KR100648618B1 - 활성 산소 억제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase; 이하 'SOD') 및 카탈라제(catalase) 활성을 가지는 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 활성산소 억제제에 관한 것으로, 본 발명의 활성 산소 소거능이 뛰어나고 독성이나 부작용이 적은 SOD 및 카탈라제 유도체 화합물은 피부 노화, 암, 치매, 류마티스 등의 활성산소와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물 등의 제조에 이용될 수 있다.

활성 산소 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase; 이하 'SOD'), 카탈라제(catalase)

Description

활성 산소 억제제{REACTIVE OXYGEN SPECIES INHIBITORS}

도 1 내지 4는 각각 M40403, 본 발명의 실시예 1의 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂ MnN₅), 실시예 5의 화합물 3-7b₁(L-2Mn) 및 실시예 6의 화합물 3-7b₃(L-2Fe)의 세포독성 시험 결과이다.

도 5는 본 발명의 실시예 1의 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂MnN₅)의 매트릭스 메탈로프로티나아제-1(Matrix metalloproteinase: MMP-1) 프로모터(promotor) 활성억제효능시험결과이다.

본 발명은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase; 이하 'SOD') 및 카탈라제(catalase) 활성을 가지는 화합물, 이를 유효성분으로 포함하는 활성산소 억제제 및 약제 조성물에 관한 것이다.

인간을 포함한 모든 호기성 생물들은, 산소를 최종 전자 수용체로 하는 호흡을 통해 에너지를 획득한다. 이와 같이, 생명유지에 절대적으로 필요한 산소이지만, 안정한 분자상태인 기저 삼중항산소가 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O₂ ^-), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, HOㆍ), 과산화수소(H₂O₂) 및 일중항산소(¹O ₂)와 같은 반응성이 매우 큰 프리 라디칼(free radical) 또는 활성 산소(reactive oxygen species)로 전환되면 생체에 치명적인 독성을 일으키는 양면성이 있다. 즉, 이들 활성 산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당 및 DNA 등에 대하여 파괴작용을 함으로써 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨병, 알츠하이머병 등의 뇌질환과 노화, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으키고 노화를 촉진하는 것으로 알려져 있다.

지질과산화물은 산화 반응에 의해 지질이 과산화 되어 생성된다. 상기 활성산소와 프리 라디칼 등이 세포막의 인지질을 산화시켜 지질과산화물이 생성된다. 세포막에 지질과산화물이 축적되면 세포막의 유동성과 기능성이 저하되어 세포기능이 저하되고, 세포 구조가 변하게 된다. 따라서, 인체 내에 지질과산화물이 과량으로 축적되면 뇌혈관 장애로 인한 뇌졸중, 심근경색, 당뇨병성 혈관장애, 고지혈증, 급성염증, 류마티스 질환, 알콜성 간염 등의 간장질환을 포함한 각종 인체질환을 일으키게 된다. 현재까지는 지질과산화를 억제하기 위하여 합성 항산화제인 BHT(butylated hydroxytoluene) 또는 BHA(butylated hydroxyanisole) 등이 사용되어 왔다. 그러나, 상기 합성 항산화제들은 지질과산화 저해활성이 우수하나 암이나 그 밖의 여러 기형을 유발할 수 있는 가능성이 매우 높아 계속적으로 사용할 수 없다.

한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 프리 라디칼(free radical)과 기타 활성 산소 및 과산화물이 생성되고 있으며, 이들에 대한 생체내 방어기구로서 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase; SOD), 카탈라제(catalase), 페록시다아제(peroxidase) 등의 항산화 효소와 함께 비타민 E, 비타민 C, glutathione, ubiquinone, 요산 등과 같은 저분자 항산화 물질들이 산화적 손상으로부터 스스로를 보호하고 있다. 그러나, 이와 같은 생체 방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인에 의하여 활성 산소의 생성이 생체 방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산소 독성에 의한 세포파괴가 야기된다. 따라서, 이와 같은 프리 라디칼을 소거할 수 있는 활성을 갖거나(free-radical scavengers) 또는 과산화물의 생성을 저해할 수 있는 활성산소 소거물질과 같은 항산화 물질들은 이들 산화물에 의하여 야기되는 각종 질환 치료제 및 노화 억제제로의 개발 가능성이 이미 잘 알려져 있다.

특히, 최근 항산화 방어기구로서의 천연 항산화제 및 이들의 산화적 손상(oxidative damage)에 대한 항산화 방어 작용 기작 연구가 주목받으면서 산화적 손상으로 야기된 여러 질병치료에 이용하기 위하여 천연 활성 산소 소거물질들을 개발하기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서, 산화적 손상을 유발하는 생체 내 프리 라디칼을 소거함으로써 산화적 스트레스에 의해 야기되는 각종 질환을 치료할 수 있는 신규 프리 라디칼 소거 물질을 개발하는 연구는 인류의 건강과 수명연장을 위한 새로운 방법을 모색하는데 크게 기여할 수 있을 것이다.

현재 국내외적으로 SOD 및 카탈라아제 유도체를 이용한 피부 노화방지 및 재생에 대한 연구는 아직 활발하지는 않으나, 지질 전달 시스템(liposome delivery system)을 이용해 SOD를 함유한 화장품이 출시되고 있으며, 프리 라디칼(free radical)에 의한 신경계 세포의 손상에 대해 카탈라아제(catalase) 및 SOD 유도체들의 효능이 검증되고 있다.(Miyachi Y, Imamura S, Niwa Y. Decreased skin superoxide dismutase activity by a single exposure of ultraviolet radiation is reduced by liposomal superoxide dismutase pretreatment. J Invest Dermatol. 1987 Jul;89(1):111-2, 1987.; Jadot G, Vaille A, Maldonado J, Vanelle P. Clinical pharmacokinetics and delivery of bovine superoxide dismutase. Clin Pharmacokinet. Jan;28(1):17-25, 1995.; Filipe P, Emerit I, Vassy J, Rigaut JP, Martin E, Freitas J, Fernandes A. Epidermal localization and protective effects of topically applied superoxide dismutase. Exp Dermatol.Jun ;6(3):116-21, 1997.; Yunoki M, Kawauchi M, Ukita N, Noguchi Y, Nishio S, Ono Y, Asari S, Ohmoto T, Asanuma M, Ogawa N. Effects of lecithinized superoxide dismutase on traumatic brain injury in rats. J Neurotrauma. Oct;14(10):739-46, 1997; Stab F, Wolber R, Blatt T, Keyhani R, Sauermann G. Topically applied antioxidants in skin protection. Methods Enzymol. 2000;319:465-78.; Vorauer-Uhl K, Furnschlief E, Wagner A, Ferko B, Katinger H. Topically applied liposome encapsulated superoxide dismutase reduces postburn wound size and edema formation, Eur J Pharm Sci. Aug;14(1):63-7, 2001.)

한편, 노화가 진행될수록 자유라디칼의 생성율이 증가하며 항산화 기작의 속도는 감소한다. 항산화 방어 기작과 산화기작의 카탈라아제(catalase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase), 글루타티온 퍼옥시다제(glutathione peroxidase)와 같은 항산화 효소들은 프리 라디칼(free radical)을 해독시키는데 중요한 효소들이며 생명연장과도 밀접한 관계가 있다고 보고되고 있다. 노화에 따른 항산화 효소활성의 감소 결과 산화압력(oxidative stress) 등에 대응하는 능력이 감소하여, 조직내 활성산소(ROS)가 축적되게 되고, 이렇게 축적된 ROS는 셀 리독스(cell redox) 상태에 영향을 미쳐서 신호전달체계에 영향을 주어서 노화가 일어나는 것으로 추론되고 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 활성산소 소거기능이 뛰어나면서도 독성이나 부작용이 적은 SOD 및 카탈라아제(catalase) 활성을 가지는 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 활성산소 소거기능이 뛰어나면서도 독성이나 부작용이 적은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 화합물을 유효성분으로 포함하는 활성 산소 억제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 활성산소 소거기능이 뛰어나면서도 독성이나 부작용이 적은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 화합물을 유효성분으로 포함하는 노화, 암, 치매, 류마티스 등 활성산소와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 활용 가능하며 특히 노화관련 화장품 등의 피부 화장료에 이용될 수 있는 약제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시페닐이며, M은 Mn, Fe 또는 Cu이며,

[화학식 2]

상기 화학식 2에서, M은 Mn, Fe 또는 Cu이며, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이고,

[화학식 3]

상기 화학식 3에서, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 헤테로 원소를 포함하는 헤테로 고리 치환기를 가지는 탄소수 4 내지 6의 알킬기이며, M은 Mn, Fe 또는 Cu이며, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이다.

상기 화학식 1 내지 3에서, M은 Mn, Fe, 또는 Cu의 2가 금속원소인 것이 바람직하고, 화학식 2 및 3에서 X는 Cl인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 하기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 활성산소억제제 및 약제 조성물을 제공한다. 바람직하게 본 발명의 약제 조성물은 피부 노화 예방 또는 치료용 약제 조성물이다.

이하에서 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 안전하고 효과적인 프리 라디칼 소거물질을 개발하기 위하여, SOD 활성 및 카타라제 활성을 나타내는 새로운 SOD 및 카탈라아제(catalase) 유도체 합성을 목적으로 실험을 수행하였다.

그 결과, 본 발명자들은 SOD 및 카탈라아제(catalase)와 같이 직접적으로 활성산소(ROS) 제거에 효과적인 효소들의 발현을 증가시키는 물질은 노화된 세포의 재생, 또는 항노화 효과가 우수한 방법임에 착안하여, 저분자의 카탈라아제(catalase) 및 SOD의 유도체를 합성하였고, 이를 세포내에서 효율적으로 이용할 수 있다면 산화의 압력(oxidative stress)으로부터 피부를 보호하고 이의 피부노화 재생 및 예방에 관한 효과를 가져올 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 SOD 및 카탈라아제(catalase) 유도체는 강력한 활성 산소 소거능을 가지며, 독성이 없고 부작용이 적은 효과가 있다.

본 발명의 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 유도체 화합물은 하기 화학식 1 내지 3 중 어느 하나로 표시되는 2가 금속의 금속 착물이다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 화학식 1 내지 3에서, R₁ 내지 R₄, M 및 X 는 각각 상기에서 정의된 바와 같으며, 이때 R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 수소 또는 하이드록시페닐인 경우가 바람직하고, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 피리딘 또는 이미다졸 치환기를 갖는 알킬기인 것이 바람직하고, M은 Mn, Cu, Fe인 것이 바람직하고, X는 Cl 인것이 바람직하다.

본 발명의 화학식 1 내지 3의 화합물의 제조방법은, 아미노기를 갖는 화합물 을 출발물질로 하여 고리화 반응, 환원 등의 일련의 과정을 거쳐 이루어질 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 제조방법의 바람직한 일례로는, 하기 반응식 1, 반응식 1-1 및 반응식 1-2와 같다.

[반응식 1]

[반응식 1-1]

[반응식 1-2]

상기 반응식 1에서, R₁ 및 R₂, 및 M은 각각 상기에서 정의된 바와 같으며, BOP는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플로로포스페이트이고, HOBt는 1-히드록시벤조트리아졸 이며, TFA는 테트라플로로아세트산이고, LAH는 리튬 알루미늄 하이드라이드이고, THF는 테트라하이드로퓨란을 나타낸 것이다.

상기 화학식 2의 화합물의 제조방법의 바람직한 일례로는, 하기 반응식 2와 같다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서, TsCl은 톨루엔 설포닐 클로라이드이고, MC는 메틸렌 클로라이드이고, Boc₂O는 디-tert-부틸 디카보네이트이고, Et₃N은 트리에틸아민이다.

상기 화학식 3의 화합물의 제조방법의 바람직한 일례로는, 하기 반응식 3a 및 3b와 같다.

[반응식 3a]

[반응식 3b]

또한, 본 발명은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 화학식 1 내지 3의 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 활성산소 제거제를 제공한다.

또한, 본 발명은 SOD 및 카탈라아제 활성을 가지는 화학식 1 내지 3의 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 노화, 암, 치매, 류마티스 등 활성산소와 관련된 질병의 예방 또는 치료에 활용 가능하며, 바람직하게는 노화관련 화장품 등의 피부 노화 예방 또는 치료용 약제 조성물일 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 이의 염 또는 이의 용매화물을 포함할 수 있다. 또한, 피부노화의 예방 또는 치료용 조성물의 경우, 통상 피부용 제제에 함유되는 약제학적으로 허용 가능한 1 종 이상의 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물에서 화학식 1의 함량은 사용 목적에 따라 적당하게 조절할 수 있으며, 특별한 제약은 없다. 본 발명의 약제 조성물은 일반적인 경구 또는 비경구 투여 방법으로 환자에게 투여될 수 있으며, 고체 또는 액체 형태 어떠한 형태로도 가능하다. 또한, 본 발명의 약제 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 1 종 이상의 액체 또는 고체 담체를 더욱 포함할 수 있다.

상기 고체형태의 제제는 분말, 정제, 분산 가능한 과립 또는 캡슐을 포함하며, 이중에서도 경구 투여에 적합한 고체 투약형태로는 정제, 분말 또는 캡슐을 들 수 있다. 적합한 부형제는 희석제, 향미제, 가용화제, 윤활제, 현탁제, 결합제, 및/또는 정제팽화제를 포함할 수 있다. 분말 또는 캡슐의 경우에는, 담체는 미분된 유효성분을 5 내지 70%, 바람직하게는 10 내지 70%를 함유할 수 있다. 적합한 고체 담체 또는 부형제로는 옥수수 전분, 스테아린산 마그네슘, 필름, 폴리에틸렌글리콜, 탈크, 설탕, 락토오스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 소디움카르복시메틸셀룰로오스, 이산화티타늄, 저융점 왁스, 코코아버터 등을 포함할 수 있다.

상기 액체형태의 제제는 용액, 현탁액 또는 유탁액일 수 있다. 예를 들면, 비경구 주사액의 경우에는 물 또는 물-프로필렌글리콜의 혼합용액이 사용될 수 있는데, 그러한 용액은 등장성, pH 등이 생체계에 적합하도록 제조된다. 액상 제제는 또한 폴리에틸렌글리콘 수용액으로 형성할 수도 있다. 경구용으로 적합한 수용액은 활성성분을 물에 녹이고 적당한 향미제, 착색제, 안정제 및 농후제를 부가하여 제조할 수도 있다. 경구용으로 적당한 수성 현탁제로는 미분된 활성성분을 천연 또는 합성검, 수지, 메틸셀룰로오스, 소디움카르복시메틸셀룰로오스 및 공지의 현탁제와 같은 점성 물질에 분산시켜 제조될 수 있다.

바람직한 약제학적 제제는 단위 투약형태이다. 그러한 형태에서, 제제는 적당량의 유효성분을 포함하는 단위 투여형태로 세분된다. 단위 투약형태는 제제의 분리된 양을 함유하는 포장된 제제일 수 있으며, 예를 들면, 바이알 또는 앰플내의 포장된 정제, 캡슐 또는 분말이다.

본 발명의 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물의 통상적인 1일 투여량은 0.1 내지 100 mg/kg 체중, 바람직하게는 1 내지 10 mg/kg 체중의 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 활성 성분의 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이상과 같이, 본 발명은 SOD 활성과 카탈라아제(catalase) 활성을 보이는 상기 화학식 1 내지 3의 화합물의 발명을 통하여 기초의과학 또는 생물학 분야에서 세포의 노화 및 사멸에 대한 기초연구에 활용할 수 있으며, 노화, 암, 치매, 류마티스 등 활성산소와 관련된 질병의 치료에 활용 가능하다. 또한 금속 또는 음이온에 대한 선택적 인식을 통하여 각종 질병에 대한 진단에 응용할 수 있고 화학적 산화반응의 촉매로 활용할 수 있다. 특히 활성 산소에 의한 노화 발생 방지에 우수한 효과가 나타나는 등의 효과로 의약품, 화장품 등에 응용할 수 있어 의약품 제조산업 및 화장품 제조 산업상 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명은 하기의 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명될 것이나, 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1 : 화합물 1(C ₁₇ H ₂₉ C ₁₂ MnN ₅ )의 합성(반응식 1-1 참조)

A.{[2-(2-벤질옥시카보닐아미노-아세틸아미노)-사이클로헥실카바모일]-메틸}-카바믹 에시드 벤질 에스터의 합성

건조된 메틸렌 클로라이드(이하, M.C)(200㎖)에 Z-Gly-OSu(Z-glycine N-succinimidyl ester, 11.79g, 38.5mmol)를 녹였다. 이 혼합물에 (+/-)-trans-1,2-디아미노사이클로헥산(2g, 17.5mmol)을 천천히 첨가한 후, TEA(5.36㎖, 38.5mmol)를 넣어 주었다. 이 혼합물 실온에서 4시간 동안 교반시켜 주었다. 이후 필터로 고체를 분리하고, 분리해낸 고체를 H₂O로 씻어주었다. 그리고, 진공 건조하여 흰색 고체를 얻었다.(수율: 90%)

¹H NMR (DMSO-d ₆) δ 1.22(s, 4H), 1.63(s, 2H), 1.75(s, 2H), 3.33(s, 4H), 3.56(m, 2H), 5.00(s, 4H), 7.31(br s, 2H), 7.33(m, 10H), 7.59(br s, 2H)

B. 2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-N-{2-[2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-아세틸아미노]-사이클로헥실}-아세트아마이드의 합성

상기 A에서 제조된 {[2-(2-벤질옥시카보닐아미노-아세틸아미노)-사이클로헥실카바모일]-메틸}-카바믹 에시드 벤질 에스터 (3g, 6.04mmol)를 무수 메탄올(300 ㎖)에 넣고 가열하여 녹여주었다. 이 혼합물에 질소를 주입하고 팔라듐 (300mg, 10 wt%)을 신속하게 넣어준 후, 수소를 다시 주입시켜주었다. 이 혼합물을 5시간 동안 교반시켜주었다. 이후, 셀라이트를 사용하고, 여과하여 팔라듐을 제거하여 주었다. 그런 다음, 용매를 농축, 건조하여 흰색 고체를 얻었다.

무수 디메틸 포름아마이드(이하, DMF)(150㎖)에 Cbz(Carbobenzyloxy)기가 제거된 화합물(1.3g,5.70mmol)을 녹인 후 트리에틸아민(1.75㎖, 12.54mmol)을 넣어주었다. 그런 다음, 얼음조(Ice bath) 하에서, 상기 혼합물에 p-톨루엔설포닐 클로라이드(2.4g, 12.54mmol)를 천천히 넣으며 저어주었다. 이 혼합물을 6시간 동안 교반시켜 주었다. 그 후 농축하여 용매를 제거하고, 다시 M.C.를 넣어 녹인 후 이것을 H₂O와 0.1N HCl, 포화된 NaCl 용액으로 차례로 씻어 주고 MgSO₄로 건조시켰다. 그 후, M.C : 에틸아세테이트(이하, EA)=7:3으로 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하여 흰색 고체를 얻었다.(수율 80%)

¹H NMR (CDCl₃) δ 1.26(d, J=6.76, 4H), 1.71(m, 2H), 1.90(m, 2H), 3.37(d, J=1.68, 2H), 3.56(d, J=1.68, 2H), 3.68(br m, 2H), 5.73(br m, 2H), 6.62(br m, 2H), 7.27(s, 3H), 7.69(d, J=8.21, 5H)

C. 2,6-비스-톨루엔설포닐옥시메틸-피리딘의 합성

무수 테트라하이드로퓨란(이하, THF)(150㎖)에 2,6-피리딘디메탄올 (1g, 7.18mmol)을 녹였다. 이 혼합물에 질소를 주입한 후 포타슘 하이드록사이드(1.6g, 28.72mmol)를 신속히 넣고 저어 주었다. 얼음조하에서, 상기 혼합물에 p-톨루엔 설포닐 클로라이드(3g, 15.79mmol)를 넣고 8시간 동안 교반시켜 주었다. 그 후 여과하여 고체를 제거하고 농축하여 용매를 제거한 후, M.C만으로 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 고체를 얻었다.(수율 88%)

¹H NMR (CDCl₃) δ 2.42(s, 6H), 5.02(s, 4H), 7.31(d, J=7.88, 6H), 7.67(t, J=8.06, 1H), 7.78(d, J=8.28, 4H)

D. 3,16-비스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로-[16.3.1.0 ^7,12 ]도코사-1(21),18(22),19-트리엔-5,14-디온의 합성

건조된 DMF(150㎖)에 B에서 제조된 2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-N-{2-[2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-아세틸아미노]-사이클로헥실}-아세트아마이드(1.2g, 2.24mmol)를 녹이고 질소를 주입하였다. 여기에 소듐 하이드라이드(118mg, 4.93mmol)을 넣고 실온에서 30분간 교반하여 수소를 제거한 후, 100 ℃로 가열하였다. 이후, 상기 C에서 제조된 2,6-비스-톨루엔설포닐옥시메틸-피리딘(1.1g, 2.46mmol)을 DMF(20㎖)에 녹인 용액을 제조하고, 이를 100 ℃에서 드롭핑 펀넬(dropping funnel)을 이용하여 상기 혼합물에 천천히 넣으며 저어주었다. 이 혼합물을 100 ℃에서 5시간 이상 가열하였다. 이후, 반응이 완료되면, 냉각시킨 후 농축하여 용매를 제거하였다. 여기에 H₂O를 넣고 생긴 고체를 여과한 후, 이 고 체를 M.C:E.A=7:3으로 컬럼 크로마토그래피 정제를 통해 흰색 고체를 얻었다.(수율 72%)

¹H NMR (CDCl₃) δ 1.21(br m, 4H), 1.57(br, m 2H), 2.01(m, 2H), 2.43(s, 6H), 3.03(br m, 2H), 3.65(d, J=1.63, 2H), 3.90(d, J=1.63, 2H), 4.03(d, J=1.36, 2H), 4.46(d, J=1.36, 2H), 6.49(br m, 2H), 7.35(t, J=6.25, 6H), 7.72(d, J=8.30, 5H)

E. 3,16-비스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로[16.3.1.0 ^7,12 ]-도코사-1(21),18(22),19-트리엔의 합성

건조된 THF(20㎖)에 D에서 제조된 3,16-비스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로-[16.3.1.0^7,12]도코사-1(21),18(22),19-트리엔-5,14-디온(500mg, 0.7mmol)를 넣고 녹였다. 여기에 환류장치를 설치 후 질소를 주입하고 1M 보란-THF 용액(11.7㎖, 11.7mmol)을 얼음조 하에서 천천히 넣어 주었다. 이 혼합물을 12시간 동안 환류시켰다. 그 후 반응이 완료되면, 냉각시킨후 얼음조 하에서 THF:H₂O(4:1)로 퀀칭(quenching)시켰다. 그럼 다음, 농축하여 용매를 제거한 후 6N HCl을 넣고 1시간 동안 교반시켰다. 이 용액을 에틸 에테르로 1번 씻어준 후, 수용액층에 6N NaOH를 넣어 pH 13 으로 맞추어 주었다. 그리고, MC(50㎖×5)로 추출한 후, Na₂SO₄로 건조시키고 농축하여 용매를 제거하여 흰색 고체를 얻었다.(수율 80%)

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.84(br m, 2H), 1.21(br m, 2H), 1.56(br m, 2H), 1.87(br m, 2H), 2.41(s, 6H), 2.90(br m, 2H), 2.99(m, 2H), 3.42(br m, 2H), 4.28(d, J=1.45, 2H), 4.43(d, J=1.45, 2H), 7.29(d, J=8.01, 4H), 7.44(d, J=7.68, 2H), 7.69(d, J=8.10, 5H)

F. 3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로[16.3.1.0 ^7,12 ]도코사-1(21),18(22),19-트리엔의 합성

질소 하에서 E에서 제조된 3,16-비스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로[16.3.1.0^7,12]-도코사-1(21),18(22),19-트리엔(200mg, 0.327mmol)을 황산(3㎖)에 녹였다. 이 용액을 90 ℃로 가열하면서 24시간동안 교반시켰다. 반응이 완료되면, 냉각시킨 후, H₂O(2㎖)를 천천히 넣어주었다. 이 혼합물에 포타슘 하이드록사이드를 얼음조 하에서 천천히 넣어 저어주면서 pH 13으로 맞추어 주었다. 에탄올(20㎖)을 넣고 여과하였다. 이때 고체를 에탄올로 여러번 씻어주고 여과하였다. 그리고, 여과하여 얻은 용액을 농축하여 용매를 제거한 후, 여기에 1N HCl을 넣고 M.C.로 1번 씻어 주었다. 수용액층에 포타슘 하이드록사이드를 넣고 pH 13으로 맞춘 후 CHCl₃로 추출하였다. 포타슘 카보네이트로 건조한 후 농축하 여 용매를 제거하였다.(수율 60%)

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.92(br m, 2), 1.23(br m, 2H), 1.70(br m, 2H), 2.11(m, 4H), 2.62(d, J=8.86, 4H), 2.82(t, J=8.75, 2H), 3.00(t, J=7.82, 2H), 3.86(d, 4.11, 4H), 6.98(d, J=7.57, 2H), 7.50(t, J=7.67, 1H)

G. 디클로로(3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로[16.3.1.0 ^7,12 ]도코사-1(21),18(22),19-triene)-망간(Ⅱ)의 제조 (화합물 1)

무수 MnCl₂(4.15mg, 0.033mmol)를 녹인 뜨거운 메탄올 용액(5㎖)에 3,6,13,16,22-펜타아자-트리사이클로[16.3.1.0^7,12]도코사-1(21),18(22),19-트리엔(10mg, 0.033mmol)을 질소하에서 넣었다. 이 용액을 1시간 동안 환류시켰다. 농축하여 용매를 제거한 후, 뜨거운 THF로 그 고체를 다시 녹였다. 그 용액을 셀라이트를 통해 여과하였다. 이 THF 용액의 부피를 농축하여 3㎖이하로 줄이고 여기에 에틸 에테르를 넣어 결정화하였다. 이 결정을 에틸 에테르로 씻으면서 여과한 후, 건조시켰다.(수율 50%); MS(FAB, NBA matrix) m/z 392(M-Cl)⁺

실시예 2: 화합물 2의 합성(반응식 2 참조)

A. N-(p-톨일설포닐)디아미노사이클로헥산의 합성(2-1)

1,2-디아미노사이클로헥산 (5g, 43.79mmole)을 메틸렌 클로라이드(MC)100 mL 에 녹인 후 0 ℃로 냉각시킨 다음, p-톨루엔설포닐 클로라이드(4.17g, 21.89mmole)을 메틸렌 클로라이드 100mL에 녹여 천천히 적가한 후 교반시켰다. 첨가가 완전히 끝나면 반응온도를 실온으로 천천히 올리고 3시간 정도 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 MC를 감압 농축하여 흰색 고체를 얻었다. 이것을 1N HCl로 씻어내고 여과한 후 이 수용액을 0 ℃로 냉각시키고 1N NaOH를 천천히 가하면 바늘 모양의 흰색 고체가 생성되며, 이것을 여과하고 건조시켰다.(수율 : 85%)

¹H-NMR(CDCl₃) : δ 0.90-1.17(m, 4H,), 1.52-1.69(m, 2H), 2.22-2.36(m, 1H,), 2.41(s, 3H), 2.52-2.70(m, 1H), 7.33(d, 2H), 7.79(d, 2H)

B. N-(tert-부틸옥시카보닐)-N'-(p-톨일설포닐)디아미노사이클로헥산의 합성(2-2)

N-(p-톨일설포닐)디아미노사이클로헥산(6.43g, 23.96mmole)을 THF 100mL에 녹이고 여기에 1N-NaOH(36mL, 36mmole)를 가하고 교반시켰다. 혼합 용액에 디-tert-부틸 디카보네이트(6.28g, 28.75mmole)를 첨가하고 실온에서 약 1시간 동안 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추면 흰색 고체가 생성되며, 이 흰색 고체를 물로 여러 번 씻어준 후 건조시키고 에틸아세테이트-헥산을 이용해서 재결정하였다.(수율: 98%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 0.96-1.32(m, 4H) 1.42(s, 9H) 1.51-1.78(m, 2H), 1.83-2.05(m, 2H), 2.40(s ,3H), 2.78-2.95(m, 1H), 3.21-3.38(m, 1H), 4.33(d, 1H), 5.49(d, 1H), 7.27(d, 2H), 7.73(d, 2H)

C. 화합물 2-3의 합성

N-(tert-부틸옥시카보닐)-N'-(p-톨일설포닐)디아미노사이클로헥산(9.05 g, 24.58 mmole)을 정제된 DMF 80mL에 녹이고 여기에 세슘 카보네이트(10.92g, 33.52mmole)을 가하고 교반시켰다. 이 혼합 용액에 피리딘 디메탄올(디토실레이트)(2-3),(5g, 11.17mmole)을 첨가한 후 12시간 동안 실온에서 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 DMF을 감압 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금(brine)으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 에틸아세테이트-헥산을 이용해서 재결정하여 화합물 2-3을 얻었다.(수율 : 98%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 1.07(bs, 8H), 1.38(s, 18H), 1.56(bs, 6H), 2.14(bs, 2H), 2.40(s, 6H), 3.14(bs, 2H), 3.48(bs, 2H), 4.47(ABq, 4H), 7.28(d, 4H), 7.40(d, 2H), 7.50(t, 1H), 7.68(d, 4H), LC-MS(ESI) : m/z = 838.4[M+H⁺]

D. 화합물 2-4의 합성

화합물 2-3(10g, 11.91mmole)을 메틸렌 클로라이드 100 mL에 녹이고 여기에 트리플로로아세트산 30mL를 가한 후 1시간 동안 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추 고 감압 농축시키면 TFA염 형태의 노란색 고체를 얻게 된다. 이 TFA염 화합물을 정제한 메틸렌 클로라이드 100mL에 녹이고 BOP(11.59g, 26.21mmole), HOBt (0.36g, 2.38mmole), 및 트리에틸아민( 8.3mL, 59.55mmole)을 차례대로 첨가하고 교반시켰다. 이 혼합용액에 토실-Gly-OH(6g, 26.21mmole)을 가한 후 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응을 멈추고 물과 메틸렌 클로라이드를 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드: 에틸 아세테이트= 1:1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다.(수율 : 85%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 1.06(bs, 4H), 1.23(bs, 4H), 1.59(bs, 8H), 2.02(s, 2H), 2.39(s, 6H), 2.41(s, 6H), 3.25(bs, 2H), 3.44-3.58(m, 4H), 4.58(ABq, 4H), 5.91(t, 2H), 6.58(d, 2H), 7.2(d, 2H), 7.29(d, 4H), 7.30(d, 4H), 7.34(t, 1H), 7.65(d, 4H), 7.80(d, 4H), LC-MS(ESI) : m/z = 1060.3[M+H⁺]

E. 화합물 2-5의 합성

화합물 2-4(5.06g, 4.76mmole)을 정제한 DMF 300mL에 녹이고 여기에 세슘 카보네이트(4.66g, 14.29mmole)를 가하고 교반시켰다. 여기에 피리딘 디메탄올 (디토실레이트)(2.13g, 4.76mmole)을 DMF 100mL에 녹인 용액을 천천히 적가한 후, 실온에서 12시간 동안 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 과량의 DMF을 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 5 : 1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 64%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 1.07-1.23(m, 8H), 1.570(bs, 8H), 1.81-2.01(m, 2H), 2.38(s, 6H), 2,41(s, 6H), 3.15(bs, 2H), 3.68-4.74(m, 12H), 7.10(bs, 2H), 7.20-7.32(m, 12H), 7.59-7.70(m, 10H), LC-MS(ESI) : m/z = 1163.3[M+H⁺]

F. 화합물 2-6의 합성

화합물 2-5(4.00g, 3.34mmole)을 정제한 THF 50mL에 녹이고 0 ℃로 냉각시킨 다음 질소 분위기 하에 1M BH₃ㆍTHF(66.8mL, 66.8mmole)를 천천히 적가한 후 교반 시켰다. 첨가가 완전히 끝나면 반응온도를 65℃로 천천히 올리고 12시간 동안 환류 교반시켰다. 반응 혼합물을 다시 0℃로 냉각시키고 거품이 일어나지 않을 때까지 물을 천천히 적가한 후 감압 농축 시키면 흰색 고체를 얻게 된다. 여기에 6N HCl 30mL를 가하고 1시간 동안 환류 교반 한 후 냉각시키고 6N NaOH로 중화시켰다. 이후, 메틸렌 클로라이드 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메탄올 : 에틸 아세테이트 = 1 : 10의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 :76%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 0.83-0.92(m, 4H), 0.93-1.35(m, 8H), 1.40-1.68(m, 4H), 1.90-2.19(m, 4H), 2.38(s, 6H), 2.40(s, 6H), 2.52-2.60(m, 2H), 2.80-3.22(m, 4H), 3.38-3.53(m, 2H), 4.01-4.47(m, 8H), 7.22-7.43(m, 12H), 7.64-7.72(m, 10H), LC-MS(ESI) : m/z = 1135.4[ M+H⁺]

G. 화합물 2-7의 합성

화합물 2-6(0.5g, 0.44mmole)을 진한 황산 10mL에 녹이고 48시간 동안 100 ℃에서 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 0℃로 냉각시킨 다음 증류수 5mL를 천천히 가하였다. 이 혼합용액에 에탄올 10mL와 과량의 KOH를 첨가(pH > 12)하고 교반시켰다. 흰색침전물이 생겨나게 되는데 이것을 글래스 여과를 이용해서 여과하였다. 이후, 수용액을 메틸렌 클로라이드를 이용해서 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시키면 깨끗한 생성물의 옅은 노란색 고체를 얻었다. (수율 : 66%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 0.82-1.21(m, 8H), 1.68-1.80(m, 4H) 2.05- 2.35(m, 8H), 2.47-2.88(m, 8H), 3.67-3.97(m, 8H), 7.11(d, 2H), 7.19(d, 2H), 7.33(t, 1H), 7.47(t, 1H), LC-MS(ESI) : m/z = 519.4[ M+H⁺]

H. 화합물 2-7a의 합성

화합물 2-7(100mg, 0.19mmole)을 메탄올 10mL에 녹이고 여기에 FeCl₂ (48.17mg, 3.8mole)을 가한 후 질소 분위기하에서 2시간 동안 환류 교반 시킨다. 그런 후 반응을 멈추고 셀라이트를 채운 글래스 여과를 이용해서 여과시키고 농축시킨다. 이것을 MeOH-에테르 용매를 이용해서 재결정하여 진녹색의 고체를 얻었다.(수율 : 75%)

실시예 3: 화합물 3-7의 합성(반응식 3a 참조)

A. N-(p-톨일설포닐)디아미노에탄의 합성(3-1)

에틸렌디아민(9g, 145.58mmole)을 벤젠 100mL에 녹인 후 0℃로 냉각 시킨 다음 p-톨루엔설포닐 클로라이드(11.41g, 59.83mmole)을 벤젠 100mL에 녹여 천천히 적가 한 후 교반 시켰다. 첨가가 완전히 끝나면 반응온도를 실온으로 천천히 올리고 3시간 정도 교반시켰다. 반응 혼합물에 흰색 침전이 생기게 되며 이 생성물을 여과하고 이것을 1N HCl로 씻어내었다. 이 수용액을 0℃로 냉각시키고 1N NaOH를 천천히 가하면 바늘 모양의 흰색 고체가 생성되며, 이것을 여과하고 건조시켜 화합물 3-1을 얻었다.(수율 : 70%)

¹H-NMR(CDCl₃) : δ 2.39(s, 3H,), 2.78(t, 2H,), 2.95(t, 2H,), 7.27(d, 2H), 7.74(d, 2H)

B. N-(tert-부틸옥시카보닐)-N'-(p-톨일설포닐)디아미노에탄의 합성(3-2)

상기 A의 N-(p-톨일설포닐)디아미노에탄(7.28g, 33.97mmole)을 THF 100mL에 녹이고 여기에 1N-NaOH (51mL, 51mmole)를 가하고 교반시켰다. 혼합용액에 디-tert-부틸 디카보네이트 (8.9g, 40.77mmole)를 첨가하고 실온에서 약 1시간 동안 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 THF를 감압 농축하여 흰색 고체를 얻었다. 이 흰색 고체를 물로 여러번 씻어준 후 건조시키고 에틸아세테이트-헥산을 이용해서 재결정하여 화합물 3-2를 얻었다.(수율: 98%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 1.37(s, 9H) 2.40(s, 3H) 3.03(q, 2H), 3.21(q, 2H), 4.85(bs ,1H), 5.20(bs, 1H), 7.29(d, 2H), 7.73(d, 2H)

C. {2-[(6-{[(2-tert-부톡시카보닐아미노-에틸)-(톨루엔-4-설포닐)-아미노]-메틸}-피리딘-2-일메틸)-(톨루엔-4-설포닐)-아미노]-에틸}-카바믹 에시드 tert-부틸 에스터의 합성(3-3)

N-(tert-부틸옥시카보닐)-N'-(p-톨일설포닐)디아미노에탄(9.56g, 30.41 mmole) 을 정제된 DMF 80mL에 녹이고 여기에 세슘 카보네이트(13.51g, 41.56mmole)을 가하고 교반시켰다. 이 혼합 용액에 2,6-비스-톨루엔설포닐옥시메틸-피리딘 (6.18g, 13.82mmole)을 첨가한 후 12시간 동안 실온에서 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 DMF을 감압 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출 하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 3 : 1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 95%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 1.35(s, 18H), 2.40(s, 6H), 3.10(t, 4H), 3.25(t, 4H), 4.34(s, 4H), 5.3(bs, 2H), 7.29(d, 6H), 7.35(d, 2H), 7.67(d, 5H), LC-MS(ESI) : m/z = 734.9[ M+H⁺]

D. 2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-N-[2-((톨루엔-4-설포닐)-{6-[((톨루엔-4-설포닐)-{2-[2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-아세틸아미노]-에틸}-아미노)-메틸]-피리딘-2-일메틸}-아미노)-에틸]-아세트아마이드의 합성(3-4)

{2-[(6-{[(2-tert-부톡시카보닐아미노-에틸)-(톨루엔-4-설포닐)-아미노]-메틸}-피리딘-2-일메틸)-(톨루엔-4-설포닐)-아미노]-에틸}-카바믹 에시드 tert-부틸 에스테르(11.77g, 16.04mmole)을 메틸렌 클로라이드 100mL에 녹이고 여기에 트리플로로아세트산 30mL를 가한 후 1시간 동안 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 감압 농축시키면 TFA 염 형태의 노란색 고체를 얻었다. 이 TFA염 화합물을 정제한 메틸렌 클로라이드 100mL에 녹이고 BOP(15.6g, 35.29mmole), HOBt 1.23g, 8.02mmole) 및 트리에틸아민(11.18mL, 80.2mmole)을 차례대로 첨가하고 교반시켰다. 이 혼합용액에 토실-Gly-OH(8.02 g, 35.29mmole)을 가한 후 2시간 동안 실온에서 교반시켰다. 반응을 멈추고 물과 메틸렌 클로라이드를 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 1 : 10의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 75%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.35(s, 6H), 2.41(s, 6H), 3.34(d, 4H), 3.38(s, 8H), 4.52(s, 4H), 5.3(t, 2H), 7.18-7.32(m, 10H), 7.58-7.72(m, 9H), LC-MS(ESI) : m/z = 955.2[ M+H⁺]

E. 3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29)-펜타엔-5,21-디온의 합성(3-5)

2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-N-[2-((톨루엔-4-설포닐)-{6-[((톨루엔-4-설포닐)-{2-[2-(톨루엔-4-설포닐아미노)-아세틸아미노]-에틸}-아미노)- 메틸]-피리딘-2-일메틸}-아미노)-에틸]-아세트아마이드(9.07g, 9.51mmole)을 정제한 DMF 300mL에 녹이고 여기에 세슘 카보네이트(7.13g, 21.87mmole)를 가하고 교반시켰다. 여기에 피리딘 디메탄올 (디토실레이트)(4.26g, 9.51mmole)을 DMF 100mL에 녹이고 천천히 적가한 후 실온에서 12시간동안 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 과량의 DMF을 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 1 : 1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 86%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.36(s, 12H), 3.20(bs, 8H), 3.79(s, 4H), 4.25(s, 4H), 4.33(s, 4H), 7.16-7.37(m, 12H), 7.58-7.74(m, 10H), LC-MS(ESI) : m/z = 1058.3[ M+H⁺]

F. 3,9,17,23-Tetrakis-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔의 합성(3-6)

3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.1^11,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29)-펜타엔-5,21-디온(7.17g, 6.78mmole)을 정제한 THF 50mL에 녹이고 0℃로 냉각 시킨 다음 질소 분위기 하에 1M BH₃ㆍTHF(82mL, 82mmole)를 천천히 적가 한 후 교반 시켰다. 첨가가 완전히 끝나면 반응온도를 65℃으로 천천히 올리고 6시간 동안 환류 교반시켰다. 반응 혼합물을 다시 0℃로 냉각시키고 거품이 일어나지 않을 때까지 물을 천천히 적가 한 후 감압 농축시키면 흰색 고체를 얻었다. 여기에 6N HCl 30mL를 가하고 1시간 동안 환류 교반한 후 냉각시키고 6N NaOH로 중화시킨 다음 메 틸렌 클로라이드 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 에탄올 : 에틸 아세테이트 = 4 : 1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 :77%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.34- 2.40(m, 20H), 3.07(t, 8H), 4.26(s, 8H), 7.29(d, 8H), 7.34(d, 4H), 7.57(t, 2H), 7.68(d, 8H), LC-MS(ESI) : m/z = 1030.3[ M+H⁺]

G. 4-브로모메틸-1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸의 합성

(1H-이미다졸-4-일)-메탄올(1.25g, 9.29mmole)를 물 20mL에 녹이고 여기에 포타슘 카보네이트(1.93g, 13.94mmole)을 가하고 0 ℃로 냉각시켰다. 여기에 p-톨루엔설포닐 클로라이드(2.13, 11.15mmole)을 THF 30 mL에 녹여 천천히 적가한 후 교반시켰다. 첨가가 완전히 끝나면 반응온도를 실온으로 천천히 올리고 2시간 정도 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 과량의 THF을 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 3 : 1의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다.

이 흰색 고체([1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸-4-일]-메탄올) (1.78g, 7.06 mmole)를 메틸렌 클로라이드 30mL에 녹이고 여기에 트리에틸아민(1.48mL, 10.59 mmole)를 가하고 0℃ 로 냉각시켰다. 여기에 메탄설포닐 클로라이드(0.67mL, 8.47mmole)을 천천히 적가 한 후 30분 동안 교반 시켰다. 1N-HCl과 메틸렌 클로라이드 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켜 깨끗한 흰색 고체를 얻었다. 이 화합물 (메탄설포닉 에시드 1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸-4-일메틸 에스터)를 아세톤 20mL에 녹이고 과량의 리튬 브로마이드를 첨가하고 1시간 동안 실온에서 교반시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 아세톤을 농축시킨 후 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드를 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 76%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.43(s, 3H), 4.35(s, 2H), 7.27(s, 1H), 7.37(d, 2H), 7.83(d, 2H), 7.94(s, 1H), LC-MS(ESI) : m/z = 316.19[ M+H⁺]

H. 6,20-비스-피리딘-2-일메틸-3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔의 합성(3-7)

3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔(0.5g, 0.49mmole)을 정제한 아세토니트릴 10mL에 녹이고 여기에 포타슘 카보네이트(0.34g, 2.45mmole)를 가하고 교반시켰다. 여기에 2-피콜일 클로라이드 하이드로클로라이드(2-picolyl chloride hydrochloride, 0.4g, 2.43mmole)를 첨가하고 24시간 동안 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 1 :2의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 54%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.39(s, 12H), 2.43(t, 8H), 3.16(t, 8H), 3.55(s, 4H), 4.22(s, 8H), 7.14(t, 2H), 7.25(d, 4H), 7.26(d, 10H), 7.47(t, 2H), 7.52(t, 2H), 7.61(d, 8H), 8.45(d, 2H), LC-MS(ESI) : m/z = 1211.1[ M+H⁺]

I. 3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-6,20-비스-[1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸-4-일메틸]-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔의 합성(3-8)

3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트 리사이클로[23.3.1.1^11,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔(0.36g, 0.35mmole)을 정제한 아세토니트릴 10mL에 녹이고 여기에 포타슘 카보네이트(0.24g, 1.75mmole)를 가하고 교반 시켰다. 여기에 4-브로모메틸-1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸 (0.32g, 1.04mmole)를 첨가하고 24시간 동안 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 메틸렌 클로라이드와 물을 이용해서 3회 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시켰다. 그런 뒤 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 = 1 : 2 의 전개용매로 컬럼 크로마토그래피를 하여 생성물인 흰색의 고체를 얻었다. (수율 : 82%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.30(t, 8H), 2.36(s, 6H), 2.37(s, 12H), 3.08(t, 8H), 3.30(s, 4H), 4.18(s, 8H), 7.14-7.30(m, 12H), 7.49(t, 2H), 7.59(d, 8H), 7.82(d, 6H), LC-MS(ESI) : m/z = 1497.3[ M+H⁺]

실시예 4: 화합물 3a의 합성(반응식 3b 참조)

A. 6,20-비스-피리딘-2-일메틸-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔의 합성(3-7a)

6,20-비스-피리딘-2-일메틸-3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.1^11,15] 트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔 (0.32g, 0.26mmole)을 진한 황산 10mL에 녹이고 48시간동안 100 ℃에서 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 0℃로 냉각시킨 다음 증류수 5mL를 천천히 가하였다. 이 혼합용액에 에탄올 10mL와 과량의 KOH를 첨가(pH > 12)하고 교반시켰다. 흰색침전물이 생겨나게 되는데 이것을 글래스 여과를 이용해서 여과하고 수용액을 메틸렌 클로라이드를 이용해서 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시키면 깨끗한 생성물의 옅은 노란색 고체를 얻었다.(수율 76%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.78(s, 16H), 3.76(s, 4H), 3.82(s, 8H), 7.06(d, 4H), 7.09(t,2H), 7.43-7.57(m, 6H), 8.46(d, 2H), LC-MS(ESI) : m/z = 585.3[ M+H⁺]

B. 6,20-비스-(1H-이미다졸-4-일메틸)-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔의 합성(3-8a)

3,9,17,23-테트라키스-(톨루엔-4-설포닐)-6,20-비스-[1-(톨루엔-4-설포닐)-1H-이미다졸-4-일메틸]-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.1^11,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔(0.5g, 0.33mmole)을 진한 황산 10mL에 녹이고 48시간동안 100℃에서 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 0℃로 냉각시킨 다음 증류수 5mL를 천천히 가하였다. 이 혼합용액에 에탄올 10mL와 과량의 KOH를 첨가(pH > 12)하고 교반시켰다. 흰색침전물이 생겨나게 되는데 이것 을 글래스 여과를 이용해서 여과하고 수용액을 메틸렌 클로라이드를 이용해서 추출하고 유기층을 모아 소금으로 씻어주고 무수 MgSO₄로 건조시켜 여과한 후 감압 농축시키면 깨끗한 생성물의 옅은 노란색 고체를 얻었다.(수율 72%)

¹H-NMR (200MHz, CDCl₃) : δ 2.63(s, 16H), 3.40(s, 4H), 3.72(s, 8H), 6.78(s, 2H), 7.02(d, 4H), 7.31(s, 2H), 7.50(t, 2H), LC-MS(ESI) : m/z = 573.4[ M+H⁺]

실시예 5: 화합물 3-7b ₁ (L-2Mn ²⁺ )의 합성(반응식 3b 참조)

상기 실시에 3에서 제조된 6,20-비스-피리딘-2-일메틸-3,6,9,17,20,23,29,30-옥타아자-트리사이클로[23.3.1.111,15]트리아콘타-1(28),11,13,15(30),25(29),26-헥사엔(20mg, 33.6 μmole)을 메탄올 5mL에 녹이고 여기에 MnCl₂ (8.45mg, 67.2 μmole)을 가한 후 질소 분위기하에서 2시간 동안 환류 교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 셀라이트를 채운 글래스 여과를 이용해서 여과시키고 농축시켰다. 이것을 MeOH - 에테르 용매를 이용해서 재결정하여 흰색 고체를 얻었다.(수율 : 75%)

실시예 6: 화합물 3-7b ₂ 및 3-7b ₃ 의 합성(반응식 3b 참조)

상기 실시예 5와 동일한 방법으로 실시하되, 상기 실시예 3에서 제조된 화합 물 3-7을 이용하여, MnCl₂ 대신 각각 CuCl₂, FeCl₂를 사용하여 구리와 철이 각각 배위된 화합물 3-7b₂(L-2Cu²⁺) 및 3-7b₃(L-2Fe²⁺)을 얻었다.

실시예 7: 화합물 3-8b의 합성(반응식 3b 참조)

화합물 3-8(20mg, 34.9 μmole)을 메탄올 5mL에 녹이고 여기에 MnCl₂ (8.8mg, 69.8 μmole)을 가한 후 질소 분위기 하에서 2시간 동안 환류교반 시켰다. 그런 후 반응을 멈추고 셀라이트를 채운 글래스 여과를 이용해서 여과시키고 농축시켰다. 이것을 MeOH - 에테르 용매를 이용해서 재결정하여 흰색 고체를 얻었다.(수율 : 75%)

실시예 8: 화합물의 활성도 실험

1) 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide Dismutase) 활성측정

반응 혼합물속의 잔틴(xanthine)과 잔틴 옥시다제(xanthine oxidase)에 의하여 수퍼옥사이드가 생성이 되며, 이것이 NBT를 환원(reduction) 시키게 되는데, SOD 활성은 이 반응혼합물 속에 첨가하여 준 SOD mimic(chemical)이 수퍼옥사이드에 의한 NBT 환원을 억제하는 정도로 측정하였다.(SOD 활성: 1 unit를 갖는 각 화합물의 umol 농도로서 그 활성을 표시하였다.)

2) 카탈라아제(catalase) 활성의 측정

과산화수소수와 화합물을 혼합한 후 240 nm의 파장에서 과산화수소의 감소를 측정하여 다음과 같이 정의하였다.

* 효소 1 unit : 1분에 과산화수소 1 umol의 감소

* 각 화합물의 50umol당 카탈라아제 활성(catalase activity)

이때, 대조군으로 사용된 물질은 카탈라아제 및 SOD의 활성을 모두 가진 것으로 알려진 EUK-134와, SOD 활성을 가지고 있는 SOD mimic인 M40403로서, 그 구조는 다음과 같다.

화합물	SOD 활성 (umol/unit)	카탈라아제 활성 (unit/50umol)
M40403	0.52	-
EUK-134	1.53	7.0
화합물 1 (C17H29C12MnN5)	30.27	-
화합물 3-7b1(L-2Mn2+)	47.5	2.92
화합물 3-7b3(L-2Fe2+)	5.33	-

상기 표 1의 결과에서 알 수 있듯이, 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂MnN₅ )의 경우 SOD 활성이 확인되었고, 화합물 3-7b₁(L-2Mn) 및 3-7b₃(L-2Fe) 역시 SOD 활성이 확인되었다.

실시예 9. 합성 유도체의 세포독성검색

합성 유도체에 대한 세포독성을 MTT 분석법으로 실험하였다.

대수증식기의 섬유모세포를 웰 당 8000 개로 96웰 플레이트에 접종하여 200 ㎕ DMEM 배지에서 24 시간과 48시간 동안 배양하였다. 배양된 세포에 유도체 화합물을 처리하고 배양한 다음 MTT 용액 0.5 ㎎/㎖를 포함한 배지에서 4 시간 더욱 배양하였다. 이후 200 ㎕ 디메틸설폭사이드 용액을 웰에 넣어 용해시키고, ELISA 판독기를 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 계산식 1로 환산하여 M40403, 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂MnN₅), 화합물 3-7b₁ (L-2Mn) 및 3-7b₃(L-2Fe)의 세포 생존율을 환산하여 도 1 내지 4에 각각 나타내었다.

(계산식 1)

도 1 내지 4의 결과에서 보면, 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂MnN₅)은 160uM 이내에서 세포독성을 보이지 않았으며 화합물 3-7b₁(L-2Mn) 및 3-7b₃(L-2Fe) 역시 200 uM 이내의 농도에서 세포 독성을 보이지 않았다.

실시예 10. 화합물 1(C ₁₇ H ₂₉ C ₁₂ MnN ₅ )의 MMP-1 프로모터 활성억제효능시험

MMP-1 프로모터-루시퍼라제(luciferase) 발현이 안정적으로 구축된 세포주를 이용하였고, 음성대조군으로 NIH3T3 세포주(mock-transfected cell line)를 이용하 였다. 각 세포에 화합물 유도체를 투여하고, 2 시간 후 TPA 100 nM을 처리하였다. 세포 각각은 탄산가스 배양기에서 48시간 동안 배양하여 MMP-1의 발현을 유도하였고, MMP-1의 발현은 루시퍼라제 키트를 이용하여 측정하였다. 또한 대조군으로 TPA(12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetate)을 처리한 세포만을 설정하고, M40403 혹은 M40403 유도체(실시예 1)를 처리한 세포에서의 루시퍼라제의 발현을 측정하여 루시퍼라제 발현 억제율을 계산하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과에서 보면, MMP-1 프로모터 루시퍼라제 구조(promotor luciferase construct)의 안정한 세포주(stable transfection cell line)를 이용하여 100 mJ/㎠의 UVB 조사 후 유도체를 처리하였을 때, 화합물 1(C₁₇H₂₉C₁₂ MnN₅)은 자외선에 의하여 유도되는 MMP-1의 발현을 억제할 수 있는 것으로 나타났다.

본 발명의 활성 산소 소거능이 뛰어나고 독성이나 부작용이 적은 SOD 및 카탈라제 유도체는 피부 노화, 암, 치매, 류마티스 등의 활성산소와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약제 조성물 등의 제조에 이용될 수 있다.

Claims (4)

1. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 카탈라아제 활성을 가지는 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물:

   [화학식 2]

   

   상기 화학식 2에서, M은 Mn, Fe 또는 Cu이고, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이고,

   [화학식 3]

   

   상기 화학식 3에서, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 또는 동시에 헤테로 원소를 포함하는 헤테로 고리 치환기를 가지는 알킬기이며, M은 Mn, Fe 또는 Cu이며, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이다.
2. 슈퍼옥사이드 디스뮤타제 및 카탈라아제 활성을 가지는 하기 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항산화제:

   [화학식 2]

   

   상기 화학식 2에서, M은 Mn, Fe 또는 Cu이고, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이고,

   [화학식 3]

   

   상기 화학식 3에서, R₃ 및 R₄는 각각 독립적으로 또는 동시에 헤테로 원소를 포함하는 헤테로 고리 치환기를 가지는 알킬기이며, M은 Mn, Fe 또는 Cu이며, X는 Cl, Br, I, OAc 또는 ClO₄ 이다.
3. 제 1항의 화학식 2 또는 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 노화 예방 또는 치료용 약제 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 1 종 이상의 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 예방 또는 치료용 약제 조성물.

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