KR100684436B1 - 항산화, 지질과산화 억제에 따른 항노화, 항염증 및 거담 활성을 갖는 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 활성상소에대한 항산화효과, 지방 또는 세포막 지질과산화 억제효과, 항염증 활성 및 거담효과를 갖는 단풍마(Dioscorea quinqueloba)의 및 가시오가피(Acanthopanax senticocus) 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 DPPH에 의해 유래되는 활성산소를 이용한 실험에서 항산화 효과를 나타내고 이에 따른 지질 과산화 생성을 감소시켜 세포의 사멸을 억제함으로서 염증을 억제하고 또한 마우스 족(足)의 염증 및 부종 억제효과 및 거담효과를 확인하여 노화를 촉진하는 각종 활성산소의 지질과 산화에 기인하는 세포의 노화 및 혈관 및 혈구의 지질과산화에 따른 동맥경화 및 이와 관련된 염증 관련 질환과 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품으로 사용될 수 있다.

항산화, 과산화지질, 단풍마, 가시오가피, TBARS, 염증, 거담

Description

항산화, 지질과산화 억제에 따른 항노화, 항염증 및 거담 활성을 갖는 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 함유하는 조성물{Composition comprising the extract of Dioscorea quinqueloba and Acanthopanax senticosus showing anti-oxidative, anti-aging by anti-lipidperoxidative, anti-inflammatory and discharge of phlegm activity}

도 1은 DPPH에 의한 항산화능 실험을 개략적으로 나타낸 도이며,

도 2는 Cu^{2 +}에 의해 산화가 야기된 LDL에서의 지질과산화물(TBARS)법에 의한 억제 효과 측정 실험을 개략적으로 나타낸 도이고,

도 3은 카라기닌(carrageenin)으로 유도된 마우스에서 부종억제 효과에 대한 실험을 개략적으로 나타낸 도이며,

도 4는 뮤신(mucin)을 이용한 유동성 측정실험을 개략적으로 나타낸 도이고,

도 5는 페놀레드(phenol red)를 이용한 기도에서의 점액분비량 측정 실험을 개략적으로 나타낸 도이고,

도 6은 DPPH를 이용한 항산화능 실험에서 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 전자공여능을 나타낸 도이며,

도 7은 DPPH를 이용한 항산화능 실험에서 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 의 IC₅₀값을 나타낸 도이고,

도 8은 TBARS법을 이용하여 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물이 LDL 지질과산화에 미치는 영향을 나타낸 도이며,

도 9는 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 LDL 지질과산화 억제효과를 IC₅₀값으로 나타낸 도이고,

도 10은 카라기닌(carrageenin)으로 유발한 쥐의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 투여에 의한 족(足)부종 증가율을 나타낸 도이고,

도 11은 카라기닌으로 유발한 쥐의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 투여에 의한 족부종 억제율을 나타낸 도이며,

도 12는 뮤신(mucin)을 이용하여 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 투여가 유동성 변화에 미치는 영향을 타나낸 도이고,

도 13은 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 첨가 용량에 따른 페놀레드(phenol red)분비량을 나타낸 도이다.

노화를 촉진하는 각종 활성산소의 지질과 산화에 기인하는 세포의 노화 및 혈관 및 혈구의 지질과산화에 따른 동맥경화 및 이와 관련된 염증 관련 질환과 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품 조성물에 관한 것이다.

최근 산업사회의 발달로 경제적인 여유와 문화적인 혜택을 누리고 있으나 이로 인한 환경오염 및 과영양화로 우리들의 생명이 직, 간접적으로 위협을 받고 있다. 따라서 현대인들의 건강에 대한 관심은 그 어느 때보다 높으며, 그 중 건강유지나 생체리듬을 조절하는 효능을 지니는 기능성 식품에 대한 관심이 높아서 최근 연구의 중점대상이 되고 있다.

인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용하여 에너지 대사를 진행하며 그 과정에서 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기능을 갖고 있지만 조직의 방어능 이상의 활성산소의 생산은 노화 및 노화와 관련된 퇴행성 질환과 동맥경화증, 고혈압, 당뇨, 관절염, 순환기 장애 뿐 아니라 암과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다는 산소 유해설이 최근 점차 인정을 받고 있다.

흔히 유해산소라고 불리어지는 활성산소는 가장 안전한 형태의 산소인 삼중항 산소(triplet oxygen; ³O₂)가 산화, 환원과정에서 환원을 받아 생성되는 단일항 산소(singlet oxygen)인 활성산소(superoxide anion; O₂), 과산화수소(hydrogen peroxide; H₂O₂)과 수산기(hydroxyl radical; ·OH)와 같은 자유기(free radical)로서, 이들이 단백질, DNA, 효소 및 T-세포와 같은 면역계의 인자를 손상시켜 각종 질환을 일으키며, 특히 문제가 되는 것은 활성산소가 세포 생체막의 구성성분인 불 포화 지방산을 공격하여 지질 과산화 반응을 일으켜 체내 과산화 지질을 축적함으로써 생체 기능이 저하되고 동시에 노화 및 성인병 질환을 유발하는 것으로 알려져 있다.

최근 노화와 성인병의 원인이 활성산소에 기인된 것이라는 학설이 점차 인정되면서 활성산소를 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제에 대한 연구가 활발히 진행되어 효소계열의 예방적 항산화제인 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 등과 천연항산화제인 토코페롤(tocopherol), 아스코르빈산(ascorbic acid), 카로테노이드(carotenoid), 글루타치온(glutathione) 및 합성항산화제인 BHA, BHT 등 많은 항산화제가 개발되어 있다.

한편, 노인성 질환 중 기관지 천식은 기침, 호흡 곤란, 가슴 답답함 등과 기관지 경련을 동반하는 질환인데 통계적으로 전 인구의 7~10%를 차지할 정도로 흔히 볼 수 있는 질환이지만 현재까지 나온 치료법에는 이 질환을 확실하게 근절시킬 수가 없는 질환으로 증상이 심할 경우에 임시방편적으로 기관지 확장제 등의 복용으로 치료의 모든 것을 대체하고 있는 실정인 질환이고 요즈음 들어서 환경오염 등으로 인하여 호흡기 관련 질환의 수가 많아지는 경향을 나타내고 있다.

기도점액은 기도에서 여러 가지 중요한 기증을 가진다. 즉, 외부에서 기도로 들어온 입자로부터 기도를 보호하고, 흡입공기의 습도를 유지하고, 흡입된 화학물질이나 가스 등을 점액의 단백질과 결합, 섬모 작용으로 제거하는 역할을 가진다. 또한 점액은 이뮤노글로블린A(IgA), 라이소자임(lysozyme), 락토페린(lactoferrin) 등과 같은 면역 기능에 중요한 역할을 하는 물질을 가지고 있다. 대부분의 거담제는 식물 등을 이용하여 수천 년 동안 민간약 또는 경험처방으로 사용하여왔고, 1989년에 이르러서는 지멘트(Ziment) 등이 점액에 영향을 미치는 약물들에 대해 총괄적인 분류를 하였다.

현재 식물을 이용해서 천식에 사용하는 기전은 크게 2가지로 분류된다. 첫째는 중추신경의 해소중추를 억제하여 효과를 내는 약으로 대표적으로 코데인(codeine)을 들 수 있으나 마약으로서 습관성이 있고, 둘째는 위와 기도의 공통 미주신경을 자극하여 점막의 분비를 촉진시켜 담의 배출을 촉진시키는 기전으로 사포닌(saponin), 아카로이드(akkaloid), 점액질 및 최토제를 들 수 있으며 대표적으로 길경 및 석산 등을 예로 들 수 있다.

이상과 같이 사포닌을 함유하는 식물들의 기전은 주로 위의 점막을 자극함으로서 그 작용점이 동일한 기관지의 점막이 자극되어 점액의 분비를 촉진시킴과 동시에 사포닌의 계면활성작용에 의해 담의 배출을 촉진하여 거담작용을 함으로서 해수를 억제한다.

본 실험의 주재료인 단풍마(Dioscorea quinqueloba)는 마과(Dioscoreaceae)에 속하는 다년생 덩굴성 초본으로 천산룡(穿山龍) 또는 개산약이라고 부르며 우리나라 각지의 산기슭이나 개울가 또는 떨기나무 숲 사이에서 자란다.

줄기에서 가지가 여러 개 갈라지며 주위에 있는 나무줄기가 바위를 감으면서 자란다. 잎자루가 길고 잎 모양은 단풍잎을 닮았으며 손바닥 모양으로 5∼7개 갈라진다. 암수딴그루이며 6∼7월에 꽃이 피어 10월에 날개가 달린 열매가 익는다. 근 연식물로 우리나라에 자생하는 것으로는 마(D. batatas), 국화마(D. septemloba), 도꼬로마(D. tokoro), 참마(D. japonica)등이 분포한다.

단풍마의 성미는 쓰고 성질은 약간 차며 간경 및 폐경으로 귀경한다. 한방학적으로 단풍마는 풍습을 없애고 혈을 잘 돌게 하며 경락을 통하게 하며 담을 삭이고 기침을 멈추는 것으로 알려져 있다.

현재까지 단풍마의 성분 및 약리활성에 대한 연구 자료는 없으나 같은 속인 마과(Dioscorea)에 대해서는 연구가 많이 진행되었으며, 분리 보고 된 성분으로 스테로이드 사포닌(steroid saponin)으로 디오스신(dioscin) 및 디오스게닌(diosgenin)이 그리고 점액질 및 전분이 다량 함유되어 있다.

현재까지의 약리 실험에서 마속(Dioscore) 식물은 핏속의 콜레스테롤을 낮추고 혈압을 내리며, 관상혈관의 혈액순환을 좋게 하고, 기침을 멎게 하여 숨찬 증상을 없애는 작용 등이 밝혀져 보고 되었으며, 민간에서도 마디증, 뼈마디의 운동장애, 통증, 타박상, 갑상선종, 갑상선 기능 항진증, 가래가 있고 기침이 나며 숨이 차는 증상, 만성 기관지염, 동맥 경화증 등을 예방 치료하는데 사용하는 것으로 보고 되고 있다.

이상과 같이 마속의 근연식물에 대한 연구는 많이 진행되었으나 우리나라에 자원으로서 분포도가 높은 단풍마에 대한 성분 및 활성에 대한 연구는 전혀 없는 바 이다.

오가피는 인삼과 같은 두릅나무과에 속하는 낙엽활엽관목으로, 오갈피라고도 하며 우리나라와 중국, 러시아에서도 생산된다.

여러 오가피나무 중에서 가장 유효성분이 많은 것으로 밝혀진 것이 본 발명의 가시오가피이다. 가시오가피는 오대산, 지리산 등과 만주, 시베리아, 훗카이도 등에 자생하고 바늘모양의 가시가 촘촘하게 붙어있는 반면 오가피는 한국 전역에 분포하고 독수리 부리 모양의 가시가 드문드문 박혀있다. 가시오가피는 구소련에서 연구가 활발하게 이루어져 그 효과를 국제 심포지움에서 발표 하기도 했는데, 가시오가피는 생체기관의 전박적인 기능을 증대시켜 주는 촉진작용을 하며, 생체 기관의 환경적응 내지 방어력을 기르는 것으로 알려져 있다.

이에 본 발명자들은 지금까지 보고된 바 없는, 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물이 항산화효과, 과산화지질 억제 효과, 항부종 활성 및 거담효과를 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 노화를 촉진시키는 활성산소에 대한 항산화효과, 지방 또는 세포막 지질 과산화 억제 효과, 항염증 활성 및 거담효과 갖는 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 신규로 하는 용도를 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 단풍마 및 겨우살이 혼합추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 DPPH에의해 유래되는 활성산소를 이용한 실험에서 항산화효과를 나타내고 이에 따른 지질 과산화 생성을 감소시켜 세포의 사멸을 억제함으로서 염증을 억제하고 또한 마우스 족(足)의 염증 및 부종 억제효과 및 거담효과를 확인하여 노화를 촉진하는 각종 활성산소의 지질과 산화에 기인하는 세포의 노화 및 혈관 및 혈구의 지질과산화에 따른 동맥경화 및 이와 관련된 염증 관련 질환과 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품으로 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 유효성분으로 하여 지질 과산화 생성을 감소시켜 세포의 사멸을 억제함으로서 염증을 억제하고 또한 마우스 족(足)의 염증 및 부종 억제효과 및 거담효과를 확인하여 노화를 촉진하는 각종 활성산소의 지질과 산화에 기인하는 세포의 노화 및 혈관 및 혈구의 지질과산화에 따른 동맥경화 및 이와 관련된 염증 관련 질환과 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품을 제공한다.

상기 조성물은 DPPH를 이용한 실험에서 항산화효과를 나타내고, TBARS 생성을 감소시키며, 마우스 족(足)부종 억제효과 및 거담효과를 나타냄으로써 항산화, 항노화, 과산화지질 억제, 항부종 및 거담 활성을 나타냄을 특징으로 한다.

상기 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 물, 탄소 수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물을 포함한다.

또한, 상기 산화 및 염증 관련 질환에는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 기관지염, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크 또는 염증성 장 질환이 포함된다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 단풍마 및 가시오가피 각각을 음건한 후, 건조된 단풍마, 바람직하게는 건조된 단풍마의 뿌리, 근경, 괴경을 포함하는 지하부 및 건조된 가시오가피를 각각 1 : 1의 중량비로 혼합한 시료 중량의 약 1 내지 20배, 바람직하게는 약 10 내지 15배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 약 1:0.1 내지 1:10, 바람직하게는 1:0.2 내지 1:5의 혼합비(㎏/ℓ)를 갖는 이들의 혼합용매로, 실온에서 약 1 내지 24시간, 바람직하게는 5 내지 15시간 동안 열수 추출, 냉침 추출, 온침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법을 사용하여, 바람직하게는 온침 추출한 후 저온 농축함으로써 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 수득할 수 있다.

본 발명의 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락 토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 및 치료의 효과를 나타내는 상기 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품을 제공한다. 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 등이 있다.

또한, 본원에서 정의되는 “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

또한, 산화, 노화 또는 염증 관련 질환의 예방 및 치료 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물

1-1. 단풍마 지하부 및 가시오가피 혼합추출물의 제조

단풍마는 진주근교의 야생품을 (주)다산으로부터 공급받았고, 가시오가피는 경동시장에서 구입하여, 각각을 음건한 후, 건조 단풍마 뿌리, 근경, 괴경을 포함하는 지하부 및 가시오가피를 1 : 1 중량비로 혼합하여 충분히 달아 건조 중량의 10 내지 15배의 70% 에탄올을 가하여 3시간씩 총 5회 온침하여 저온 농축한 후 냉동 건조하여 단풍마 지하부 및 가시오가피의 에탄올 추출물을 수득하였다.(수득율 : 63.3%)

참고예 1. 실험 동물 준비

실험동물은 스프라규 다우레이(Sprague-Dawley)계의 평균 체중이 230 ± 10g인 수컷의 흰 마우스를 한림실험동물연구소(경기도 화성시)에서 구입하였다. 12시간 명암 주기와 항온(21~23℃). 항습(55%) 조건하에서 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 적어도 4일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다.

참고예 2. 통계처리

실험의 분석결과는 평균± 표준오차(S.E)로 표시하였으며, 유의성은 SPSS/PC+ 패키지(package)의 원-웨이 아노바(one-way ANOVA)를 이용하여 던칸즈 멀티플 테스트(Duncan's multiple test)로 분석하였다.

실험예 1. 항산화 시험

1-1. DPPH 를 이용한 항산화능 실험

상기 실시예 1-1의 단풍마 지하부 및 가시오가피 혼합추출물(이하 ARM이라 명명함)을 하타노(Hatano)등의 방법에 의하여 각 분획(fraction)을 3000, 2000, 1000, 500, 250ppm(99.5% 에탄올)의 5가지 농도로 조제한 용액 0.1㎖(대조군 : 99.5% 에탄올)에 0.1mM DPPH용액(99.5% 에탄올) 1.9㎖를 가하였다. 볼텍스 믹서(Vortex mixer)로 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분 동안 배양(incubation)시킨 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 515㎚에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조약물로는 L-아스코르브산(ascorbic acid)를 500, 250, 100, 50, 25ppm(99.5% ethanol)의 5가지 농도로 조제하여 측정하였다. 대략적인 실험 방법을 도 1에 나타내었다. 각 시료의 항산화작용은 DPPH에 대한 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)과 IC₅₀값(DPPH 라디칼 형성을 50% 억제하는데 필요한 ㎕ 농도)으로 나타내었으며, 결과는 하기 수학식 1로 계산하였다. 여 표 1, 표 2, 도 6 및 도 7에 나타내었다.

그 결과 대조 약물인 아스코르빈산과 비교하였을 때 3000ppm에서 유의성 있는 결과를 나타내었다.

또한 IC₅₀의 경우에서는 유의성 있는 결과를 나타내지는 못했지만 어느정도의 효과를 나타내었다.

[수학식 1]

시료 O.D.값 = 시료를 가한 시험액의 흡광도

대조군 O.D.값 = 에탄올 0.1㎖(시료 대신)+0.1mM DPPH 1.9㎖

[표 1]

수치=평균 ± 표준오차(n=2), 음성대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

[표 2]

수치=평균± 표준오차(n=2), 음성대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05

1-2. 지질과산화물( TBARS ) 분석을 이용한 지질과산화 억제효과

인간 혈장 LDL(low-density lipoprotein, 400㎍), 1mM CuSO₄ 16㎕ 및 농도별로 조제한 각 시료(2000, 1000, 500, 250, 100ppm) 100㎕에 PBS(pH 7.4)를 섞어 전체 부피가 1㎖가 되도록 하였다. 볼텍스 믹서로 혼화하여 37℃ 수욕상에서 4시간 동안 진탕 배양하여 산화시킨 후 1mM EDTA 20㎕를 첨가하여 산화를 중지시켰다.

산화된 LDL용액에 25% 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid) 1㎖를 넣어 단백질을 침전시킨 후 그 상층액에 1% 티오바비튜린산(thiobarbituric acid) 1㎖를 첨가하여 95℃에서 발색시킨 후 냉각시켰다. 생성된 말론디알데히드(MDA)의 양을 532nm에서 분광광도계를 이용하여 측정하였다. 대략적인 실험 방법을 도 2에 나타내었다.

MDA 표준시료로는 10nM 1,1,3,3-테트라에톡시프로판(Tetraethoxypropane)용액을 조제하여 사용하였으며, 하기 수학식 2로 계산하였고, 또한 각 시료의 LDL 지질과산화 억제효과를 비교검토하기 위해서 Cu^{2 +}에 의해 유도되는 과산화지질의 생성을 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도(IC₅₀)는 하기 수학식 3으로 계산하여 각각의 결과를 표 3, 표 4, 도 8 및 도 9에 나타내었다.

[수학식 2]
MDA 농도 (nM/㎖)= (f/F)× 10

F: 표준시료의 흡광도 (532nm)

f: 검체의 흡광도 (532nm)

[수학식 3]

[Ox-LDL]: Cu^{2 +}에 의해 산화된 LDL의 MDA

[Sample LDL] : 시료 추가로 산화된 LDL의 MDA

[LDL] : 비산화된 LDL의 MDA

[표 3]

LDL : 비산화 LDL, Ox-LDL : Cu^{2 +}에 의해 산화된 LDL, 수치= 평균 ± 표준오차(n=2), 음성 대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

[표 4]

수치=평균 ± 표준오차(n=2), 음성 대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

그 결과 표 3에서 보여지는 바와 같이 대조약물인 아스코르빈산과 비교하였을 때 유의성 있는 결과를 나타냄을 확인하여 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 처리가 지질 과산화를 억제함을 확인할 수 있었다. 또한 IC₅₀의 경우도 마찬가지로 유의성 있는 결과를 나타내었다.

실험예 2. 마우스 카라기닌 ( carrageenin ) 모델에서의 족(足) 부종시험

참고예 1에서 준비한 230± 10g인 흰 마우스 8마리를 1군으로 하여 각 쥐의 무게와 정확히 표시된 발의 용적을 측정하였다. 대조군은 사린(saline) 200mg/kg을, 양성대조군은 인도메타신(indomethacin, 시그마사, 이하 IDMC라 명명함) 1mg/kg을, 나머지 각 실험군은 단풍마의 지하부 및 가시오가피 혼합추출물을 각각 예비실험을 통해 각 시료별 효능의 변별력이 가장 높은 200mg/kg씩 경구 투여하였다. 각 시료와 약물은 사린에 녹여서 조제하였다. 경구 투여 30분경과 후 각 군에 카라기닌(carrageenin, 시그마사)25mg/kg을 발바닥에 피하 주사하였다. 각 군을 1시간 후부터 4시간 후까지 정확히 표시된 발의 용적을 측정하였다. 모든 실험은 두 번씩 진행되었다. 대략적인 실험 방법을 도 3에 나타내었다.

각 시간의 부종 증감을 관찰하여 각 시간별 부종 증가율(하기 수학식 4에 의해 계산)과 부종 억제율을 대조군과 비교하여 계산하였으며 결과를 표 5, 표 6, 도 10 및 도 11에 나타내었다.

[수학식 4]

[표 5]

수치=평균 ± 표준오차(n=2), 음성 대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

[표 6]

수치=평균 ± 표준오차(n=2), 음성 대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

그 결과 대조약물인 IDMC(인도메타신)과 비교하였을 때, 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 투여한 군이 족 부종 억제 효과가 좋음을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 거담실험

3-1. 뮤신(mucin)을 이용한 유동성 측정

0.1% Mucin 용액 10㎖에 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 시료와 양성대조군(N-Acetyl-L-cysteine)을 5, 10, 15, 20mg의 농도로 구분하여 각각 적가하여 37℃에서 30분간 배양하였으며, 대조군은 살린(saline) 10㎖만을 처리하였다. 대략적인 실험 방법을 도 4에 나타내었다.

상기와 같이 처리한 시험군을 37℃에서 오스왈드 모세관 점도계(Ostwald viscometer)를 사용하여 점성에 따른 낙하시간을 측정하여 이의 유속(Flow rate)값을 계산하여 표 7 및 도 12에 나타내었다.

[표 7]

수치=평균 ± 표준오차(n=2), 음성 대조군으로부터 유의성: ^*p < 0.05, ^**p < 0.01

실험 결과 대조군인 살린을 처리한 군과 비교 하였을 때 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물 투여군에서 약간의 활성을 나타내었다.

3-2. 페놀레드(phenol red)를 이용한 기도에서의 점액분비량 측정

참고예 1에서 준비한 230± 10g의 흰마우스 6마리를 1군으로 하여 대조군은 살린(saline)을 각각 100, 200, 300 mg/kg 경구 투여하였고, 양성대조군은 프로스판시럽은 성인용량인 167㎍/kg을 기준으로 각각 84, 167, 334㎍/kg의 세 가지 농도로 경구 투여하였다. 나머지 각 실험군은 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물을 각각 100, 200, 300mg/kg 경구 투여하였으며, 각 시료와 약물은 살린에 녹여서 조제하였다. 각 군을 30분경과 후 0.5㎖의 페놀레드(phenol red) 80mg/kg을 복강 주사하였다. 각 군의 마우스를 1시간 경과 후 기도를 절개하여 적출한 후 1㎖의 살린에 30분간 조직을 세척 및 볼텍싱 (washing/vortexing)한 후 그 세정액을 원심분리(1500rpm, 20min, 실온)하였다. 분리한 상층액으로부터 0.9㎖를 취하여 이 용액에 0.1㎖의 1M NaOH를 가하여 발색시켰다. 이 용액을 흡광도 546nm에서 측정하여 기도로부터 추출된 페놀레드를 측정하였다. 이를 적출한 기도의 무게로 나누어 기도에 대한 페놀레드의 비율을 구하여 기도에서의 점액분비량을 구하였다. 대략적인 실험 방법은 도 5에 나타내었으며, 결과는 표 8 및 도 13에 나타내었다.

[표 8]

^*대조군= 블랭크(blank)로써 각 3회

실험 결과 대조군 및 양성대조군과 비교해 본 결과 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물의 투여가 점액 분비량을 증가시키는 효과를 나타냈다.

실험예 4. 급성독성 시험

6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 각 그룹 당 2마리씩의 동물에 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추물을 100 ㎎/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상 및 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 강장기와 흉강 장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사 및 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 추출물은 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

상기 단풍마 지하부 및 가시오가피 혼합추출물의 제제예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1의 추출물........................100 ㎎

소디움 메타비설파이트....................3.0 ㎎

메틸파라벤...............................0.8 ㎎

프로필파라벤.............................0.1 mg

주사용 멸균증류수.........................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 2 ㎖로 한 후, 2 ㎖ 용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 추출물......................200 ㎎

유당...................................100 ㎎

전분...................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

실시예 1의 추출물.....................100 ㎎

유당...................................50 ㎎

전분...................................50 ㎎

탈크....................................2 ㎎

스테아린산 마그네슘....................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 액제의 제조

실시예 1의 추출물.....................1000 ㎎

설탕....................................20 g

이성화당................................20 g

레몬향..................................적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 연고제의 제조

실시예 1의 추출물....................1000 ㎎

정제라놀린...........................1000 ㎎

바셀린...............................8000 ㎎

실시예 1의 추출물과 정제라놀린을 완전히 혼화합 다음 바셀린을 넣어 혼화하여 연고제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 추출물.............................1000 ㎎

비타민 혼합물....................................적량

비타민 A 아세테이트.......................70 ㎍

비타민 E.................................1.0 ㎎

비타민 B1...............................0.13 ㎎

비타민 B2...............................0.15 ㎎

비타민 B6................................0.5 ㎎

비타민 B12...............................0.2 ㎍

비타민 C.................................10 ㎎

비오틴...................................10 ㎍

니코틴산아미드..........................1.7 ㎎

엽산.....................................50 ㎍

판토텐산 칼슘...........................0.5 ㎎

무기질 혼합물...................................적량

황산 제1철.............................1.75 ㎎

산화아연...............................0.82 ㎎

탄산마그네슘...........................25.3 ㎎

제1인산칼륨.............................15 ㎎

제2인산칼슘.............................55 ㎎

구연산칼륨..............................90 ㎎

탄산칼슘...............................100 ㎎

염화마그네슘..........................24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 추출물.......................1000 ㎎

구연산..................................1000 ㎎

올리고당.................................100 g

매실농축액.................................2 g

타우린.....................................1 g

정제수를 가하여.....................전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 단풍마 및 가시오가피 혼합추출물은 활성산소의 지질과 산화에 기인하는 세포의 노화 및 혈관 및 혈구의 지질과산화에 따른 동맥경화 질환 예방 활성 및 거담효과를 나타내므로 활성산소와 관련된 노화 및 염증 및 이와 관련된 염증 및 가래와 관련된 호흡기 질환의 예방 및 개선용 건강보조식품으로서 이용될 수 있다.

Claims (4)

1. 항산화 효과 및 지질과산화 억제효과를 나타내는 단풍마(Dioscorea quinqueloba) 및 가시오가피(Acanthopanax senticosus) 혼합추출물을 유효 성분으로 함유하는 통증 및 염증의 억제 및 개선용 건강보조식품.
2. 제 1항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강보조식품.
3. 삭제
4. 삭제

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