KR100618163B1

KR100618163B1 - 프라네올을 유효 성분으로 함유하는 항진균용 조성물

Info

Publication number: KR100618163B1
Application number: KR1020050014237A
Authority: KR
Inventors: 이동건; 성우상; 정현준; 이인선; 김현수
Original assignee: 학교법인 계명기독학원
Priority date: 2005-02-21
Filing date: 2005-02-21
Publication date: 2006-08-29
Also published as: KR20060093213A

Abstract

본 발명은 프라네올을 유효 성분으로 함유하는 항진균용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 항생 활성을 나타내는 딸기 또는 파인애플 유래의 프라네올을 유효성분으로 함유함으로써 세포 독성이 없이 탁월한 항균 및 항진균 활성을 나타내는 조성물을 제공할 수 있으므로 인체에 안전한 항생제 및 식품 보존용 첨가제, 화장품 첨가제, 천연물성 농약제제 등으로 응용가능성이 있어서 매우 유용하다.

프라네올, 항균, 항진균, 항생제

Description

프라네올을 유효 성분으로 함유하는 항진균용 조성물{Antimicrobial composition comprising furaneol as an effective ingredient}

도 1은 프라네올의 항생 활성을 가시화하기 위해 병원성 세균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 페트리 접시에 도말한 사진이다. 여기에서 (가)는 아무 물질도 처리하지 않은 대조구, (나)는 20㎍ 프로피온산을 처리한 것, (다)는 40㎍ 프라네올을 처리한 것을 나타낸다.

도 2는 프라네올의 항생 활성을 가시화하기 위해 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 페트리 접시에 도말한 사진이다. 여기에서 (가)는 아무 물질도 처리하지 않은 대조구, (나)는 20㎍ 암포테리신 B를 처리한 것, (다)는 20㎍ 프라네올을 처리한 것을 나타낸다.

도 3은 프라네올의 항생 활성이 정균 작용인지 살균 작용인지를 확인하기 위해 시간에 따른 프라네올의 스태필로코쿠스 아우레우스에 대한 항생 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 여기에서 ●는 20㎍ 프로피온산을 처리한 것, ○는 20㎍ 프라네올을 처리한 것을 나타낸다.

도 4는 프라네올의 항생 활성이 정균 작용인지 살균 작용인지를 확인하기 위해 시간에 따른 프라네올의 캔디다 알비칸스에 대한 항생 활성을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다. 여기에서 ●는 20㎍의 암포테리신 B를 처리한 것, ○는 20㎍ 의 프라네올을 처리한 것을 나타낸다.

도 5는 프라네올이 생체내에서 어떤 작용 기작으로 항진균 활성을 나타낼 지를 확인하기 위해 캔디다 알비칸스가 체내에 감염되었을 때, 병원성을 유발시키는데 필수적인 역할을 하는 동종 이형(Dimorphic transition)에 대한 프라네올의 영향을 조사한 결과를 보여주는 것이다. 여기에서 (가)는 아무 물질도 처리하지 않은 대조구, (나)는 20%의 송아지 혈청액만을 처리한 것, (다)는 40㎍의 프라네올을 처리한 것, (라)는 80㎍의 프라네올을 처리한 것을 나타낸다.

도 6은 프라네올의 항생 활성의 작용 기작을 알아보기 위해 프라네올에 의한 유전자 파괴 활성을 조사한 결과를 보여주는 것이다. 여기에서 (가)는 유전자의 크기를 알수 있는 마커, (나)는 아무 물질도 처리하지 않은 대조구, (다)는 프라네올을 유전자에 처리한 후 2시간 동안 배양한 것, (라)는 3시간 동안 배양한 것, (마)는 4시간 동안 배양한 것, (바)는 5시간 동안 배양한 것을 나타낸다.

본 발명은 프라네올을 유효 성분으로 함유하는 항진균용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 딸기 또는 파인애플로부터 분리되어질 수 있는 프라네올을 유효성분으로 함유하는 항박테리아제, 항진균제, 식품보존첨가제, 화장품 첨가제 또는 천연물성 농약 등의 용도로 사용될 수 있는 항진균용 조성물에 관한 것이다.

지금까지 수많은 항생제가 개발되면서 병원성 미생물에 의한 질병 치료에 사 용되어 왔지만 항생제의 오남용으로 인해 여러 항생제에 내성을 지닌 내성 균주가 출현하게 되었다. 이로 인해 지금까지 사용 되어지고 있는 수많은 항생제가 무용지물이 되어 지고 있다. 이러한 시점에서 항생제 내성 균주에 대한 새로운 항생제의 개발이 절실하게 요구되고 있다.

한편, 딸기향의 가장 중요한 휘발성 물질 중 하나인 프라네올는 파인애플에서 처음 발견되어진 이후 {Rodin, J. O., et al. J. Food Sci. 30 (1965) 280}, 딸기 {Ohloff, G. et al. Fortschr. Chem. Forsch. 12 (1969) 185}에서도 분리 되어졌다. 프라네올에 대한 선행 연구로는 항산화 작용 효과와 백내장 억제 작용{Saski T. et al. Biosci Biotechnol Biochem. 62 (1998) 9}이 보고 되어 졌다. 그리고 동물 모델에서의 종양 형성을 억제한다는 내용{Kataoka S. et al. Food Chem Toxicology 35 (1997) 449}이 보고되어진 바 있지만, 항균 및 항진균 활성에 대한 연구는 미미한 실정이었다.

이에 본 발명자는 프라네올의 항균 및 항진균 활성과 그 작용 기작을 밝히고 상기 프라네올을 이용하여 항진균성 조성물을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 프라네올을 유효 성분으로 함유하는 항진균용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 프라네올의 항균 및 항진균 활성과 그 작용 기작을 밝히고 상기 프라네올을 이용하여 항진균성 조성물을 제조할 수 있음을 확인함으로 써 달성하였다.

본 발명은 하기 화학식의 프라네올 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항진균 활성 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식의 프라네올은 항박테리아제, 항진균제, 식품보존첨가제, 화장품 첨가제 또는 항진균용 농약 등에 포함되어 항진균 활성조성물로써 사용될 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 프라네올의 병원성 미생물에 대한 항균 활성 조사

프라네올(4-Hydroxy-2,5-Dimethyl-3(2H)-Furanone)은 딸기, 파인애플에서 분리되는 물질로서 하기 화학식 1의 구조를 가졌다. 본 발명에서 프라네올은 시그마 알드리치 코리아사로부터 구입하여 4 ℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

프라네올의 항균 활성을 측정하기 위하여, 먼저 병원성 세균인 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코쿠스 애피덜미디스(Staphylococcus epidermidis), 대장균(Escherichia coli), 대장균 O-157(Escherichia coli O-157), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris)와 경북대학교 병원 환자에게서 분리한 메치실린 내성 스태필로코쿠스 아우레우스(Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus) 5종과 항생제 내성 슈도모나스 아루지노사(Antibiotics-Resistant Pseudomonas aeruginosa)를 LB 완전 배지 (Tryptone 1 %, NaCl 1 %, Yeast extract 0.5 %)로 1×10⁶세포/1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 프라네올의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리했다. 그런 후, 37 ℃ 배양기에서 6시간 동안 진탕배양을 하면서 ELISA 판독기(reader)를 이용하여 620 nm의 파장 하에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였다.

또한, 프라네올의 항진균 활성의 측정에는 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 YPD 완전 배지(포도당 2%, peptone 1%, yeast extract 0.5%, pH 5,5)에 배양하여, YPD 액체 배지로 2×10³ 세포/ 1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 프라네올의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리했다. 그런 후, 28 ℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액 [5 mg of MTT/mL of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. MTT에 의하여 생성된 포르마잔 (Formazan)들을 용해하기 위해 0.02 N HCl이 포함된 20 % SDS를 20 ㎕를 넣은 후, 37 ℃에서 16시간 반응시켰다. ELISA 판독기(reader)로 570 nm의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도(MIC)를 측정하였다.

상기와 같은 실험 결과, 프라네올의 항균 활성은 그람 양성과 음성균을 포함한 넓은 범위의 병원성 세균에서 항균 활성을 가지고 있으며, 최소 생육 저지 농도 (MIC)는 대부분 20 - 40 ㎍으로(하기 표 1 참조), 식품 산업에서 식품 보존용 첨가제(방부제)로 사용되어지고 있는 프로피온산(Propionic acid)과 유사한 항균 활성을 나타냄을 확인 할 수 있었다.

프라네올의 병원성 세균에 대한 최소 생육 저지 농도 (MIC)

	병원성 세균에 대한 MIC ^a(㎍/mL)
	그람 양성균		그람 음성균
	S. 아우레우스	S. 애피덜미디스	대장균	대장균 O-157	P. 불가리스
프라네올	20-40	20	20	20	20
프로피온산	20	20	10-20	10	10
[주] a: 병원성 세균의 생육이 전혀 안되는 프라네올의 농도

또한, 경북대학교 병원 환자에게서 분리한 항생제 내성 균주인 메치실린 내성 스태필로코쿠스 아우레우스와 항생제 내성 슈도모나스 아루지노사에서도 또한 20 - 40 ㎍의 최소 생육 저지 농도를 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2 참조).

프라네올의 경북대학교 환자로부터 분리한 항생제 내성 균주에 대한 최소 생육 농도(MIC)

	항생제 내성 균주에 대한 MIC ^a(㎍/mL)
	MRSA^b					P. 아루지노사 ^c
	03ST 1	03ST 30	03ST 33	03ST 46	03ST 67	97K 015	97K 064	97K 091	97K 104	03K 268
프라네올	20	20	20-40	40-80	20	20-40	10-20	40	20	20
프로피온산	10	10-20	5-10	20	10-20	10-20	10	20	10-20	10
[주] a: 항생제 내성 균주에 대해 생육이 전혀 안되는 프라네올의 농도 b: 메치실린 내성 스태필로코쿠스 아우레우스(Methicilin-Resistant Staphylococcus aureus) c: 항생제 내성 슈도모나스 아루지노사(Antibiotics-Resistant Pseudomonas aeruginosa)

프라네올의 항진균 활성 측정의 결과, 병원성 진균에 대해서 5 - 20 ㎍의 최소 생육저지농도를 나타내었다(표 3 참조). 이는 대조군인 임상에서 사용되어지고 있는 강력한 항진균제인 암포테리신 B (Amphotericin B)보다는 항진균 활성이 조금 떨어지지만, 그래도 강력한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있었다.

프라네올의 병원성 진균에 대한 최소 생육 저지 농도(MIC)

	병원성 진균에 대한 ^aMIC(㎍/mL)
	C. 알비칸스	T. 베이겔라이	S. 세르비지애
프라네올	5-10	10-20	10
암포테리신 B	2.5-5	5	5
[주] a: 병원성 진균에 대해 생육이 전혀 안되는 프라네올의 농도

실시예 2: 프라네올의 항생 활성의 가시적 조사

프라네올의 항생 활성을 가시화하기 위한 실험은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 항균 활성을 가시화하기 위해 스태필로코쿠스 아우레우스를 LB 액체 배지에서 배양한 후에 세포수를 1×10⁶ 세포/ 1 mL가 되도록 LB 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 100 ㎕ 씩 분주 한 후, 프라네올의 용액을 처리하고, 37 ℃ 배양기에서 6시간 동안 배양하였다. 그런 후, LB 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 37 ℃ 배양기에서 배양하여 페트리 접시 사진을 찍었다. 다음으로 항진균 활성을 가시화하기 위해 캔디다 알비칸스를 YPD 액체 배지에서 배양한 후에 세포수를 2×10³ 세포/ 1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 100 ㎕ 씩 분주 한 후, 프라네올의 용액을 처리하고, 28 ℃ 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 그런 후, YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 28 ℃ 배양기에서 배양하여 페트리 접시 사진을 찍었다.

프라네올의 항생 활성을 가시화하기 위한 페트리 접시 사진 결과, 프라네올을 처리한 군에서 항균 활성과 항진균 활성 모두 프라네올 비처리군에 비해 콜로니의 생성이 현저히 떨어짐을 확인하였으며 이로써 프라네올의 항생 활성을 분명하게 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조).

실시예 3: 프라네올의 시간에 따른 항생 활성 조사

프라네올의 시간에 따른 항생 활성의 측정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 항균 활성의 시간에 따른 측정은 스태필로코쿠스 아우레우스를 LB 배지에서 배양한 후, 세포수를 1×10⁶ 세포/ 1 mL가 되도록 LB 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그런 후, 프라네올의 용액을 처리하고 37 ℃에서 배양하면서 일정 시간별로 LB 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 37 ℃ 배양기에서 도말한 페트리 접시를 배양하여 형성된 콜로니의 숫자를 확인하였다. 다음으로 항진균 활성의 시간에 따른 측정은 캔디다 알비칸스를 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수를 2×10³ 세포/ 1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그런 후, 프라네올의 용액을 처리하고 28 ℃에서 배양하면서 일정 시간별로 YPD 고체 배지 페트리 접시에 도말하여 28 ℃ 배양기에서 도말한 페트리 접시를 배양하여 형성된 콜로니의 숫자를 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).

그 결과, 항균 활성과 항진균 활성 모두에서 병원성 미생물에 대해서 정균 작용이 아니라, 살균 작용을 나타냄을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 동종 이형에 대한 프라네올의 영향 조사

캔디다 알비칸스의 병원성에 필수적인 동종 이형(Dimorphic transition)에 대한 프라네올의 영향은 다음과 같이 조사하였다. 캔디다 알비칸스를 YPD 배지에서 배양한 후, 세포수가 2×10³ 세포/ 1 mL가 되도록 YPD 배지로 희석하여 96-웰 플레이트에 그 희석액을 분주하였다. 그런 후, 프라네올의 용액과 함께 생체 내 조건을 맞추어 주기 위해 20% 송아지 혈청액(Fetal bovine serum)을 넣어 주고, 체온과 같은 온도인 37 ℃ 배양기에서 배양하면서 균의 형태 변화를 관찰하였다(도 5 참조).

그 결과 대조군인 송아지의 혈청액만을 넣은 경우에는 균사체를 형성하는데 비하여, 프라네올의 처리군에서는 균사체 형성이 저해되는 것을 확인할 수 있었다(도 5 참조). 이로써 프라네올이 생체 내에서 캔디다 알비칸스에 의한 발병을 막을 수 있음이 판명되었다.

실시예 5: 프라네올에 의한 유전자 파괴 활성 조사

프라네올에 의한 유전자 파괴 활성 조사는 하기와 같이 실시하였다. 슈퍼 코일드 PUC 19 플라스미드 유전자(5 ㎍/mL) 2 ㎕를 6 ㎕의 멸균된 3차 증류수에 섞고, 여기에 10 ㎍의 프라네올의 용액을 섞어서 37 ℃ 배양기에서 2, 3, 4, 5시간 동안 배양하였다. 그런 후, 6× loading 완충액 (Takara Co.) 2 ㎕와 섞고, 혼합액 전체를 아가로스 젤에 적제하고, 50V 전압 하에서 SLMUP- ID-21J(Seoulin bioscience co.)를 이용하여 30분 동안 전기 영동하였다. 전기 영동에 사용한 완충액은 TAE 완충액(Tris-acetate-EDTA pH 8.0)을 사용하였고, 아가로즈 젤은 1.0% SEAKem GTG agarose를 사용하였다. 그런 후, 에티듐-브로마이드 (Ethidium bromide 0.5 mg/mL) 수용액에서 40분 동안 염색하여 300 nm의 자외선 파장 하에서 발색하여 사진 촬영을 하였다(도 6 참조).

그 결과, 시간이 지남에 따라 프라네올에 의해 유전자가 파괴됨을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 프라네올의 항생 활성이 병원성 미생물의 유전자에 대해 프라네올이 손상을 줌으로써 항생 활성을 나타냄이 판명되었다.

실시예 6: 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성 측정

인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다. 적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0%의 적혈구 세포 용액을 만든다. 그런 후, 8.0% 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후에 프라네올의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다. 모든 웰에 총액의 양이 200 ㎕가 되도록 생리 식염수(Saline 0.85% NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다. 적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기 (reader)로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1% 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100% 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0% 파괴능으로 계산하였다. 프라네올의 파괴능은 하기 식에 의하여 계산하였다.

% 파괴능 = [( 프라네올을 처리한 용액의 흡광도_414nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도_414nm)/(트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도_414nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도_414nm) × 100

그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 표 4를 통해 알 수 있듯이 본 발명 프라네올은 전혀 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 임상에서 항진균제로 사용되어지는 암포테리신 B은 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타났고, 식품 산업에서 사용되어지는 프로피온산은 높은 농도에서 약간의 세포 독성을 나타내었다. 따라서, 본 발명에서 발견된 프라네올는 인간의 신체에 피해 없이 인간에 대해 사용이 가능함을 확인할 수 있었다.

인간 적혈구 세포(Human erythrocytes)에 대한 프라네올의 세포 독성 측정

	% 인간 적혈구 파괴능 ^a(㎍/mL)
	80	40	20	10	5	2.5
프라네올	0	0	0	0	0	0
프로피온산	5.2	0	0	0	0	0
암포테리신 B	100	98.6	92.3	86.6	71.2	62.2
[주] a: 인간에 대한 세포 독성은 인간 적혈구 세포에 대한 프라네올의 파괴능으로 측정

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 프라네올의 항균 및 항진균 활성과 그 작용 기작을 밝히고 세포 독성을 조사함으로써 프라네올을 이용하여 세포독성이 전혀 없는 신규의 항진균성 조성물을 제조할 수 있는 매우 뛰어난 효과가 있으므로 의약품 및 농화학 산업 상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

하기 화학식의 프라네올 또는 그의 유도체를 유효성분으로 함유하는 항진균 활성 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 항진균 활성 조성물은 항박테리아제, 항진균제, 식품보존첨가제, 화장품 첨가제 및 항진균용 농약으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나임을 특징으로 하는 항진균 활성 조성물.