KR100705054B1

KR100705054B1 - 모노메틸파이토스핑고신 및 그를 함유하는 항암 조성물

Info

Publication number: KR100705054B1
Application number: KR1020040039703A
Authority: KR
Inventors: 임대석; 김진욱; 박성진; 황유아; 박장서; 이호재
Original assignee: 주식회사 두산
Priority date: 2004-06-01
Filing date: 2004-06-01
Publication date: 2007-04-06
Also published as: WO2005118521A1; KR20050114477A

Abstract

본 발명은 항암 활성이 있는 스핑고지질(sphingolipid)의 유도체 및 그를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스핑고지질의 유도체인 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 및 그를 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의한 모노메틸파이토스핑고신 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염은 스핑고신키나아제(Sphingosine kinase)의 활성을 뛰어나게 억제하여 이에 의해 유발되는 많은 메커니즘을 차단할 수 있으며, 특히 스핑고신키나아제에 의해 세라마이드와 스핑고신이 인산화되는 것을 막음으로써 이들의 농도를 높게 유지시켜, 암세포의 아폽토시스를 유발하여 암 또는 암 관련 질환을 치료 또는 예방할 수 있고, 또한 스핑고신키나아제의 세포 증식 촉진 활성을 억제함으로써 암과 건선 등과 같은 과증식성 질환을 치료 또는 예방할 수 있으므로, 이를 함유하는 조성물은 스핑고신키나아제 억제용 조성물, 과증식성 질환 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 항암용 조성물로써 사용될 수 있다.

스핑고지질, 모노메틸파이토스핑고신, 스핑고신키나아제, 암.

Description

모노메틸파이토스핑고신 및 그를 함유하는 항암 조성물{Monomethylphytosphingosine and the composition for anti-cancer containing the same}

도 1은 MDA-MB-231 세포주에 대한 MMPS의 세포독성에 관한 그래프이고,

도 2는 MMPS의 스핑고신키나아제 활성 억제 효과에 관한 그래프이다.

본 발명은 항암 활성이 있는 스핑고지질(sphingolipid) 유도체 및 그를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 스핑고지질의 유도체인 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염 및 그를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

스핑고지질은 1884년 튜디첨(Thudichum)에 의해 처음 밝혀진 것으로 수수께끼 같은(Sphinx like) 물질이라 명명되었으며, 세포의 성장, 증식, 분화의 조절과 함께 생명 현상의 중심에서 핵심적인 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.

인체내에서 스핑고지질은 스핑고신(Sphingosine), 파이토스핑고신(Phytospingosine), 스핑가닌(Sphinganine)이라고 하는 물질을 기본 골격으로 하고 있으며, 여기에 지방산이 연결된 형태인 세라마이드(Ceramide)를 비롯하여 약 300종류 이상의 유도체를 가지고 있다.

스핑고지질은 인지질과 함께 세포막을 구성하는 주요성분으로, 극성부위와 비극성 부위를 가지고 있다.

스핑고지질에 지방산이 연결된 형태인 세라마이드는 세포내에서 일어나는 여러 가지 작용 기전을 일으키는 데 중요한 역할을 많이 하는 것으로 알려져 있으며, 특히, 세포증식(cell proliferation), 세포 분화(cell differentiation), 세포 증식의 일시적인 정지상태(growth arrest), 아폽토시스(apoptosis)에 관여하고 있다.

스핑고지질의 기능해석은 1990년대에 들어와 본격적으로 시작되었다. 특히 하넌(Hannun), 벨(Bell) 등에 의하여 스핑고신의 프로테인키나아제(Protein Kinase) 억제효과가 확인되면서 연구가 활발해지기 시작하였으며, 세포분화, 성장, 노화, 사멸 등의 중요한 생명현상이 세라마이드에 의해 조절됨이 밝혀지면서 생물학연구의 핵심으로 발전하였다.

세라마이드는 암 치료의 중요한 기작인 아폽토시스를 유발하는 물질로 항암제 개발의 중심 테마로 위치하고 있으며, 현재 사용중이거나 개발중인 많은 항암제는 세라마이드의 생합성 경로에 영향을 미침으로 해서 그 효과가 나타나는 것으로 해석되고 있다.

암세포를 사멸시키기 위한 치료범위에는 세라마이드, 세라마이드 유도체(derivative) 및 유사체(analog)를 직접 암세포에 처리하거나 세라마이드의 새로운(de novo) 합성을 유도하는 물질 및 시작물질을 항암제로 사용하기도 한다.

따라서, 세라마이드 및 스핑고지질의 생합성에 관여하는 효소의 활성을 조절하는 물질은 항암제로 개발될 가능성이 매우 높기 때문에 최근 관심의 초점이 되고 있는 분야이다. SPT(Serine Palmitoyl Transferase), 세라미다아제(Ceramidase), SMase(Sphingomyelinase), GlcCer 합성효소(Gluco-sylceramide synthase), 스핑고신키나아제(Sphingosine kinase) 등은 세라마이드의 합성 및 가수분해에 관여하는 효소로, 이러한 효소의 활성화 및 저해물질은 암세포내 세라마이드 함량을 적절히 조절하여 암세포의 아폽토시스를 유도할 수 있는 가능성을 제시하고 있다.

세포내 세라마이드의 함량을 조절하는 물질에 대한 연구는 크게 스핑고지질 및 세라마이드의 유도체 개발과 유사체 개발로 국한할 수 있으며, 더불어 스핑고지질 생합성에 영향을 미치는 기능성 지방산, 비타민류, 안드로겐(androgens), ROS(reactive oxygen species: hydroxyperoxide, nitric oxide releasing compound), GSH 수치(glutathione level) 및 레시틴 수치(lecithin level)에 영향을 주는 물질 등 상당히 많은 분류의 물질을 포함하고 있다.

이중, 최근 항암제로 활발히 연구 중인 P-약물(P-drug)은 아미노알콜(aminoalcohol)류의 세라마이드 유사체이다. PDMP(D-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-pro-panol)는 이중에서 가장 많이 연구되고 있는 초기 합성물질로 셀 사이클(cell cycle)에 중요한 영향을 미치는 GlcCer(glucosylceramide)의 합성에 대한 저해제(inhibitor)로서 탁월한 효과를 보 인다. 이보다 효과가 우수한PPMP(D-threo-1-phenyl-2-palmitoylami-no-3-morpholino-1-propanol)는 조금 더 긴 체인을 가진 상동체(homolog)이고 PPPP(P4D-threo-1-phenyl-2-palmi toylamino-3-pyrrolidino-1-propanol) 또한 PDMP에 비해 높은 억제 효과를 보이는 유사체이다. P-약물은 일반적인 암세포에 대한 항암효과는 물론 항암제 내성과 연관이 있는 GlcCer의 합성을 억제하여 약제내성의 예방에도 기여할 것으로 기대된다.

또한, 세라미다아제 저해제(Ceramidase inhibitor)인 B13나 N-올레오일에탄올아민(oleoylethanolamine)도 세라마이드 유사체로 세라마이드의 분해를 억제함으로서 암세포 사멸을 유도한다. 이외에도 FTY-720, 푸모니신(fumonisin), 미리오신(Myriosin) 등 스핑고지질 및 세라마이드와 구조가 유사한 세라마이드 생합성 억제제가 있다.

세라마이드 생합성에 관여하는 물질 중에는 이미 항암제로 쓰이고 있는 물질들이 많이 있다. 빈크리스틴(vincristine), 젬시타빈(gemcitabine), 캄토테신(camptothecin), 호모캄토테신(homocamptothecin), 이리노테칸(irinotecan) 등이 대표적인 예로 대부분 SMase(Sphingomyelinase)의 활성을 촉진하는 것이다. 그러나, 세라마이드로부터 생성되는 GlcCer 및 S1P(sphingosine 1-phosphate)는 암세포의 생장을 촉진하므로 GlcCer 합성효소(synthase), 세라미다아제(ceramidase)나 SPHK(Sphingosine kinase) 등에 대한 선택적 억제제의 개발이 암에 대한 효율적 치료전략이 될 것으로 사료된다. 특히, SPHK 저해제는 새로운 항암제의 개발 타겟으로 가능성이 높아, 최근 들어 연 구가 시작되는 분야이다.

특히 최근 들어 스핑고신에 메틸화 반응을 시킨 DMS(Dimethylsphingosine)와 스핑가닌의 이성질체인 사핀골(safingol)이 SPHK 저해제(inhibitor)로 알려져 새로운 항암제 타겟(Target)으로 많은 관심이 집중되고 있다. 실제 DMS의 경우 미국의 M.D 앤더슨(Anderson) 암연구소의 연구결과에 의하면 약제내성을 띈 급성 백혈병에 효과가 있는 것으로 확인되어 항암제로의 개발 가능성이 확인되었으며, 아울러 이러한 물질을 통해 세포내 스핑고지질 및 세라마이드의 함량을 조절할 수 있는 특정 구조에 대한 연구가 현재 활발히 진행되고 있다.

따라서, 본 발명자들은 스핑고지질의 기본구조에 다양한 기능기(functional group)의 변화를 줌으로써 의화학적 분자설계를 통하여 효능을 가지는 새로운 구조의 유도체들을 합성해본 결과, 모노메틸파이토스핑고신(MMP)이 우수한 스핑고신키나아제 활성 저해능 및 항암 효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 스핑고지질(sphingolipid)의 유도체 즉, 모노메틸파이토스핑고신(MMPS)을 이용하여 스핑고신키나아제(Sphingosine kinase)의 활성을 억제함으로써 세라마이드와 스핑고신이 인산화되는 것을 막아 세라마이드와 스핑고신의 농도를 높게 유지시킴으로써 암세포의 아폽토시스를 유발하여 암 또는 암관련 질환을 치료 또는 예방하는 것을 목적으로 한다. 또한, 스핑고신키나제의 세포 증식 촉진 활성을 억제함으로써 암과 건선 등과 같은 과증식성 질환을 치료 또는 예방하는 것을 목적으로 한다. 또한, 이러한 효과를 갖는 항암용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는염 및 그를 함유하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 스핑고신키나아제 억제용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 스핑고신키나아제 억제용 조성물은 암 또는 암 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 아폽토시스 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 아폽토시스 유도용 조성물은 암 또는 암 관련 질환을 치료 또는 예방하기 위한 용도로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 과증식성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 과증식성 질환은 건선인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 암의 치료 또는 예방을 위한 항암용 조성물을 제공한다.

상기한 본 발명에 의한 조성물은 상기 모노메틸파이토스핑고신 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 허용 가능한 염의 형태로 의약에 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

상기 화학식 1의 모노메틸파이토스핑고신은 하기 화학식 2의 파이토스핑고신(Phytosphingosine)을 용매 중에서 환원제의 존재하에서 포름알데히드 반응을 시켜 제조할 수 있다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.

본 발명에 의한 상기 화학식 1의 모노메틸파이토스핑고신 화합물은 하기와 같은 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 좀 더 구체적으로 설명하면, 상기 화학식 1의 모노메틸파이토스핑고신 화합물은 상기 화학식 2의 화합물로부터 단백질의 아민 메틸화 반응을 응용한 환원적 메틸화 반응을 이용하여 제조할 수 있다. 먼저, 파이토스핑고신에 용매로 보레이트 완충용액을 메탄올과 동량 섞어 만든 용매를 가한 후, 아민의 반응성을 증가시키기 위하여 하이드라이드(hydride), 바람직하게는 소듐보로하이드라이드(Sodium Borohydride; NaBH₄)를 사용하며, 그 사용량은 화학식 2의 화합물을 기준으로 하여 8.0 내지 10 몰 배량을 가한 다음, 35 내지 37 % 포름알데히드 수용액을 일정량씩 시간 간격을 두고 여러 번 가하여 진행시키며 36 내지 72 시간 동안 상온 상태에서 반응시켜 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신을 수득할 수 있다.

본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 산화제는 상기 열거된 것 만으로 한정되는 것은 아니고 반응에 영향을 끼치지 않는 범위 내에서는 당업계에 통상적으로 공지된 모든 것이 사용될 수 있다.

또한, 상기 기재된 방법으로 제조된 상기 화학식 1의 화합물인 모노메틸파이토스핑고신은 클로로포름이나 클로로포름 및 메탄올의 혼합 용매 등의 유기 용매로 추출하고 실리카겔에 의한 흡착크로마토그래피로 정제할 수 있다.

정제되어진 모노메틸파이토스핑고신은 그대로 또는 약제학적으로 허용 가능한 염의 형태로 의약에 사용할 수 있다. 상기 염으로는 약제학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 모노메틸파이토스핑고신 및 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 약학조성물은, 전체 조성물 중 상기 화합물을 0.001 내지 20 중량 %의 농도로 함유하는 것이 바람직하다. 이는 0.001 중량 % 미만의 농도에서는 그 효과를 얻기 어려우며, 20 중량 % 초과의 농도에서는 생식기능에 이상을 초래할 수 있기 때문이다.

본 발명의 모노메틸파이토스핑고신은 스핑고신키나아제의 활성을 저해하여 세포의 사멸을 촉진하는 세라마이드와 스핑고신의 세포내 축적을 유도함과 동시에, 스핑고신키나아제의 산물인 S1P(sphingosine 1-phosphate)의 종양유발 효과를 차단하는 이중의 항암 효과를 기대할 수 있다.

본 발명자들은 스핑고지질의 유도체 즉, 파이토스핑고신의 메칠화 유도체인 상기 화학식 1의 모노메틸파이토스핑고신의 스핑고신키나아제 저해 활성을 측정한 결과, 그 효능을 확인하였고, 동시에 DMS(Dimethylsphingosine)보다 스핑고신키나아제 저해효능이 더 우수함을 확인하였다.

본 발명의 모노메틸파이토스핑고신 및 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 대상자의 연령, 성별, 체중, 증상, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.001 내지 1000 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 또한, 그 투여량은 연령, 성별, 체중, 질병의 정도, 투여경로 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등 의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

한편, 본 발명의 모노메틸파이토스핑고신 및 그를 포함하는 염은 그다지 심각한 독성 및 부작용은 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하고자 하며, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 모노메틸파이토스핑고신(MMPS)의 합성

파이토스핑고신(Phytosphingosine) 2 g (0.0063 몰)에 메탄올 200 ㎖를 가하고 40 ℃에서 교반하여 용해시킨 후, 0.2 M 보레이트 완충용액(pH 9.0)을 메탄올과 동량으로 섞어만든 용매를 천천히 가하고 소니케이션(sonication)으로 분산시킨 다음, 4 ℃ 빙욕상(ice bath)에서 소듐보로하이드라이드(Sodium Borohydride) 1 g을 끓어오르는 것에 주의하면서 조심스럽게 가하였다. 10분 후 37 % 포름알데히드(Formaldehyde) 수용액을 10 ㎖씩, 5분 간격으로 6번 가하였다. 24시간 후 같은 방법으로 소듐보로하이드라이드를 한번 더 가하였다. 반응은 실온에서 72 시간동안 진행시켰으며, 72시간이 경과된 후 클로로포름 100 ㎖를 가하고 증류수로 추출함으로서 반응을 멈추고 실리카겔에 의한 흡착크로마토그래피로 정제하여 본 발명에 의한 상기 화학식 1의 화합물인 모노메틸파이토스핑고신(이하; MMPS)을 얻은 다음, 다시 실리카겔 박층 크로마토그래피(TLC)로 정제(전개용매; 클로로포름: 메탄올: 암모니아수 = 80 : 20 : 2, R_f= 0.6)하여 백색의 본 발명에 의한 상기 화학식 1의 화합물인 모노메틸파이토스핑고신 1.5 g(수율 68.9 %)을 얻었다. 또한, ¹H NMR(Avance500, Bruker)로 메틸기(methyl기)가 한 개 도입된 것(= 2.4 ppm, s, 3H)을 확인하였으며, MALDI-MASS(Applied biosystems INC, Voyag-DE^TM)로 분자량(계산치: 317.29, 측정치: 316.35)을 측정하여 확인하였다.

실험예 1. 세포 독성 평가(Measurement of cytotoxicity)

상기 실시예 1에서 제조한 화합물인 모노메틸파이토스핑고신의 세포독성을 알아보기 위하여 하기와 같이 MTT 분석실험(MTT assay)을 수행하였다. MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyltetrazolium)는 배지에 용해시 황색을 띄는 염색시약으로, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내에 존재하는 활성을 띤 디하이드로게나아제(dehydrogenase)라는 효소에 의해 보라색 포르마잔(formazan)으로 변색되는 특징이 있다. 따라서, 세포의 성장이 멈추거나 세포가 죽으면 보라색 포르마잔으로의 변색이 줄어들게 되므로 그 정도를 흡광도를 통해 측정함으로써 세포 독성을 평가할 수 있다.

먼저, 인체유래 유방암 세포주 즉, MDA-MB-231(서울 공릉동 소재 원자력의학원으로부터 분양)을 1×10⁴ 세포/웰(1×10⁴ cell/well)의 수로 96-웰 플레이트(96- well plate)에 접종(seeding)하여 37 ℃, 5 %의 이산화탄소(CO₂) 배양기에서 24 시간동안 배양한 다음, 상기 실시예 1에서 제조한 MMPS 및 DMS(Dimethylsphingosine)을 각각 무혈청 배지(serum free MEM)에 희석하여 1 μM, 5 μM, 10 μM, 20 μM 및 40 μM의 농도로 세포에 처리하여 24 시간동안 배양하였다. 그런 다음, 최종농도가 0.5 mg/㎖인 MTT를 각 웰에 넣어 3시간동안 더 배양한 후 염색시약의 용해 후 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 음성대조군으로서는 MMPS를 처리하지 않은 세포군과 용매대조군으로서는 MMPS를 용해시킨 DMSO(dimethylsulfoxide)만을 처리한 세포군을 사용하였다.

그 결과, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, MMPS는 20 μM의 농도에서 DMS(Dimethylsphingosine)와 거의 비슷한 세포독성을 보였으며, 10∼20 μM의 유효농도를 결정할 수 있었다.

실험예 2. MMPS의 스핑고신키나아제 억제(Inhibition of sphingosine kinase) 효과

상기 실시예 1에서 제조한 MMPS의 스핑고신키나아제 활성 억제 효과를 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 스핑고신키나아제 활성 분석(Sphingosine kinase activity assay)은 ³²P 표지된 ATP(³²P labelled ATP)를 이용하여 표지(labelling)된 스핑고신-1-포스페이트(sphingosine-1-phosphate)를 TLC에 전개시킨 후 방사선량을 측정하는 방법으로 수행하였다. 이 때, 사용한 ³²P 표지된 ATP는 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)의 NEG 002(2 mCi/㎖)를 사용하였으며, 스핑고신키나아제 분석용 완충용액(assay buffer)의 조성은 하기 표 1(SK1 분석 완충용액 사용)과 같았다. 또한, 1 mM PMSF와 0.5 % 아프로티닌(aprotinin)은 로쉬(Roche)사의 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 50X의 저장용액(stock solution)으로 제조하여 사용하였으며, DTT는 200 mM, 인산 저해제(Phosphate inhibitor)인 NaVO₃는 1M의 농도로 제조하여 사용 전에 첨가하였고, 프로테아제 저해제와 NaVO₃는 4 ℃에서 보관하고 DTT는 20 ℃에서 보관하면서 사용하였다.

SK1 분석 완충용액	SK2 분석 완충용액
20 mM 트리스(Tris) HCl(pH 7.5)	20 mM 트리스 HCl(pH 7.5)
0.25 mM EDTA 2 Na	0.25 mM EDTA 2Na
1 mM MgCl₂	1 mM MgCl₂
12 mM β-글리세로인산 (β-glycerophosphate)	12 mM β-글리세로인산
1 mM Na₄P₂O_7·12 H₂O	1 mM Na₄P₂O_7·12 H₂O
5 mM NaF	5 mM NaF
5 % 글리세롤(glycerol)	5 % 글리세롤(glycerol)
1 mM PMSF	1 mM PMSF
2 mM DTT	2 mM DTT
0.5 % 아프로티닌(aprotinin)	0.5 % 아프로티닌
0.5 mM 4-디옥시피리독신 (4-deoxypyridoxine)	0.5 mM 4-디옥시피리독신
	200 mM KCl

스핑고신키나아제 분석(Shingosine kinase assay)은 E-튜브(tube)에 CHO-K1(Chinese Hamster Ovary: ATCC Number: CCL-61, 스핑고신키나아제 유전자들이 트렌스펙션 된 세포주) 세포 라이세이트(lysate), 기질(substrate; 10∼40 μM), 시 험시료인 상기 실시예 1의 MMPS(10∼100 μM), ATP(0.5 mM, Hot 2uCi/㎖)를 첨가하고, 나머지는 상기 스핑고신키나아제 분석용 완충용액을 첨가하여 반응 볼륨(reaction volume)을 맞추었다. 또한, -80 ℃에서 꺼낸 라이세이트(lysate)를 얼음 위에서 녹인 후, 25∼30 A로 10초 동안 소니케이션(sonication)한 후 5초 냉각하는 방식으로 2회 반복한 다음, 적당량(트렌스펙션 후 발현 수준(expression level)을 확인하여 결정)을 반응액에 첨가한 후 37 ℃에서 30분간 효소반응을 수행하였다. 효소반응이 끝난 다음(reaction volume 50 ㎕) 클로로포름: 메탄올: 염산= 100: 200: 1의 용액을 200 ㎕ 첨가한 후 1 분간 보텍스(vortex)하여 반응을 종결시켰다. 그 후, 다시 클로로포름 65 ㎕ 와 1 M KCl 용액 650 ㎕를 첨가한 후 5 분간 보텍스(vortex)하고 5,000 rpm에서 3분간 원심분리한 다음, 상등액을 완전히 제거한 후 증발(evaporation)시켰다. 증발이 끝난 다음 클로로포름: 메탄올= 2: 1 용액을 20 ㎕ 첨가하고 TLC 플레이트(plate)에 점적한 후, 1-부탄올(butanol): 아세트산(acetic acid): 물(water)= 3: 1: 1의 용액을 전개용매로 사용하여 전개하고 노출(Exposure)시킨 후 방사선량을 측정하여 표지된 스핑고신-1-p(labelled sphingosine-1-p)를 계산하였다. 이 때, 대조군으로서 DMS(Dimethylsphingosine)를 사용하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, MMPS(M-1)는 양성대조군 DMS를 다소 능가하는 우수한 스핑고신키나아제 억제 효과를 보였다.

하기에 상기 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제형예 1: MMPS 2 % 크림>

[표 1]

성분	함량(중량%)
상기 실시예 1의 MMPS	2.0 %
프로필렌 글리콜	20.0 %
스테아릴 알코올	6.5 %
세틸 알코올	3.5 %
소르비탄 모노스테아레이트	3.0 %
폴리소르베이트 60	2.0 %
이소프로필 미리스테이트	1.0 %
무수 나트륨 설파이트	0.2 %
폴리소르베이트 80	0.1 %
정제수	61.7 %

스테아릴 알코올, 세틸알코올, 소르비탄 모노스테아레이트 및 이소프로필 미리스테이트를 이중벽 용기에 도입시키고 혼합물이 완전히 용융될 때까지 가열하였다. 이 혼합물을 70 내지 75 ℃에서 액체에 대한 균질기를 사용하면서 따로 제조한 정제수, 프로필렌 글리콜 및 폴리소르베이트 60의 혼합물에 가하였다. 생성된 에멀젼을 계속 혼합하면서 25 ℃미만으로 냉각시켰다. MMPS, 폴리소르베이트 80 및 정제수의 용액 및 정제수 중의 무수 나트륨 설파이트 용액을 이어서 계속 혼합하면서 에멀젼에 가하였다. 크림을 균질화시키고 적당한 튜브에 충전시켰다.

<제형예 2: MMPS 2 % 국소용 젤>

[표 2]

성분	함량(중량%)
상기 실시예 1의 MMPS	2.0 %
프로필렌 글리콜	4.0 %
하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린	25.0 %
에틸 알코올 95 % (v/v)	4.0 %
카라기난 PJ	1.0 %

염산을 용액이 될 때까지 적당량을 가하였다. 수산화 나트륨을 pH 6.0 이 될 때까지 적당량을 가하였다. 정제수를 적당량을 가하여 100 mg 이 되게 하였다.

정제수 중의 하이드록시프로필 베타-사이클로덱스트린의 용액에 교반하면서 MMPS를 가하였다. 염산을 용액이 될 때까지 가하고 이어서 수산화나트륨을 pH 6.0 이 될 때까지 가하였다. 이 용액을 혼합하면서 프로필렌 글리콜 중의 카라기난 PJ의 분산액에 가하였다. 서서히 혼합하면서 혼합물을 50 ℃로 가열하고 에틸 알코올을 가하여 약 35 ℃로 냉각시켰다. 정제수의 잔량을 가하고 혼합물을 균질할 때까지 혼합하였다.

<제형예 3: MMPS 나노분산액>

[표 3]

MMPS 나노분산액 전상

성분	함량(중량%)
상기 실시예 1의 MMPS	36.6 %
포스파티딜 콜린	9.0 %
폴리솔베이트 80	34.0 %
에틸 알코올	7.4 %
미글리올 812	13.0 %

미글리올 812, MMPS 및 폴리솔베이트 80을 혼합하였다. 포스파티딜 콜린을 에탄올에 용해시키고 상기 혼합물에 가하여 균질성 투명 액체를 얻었다.

[표 4]

MMPS 나노분산액 수상

성분	함량(중량%)
상기 실시예 1의 MMPS	2.0 %
포스파티딜 콜린	0.49 %
폴리솔베이트 80	1.86 %
에틸 알코올	0.63 %
미글리올 812	0.71 %
정제수	100.0 % 가 되도록 첨가

MMPS를 함유하는 수상 (예를 들어 94.54 g)을 교반시키면서 50 ℃에서 용기 내에 두었다. 액체 나노분산액 전상 (예를 들어 5.46 g)을 교반시키면서 수상에 가하였다.

상기 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 MMPS 및 그를 포함하는 염은 스핑고신키나아제(Sphingosine kinase)의 활성을 뛰어나게 억제하여 스핑고신키나아제에 의해 세라마이드와 스핑고신이 인산화되는 것을 막음으로써 세라마이드와 스핑고신의 농도를 높게 유지시켜 이에 의해 암세포의 아폽토시스를 유발함으로 항암 활성을 나타내며, 또한 스핑고신키나아제의 세포 증식 촉진 활성을 억제하여 항암 효과를 나타내므로 이를 함유하는 조성물은 스핑고신키나아제 억제용 조성물, 과증식성 질환 또는 암의 치료 또는 예방을 위한 항암용 조성물로써 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

삭제
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고, 스핑고신키나아제를 억제하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.

[화학식 1]
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고, 아폽토시스를 유도하는 것을 특징으로 하는 암 치료 또는 예방용 조성물.

[화학식 1]
삭제
하기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건선 치료 또는 예방용 조성물.

[화학식 1]
하기 화학식 1로 표시되는 모노메틸파이토스핑고신(MMPS) 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 또는 예방을 위한 항암용 조성물.

[화학식 1]