KR100684916B1 - 베타 글루칸을 유효성분으로 포함하는 골절치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 β-글루칸을 유효성분으로 포함하는 골절 치료용 조성물에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 β-글루칸은 β-1,3/1,6 결합을 가지며, 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) SM2001로부터 생산되는 것으로 골화 작용을 촉진하여 골절 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
골절, 베타-글루칸, 가골

Description

베타 글루칸을 유효성분으로 포함하는 골절치료용 약학 조성물 {A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR FRACTURE HEALING COMPRISING BETA-GLUCAN AS AN EFFECTIVE INGREDIENT}
도 1은 매체 대조군 (A)와 비교하여, 31.25mg/kg (B); 62.5mg/kg(C); 125mg/kg (D)의 글루칸 및 10㎍/kg PTH (E)가 투여된 SD 래트 모델에서의 가골의 감소를 보여주는 늑골의 사진이다.
도 2는 매체 대조군 (A)와 비교하여, 31.25mg/kg (B); 62.5mg/kg(C); 125mg/kg (D)의 글루칸 및 10㎍/kg hPTH (E)가 투여된 골절 SD 래트 모델에서의 활성화된 연골의 골화 및 이에 따른 골성조직의 증가를 보여주는 늑골부위의 조직병리학적 검사 사진이다.
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본 발명은 비단백질성 골절 치료제 분야에 속하는 것으로, 구체적으로는 β-글루칸, 보다 구체적으로는 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 골절 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
골절이란 강한 외력이 작용하여 뼈가 부분적으로 또는 완전히 이단된 상태를 의미하는 것으로, 일시적인 큰 외력에 의한 외상성 골절, 만성적인 가압에 의한 지속골절 또는 피로골절, 병적으로 조직이 침해되어 발생하는 병적 골절로 분류될 수 있다. 현재, 미국에서만 매년 약 8백만 건의 골절이 발생하며, 이들 골절의 5-10%는 골절된 부위의 유합이 지연되거나 또는 유합되지 않는 심각한 상태로 증상이 발전하게 된다 [Weitzel and Esterhai, 1994; Melton, 1995].
또한 골절이란 뼈나 골단판 또는 관절면의 연속성이 비정상적으로 끊어진 상태로서 일반적으로 뼈의 깨짐을 일컫는다. 골절을 유발하는 원인으로서는 교통사고 등의 외상, 산업장애에서 일어나는 안전사고 및 산업재해의 결과 골다공증 등의 질병으로 인한 뼈의 변화 및 스포츠나 하중으로 인한 반복적인 뼈에 대한 스트레스 등이 있다. 골절치유란 골절로 인해 손상된 골 조직이 비연속적인 상태로부터 일련의 생리적 과정을 거쳐 골절에 의한 골의 연속성이 재개되어 궁극적으로 골격 본래의 부하를 견딜 수 있는 정도를 되찾는 복잡한 과정이다 [Frost, 1989]. 이때 완전한 회복이 곤란한 경우, 신체장애를 비롯하여 골절부위의 통증으로 인한 육체적 고통, 심리적 불안, 경제적 손실 등을 주어 개인에 있어 삶의 질을 저하시키고 사회에는 경제적 손해를 초래한다. 일반적으로 골절 치유 과정 동안 혈병, 손상 받은 뼈세포 및 뼈 기질은 큰포식세포에 의해 제거되며, 골절부위 주위에 있는 골막과 골내막의 뼈선조세포는 활발하게 증식하여 골절 주변에 세포성 조직을 형성하고 이들은 골절된 부위로 들어간다. 골절된 부위의 결합조직에서는 작은 연골조각으로부터 연골내골화과정이 일어나거나 막성뼈발생과정을 통해 미성숙한 뼈가 형성된다.
따라서 골절치료제는 결핍된 골의 양적 및 질적 증가가 필요한 골다공증과 같은 다른 골질환 치료제와는 달리, 이러한 복잡한 과정을 촉진시켜 완전한 뼈로의 재생을 촉진시켜야 한다.
골 조직의 형성과 골절 및 치유에 관하여서는 오래전부터 관심의 대상이 되어왔으며, 골절치유 과정을 규명하기 위하여 유전적 요인, 성장기에 따른 영향, 혈액공급에 의한 영향, 고정 방법에 따른 영향, 골 이식의 여부, 기타 치유 촉진인자의 투여 등의 여러 가지 관점에서 많은 연구가 진행되어 왔다 [Kawamura and Urist, 1988].
그러나, 이러한 국소적 골절부위의 치유를 위한 치료제는 매우 한정된 상황이며, 현재 골형성 단백질(BMP2 and BMP7) [Sakou, 1998; Welch et al., 1998b] 및 인간 부갑상샘 호르몬(hPTH) [Cosman and Lindsay, 2004; Skripitz and Aspenberg, 2004]이 골절부위의 치료를 위한 치료제로서 주로 사용되고 있다.
그러나, 상기 치료제는 치료에 요구되는 비용이 고가일 뿐 아니라, 이들의 임상적 효과 및 장기간 사용 시의 안전성이 규명되지 않았다. 나아가, 상기 단백질 및 호르몬 요법에 사용되는 단백질 및 호르몬은 제조가 매우 까다로운 것은 물론, 투여 시 체내에서 항체를 형성한다는 단점을 또한 가지고 있다 [Li et al., 2003].
나아가, 종전에 동물모델에서의 PGE2(prostaglandin E2)의 투여가 골형성 및 가골(callus) 발생을 촉진하는 것으로 보고되었다 [Voegeli and Chapman, 1985; Keller et al., 1992]. 그러나, PGE2는 설사, 졸음증 및 홍조 등을 포함하는 부작용으로 인해서 PGE2를 인간에게 사용하기에는 부적합하다.
그러므로, 상기의 펩티드 또는 단백질 골절 치료제가 갖는 단점을 극복할 수 있으며, 상기 언급한 바대로, 골절치료에 특이적인 비단백질성의 작은 분자를 사용 한 골절 치료제의 개발이 절실히 요구된다.
한편, 현재 선진국에서 화장품, 면역활성촉진제 및 항암제 등 다양한 분야에서 산업적으로 널리 응용되고 있는 비단백질성 천연물질로서 글루칸이 있으며, 인간에의 사용에 있어 그 안정성이 입증되었다. 글루칸은 포도당이 연결된 섬유소 형태의 복합 다당류로서 α-글루칸 및 β-글루칸으로 분류된다. 전자는 일반적으로 식물의 전분 속에 존재하고, 후자는 곡물, 버섯 및 효모의 세포벽 내에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 항암제 등의 다양한 산업 분야에 널리 응용되고 있는 것은 β-글루칸이다.
이러한 효모, 버섯, 보리, 귀리 등 곡물 유래 β-글루칸은 포도당의 연결구조 및 물성에 따라서 β-글루칸 내에서도 특성의 차이를 보인다. 예를 들어 표고버섯의 자실체로부터 분리된 버섯 유래 β-글루칸은 수용성이며, 생체 내에서 감염방어 등의 면역기능을 나타내는 보체계를 활성시켜 면역기능을 획기적으로 증진시키며, 항종양효과를 발휘한다고 알려져 있으며 [Czop, 1986; Estrada et al., 1997], 곡류인 보리, 귀리 등의 세포벽에 존재하는 β-글루칸은 혈중 콜레스테롤의 강하에 탁월한 효과가 있다고 보고되고 있으나[Lia et al., 1995; Bell et al., 1999], 골절 치료제로서의 용도에 대해서는 알려진 바가 없다.
한국 등록특허공보 제484319호에는 β-글루칸을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있다. 그러나 상기 문헌에는 골절의 치료에 관한 β-글루칸의 용도에 관하여는 전혀 암시 또는 개시되어 있지 않다.
Kruger 등 및 Luegmayr 등은 다당류가 골형성에 어느 정도의 효과가 있음을 개시한 바 있으나 [Kruger et al., 2003; Luegmayr et al., 2004], 구체적인 다당류의 종류 및 이의 구체적인 용도에 관하여는 전혀 언급하지 않았다.
Grundnes 및 Reikeraas은 귀리 유래의 글루칸을 골형성 촉진을 위해 사용하는 것에 관하여 개시한 바 있으나, 글루칸에 의해 유도된 면역반응으로 인해 골형성 촉진에 효과가 없음을 기재하고 있다[Grundnes and Reikeraas, 2000].
이에 본 발명은 상기와 같은 종래 골절의 치료에 사용될 수 있는 골형성 치료제의 문제점을 인식하여 완성된 것으로, 이를 대체할 있는 비단백질/펩티드성, 비면역원성의 안전한 천연물질을 탐색하던 중, 분지형 구조를 갖는 특정 구조의 수용성 β-글루칸이 골절 치료에 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 골절의 치료에 효과적으로 사용될 수 있는 비단백질성 천연 물질 유래의 골절치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적달성을 위해 본 발명은 β-1,3 결합으로 연결된 포도당 주쇄를 포함하고, 상기 포도당중 적어도 하나는 분지된 포도당과 β-1,6 결합으로 연결된 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하는 골절 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 β-1,3/1,6-글루칸이 아우레오바시디움 플루란스 SM2001 유래인 것을 특징으로 하는 골절 치료용 약학 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 β-글루칸을 유효성분으로 포함하는 골절 치료용 약학 조성물을 제공한다.
글루칸은 상기 배경기술에서 언급한 대로 효모, 귀리 또는 보리, 및 예컨대 마이타케 버섯과 같은 의학적 용도로 사용되는 버섯류의 세포벽에서 발견되는 복합 다당류로서, 본 발명의 효과를 나타내는 다양한 식물 및 균류 유래의 β-글루칸이 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다.
특히, 상기 β-글루칸은 β-1,3 결합으로 연결된 포도당 주쇄를 포함하고, 상기 포도당 중 적어도 하나는 분지된 포도당과 β-1,6 결합으로 연결된 구조의 수용성 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체이다.
구체적으로, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 β-1,3 결합으로 연결된 포도당 5 분자당 한 분자의 포도당이 β-1,6 결합된, β-1,3 및 β-1,6 결합이 서로 혼재되어 있는 분지형의 β-글루칸(branched β-glucan)이다. 이러한 β-1,3 결합 이외에 β-1,6 결합으로 인해 직쇄형의 다른 β-글루칸보다 생리활성이 높다.
상기 β-1,3/1,6-글루칸은 결정화도가 낮은 무정형 구조를 가지며, 분자량이 수십만에서 수백만에 이른다. 또한 젖산기가 주 사슬에서 분지된 포도당에 치환되어 있어 물에 용이하게 용해되는 수용성의 산성 다당류로서 경구투여에 적합한 장점이 있다.
수용성 β-글루칸은 불용성인 것보다 면역조절능력 및 항종양 활성의 증대 등의 생리활성 면에서도 향상된 결과를 나타낸다 (Seljelid, R. A, 1986; Zhanga, M. et al, 2004; Williams, D. L.et al, 1992; Darina Slamenovaa, D. et al, 2003). 본원 발명에서 사용된 용어 유도체는 당업계의 공지된 용어로서, 분지쇄의 포도당의 하이드록실기가 예를 들면 카르복시메틸기, 황산기, 아민기, 그리고 설포에틸기 등으로 치환되어 수용성화된 β-글루칸을 포함하는 것이다.
특히, 상기의 특성을 갖는 β-1,3/1,6-글루칸은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
Figure 112005060912535-pat00001
(상기 화학식 1에서, n은 1 내지 약 4,000이며 X는 젖산기가 대표적이며 이외에도 예를 들면, 말레산 또는 설포아세트산 등이 있다.)
보다 특히, 상기 글루칸은 본 출원인의 한국 특허등록 제0443209호의 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans )의 변종인 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 (KCCM 10307) 유래이며, 당업계의 공지된 β-글루칸의 제조방법 또는 상기 특허 명세서에 기재된 방법대로 제조될 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 유래의 β- 1,3/1,6-글루칸을, 당업계에서 골절 치료제의 유효성을 평가하기 위한 골절 모델[Connolly et al., 1978; Shih and Norrdin, 1987; Hashimoto et al., 1989; Vinther et al., 2005]로서 널리 사용되는 골절 유도된 래트 모델(SD 래트모델)에 투여한 결과, 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸이 특히 골화(ossification)를 촉진함으로써, 골절 치료에 있어, 종전에 사용된 hPTH와 비교하여 대등하거나 우수한 효과를 달성하는 것을 확인하였다.
본 명세서에 사용된 용어 "골절"은 강한 외력이 작용하여 뼈가 부분적으로 또는 완전히 이단된 상태를 의미하는 것으로, 일시적 큰 외력에 의한 외상성 골절, 만성적인 가압에 의한 지속골절 또는 피로골절, 병적으로 조직이 침해되어 발생하는 병적 골절을 모두 포함한다.
이러한 골절은 긴통뼈, 예를 들면 넙적다리뼈 및 자뼈, 및 납작뼈 예를 들면 머리뼈 등에서 일어난다. 통상적 골절의 치료는 골절부위를 정위치에 접착시켜 양쪽의 골유합이 될 때까지 부동으로 고정시키는 것을 포함하며, 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 조성물은 상기 통상적 치료와 함께 병행하여 사용될 수 있다.
본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체는 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 투여될 수도 있고, 또한 단독으로 또는 골절 치료제로서의 효능 증진을 위해 다른 약학적 활성성분 및/또는 칼슘이나 비타민 D3과 조합하여 투여될 수 있다.
이외에도 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체를 포함하는 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 희석제, 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등의 부형제를 더 포함할 수 있다. 구체적으로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘, 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 β-1,3/1,6 글루칸을 포함하는 골절 치료용 약학 조성물의 투여방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 산제, 정제, 환제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 액, 에멀젼, 현탄액, 시럽제, 엘릭서, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 등의 형태로 제형화되어 전신적으로 또는 국소적으로 경구 또는 비경구 투여될 수 있으며, 특히 경구 투여가 바람직하다.
경구 투여를 위한 고형 제형에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제형은 β-1,3/1,6-글루칸에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 슈크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제형으로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
더 나아가 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 약학 조성물은 당해 기술 분야의 공지된 적절한 방법을 사용하여 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 바람직하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양할 수 있으나, 약학 조성물 중 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체의 유효 투여량은 통상적으로 성인(70kg)의 경우, 1일당 0.1 내지 1000mg/kg이며, 하루 1 내지 수회 투여될 수 있다. 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동가능하기 때문에, 상기 투여량에 가감이 있을 수 있다는 사실은 당업자에게 자명하며, 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
투여횟수는 원하는 범위 내에서 하루에 1회, 또는 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 투여 기간도 특별히 한정되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물은 그대로 경구투여하는 것 이외에, 임의의 음식물에 첨가하여 일상적으로 섭취할 수도 있다.
본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인 간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸 또는 이의 유도체를 포함하는 약학 조성물은 우수한 골절치료 효과를 제공할 뿐만 아니라, 약물에 의한 독성 및 부작용도 없어 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 골절치료에 사용된 약물 및 투여
실시예 1-1 아우레오바시디움 풀루란스 SM -2001 유래의 β-1,3/1,6- 글루칸의 제조
아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 유래의 β-1,3/1,6-글루칸은 한국 특허등록 제0443209호에 기재된 대로 분말로 제조하였다.
요약하면, 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001(KCCM 10307)를 탄소원으로서 포도당을 포함하는 배양배지에 접종 후, 30℃에서 3일간 진탕배양하였다. 상기 배양액을 원심분리하여 상등액을 회수한 후, 95% 에탄올로 추출하여 투석한 후, 이를 진공 동결건조하여 수용성 β-1,3/1,6- 글루칸을 제조하였다. 제조된 상기 글루칸은 사용 전까지 빛이 들어가지 않게 하여 4℃에서 보관하였다.
아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 유래의 β-1,3/1,6-글루칸은 또한 상업적으로 입수가능하다((글루칸 Corp., Korea).
실시예 1-2 hPTH 및 β-1,3/1,6- 글루칸의 투여
아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001 유래의 β-1,3/1,6-글루칸이외에, 양성 대조군으로서 hPTH(1-34; Sigma, USA)를 사용하였다.
실험동물에 투여하기 위해, 실시예 1-1에 따라 제조된 β-1,3/1,6-글루칸을 총부피 2ml 중에 31.25, 62.5 및 125mg/kg의 양으로 증류수로 희석하였다. 이어서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸 용액을 랫트 경구용 존데(sonde)가 달린 3ml 주사기를 사용하여, 하기 실시에 2에 따라 준비된 실험 동물에 늑골 골절 6시간 후부터 매일 14일간 경구 투여하였다. hPTH는 10㎍을 생리 식염수에 녹여 실험동물 체중당 2ml의 농도로 상기와 동일한 기간 동안 피하주사로 투여하였다. 자세한 투여량을 하기 표 1에 정리하였다.
그룹 투여량 마릿수 그룹 명칭 매체 투여경로 투여횟수
골절 유발 매체 대조군 매체 6 매체 대조군 증류수 경구 14일 간 매일 일 회
인간 부갑상샘 호르몬 10㎍/kg 6 hPTH 식염수 피하
β-1,3/1,6-글루칸 31.25mg/kg 6 G31.25 증류수 경구
β-1,3/1,6-글루칸 62.5ml/kg 6 G62.5 증류수 경구
β-1,3/1,6-글루칸 125mg/kg 6 G125 증류수 경구
실시예 2 실험동물에서의 골절 유발
30 마리의 암컷 SD 랫트(8주령, Charles River, Japan)를 본 실험에 사용하였다. 상기 실험동물을 염산 자일라진(Wako Pure Chemical Industries Ltd., Japan) 및 염산 케타민(ICN Biochemicals Inc., USA)으로 마취하고, 일반 외과수술 방법으로 피부를 절제하여 늑골을 노출시킨 다음, 7 및 8번 늑골을 가로로 완전히 절단하여 골절을 유발한 다음 봉합하였다.
실시예 3 아우레오바시디움 풀루란스 SM -2001 유래의 β-1,3/1,6- 글루칸의 골절 치료에 대한 효과
β-1,3/1,6-글루칸의 골절 치료에 대한 효과를 조사하기 위해, 실시예 1에 따라 제조된 β-1,3/1,6-글루칸 및 양성 대조군으로서 hPTH를 실시예 2에 따라 골절 유발된 래트에 표 1의 투여량으로 투여한 후, 14일째에 희생시켜, 하기와 같이 체중 및 증체량의 변화, 가골 부피의 변화, 가골 밀도의 변화, 가골 강도의 변화를 관찰하고, 조직병리학적 검사를 수행하였다.
모든 데이터는 평균±표준편차로 나타냈다. 각 투여그룹 당 개체수는 6마리이며, 통계 분석은 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test (MW test)로 SPSS for Windows (Release 6.1.3., SPSS Inc., USA)를 이용하여 수행하였으며, 매체 대조군에 대한 백분율 변화(PC)는 하기의 식으로부터 계산하였다:
PC vs 매체 대조군(%)= [(시험군의 데이터-매체 대조군의 데이터)]/매체 대조군의 데이터] x 100
실시예 3-1 체중 변화 및 증체량의 측정
체중의 변화는 골절 유발 수술 하루 전, 수술 직후, 수술 후 시험 약물(β-1,3/1,6 -글루칸 및 hPTH) 투여 1, 7 및 13일 후에 각각 측정하였다. 체중을 측정하기 전 각 실험동물은 식이에 의한 오류를 감소시키기 위해 밤새 절식시켰다. 체중 변화 및 증체량은 하기의 식으로부터 계산된다:
증체량 (g) = 최종 희생일의 체중 - 투여 개시일의 체중
결과는 하기 표 2에 요약하였다.
체중(g) 수술 전 수술 직 후 투여시1) 투여 후 경과일 수 희생시2)
1 days 7 days 13 days
매체 대조군 208.33±8.07 202.50±10.75 212.50±9.91 232.00±14.38 237.17±13.20 219.17±11.05
hPTH 218.83±8.86 204.1±7.31 212.17±9.91 227.67±11.71 239.83±10.15 221.83±8.59
G31.25 207.67±9.29 200.83±7.68 214.83±8.16 230.17±16.47 237.67±12.31 221.83±11.39
G62.5 211.50±5.75 204.17±6.11 215.83±8.35 234.33±12.44 248.83±13.32 231.67±10.25#
G125 209.67±11.20 201.83±12.12 216.50±10.09 230.33±8.71 238.00±14.53 228.00±12.93
변화 변화 1
매체 대조군 16.67±13.92
hPTH [PC]3) 17.6±4.89 [6.00]
G31.25 [PC] 21.00±7.46 [26.00]
G62.5 [PC] 27.59±11.59 [65.00]
G125 [PC] 26.17±11.34 [57.00] #
각 투여그룹 별 명칭은 표 1과 같다; 1) 절식한 다음 투여 시작일를 의미한다; 2) 수술 후 14일째에 희생시킨 것을 의미한다; 3) PC= 백분율(%) 변화 vs 매체 대조군; #는 MW test에 의해 매체 대조군과 비교하여 p<0.05이다.
표 2에서 보는 바와 같이, 모든 글루칸 투여그룹에서 전반적으로 체중의 증가 경향이 관찰되었으며, 실험 전 기간 동안의 증체량 역시 증가되는 경향을 나타내었으나, 매체 대조군과 비교하여 유의성 있는 체중의 증가 및 증체량은 관찰되지 않았다.
이러한 글루칸 투여 후의 체중의 증가는 독성 및 그 외 다른 현상으로 인한 것이라기 보다는 글루칸의 약리학적 효과에 기인하는 것이다.
실시예 3-2 가골 부피의 측정
상기 언급한 바대로, 늑골 골절된 랫트를 14일째 희생시켜, 7번째 및 8번째 늑골을 적출하여 가골의 장축 및 단축을 mm 단위로 측정하였다. 가골의 부피는 하기와 같이 계산된다:
가골의 부피(mm3) = 1/2(a x b2)
식 중에서, a는 장축의 길이이고, b는 단축의 길이임.
측정 결과는 표 3에 요약하였으며, 또한 전반적인 형태의 변화를 도 1에 나타냈다.
가골부피 장축 ( mm ) 단축 ( mm ) 부피 ( mm 3 )
매체 대조군 6.05±0.84 3.49±0.26 37.22±8.23
hPTH [PC]1) 4.80±0.63 2.86±0.30 19.82±4.97#[-46.75]
G31.25 [PC] 5.49±0.57 3.02±0.51 25.48±8.02#[-31.55]
G62.5 [PC] 5.20±0.47 3.04±0.39 24.39±7.21#[-34.48]
G125 [PC] 5.20±0.36 3.04±0.40 24.13±5.88#[-35.18]
각 투여그룹 별 명칭은 표 1과 같다; 1) PC= 백분율(%) 변화 vs 매체 대조군; #는 MW test에 의해 매체 대조군과 비교하여 p<0.01이다.
표 3 및 도 1에서 보는 바와 같이 모든 투여그룹에서 매체 대조군과 비교하여, 투여량에 의존적인 가골 부피에 있어 유의적 감소를 나타냈다. 구체적으로 매체만을 투여한 매체 대조군과 비교하여 β-1,3/1,6-글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹 및 hPTH 투여그룹에서 각각 -31.55, -34.48, -35.18 및 -46.75%의 감소를 나타냈다.
골절 후 치유 과정에서 가골의 형성은 매우 중요하며 초기에는 부피가 증가하는 경향이 있으나, 골절된 뼈가 유합되면서 치유가 진행됨에 따라 그 부피가 감소하게 된다[Ross et al., 1995]. 일반적으로 골화 및 치유가 진행되면, 가골 부피는 감소하면서, 골화에 의한 골밀도 및 골강도는 증가하게 된다[Amanat et al., 2005; Eckardt et al., 2005].
따라서, 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸의 처리에 의한 매체 대조군과 비교한 가골 부피의 감소는 β-1,3/1,6-글루칸이 골절 치료에 직접적 효과가 있음을 나타내는 것이다.
실시예 3-3 가골 밀도 및 강도의 변화
실시예 3-2에서 적출된 8번째 늑골의 가골 중앙 부위의 밀도(BMD, bone mineral density) 및 강도를 측정하였다. 골밀도는 X-ray 흡수계측기(DEXA, PXImus; Lunar Medison WI)를 이용하여 측정하였으며, 결과는 단위는 mg/cm2으로 표시하였다. 골강도(FL, failure load)는 컴퓨터 검사장비 (Instron 6022; Instron, USA, speed 20mm/min)를 이용하여 3지점 굽힘 골절 검사(three point bending test)로 측정하였으며, 단위는 Newton (N)으로 환산하였다.
결과는 표 4에 나타냈다.
투여그룹 BMD (mg/cm2) FL (N )
매체 대조군 0.215±0.023 1.783±0.331
hPTH [PC]1) 0.288±0.024# [34.11] 2.857±0.171# [60.19]
G31.25 [PC] 0.252±0.023## [32.56] 2.317±0.278## [29.91]
G62.5 [PC] 0.285±0.038## [34.88] 2.587±0.425## [45.05]
G125 [PC] 0.290±0.049## [34.88] 2.875±0.242# [61.21]
각 투여그룹 별 명칭은 표 1과 같다; 1) PC= 백분율(%) 변화 vs 매체 대조군; MW test에 의해 매체 대조군과 비교하여 #는 p<0.01 및 ##는 p<0.05 이다.
표 4에서 보는 바와 같이 매체 대조군과 비교하여 모든 투여그룹에서 골밀도(BMD) 및 골강도(FL)에 있어 유의적 증가를 나타냈다. 구체적으로 골밀도에 있어서, β-1,3/1,6-글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹 및 hPTH 투여그룹에서 각각 17.05, 32.56, 34.88 및 34.11%의 증가를 나타냈으며, 골강도에서는 각각 29.91, 45.05, 61.21 and 60.19%의 증가를 나타냈다.
골절에 있어 골밀도 및 골강도는 표적 약물의 효능을 예측하는 중요한 지표로 작용한다[Horcajada-Molteni et al., 2000; Bilston et al., 2002].
따라서, 상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸이 골절 치료에 있어 종전 호르몬 치료제와 대등한 효과를 나타낸다는 것을 증명하는 것이다. 나아가, β-1,3/1,6-글루칸은 호르몬 제제에 비해 제조가 용이하고, 저렴하며, 경구투여가 가능한 것은 물론 면역유발성 및 부작용이 적은 것을 고려하면, 상기 결과는 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸이 종전의 치료제를 대체할 수 있는 우수한 골절 치료제라는 것을 증명하는 것이다.
실시예 3-4 조직병리학적 검사
조직병리학적 검사를 위해, 골절 부위를 포함하는 상기 실시예 3-2에서 적출된 7번째 늑골을 10%의 중성 pH로 완충된 포르말린(NBF)에 12시간 동안 고정시킨 후, 칼슘제거 용액 [24.4% 포름산, 0.5N 수산화나트륨]에서 5일 동안 두어 칼슘을 제거하였으며, 상기 용액은 매일 교환하였다. 칼슘제거 후에 공지된 방법에 따라 파라핀에 상기 늑골을 매몰시켜 3~4μm 두께의 절편으로 절단한 후 Masson 염색을 실시하였다.
가골의 조직학적 측정 지표로서 가골에서의 결합조직부피(CtV/callus); 연골부피(CV/callus) 및 골부피 (OV/callus)를 매체 대조군과 비교한 감소 또는 증가 %로, 그리고 단위면적당 가골부위의 파골세포 수(Ocn/Callus)(N/mm2)를 측정하였다. 상기 측정은 현미경(Zeiss, Germany)에 장착된 자동화 영상 분석기(ANALYSIS Image Processing; SIS, Germany)를 이용하여 현미경하에서 수행하였다.
결과는 표 5에 나타냈다.
Histomorph 1 ) Ocn / Callus 가골의 구성
CtV / Callus CV / Callus OV / Callus
매체 대조군 6.67±2.25 43.82±3.93 38.41±3.02 17.77±3.30
hPTH [PC]2) 17.50±2.88 [162.50]# 30.62±9.86 [-30.12]# 26.58±5.05 [-30.80]# 42.80±7.03 [140.86]#
G31.25 [PC] 9.00±2.10 [35.00] 34.46±8.56 [-21.36] 34.87±6.94 [-9.22] 30.67±6.52 [72.58]##
G62.5 [PC] 11.50±3.08 [72.50]## 33.43±3.70 [-24.57]# 29.56±4.93 [-23.05]## 37.02±3.98 [108.30]#
G125 [PC] 11.67±1.75 [75.00]# 33.06±9.66 [-24.57]# 25.18±6.25 [-34.45]# 41.777 7.03 [140.86]#
각 투여그룹 별 명칭은 표 1과 같다; 1) PC= 백분율(%) 변화 vs 매체 대조군; MW test에 의해 매체 대조군과 비교하여 #는 p<0.01 및 ##는 p<0.05 이다.
상기 표 5에 해당하는 각 투여그룹의 조직병리학적 검사 사진은 도 2에 있다. 도 2 및 표 5에서 보는 바와 같이 매체 대조군(A)에서는 신생 결합조직, 연골조직 및 골조직으로 구성된 전형적인 가골조직 소견이 관찰되었으며, 일부 연골에서는 연골내 골화에 의한 골조직의 형성이 관찰되었다. 한편 hPTH 투여그룹을 포함한 모든 투여그룹에서도 매체 대조군과 유사한 구성의 가골이 관찰되었으나, 연골내 골화가 더 활발히 진행되는 것으로 관찰되었으며, 이로 인한 골조직의 비율 증가가 관찰되었다.
즉, 가골내 골조직의 비율(ostoid tissue volume(OV)/Callus)이 hPTH 투여그룹을 포함한 모든 투여그룹에서 매체 대조군과 비교하여 유의적으로(p<0.01 또는 p<0.05)증가되었으며, 이로 인해, 가골내 결합조직(Connective tissue volume(CtV)/Callus) 및 연골(Cartilaginous volume(CV)/Callus) 비율은 매체 대조군에 비해 현저히 감소되었다. 한편 가골내 파골세포 수(Osteoclast cell number(Ocn)/Callus) 역시 모든 투여그룹에서 매체 대조군에 비해 유의적으로(p<0.01 또는 p<0.05) 또는 현저히 증가되었다. 상기와 같은 변화는 글루칸 투여그룹에서 투여 용량 의존적이었다.
구체적으로, OV/Callus 는 글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹, hPTH 투여그룹에서 매체 대조군에 비해 각각 72.58, 108.30, 135.05 및 140.86%의 변화를 나타내었다.
CtV/Callus 는 글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹, hPTH 투여그룹에서 매체 대조군에 비해 각각-21.36, -23.72, -24.57 및 -30.1%의 변화를 나타내었다.
CV/Callus 는 글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹, hPTH 투여그룹에서 매체 대조군에 비해 각각 -9.22, -23.05, -34.45 및 -30.80%의 변화를 나타내었다.
Ocn/Callus 는 글루칸 31.25, 62.5 및 125mg/kg 투여그룹, hPTH 투여그룹에서 매체 대조군에 비해 각각 35.00, 72.50, 75.00 및 162.50%의 변화를 나타내었다.
일반적으로 골절에 의해 유도된 가골은 신생 결합조직, 골조직 및 연골조직으로 구성되며, 골절의 치유가 진행되면서, 골조직은 증가하며 그 결과 다른 조직은 감소하게 된다. 따라서 골절 치유에 따른 이러한 가골구성 성분의 변화는 치료 약물의 효능을 측정하는 훌륭한 지표가 될 수 있다[Grills et al., 1997; Kim et al., 1998; Welch et al., 1998a; Li et al., 1999; Seo et al., 2000; Follak et al., 2005].
그러므로, 이러한 사실은 본 실시예의 결과와 일치하는 것으로 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸이 골절의 치유에 우수한 효과가 있음을 증명하는 것이다.
즉, 상기와 같은 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸 투여그룹에서의 가골을 구성하는 조직의 투여량 의존적 변화는, 본 발명에 따른 β-1,3/1,6-글루칸이 골절 치료에 있어 종전 호르몬 치료제와 대등한 효과를 나타낸다는 것을 증명하는 것이다. 나아가, β-1,3/1,6-글루칸은 호르몬 제제에 비해 제조가 용이하고, 저렴하며, 경구투여가 가능한 것은 물론 면역유발성 및 부작용이 적은 것을 고려하면, 상기 결과는 본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸이 종전의 치료제를 대체할 수 있는 우수한 골절 치료제라는 것을 증명하는 것이다.
본 발명의 β-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 조성물은 골절의 치료에 있어서 종전의 호르몬제제와 대등하거나 월등한 효과를 가질 뿐 아니라, 종전에 호르몬에 비해 제조가 용이하고, 저렴하며, 주사에 비하여 용이한 경구투여가 가능한 것은 물론, 면역유발성 및 부작용이 월등히 낮기 때문에, 투여방법, 부작용, 안전성 및 비용 등에서 문제가 되는 종전의 호르몬 제제를 대체하여 사용될 수 있다.

Claims (4)

  1. β-1,3 결합으로 연결된 포도당 주쇄를 포함하고, 상기 포도당중 적어도 하나는 분지된 포도당과 β-1,6 결합으로 연결된 β-1,3/1,6-글루칸을 유효성분으로 포함하는 골절 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 β-1,3/1,6-글루칸은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 골절 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112005060912535-pat00002
    [식 중에서, n은 1 내지 약 4,000이며 X는 젖산,말레산 또는 설포아세트산임]
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, β-1,3/1,6-글루칸은 아우레오바시디움 플루란스(Aureobasidium pullulans) SM2001 유래인 것을 특징으로 하는 골절 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, β-1,3/1,6-글루칸은 경구투여되는 것을 특징으로 하는 골절 치료용 약학 조성물.
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