KR100603495B1 - 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무 추출물 및 이를함유하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물, 그 제조방법 및 상기 추출물 유효량과 의약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 암세포 증식억제용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 등나무 혹(瘤) 추출물은 암세포의 전이과정 중의 대표적인 표적 마커의 하나인 CD44의 발현을 억제하여 암세포의 이동을 감소시키고, 세포부착에 관련된 단백질인 GTP-RhoA의 활성을 증가시켜 세포이동을 저해시켜, 결국, 암세포의 운동성을 저지시켜 암의 전이와 확장을 억제하는 효과를 가진다.
등나무, 혹(瘤), 추출물, 암세포, 항암, 운동성
Description
도 1은 본 발명에 따른 등나무 추출물의 항암활성을 검증한 운드힐링 시험의 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 등나무 추출물이 전이의 표지인자인 세포분화인자(CD44)의 발현에 미치는 영향을 나타낸 PCR 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 등나무 추출물이 RhoA 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 웨스턴 블로팅의 결과이다.
본 발명은 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물, 그 제조방법 및 상기 추출물 유효량과 의약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 암세포 증식억제용 조성물에 관한 것이다.
최근 암으로 인한 사망률의 증가는 새로운 항암제의 개발 및 발견에 많은 투자를 유도한다. 암은 신체 내에서 조직, 혹은 세포의 일부가 정상적인 사멸의 과정을 거치지 않고 비정상적으로 증식과 성장을 계속하면서 정상의 조직들조차도 파괴를 하여 결과적으로 세포, 조직, 기관으로 이루어지는 신체의 일부, 혹은 다수의 정상적인 기능이 마비되어 최종적으로 사망에 이르게 되는 퇴행성 질환의 대표적인 질병이다. 이에 효과적인 항암제로 많은 약물들이 개발되어 임상에 사용되고 있다. 하지만 현재 시판, 혹은 개발된 항암제는 항암제로서의 효과가 탁월한 반면에 그에 따르는 부작용이 많이 보고되어져 왔다. 또한 기술적으로 투약에 있어서 전문적인 지식을 가지는 의료인에 의해 시술되는 경우가 대부분으로 이차적인 비용 또한 많이 드는 것이 사실이다.
국내특허 제10-0242240은 담배풀 (Carpesium adrotanoides L)로부터 신생혈관 유도현상을 억제하는 활성을 갖는 세스큐터핀 락톤계 화합물의 제조 방법 및 이를 포함하는 조성물에 관한 것으로 각막 이식시 실명, 암전이 및 당뇨병성 망막증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 보고하였고, 미국특허 5,801,254는 Artemisia sylvatica MAXIMOWICZ으로부터 arteminolide를 분리하고 이들이 파네실 프로테인 전이효소의 저해제임을 여러 가지 암세포주와 동물모델로서 증명하였다. 또한 미국특허 6,387,948은 8-acetylarteminolide로부터 항전이 효과를 검증하여 2002년에 보고하였다.
국내등록특허 0202395와 0213897은 신생혈관유도현상을 억제하는 쑥 유래의 아타노말로이드계와 계피 유래의 신남알데하이드의 유도체의 제조 방법과 이를 함 유하는 조성물에 관한 특허로서 이들 각각은 천연 식물 성분에서 항암 또는 항전이의 활성을 보고하였다.
국내특허출원 10-2001-38966과 10-2001-56356은 항암 및 암 전이 억제 효과를 갖는 조성물에 관한 것으로써 복령, 백출산에, 선학초와 어성초를 가미한 백선영출산의 항전이 및 항암작용을 실험적으로 입증하고자, 물추출물, 헥산, 부탄올, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르 분획과 스크리닝 과정에서 유효했던 분획의 세포 독성효과 등의 항암 활성과 혈관 형성 억제, 단백질 분해효소의 발현억제, 항전이 효능 등을 검토한 결과 부작용이 없으면서 항암효과를 가지는 것으로 나타났다. 이 기술은 서양의학의 암 치료법은 화학요법, 방사선 요법, 수술요법, 면역요법 등이 시행되고 있는데 암세포 뿐만 아니라 인체의 정상조직과 기관에 대한 독성이 강하여 환자에게 소화기 장애, 공수 기능억제, 면역기능저하, 염증반응, 신경쇠약 등의 부작용을 유발함에 따라, 이러한 문제점을 해결하기 위한 조성물로서 부작용이 없는 장점을 가지며 신규 항암제로서의 용도를 제공한다.
본 발명자들은 부작용이 없고, 새로운 항암 활성이 있는 천연물질을 개발하고자 예의 노력한 결과, 초고속 스크리닝의 기술을 적용하여 몇 가지의 후보 예비물질을 선별하고, 이들 중, 등나무 추출물이 항전이 활성을 나타내는 표지인자인 CD44(CD44 antigen; Hermes Antigen; Pgp1; Mdu3)의 발현을 억제하고, 부착단백질인 RhoA의 활성을 증가시켜 암세포의 이동을 억제한다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 암세포 증식억제 활성을 가지는 등나무 추출물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 등나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 암세포 증식억제용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 운드힐링 에세이를 통한 암세포의 이동을 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤)을 C3~6 저급알콜, 물, 저급 유기산, 저급알콜에스테르, 저급케톤 및 할로겐화탄화수소로 구성된 군에서 선택된 용매로 추출하는 단계; 및 (b) 상기 추출액을 회수하는 단계를 포함하는 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 추출물 유효량과 의약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 암세포 증식억제용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 등나무 추출물은 항암효과를 나타내기 위한 제제나 다른 물질과 혼합하여 항암효과를 더욱 증강시킬 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 운동성이 있는 암세포를 암세포 이동저해 후보물질이 함유된 배지를 포함하는 플레이트에 부착하는 단계; (b) 상기 암세포가 부착된 일정영역에서 상기 암세포를 제거하는 단계; 및 (c) 상기 암세포가 제거된 영역으로 상기 암세포가 재이동하는 것을 억제하는 물질을 선택하는 단계를 포함하는 운드힐링 에세이를 통한 암세포의 이동을 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않으며 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
하기 실시예에서는 등나무 추출물의 암세포 증식억제 효과를, 암세포의 운동성 저해, 표식 인자로 알려진 CD44의 억제 및 세포의 부착을 증가시키는 활성화된 형태의 RhoA 활성증가를 통하여 확인하였다.
실시예 1: 등나무(
Wisteria florbunda)
추출물의 제조
본 실시예에서는 Wisteria florbunda에서 채집한 혹(瘤)을 클로로포름에 침지시켜 추출액을 제조하였다. 먼저 채집한 등나무의 혹 5g을 세밀하게 잘라 유리제 시험관에 넣고, 추출용매(클로로포름) 5ml을 첨가한 다음, 밀봉하였다. 200rpm으로 30분간 교반한 다음, 하루밤 동안 정치시킨 후, 5,000rpm으로 원심분리하여 상등액을 수득하고, 이를 본 발명의 추출물로 사용하였다.
본 실시예에서는 추출용매로 클로로포름을 사용하였지만, 증류수, 에탄올, 메탄올 등의 다른 유기용매를 사용하여 추출할 수도 있다. 추가로 사용가능한 유기용매로는 C3~6 저급알콜, 저급 유기산, 저급알콜에스테르, 저급케톤 및 할로겐화탄화수소 등이 있다.
실시예 2: 등나무 추출액의 in vitro 항암 활성
실시예 1에서 수득한 등나무 추출물의 in vitro 항암활성을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다. 암세포의 하나인 Mus musculus B16F1(ATCC CRL-6323)은 부착세포로서 운동성이 있는 것으로 알려져 있다.
10% FBS(fetal bovin serum)를 포함한 RPMI 1640 배지에 B16F1 세포를 6개 구멍의 플레이트에 이식시킨 다음, 세포가 플레이트의 바닥에 붙고 난 후, 1~2mm의 선을 그어 세포를 이 공간에서 제거시켰다. 이후 이 부분으로 세포가 재이동하는 능력을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 등나무 추출물을 5μg/ml을 첨가한 경우, 대조구보다 더 명확하게 세포의 손상회복력이 시간 의존적으로 저해되었다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 등나무 추출물이 암세포의 증식억제, 더 구체적으로 표현하면, 암세포의 이동억제에 매우 효과적이라는 것을 확인 할 수 있었다.
실시예 3: RT-PCR에 의한 RNA 수준에서의 확인
세포의 운동성과 세포 간 교환에 관여하는 CD44의 발현정도를, RT-PCR을 통하여, mRNA 수준의 발현정도로 알아보고자 하였다. 10% FBS(우태아혈청)를 포함한 RPMI 1640 배지에 B16F1세포를 만 하루동안 실시예 1에서 수득한 등나무 추출물과 함께 배양한 후, Trizol(Gibco BRL)을 이용하여 RNA를 추출한 다음, 이를 이용하여 RT-PCR을 수행하였다.
cDNA합성은 oligo 역전사효소(Intron)를 사용한 RNA 1g으로부터 합성하였고, 마우스형의 CD44의 앞쪽 프라이머(서열번호 1)와 뒤쪽 프라이머(서열번호 2), GAPDH의 앞쪽 프라이머(서열번호 3)와 뒤쪽 프라이머(서열번호 4)로부터 합성 duplex oligonucleotide를 제조하였다.
서열번호 1: 5'-TCGATTAGAATGTAACCTGCC-3'
서열번호 2: 5'-TGGTGTGTTCTATACTCGCCC-3'
서열번호 3: 5'- ATGTTCCAGTATGACTCCAC-3'
서열번호 4: 5'- GCCAAAGTTGTCATGGATGA-3'
RT-PCR은 95℃에서 105초 배양을 시작으로 Bio-Rad Cycler로 수행하였다. 결국 94℃에서 30초, 55℃에서 1분, 그리고 72℃에서 2분, 72℃에서 7분 배양으로 30 사이클을 수행하였다. PCR 산물은 3% 아가로스젤에서 전기영동 하고 에티듐브로마이드로 염색한 후, 사진을 찍었다 (도 2). RT-PCR의 mRNA의 동량 사용 여부를 확인하기 위한 대조구로는 GAPDH의 앞쪽 프라이머(서열번호 5)와 뒤쪽 프라이머(서열번호 6)를 사용하여 산물을 비교하였다 (도 2).
서열번호 5: 5'- ATGTTCCAGTATGACTCCAC-3'
서열번호 6: 5'- GCCAAAGTTGTCATGGATGA-3'
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 등나무 추출물을 3 μg/ml 첨가한 경우, 대조구에 비해, 암세포내 CD44의 발현이 현저히 감소하였다. 이 결과는 등나무 추출물이 CD44의 발현을 억제하여 암세포의 운동성을 감소시키고 이로 인하여 암세포의 증식을 억제시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4: Western blotting에 의한 활성화된 RhoA 단백질의 활성 측정
세포의 부착에 관여하는 단백질인 RhoA의 활성을 보고자 다음과 같이 실험을 하였다. 10% FBS(fetal bovin serum)를 포함한 RPMI 1640 배지에 B16F1세포를 만 하루동안 실시예 1에서 수득한 등나무 추출물과 함께 배양한 다음, 세포를 수확 후, 파쇄하여 단백질을 확보하였다. 이후 RhoA의 활성화된 부분만을 확인하기 위하여 Western blotting을 수행하였으며, GTP-RhoA 활성 측정용 키트(PIERCE #89854)를 이용하여 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 등나무 추출물을 3 μg/ml 첨가한 경우, 대조구에 비하여, GTP-RhoA의 단백질 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, 본 발명에 따른 등나무 추출물에 의하여 GTP-RhoA가 활성화되어, 결국 암세포의 이동을 억제하는 것으로 확인할 수 있다. 한편 활성화되지 않은 RhoA의 단백질량에는 차이가 없었다.
결론적으로, 본 발명에 따른 등나무 추출물은 암세포의 전이과정 중의 대표적인 표적 마커의 하나인 CD44의 발현을 억제하여 암세포의 이동을 감소시켰고, 세포부착에 관련된 단백질인 GTP-RhoA(활성화된 Ras Homolog Gene Family)의 활성을 증가시켜 세포이동을 저해시켰다. 또한 고전이성 세포는 세포간의 이동이 활발한 것을 이용한 상처회복 검정(운드힐링 에세이)에서도 본 발명에 따른 등나무 추출물을 첨가한 경우, 농도 의존적으로 세포이동이 저해되었다. 이 결과는 등나무추출물이 암세포의 운동성을 억제하여 결국, 암세포의 증식을 억제한다는 것을 시사한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 암세포 증식억제 활성을 가지는 등나무 추출물, 그 제조방법 및 상기 등나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 암세포 증식억제용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에서는 운드힐링 에세이를 통한 초고속 스크리닝 기법에 의하여 등나무 추출물로부터 항암활성이 있는 성분을 확인하였는 바, 다른 천연 식물성분에 대해서도 이와 같은 기법의 적용이 가능하며, 이를 통해 항암활성을 가지는 물질을 스크리닝 할 수 있을 것이다. 이러한 천연 식물유래 추출물은 항암성분, 항암식의약품, 바이오화장품의 성분으로 유용할 것이다.
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Claims (8)
- 다음의 단계를 포함하는 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물의 제조방법:(a) 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤)을 할로겐화탄화수소 용매로 추출하는 단계; 및(b) 상기 추출액을 회수하는 단계.
- 제1항에 있어서, 용매는 클로로포름인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항의 방법에 의해 제조되고, 암세포의 증식억제 활성을 가지는 등나무(Wisteria florbunda) 또는 그 혹(瘤) 추출물
- 제3항에 있어서, 암세포내 CD44의 발현을 저해하고, 부착단백질의 활성을 증가시켜 암세포의 이동을 억제하는 기능을 가지는 것을 특징으로 하는 추출물.
- 제4항에 있어서, 상기 부착단백질은 RhoA 단백질인 것을 특징으로 하는 추출물.
- 제3항의 추출물 유효량과 의약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 암세포 증식억제용 조성물.
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|---|---|---|---|---|
| KR20220036266A (ko) | 2020-09-15 | 2022-03-22 | 한국콜마주식회사 | 등나무꽃의 향취를 재현한 향료 조성물 |
| KR20220090814A (ko) | 2020-12-23 | 2022-06-30 | 대한민국(산림청 국립산림과학원장) | 등나무 종자추출물을 포함하는 자외선에 의한 피부세포 손상의 예방 또는 개선용 조성물 |
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- 2004-04-21 KR KR1020040027426A patent/KR100603495B1/ko not_active IP Right Cessation
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| Cytometry 41(1), 19-30 (2000.) * |
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