 염증 질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 세포 배양

인간 단핵성 세포주 U937 (ATCC, U.S; Cat. CRL-1593.2)를 10% 우태아혈청 (Gibco-BRL), 100 U/ ml 페니실린 (Gibco-BRL), 100 μg/ml 스트렙토마이신 (Gibo-BRL)이 포함된 RPMI-1640 (Gibco-BRL) 을 배지로 사용하여 5% CO₂와 37℃ 조건하에서 부유 배양하였다.

인간 태반혈관 내피세포주인 HUVEC (human umbilical vein endothelium cell, Cambrex, U.S.; Cat. CC-2517A)을 10% 우태아혈청이 든 EGM-2 배지 (Cambrex, U.S.)를 사용하여 5% CO₂와 37℃ 조건하에서 계대배양을 했다. 하기 실험들에서 실험 16시간 전에 전처리로 우태아혈청 농도를 10%에서 0.5%로 낮추어 주었다. 조건에 따라 인간 재조합 인터페론 감마 (10 ng/ml, Cambiochem, U.S.)와 PMA (1 ng/ml, Cambiochem) 또는 배지를 일정시간 동안 처리한 후 각 실험들이 이루어졌다. 마우스 단핵성 세포주 WEHI-274.1 (ATCC, Cat. CRL-1679)과 마우스 내피세포주 SVEC 4-10 (ATCC, Cat. CRL-2181)을 배양하여 상기의 인간 세포주와 동일한 방법으로 전처리하였다.

인간 T 림프구 Jurkat 세포주 (ATCC, TIB152 clone)를 10% 우태아혈청, 100 U/ ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 RPMI-1640 (Gibco-BRL)을 배지로 사용하여 5% CO₂와 37℃ 조건하에서 부유 배양하였다.

단백질 발현과 정제를 위해서는 CHO-S 세포주 (Invitrogen, Cat. 11619-012)를 이용하였다. 배지로는 10% 우태아혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신이 포함된 F12/HAM (Gibco-BRL)을 배지로 5% CO₂와 37℃ 조건 하에서 부유 배양하였다.

실시예 2: 인간 Bst2 와 마우스 Damp -1 유전자 클로닝

히스티딘 표지된 Bst2 발현벡터를 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 완전한 인간 Bst2 유전자의 cDNA (NM004335)(서열번호 1)는 Origene사 (US)에 의뢰하여 합 성하였으며 Pfu ultra HF DNA 폴리머라아제 (Stratagene)를 사용하여 50 μl 부피로 PCR 증폭하였다. PCR 증폭생성물을 DNA 제한효소 Sal I과 Not I을 사용하여 pCMV HA 벡터 (Clontech)로 클로닝하였다

Bst2와 Damp-1의 가용성 단편 발현을 위한 벡터를 다음과 같이 제조하였다. 클로닝 과정과 프라이머 서열(서열번호 7 내지 15)은 도 2에 나타나 있다. 인간 Bst2 단백질의 세포막 외부 영역을 코딩하는 DNA 단편을 PCR 증폭반응으로 얻었으며 발현 후 세포 밖으로의 분비를 촉진하기 위하여 tPA (tissue Plasminogen activator)의 시그날 서열 P를 Bst2 단백질의 아미노기에 연결시켰다. 또한 단백질의 확인과 정제과정을 용이하게 조작하기 위하여 Bst2 단백질의 카르복실기에 여섯 개의 히스티딘 잔기를 더해 주었다. 이 때, Bst2 가용성 단편은 카르복실기 말단에 11개의 아미노산 잔기를 포함하지 않고 막 통과 및 세포질 영역을 함유하지 않게 만들었다. PCR 증폭 반응물은 DMSO (dimethyl sulfoxide, Sigma)의 최종농도가 0.8% 되게 처리하여 BamH I과 Xba I의 두 제한효소 반응 후 pCDNA 3.1 (Invitrogen)벡터로 클로닝하였다.

완전한 마우스 Damp-1 유전자의 cDNA (NM 198095)(서열번호 3)는 마우스 간으로부터 정제한 mRNA를 시료로 하여 RT-PCR 증폭하여 제조하였다. 증폭생성물을 DNA 제한효소 BamH I과 Xba I을 사용하여 pcDNA 3.1 벡터 (Invitrogen)로 클로닝하였다. 가용성 단편 부분의 결정은 인간 Bst-2와 마우스 Damp-1 아미노산 서열 유사성 분석을 통하여 결정하였다. 서열번호 5의 가용성 Bst2 단편, 서열번호 6의 가용성 Damp1 단백질 단편을 발현하는 벡터를 제조하였다.

실시예 3: 실시간 정량적 RT- PCR 증폭 반응

세포 내 특정 유전자의 발현정도를 확인하기 위해 실시간 정량적 RT-PCR 증폭 반응을 수행하였다. 이 실험은 ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) 기기와 SYBR-Green assay 키트를 사용하였다. 각 반응의 프라이머와 프로브들은 Primer Express 소프트웨어 (Applied Biosystems)를 사용하여 디자인하였다.

외가닥 cDNA 10 ng을 각 반응용기에 담고 멀티플렉스 TaqMan PCR 반응 (50 μl)을 TaqMan Universal PCR master mix를 사용하였다. 비교 사이클 역치법 (the comparative cycle threshold method, Ct)을 이용하여 타겟 cDNA 양의 상대적 수치를 계산하여 분석하였다. PCR 증폭 반응물은 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다.

특정 유전자 A에 대한 상대적 정량은 대조군 세포 (트랜스펙션하지 않은 샘플)에 대한 변화배수로 표시하였다. 이 값은 트랜스펙션된 세포에서의 보정유전자 B (인간 GADPH유전자)에 대한 2-CT (C_t1-C_t0, C_t1=C_t1A-C_t1B, C_t0=C_t0A-Ct0B) 계산법으로 얻어졌다. 각 값은 3회 반복 실험한 값들이다. 본 발명에서는 Bst2 유전자와 인터루킨-2의 발현량을 측정하기 위해 상기의 실험들이 이루어졌다.

실시예 4: 가용성 Bst2 단백질 단편 또는 Damp1 단백질 단편의 발현 및 정제

상기에서 제조한 가용성 Bst2 단백질 단편 또는 Damp1 단백질 단편 발현을 위해서 특정 동물세포내로 벡터 DNA를 일시적 또는 영구적으로 삽입하였다. 단백질의 일시 발현은 칼슘인산염 (CaPO₄) 방법으로 실시하였다. 트랜스펙션 24시간 전에 7 x 10⁶ 개의 293T 세포 (ATCC) 를 150 mm 세포배양 플레이트에 준비하고 트랜스펙션 1시간 전에 2% 우혈청 (fetal bovine serum, GIBCO-BRL) 이 함유된 IMDM 배지 (Cambrex) 로 교환하였다. 각 DNA 75 ug과 250 mM 칼슘이 포함된 TE (1 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH 8.0) buffer 1.5 ml과 HEPES 완충액 (50mM HEPES, 140mM NaCl, 1.4mM Na₂HPO₄ pH 7.05) 1.5 ml을 실온에서 혼합하여 1분 정도 방치하였다가 준비된 세포에 처리하였다. 처리한 세포를 37℃ CO₂ 배양기에서 6시간 동안 방치 후 처리용액을 제거하고 무혈청 배지를 더하여 72시간 이상 배양 후 배지를 수거하였다. 단백질의 영구 발현세포주의 제조에는 리포젝타민 방법과 선별마커로 다이하이드로폴레이트 리덕타아제가 이용되었다. 이를 위하여 트랜스펙션 48시간 전에 100 mm 세포배양 플레이트 당 1.35 x 10⁶ 개의 CHO-DUKX-B11 (dhfr^- ) 세포 (ATCC)를 10% 우혈청이 포함된 IMDM 배지로 준비하였다. 각 DNA 18 ug이 포함된 IMDM 무혈청배지 0.6 ml 과 리포펙타민 2000 (Lipofectamine 2000, Invitrogen) 54 ul 가 포함된 IMDM 무혈청 배지 0.6 ml을 실온에서 섞은 후 45분간 방치하였다. 이 혼합액에 8.8 ml의 IMDM 무혈청배지를 첨가하여 준비된 세포에 처리하여 37℃ CO₂ 배양기에서 6시간 동안 방치하였다. 그 후 선별배지인 10% 투석 우혈청이 포함된 IMDM 배지로 교환하여 배양하였다. 일시발현된 단백질의 확인을 위하여 트랜스펙션 72시간 이상 배양 후 수거한 배지를 모아 0.2 μM 필터 (Millipore)로 필터하고 생산된 Bst2 가용성 단편 단백질은 항-Bst2 폴리클로날항체 (Roche) 또는 항-히스티딘 항체 (Roche)를 사용한 면역블롯으로 확인하였다.

가용성 Bst2 단백질 단편 또는 Damp1 단백질 단편의 대량 발현 및 정제를 위하여 Bst2 또는 Damp-1 발현벡터가 안정적으로 삽입된 숙주세포주를 다음의 방법으로 선별하여 생산세포주로 선정하였다. 다이하이드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR: dihydrofolate reductase) 유전자가 결핍된 CHO 숙주세포에 발현벡터를 형질도입 하였으며, 발현벡터에는 dhfr 유전자를 함유하고 있어 선별마커로 사용하였다. 발현벡터가 도입된 CHO 세포주는 48시간 후 96 웰 세포배양 플레이트에 웰당 1 x 10³개의 세포를 준비한 후 20 nM methotrexate (MTX, 메토트리세이트) 함유 배지에서 다이하이드로폴레이트 리덕타아제 유전자 증폭을 시작하였다. 2주 배양 후 수거된 배지에 포함된 Bst2 가용성 단편 단백질량을 항 Bst2 항체를 이용한 ELISA 방법을 통해 발현량이 높은 세포주를 선별한 뒤 MTX 농도를 점진적으로 300 nM 까지 증가시킴으로써 유전자 증폭을 완료하였다. 증폭이 완료된 세포주의 배양액을 수거 후 ELISA 및 면역블롯 방법을 사용하여 발현량이 가장 높은 생산 세포주를 최종 선정 하였다. Bst2 가용성 단편 단백질은 무혈청 조건에서 배양한 배지 내에 있으므로 그 배지를 모아 단백질 카르복실기에 위치한 6개의 히스티딘 잔기를 이용하여 단백질을 정제하였다. 이 때 사용된 컬럼은 NTA 킬레이팅 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다 (NTA chelating agarose Cl-6B, Peptron Inc.). 이후 정제된 단백질의 순도는 전기영동법과 효소면역검사법 (ELISA)로 확인하고 정량은 BCA (Biorad, US) 정량법과 UV 흡광도 측정법으로 결정하였다.

상기의 방법으로 정제된 인간 Bst2 가용성 단편 및 마우스 Damp1 가용성 단편을 4~20% SDS-PAGE 법으로 전기영동하여 단백질을 확인하였다 (도 3A). 1% 다이티올트레이톨 (DTT, dithiothreitol) 처리 및 N-glycosidase F (Sigma) 처리로 2량체 (dimer)를 형성한 당단백질임을 알 수 있었다 (도 3B). 이하의 실험 결과는 제작한 가용성 단편 중, 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 가용성 Bst2 단백질 단편, 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 가용성 Damp1 단백질 단편에 대한 결과이다.

실시예 5: Bst2 단백질과 U937 세포주의 동종 간 군집 형성 관계

5-1: U937 세포의 군집 형성 과정에서 Bst2 발현량의 변화

인간 단핵구세포인 U937의 군집형성 과정에서 Bst2 단백질의 발현정도를 살 펴보았다. 1 x 10⁶개의 U937 세포를 PMA (2 ng/ml)와 LPS (10 μg/ml)을 24시간 동안 처리하여 U937 동 세포간군집 형성을 유도한 후, 위상차 현미경 (Olympus 1X71, state, US)을 사용하여 동종 간 군집 형성 정도를 관찰하였다. 군집 형성 정도는 포토샵 버전 7.0 소프트웨어를 사용하여 형성된 군집의 크기를 픽셀 (pixel) 단위로 측정하였다. 도면에서 표시된 표준편차 값은 임의 선정된 6개의 군집의 평균값에서 계산되어졌다. 그 후 사용한 모든 세포를 수거하여 RNA를 단리하여 Bst2 발현량을 서열번호 16 내지 17의 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR 반응으로 조사하였다.

센서 올리고머: 5‘TTT TCT CTT CTC AGT CTC 3' (서열번호 16)

안티센서 올리고머: 5‘ GCA TCT ACT TCG TAT GAC 3' (서열번호 17)

이 실험에서 U937 세포는 PMA/LPS 처리에 의한 동종 간 군집형성을 유도한 지 1 시간 후에 세포 내 Bst2 발현이 3배 정도 증가함을 알 수 있었다. 이러한 증가 수준은 24시간이 경과할 때까지 유지되었다. 이로써 U937 세포의 동종 간 군집형성과정에서 Bst2 유전자의 발현이 증가되어짐을 알 수 있었다(도 4).

5-2: Bst2 단백질과 U937 세포주의 동종 간 군집 형성

U937 세포의 동종 간 군집형성과정에서 Bst2 유전자의 발현 증가가 필수적인지를 조사하기 위해 Bst2 단백질을 과발현시킴으로써 군집형성이 유도되는지를 살 펴보았다.

상기 언급한 조건에서 배양한 1 x 10⁶ 개의 U937 세포를 96 웰 세포배양 플레이트 (NUNC)에 준비하여 PMA (2 ng/ml, Calbiochem)와 LPS (10 μg/ml, Calbiochem)를 기존 배양조건에서 24시간 처리한 후, 위상차 현미경 (Olympus 1X71, state, US)을 사용하여 동종 간 군집 형성 정도를 관찰하였다.

Bst2 단백질 자체는 U937세포의 군집형성을 유도하지 못하는 반면, PMA와 LPS 처리에 의해 U937세포는 동종간 군집 형성이 활발히 이루어짐을 관찰할 수 있었다. U937 세포의 동종간 군집 형성 (homotypic aggregation)은 Bst2의 일시적 과발현에 의해 4배 정도 증진되어짐을 알 수 있었다 (도 5). 이로써 Bst2 발현은 U937 세포간 군집형성의 충분요건은 아니지만 필요 요건임을 알 수 있었다.

5-3: Bst2 가용성 단편을 이용한 U937 세포주의 동종간 군집 형성 억제

앞에서 확인한 U937 세포의 동종간 군집형성과정에서 Bst2 유전자의 발현 증가가 필수적임을 검증하기 위해 Bst2 단백질의 작용을 억제함으로써 군집형성이 억제되어지는가를 살펴보았다.

U937 세포를 PMA와 LPS 전처리로 군집형성을 유도한 후 CHO-S 세포주에서 일시적 발현에 의해 Bst2 가용성 단편이 포함된 배지 (decoy media)를 단계 희석하여 처리하였다. Bst2 가용성단편을 발현하지 않는 CHO-S 세포 배양액 (control media) 을 동량 처리하였을 경우에 비해 PMA와 LPS에 의한 U937세포간군집 형성이 50% 감소하였다 (도 6). 즉, Bst2 가용성 단편이 U937세포주의 동종간 군집 형성을 억제함을 알 수 있었다.

실시예 6: Bst2 단백질과 두 세포의 이종간 군집 형성 관계

6-1: Bst2 가용성 단편을 이용한 U937 - HUVEC 세포간군집 형성 억제

12-웰 세포배양 플레이트에서 HUVEC 세포 (1~5 x 10⁴ cells/ ml)를 준비한 후 하루가 경과하면 0.5% 우혈청배지가 든 저혈청배지로 바꾸어주고 인터페론 감마 (Calbiochem)를 최종농도 10 ng/ml되게 24시간 전처리하였다. 전처리한 HUVEC 세포에 U937세포 (2 x 10⁶ cells/ ml, 500 μl)를 더하여 37℃에서 4시간 방치하였다. 인산염 완충액으로 3 내지 4번 씻어준 후 남아 있는 세포들을 4% 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 현미경으로 세포들을 관찰하였다.

인터페론 감마 전처리를 하지 않은 HUVEC 세포는 U937세포와 결합하지 않는 반면 인터페론 감마를 처리해 준 HUVEC 세포는 U937세포와 결합하여 이종 세포간 군집 형성을 보였다. 인터페론 전처리 후 Bst2 가용성 단편 단백질이 포함된 배지를 처리한 HUVEC 세포들은 U937세포와의 군집형성이 감소되었다. 기본 배지 또는 알부민 단백질의 처리에 의해서는 군집형성에 아무 영향도 없음을 알 수 있었다 ( 도 7). 이 때 정상배지 (normal media)는 우혈청이 포함된 일반배지를 뜻하며 대조군 배지 (control media)는 Bst2 가용성 단편 단백질이 발현되지 않은 세포의 배양액을 뜻한다. 또한 두 세포간의 군집형성은 Bst2 가용성 단편의 처리농도 의존적으로 억제되었다 (도 8).

6-2: Bst2 의 siRNA 를 이용한 U937 - HUVEC 세포간군집 형성 억제

Bst2 특이적으로 작용하는 다양한 siRNA를 제작하였다 (QIAGEN). 서열번호 18 내지 40의 서열에 의해 코딩되는 Bst2 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥으로 이루어진, Bst2 특이적 siRNA를 총 23종류 제작하였다.

이하의 실험 결과는 제작한 siRNA 중, 서열번호 38에 의해 코딩되는 Bst2 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥과 이에 상보적인 센스 RNA 가닥으로 이루어진 siRNA에 대한 결과이다.

앞선 동일한 조건에서 HUVEC 세포에 실시예 3에 표기된 것과 같이 센스와 안티센스 서열로 이루어진 siRNA (HPP grade, Qiagen) 를 트랜스펙션으로 세포에 삽입한 후 인터페론 감마 처리한 세포들의 U937세포와의 군집형성을 살펴보았다.

타겟 서열 5‘AAGCGTGAGAATCGCGGACAA 3' (서열번호 38)

센서 올리고머: 5' r(UUGUCCGCGAUUCUCACGC)d(TT) 3'

안티센서 올리고머: 5‘ r(GCGTGAGAATCGCGGACAA)d(TT) 3'

비특정 siRNA 처리에 의해서는 아무 영향이 없으나 Bst2 유전자 특이적 siRNA를 처리하였을 때 대조군 처리와는 달리 U937세포와 HUVEC 세포 간의 군집형성을 완전히 억제되었다 (도 9).

HUVEC 세포에서 트랜스펙션법으로 Bst2 단백질 발현을 일시적으로 증가시켰을 때 U937 세포의 부착에 미치는 영향을 살펴보았다.

이종간 군집형성의 정량적 분석을 통해 Bst2 단백질 발현의 증가는 인터페론 감마 단독처리 때보다 50% 이상 군집형성을 증가시키는 것으로 관찰되었다. Bst2 단백질의 과발현이 유도된 HUVEC세포에 Bst2 유전자의 siRNA 처리하였을 때 과발현에 의해 증가된 세포간군집 형성이 다시 억제되었다. 이를 통하여 두 세포간 군집 형성에 Bst2 단백질의 발현이 중요함을 알 수 있었다 (도 10).

실시예 7: Bst2 단백질과 T 림프구 동종간 군집 형성 및 활성 관계

7-1: Bst2 과발현과 T 림프구 동종간 군집 형성과 인터루킨-2 생산 관계

T 림프구 세포인 Jurkat 세포는 다음의 방법으로 세포간 군집을 형성하며 세포 활성을 유도하였다.

Jurkat 세포 (5 x 10⁵ cells/ ml)에 항 CD3 단클론항체 (OKT3: 10 μg/ml, BD Pharmingen)을 4℃에서 20분간 처리한 후, 항 마우스 면역글로블린 폴리클론 항체 (25 μg/ml, Zymed)를 37℃에서 1시간 동안 처리하게 되면 세포간 군집형성이 일어나며 활성이 유도되어 인터루킨 2의 생성이 유도되어진다 (도 11, 12). 이 방법으로 녹색형광단백질(GFP)의 과발현을 유도하였을 경우는 아무 영향이 없는 반면 Bst2 과발현 벡터 삽입 후 Jurkat 세포 활성화를 유도하면 세포간군집형성이 5배 이상 증가되어졌다 (도 11A). T 림프구의 활성에 의한 인터루킨 2의 mRNA량을 실시간 RT-PCR 방법(실시예 3)으로 측정하였을 때 녹색형광단백질(GFP: green fluorescence protein) 과발현 대비 Bst2 과발현 조건에서 인터루킨 2의 mRNA 발현이 2배 정도 증가하였다 (도 11B).

7-2: Bst2 가용성 단편 및 siRNA 처리와 T 림프구 동종간 군집 형성과 인터루킨-2 생산 관계

항 CD3 단클론항체를 이용한 Jurkat 세포의 활성화 조건에서 Bst2 가용성 단편을 30분 전에 전처리하였을 때 억제정도를 관찰하였다. 이 때 처리량은 Bst2 가용성 단편이 포함된 동물세포 배양액을 단계희석 (serial dilution)하여 상대적인 양으로 처리하였다. 여기서 군집형성 크기는 비처리군 크기에 대한 비율로 표시하였다.

본 활성화 조건에서 Bst2 가용성 단편 전처리는 Jurkat 세포간의 군집형성을 50% 감소시켰다. 또한, Jurkat 세포 활성화에 의해 인터루킨-2의 발현량이 3배 증 가하였는데 Bst2 가용성 단편 처리에 의해 인터루킨-2의 합성이 다시 기초(basal) 수준으로 떨어졌다 (도 12, 13).

실시예 8: 마우스 천식염증 모델에서 Bst2 가용성 단편의 작용

8-1: 마우스 천식 모델 유도

마우스 (BALB/c, 8주령)에서 오브알부민 감광에 의한 천식모델을 다음과 같이 준비하였다. 1차 감작으로 오브알부민을 연속 5일 동안 비강내 주사하고 3주 후에 2차 감작으로 다시 연속5일 주사하였다. 2차 감작 실시 1주일 후 다시 오브알부민을 24시간 간격으로 3회 주사하여 천식을 유도하였다. 이 때 오브알부민 3회 주사 시작 30분 전에 Bst2가용성 단편을 정맥주사하여 전처리하고 오브알부민 1차 및 3차 주사하기 30분 전에 Bst2 가용성 단편을 주사하였다. 이로부터 3일 후 마우스로부터 혈청 및 폐조직 등을 추출하였다.

8-2: Bst2 가용성 단편에 의한 침윤면역세포 수의 변이

마우스에서 오브알부민 감광에 의한 천식모델에서 Bst2 및 Damp-1 가용성 단편을 각각 10 mg/kg로 주사함으로써 천식 염증을 보일 때 모여드는 호중구, 호산 구, 대식세포, 림프구 등의 수를 측정하여 비교하였다. 쥐의 흉곽을 절개하여 폐와 기관을 노출시키고, 기관 상단부를 절개한 후 주의 깊게 도관을 삽입하여 37℃의 생리식염수로 기관지 폐포세척술을 시행하였다. 회수된 세척액을 모아 4℃로 유지하면서 원심분리를 실시하고, 남아있는 세포압착결정은 hemocytometer 와 세포염색을 통해 현미경 아래에서 총 세포 수를 측정하는데 이용하였다. 오브알부민 감광 72 시간 이후 폐포액에는 생리식염수만을 전처리해 주었을 때 대비 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구 등의 총 세포 수가 증가되었다. 오브알부민 감광된 마우스에 Bst2 가용성 단편을 처리하였을 때 폐포 세척액 내에 존재하는 총 세포 수, 호중구, 호산구 및 림프구의 세포 수가 현격히 감소하였다. (도 14).

8-3: Bst2 가용성 단편에 의한 시토카인의 생성 추이

마우스에서 오브알부민 감광에 의한 천식모델에서 Bst2 및 Damp-1 가용성 단편을 주사함으로써 천식 염증을 나타낼 때 생성되는 시토카인 (interleukin- 4, interleukin- 5, interleukin-13) 들을 다음의 방법으로 측정하여 비교하였다. 기관지 페포세척 후 폐 조직을 적출하여 폐 조직으로부터 단백질을 추출하였다. 폐 조직의 세포질 내 단백질은 NP-40을 사용한 lysis buffer를 이용하여 추출하며, 추출된 단백질은 폴리아크릴아미드 SDS 젤 상에서 전기영동으로 분리하고, 분리된 단백질은 wet transfer method를 통해 PVDF 막으로 옮겼다. 여러 1차 항체 (항 IL-4 항체: Setotec Inc., 항 IL-5 항체: Santa Cruz Inc., 항 IL-13항체: R&D Inc., 항 actin 항체: Sigma Inc.) 는 1:1000 으로 희석시켜 배양하고, 결합된 1차 항체는 2차 항체 (anti-rabbit HRP conjugated IgG) 와 반응시킨 후 ECL reagent를 이용한 발색반응으로 확인하였다. 오브아부민 감광에 의해 천식 마우스 폐조직에서는 인터루킨4, 인터루킨5, 인터투킨13 등의 시토카인이 증가되는 것을 관찰하였다. 그와 동시에 오브알부민 감광된 천식 마우스에 Bst2 decoy 단백질을 주사한 후 수거한 폐 조직에서는 decoy 단백질 투여농도에 반비례하여 시토카인이 감소됨이 측정되었다. 이로써 Bst2 decoy 단백질의 치료효능이 있음을 알 수 있었다 (도 15).

실시예 9: 인간 Bst2 와 마우스 Damp -1 단백질 간의 기능의 유사성

인간 Bst2 와 마우스 Damp-1 단백질 간의 아미노산 서열 유사성이 35% 정도이므로 실제 두 유전자 간의 상호작용 가능성을 확인해 보았다. 인터페론 감마를 처리한 HUVEC 세포와 U937세포의 결합을 억제하는 각 단백질의 효능을 실시예 5 의 방법으로 확인하였다. 대조군 단백질로 소혈청알부민 (BSA: bovine serum albumin) 단백질을 사용하였을 때 배지 단독으로 처리할 경우에 비하여 HUVEC 세포에 붙은 U937세포 수는 변화가 없었다. 인간 Bst2 decoy 단백질과 마우스 Damp-1 decoy 단백질을 처리하였을 때는 HUVEC세포와 U937세포의 결합을 decoy 단백질 처리 농도 의존적으로 억제함을 관찰하였다 (도 16). 또한 실시예 8에서 천식을 유도한 지 3일 후에 마우스로부터 채취한 폐 조직을 10% 포름알데하이드 용액으로 고정시킨 후 파라핀 절편으로 준비하여 헤마톡실린 (hematoxylin)과 에오신 (eosin)으로 염색하 였다. 천식 마우스 모델에서 오브알부민 감작시킨 마우스의 폐포 조직에서는 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구 등이 몰려들어 폐포조직을 가득 채우고 있고 기도 상피조직이 두꺼워지고 점액 및 세포 잔해 등이 쌓여 있음을 알 수 있었다 (도 17). 마우스 Damp1 가용성 단편 또는 인간 Bst2 가용성 단편을 처리하였을 때 폐포조직에 모여든 호중구, 호산구, 대식세포, 림프구 등의 수가 급감하여 천식을 유도하지 않은 마우스 (생리식염수 처리)의 폐포조직처럼 깨끗한 상태를 보였다. 이 효과는 마우스 Damp1 가용성 단편이 인간 Bst2 가용성 단편 단백질과 대등한 천식 억제효과를 보여줌을 의미한다.

실시예 10: 항 Bst2 폴리클로날 항체 제조

CHO-S 세포주에서 발현/ 정제한 Bst2 및 Damp-1 decoy 단백질을 ribi 아주방트와 1:1로 섞어 2주 간격으로 토끼에 주사하여 면역을 유발하였다. 면역과 더불어 채혈하여 토끼 내의 항체 생성여부를 관찰하고 3회 면역 후에 최종 토끼 혈청을 얻었으며 이후 Bst2 단백질을 고정상에 붙인 컬럼을 사용하는 친화력 정제법 (affinity chromatography)을 이용하여 항 Bst2 폴리클로날 항체를 정제하였다.

실시예 11: Bst2 가용성 단편의 대사속도 개선을 위한 PEG 접합형 제조

11-1. PEG 접합형 제조

PEG 접합은 다음의 2가지 방법으로 진행하였다: (1) 알데하이드 PEG (2) 숙시니미딜 카르보네이트 PEG (도 18). 우선 Aldehyde PEG 접합의 경우, 1 mg의 Bst2 가용성 단편 단백질을 0.1M 인산염 완충액 (pH 7.5)으로 투석한 후, (mPEG12000-OCH₂COGly-Gly)₂(2,4-디아미노 부틸산)-PEG'-NHS를 30배 몰수비로 섞어 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 한편, 카르보네이트 PEG 접합의 경우, 1 mg의 Bst2 가용성 단편 단백질을 0.1 M 인산염 완충액 (pH 5.0)으로 투석한 후 숙시니미딜 카르보네이트 PEG을 20배 몰수비로 섞어 실온에서 2시간 교반하여 반응시켰다. 반응이 완료된 후 크기 배제 컬럼 (Superdex-200, Pharmacia)을 이용하여 PEG-Bst2 가용성단편을 분리, 정제하였다. 정제 후 완성된 시료는 50 mM 인산염 완충액 (pH 7.4)로 투석하였다.

11-2. PEG 접합형의 체내 안정성 개선 효과

<실시예 11-1>에서 제조된 Bst2 가용성 단편-PEG 접합형을 0.4~2 mg/kg의 농도로 7주령 웅성 Sprague-Dawley 랫트의 꼬리 정맥으로 주사하였으며, 대조구는 생리식염수를 약물 투여량과 같은 용량으로 주사하였다. 또한 같은 양의 Bst2 가용성 단편 단백질이 대조군으로 사용되었다. 채혈은 약물 투여전, 투여후 2분, 5분, 10분, 30분, 1시간, 2시간, 6시간, 12시간, 24시간에 약물투여 전일 우측 경정맥에 Cannula를 통하여 채혈하였으며, 그 결과는 다음의 효소면역검사법 (ELISA)으로 측 정하였다. Bst2 가용성 단편에 대한 항체 (100ng/ml, PBS)를 96-well 용기에 4℃에서 8시간 이상 반응시켜 고정시킨 후 알부민 용액 (PBS)을 처리하여 37℃에서 2시간 동안 방치하는 blocking 단계를 두었다. 랫트 혈청 또는 Bst2 가용성 단편 (표준시료)를 적정 배수로 희석하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. Bst2 가용성단편의 카르복실기에 있는 히스티딘 tag을 인식하는 단클론항체 (mAb conjugated with horseradish peroxidase, Roche Inc.)를 처리하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 잘 씻어 준 후, peroxidase의 기질을 처리하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 혈청 중에 남아 있는 Bst2 가용성 단편-PEG 접합형의 잔존 유무를 표준시료를 이용하여 정량적으로 환산하였다 (도 19). 도 19에서 201B-H는 인간 Bst2 가용성 단편 시료를 의미하고 201B-HP는 Bst2 가용성 단편-PEG 접합형 시료 (알데하이드 접합법)를 의미한다.

실시예 12: 염증관련 질환에서의 Bst2 발현분포

염증관련 질환 (천식, 아테롬성 동맥경화, 류마티스성 관절염, 건선, 크론씨병, 궤양성 대장염 등)의 조직에서의 Bst2 단백질의 발현정도를 관찰하였다. 10% 포름알데하이드 용액에 고정시켜 파라핀 절편에 묻어 놓았던 폐 조직의 파라핀 블록을 1.5㎛ 두께로 잘라내어 슬라이드를 제작한다. 제작된 슬라이드는 H&E 염색을 통해 알레르겐과 약물투여에 의한 폐 조직의 변화 관찰에 이용한다. 실시예 10에서 준비한 폴리클론 항체를 이용하여 조직염색을 수행하였다. 이 결과 정상조직 대비 염증관련 질환에서 Bst2 단백질이 과발현됨을 알 수 있었으며 면역세포, 혈관 내피세포 등에 발현되고 있음을 관찰할 수 있었다 (도 20).

본 발명에 따라 Bst2 또는 Damp1의 안타고니스트를 제공함으로써, 이에 이해 매개되는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 패혈증, 염증장병, 다발성 경화증, 급성 심근경색, 심장 발작, 건선, 접촉성 피부염, 골관절염, 비염, 크론씨병 및 자가면역질환 등을 포함한 염증 관련 질환을 치료하는데 사용할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

삭제
세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Bst2 단백질의 세포막 내부 도메인(intracellular domain)의 전체영역 또는 일부영역이 결실된 가용성 Bst2 단백질 단편.
제2항에 있어서, 상기 Bst2 단백질 단편은 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 Bst2 단백질 단편.
삭제
세포간 결합을 억제하여 염증 억제 효과를 가지는, Damp1 단백질의 세포막 내부 도메인(intracellular domain)의 전체영역 또는 일부영역이 결실된 가용성 Damp1 단백질 단편.
제5항에 있어서, 상기 Damp1 단백질 단편은 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것인 Damp1 단백질 단편.
제2항 또는 제3항의 Bst2 단백질 단편을 코딩하는 핵산.
제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
제8항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제5항 또는 제6항의 Damp1 단백질 단편을 코딩하는 핵산.
제10항의 핵산을 포함하는 벡터.
제11항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제9항 또는 제12항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 Bst2 단백질 단편 또는 Damp1 단백질 단편을 제조하는 방법.
폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체(co-poly(ethylene/propylene) glycol), 폴리옥시에틸렌, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리사카리드, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리아크릴 아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 헤파린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체로 개질된 Bst2 단백질 또는, 제2항 또는 3항의 Bst2 단백질 단편.
폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체(co-poly(ethylene/propylene) glycol), 폴리옥시에틸렌, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리사카리드, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리아크릴 아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 헤파린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체로 개질된 Damp1 단백질 또는, 제5항 또는 6항의 Damp1 단백질 단편..
삭제
제14항 또는 제15항에 있어서, 비펩타이드성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜인 단백질 또는 단백질 단편.
Bst2 단백질, Damp1 단백질, 가용성 Bst2 단백질 단편, 가용성 Damp1 단백질 단편, 비펩타이드성 중합체로 개질된 Bst2 단백질 또는 Bst2 단백질 단편, 또는 비펩타이드성 중합체로 개질된 Damp1 단백질 또는 Damp1 단백질 단편을 포함하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물.
제18항에 있어서, 염증 질환이 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 패혈증, 궤양성 대장염, 다발성 경화증, 급성 심근경색, 심장 발작, 건선, 접촉성 피부염, 골관절염, 비염, 크론씨병 및 자가면역질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 조성물.
Bst2 또는 Damp1 mRNA에 상보적인 안티센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 센스 RNA 가닥으로 이루어지는, Bst2 또는 Damp1 특이적 RNA 간섭(RNA interference)을 유도함으로써 세포간 결합을 억제하여 염증 억제효과를 가지는 siRNA 핵산 분자.
제20항에 있어서, 상기 siRNA 핵산 분자가 10 내지 40개의 뉴클레오타이드 길이를 갖는 siRNA 핵산 분자.
제20항에 있어서, mRNA가 서열번호 18 내지 40의 서열에 의해 코딩되는 것인 siRNA 핵산 분자
제20항의 siRNA 핵산 분자를 포함하는 염증 질환 예방 또는 치료 조성물.
제23항에 있어서, 염증 질환이 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 패혈증, 염증장병, 다발성 경화증, 급성 심근경색, 심장 발작, 건선, 접촉성 피부염, 골관절염, 비염, 크론씨병 및 자가면역질환으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 조성물.
Bst2 단백질 또는 Damp1 단백질에 의한 세포간 결합을 억제하는 물질을 투여하는 것을 포함하는, 인간을 제외한 동물의 염증 반응을 억제하는 방법.
제25항에 있어서, 상기 물질이 Bst2 단백질, Bst2 단백질 단편, Damp1 단백질 또는 Damp1 단백질 단편인 방법.
제26항에 있어서, 상기 Bst2 단백질, Bst2 단백질 단편, Damp1 단백질 또는 Damp1 단백질 단편이 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜-프로필렌 글리콜 공중합체(co-poly(ethylene/propylene) glycol), 폴리옥시에틸렌, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리사카리드, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 에틸 에테르, 폴리아크릴 아미드, 폴리아크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 지질 중합체, 키틴류, 히아루론산, 헤파린 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비펩타이드성 중합체로 개질된 것인 방법.
제25항에 있어서, 물질이 Bst2 또는 Damp1 mRNA 특이적인 siRNA 핵산 분자인 방법.