KR100583861B1

KR100583861B1 - 항 에이파토시스 재조합 단백질 및 이를 포함하는 의약품,세포 배양용 배지 첨가물 및 건강 식품

Info

Publication number: KR100583861B1
Application number: KR1020020059686A
Authority: KR
Inventors: 박태현; 김은정; 박혜정
Original assignee: 주식회사 핸슨바이오텍
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2002-10-01
Publication date: 2006-05-26
Also published as: KR20040031810A

Abstract

에이파토시스를 효율적으로 억제할 수 있는 누에로부터 얻어진 새로운 유전자를 이용하여 대량생산이 가능하고 효능의 일정성이 보장되는 재조합 단백질을 제공한다. 누에 체액으로부터 분리된 단백질의 유전자를 이용, 유전자 재조합 기술에 의하여 제조되는 항 에이파토시스 재조합 단백질 및 이를 포함하는 항 에이파토시스 의약품, 세포 배양용 배지 및 식품이 개시되어 있다. 기존의 항 에이파토시스 유전자와는 다른, 누에에서 발견된 항 에이파토시스 효능을 가진 새로운 유전자를 이용하여 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질을 합성할 수 있고, 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질은 동물세포 및 인간세포에 적용되어 에이파토시스를 효과적으로 억제할 수 있게 된다.

Description

항 에이파토시스 재조합 단백질 및 이를 포함하는 의약품, 세포 배양용 배지 첨가물 및 건강 식품{RECOMBINANT ANTI-APOPTOTIC PROTEIN AND　PHARMACEUTICALS, MEDIUM ADDITIVES, AND HEALTH FOOD INCLUDING THE SAME}

도 1은 30K 단백질 유전자가 E. coli BL21(DE3)내의 플라스미드에 올바르게 클로닝되었는 지를 확인하는 단백질 전기영동 결과이다.

도 2는 재조합 30K 단백질을 생산하도록 구축된 균주로부터 재조합 30K 단백질의 발현을 확인하는 단백질 전기영동 결과이다.

도 3은 내포체 형태로 발현된 재조합 30K 단백질을 친화성 컬럼인 하이트랩(HiTrap)상에서 재접힘을 유도하고 최종적으로 정제하여 전기 영동한 결과이다.

도 4는 상기 도 3의 재조합 30K 단백질을 배양 배지에 첨가한 경우에 바이러스 감염 후 7일째의 숙주 세포 생존율을 도시한 그래프이다.

도 5a 내지 도 5d는 액티노마이신D로 곤충 세포의 에이파토시스를 유발시킨 뒤 각 숙주세포의 DNA 함량 분포에 미치는 영향을 보여주는 FACS 분석 크로마토그램이다.

도 6a 내지 6c는 인간 세포주 HeLa 세포를 배양하는 경우, 스타로스포린으로 에이파토시스를 유발시켰을 때의 숙주세포의 DNA 단편화에 미치는 영향을 나타내는 것으로, 처리 후 12시간 후에 세포를 획스트 33258로 염색시켜 형광 현미경(100배 확대)으로 분석한 사진이다.

도 7은 상기 도 6a 내지 6c의 형광 현미경 관찰 결과로부터, 총 세포수에 대한 에이파토시스가 일어난 세포의 비율을 백분율로 나타낸 그래프이다.

본 발명은 재조합 단백질에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 항 에이파토시스 효능을 가지는 유전자를 이용하여 제조되는 재조합 단백질 및 이를 포함하는 의약품 등에 관한 것이다.

세포분열에 의하여 세포는 증식하여 세포수가 증가한다. 이에 대하여 세포수를 감소시키는 세포사의 양식에는 에이파토시스(apoptosis)와 괴사(necrosis)의 2 종류가 있으며, 에이파토시스는 고등세포가 외부의 자극에 대해서 능동적으로 사멸하는 프로그램된 세포 사멸 기작인 점에서 수동적인 세포 사멸 기작인 괴사(necrosis)와 구별된다.

프로그램된 세포 사멸은 대부분의 동물조직에서 위험한 세포나 과잉 생산된 세포를 제거하는 과정으로 배 발생과 종양의 퇴화 및 면역 시스템에서 중요한 역할을 한다. 이러한 에이파토시스는 현존하는 수많은 질병과 관련이 있는데, 대표적인 것으로는 에이파토시스가 결핍됨에 따라서 나타나는 암, 자가면역증 등이 있으며, 에이파토시스가 과잉됨에 따라서 나타나는 치매나 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환 및 후천성 면역결핍증(AIDS) 등이 있다.

이러한 질병들이 에이파토시스와 관련이 있다는 사실이 밝혀진 이후 현재까지, 상기 관련 질병 치료에의 응용을 위하여 에이파토시스 유발 경로와 분자 생물학적 기작 그리고 에이파토시스의 조절에 관한 많은 연구들이 진행되어 왔다. 이러한 연구를 바탕으로 질병치료를 위해서 항 혹은 촉진 에이파토시스 유전자를 이용한 유전자 치료나 에이파토시스 유발시 일어나는 신호전달과정(signal transduction)에 간섭하는 물질들을 이용하기도 한다.

현재까지 보고된 항 에이파토시스 유전자로는 가장 대표적인 bcl-2 계열 유전자와 열 충격 단백질(Heat Shock Protein: HSP) 유전자인 Hsp 70와 Hsp 27, 그리고 에이파토시스 저해 단백질(Inhibitor of Apoptosis Protein: IAP) 계열 유전자 등이 있다. 실제로 bcl-2 계열의 단백질인 bcl-x_L을 이용하여 노인성 치매의 아밀로이드 펩타이드에 의해 유도되는 PC12 세포의 에이파토시스와 괴사를 억제시키는 연구가 진행되고 있으며(Neurosci. Lett. 272, 62 (1999)), 또한 암을 치료하기 위해서 bcl-2, Hsp 70 및 Hsp 27 에 대한 안티센스 테크놀러지(antisense technology)가 시도되고 있는데 항 bcl-2 치료가 특히 림프종에서 효과가 두드러진다는 연구결과가 알려져 있다(J. Natl, Cancer Inst. 89, 998 (1997), Lancet 349, 1137 (1997)).

현재까지 수많은 연구결과를 통해서 에이파토시스 조절인자들이 밝혀짐에 따라, 이러한 조절인자들이나 그 조절인자들의 게놈정보를 이용한 상동단백질 혹은 이들의 유전자를 이용하여 에이파토시스를 방지하는 기술은 크게 두 가지 관점에서 연구가 진행되고 있다.

첫째는 세포자멸에 의해 유발되는 인체의 각종 질병을 치료하는 분야이고, 둘째는 숙주세포의 생존성을 오래 유지함으로써 세포의 생산성을 높이려는 세포배양공학과 관련된 연구이다. 이들 연구에서는 에이파토시스를 억제하는 것으로 잘 알려진 bcl-2 계열의 단백질이나 유전자를 이용하는 연구가 주류를 이루고 있다.

그러나, 에이파토시스를 저해하는 유전자로 알려진 것은 상기 bcl-2 계열 등 그 종류가 한정되어 있고, 따라서 에이파토시스를 억제하기 위한 다양하고 경제적인 응용이 어려운 문제점이 있다.

이러한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자는 상기 bcl-2 등의 기존의 항 에이파토시스 유전자를 대체할 수 있는, 누에 체액의 분획 및 그 분리·정제방법 등을 개발하였다. 상기 선행 연구에 따르면, 누에 체액을 배지에 첨가함으로써 곤충세포-배큘로바이러스 시스템에서 재조합 단백질의 생산을 증대시킬 수 있으며(Biotechnol. Lett., 19, 1087 (1991)), 누에 체액을 첨가함으로써 숙주세포의 생존률을 증가시킬 수 있다(Biotechnol. Prog., 15, 1028 (1999)). 이러한 숙주세포의 생존률의 증가는 누에 체액이 배큘로바이러스에 의한 곤충세포의 에이파토시스를 저해하기 때문이며(Biochem. Biophys. Res. Commun., 271, 186 (2000)), 이 효과는 포유동물세포와 인간세포의 경우에도 적용된다. 또한, 바이러스뿐만 아니라 화학물질에 의해 유도되는 곤충세포, 포유동물세포, 인간세포의 에이파토시스 모두의 경우에 누에체액이 에이파토시스를 저해한다.

상기의 연구결과는 누에 체액내에 에이파토시스를 억제하는 성분이 존재한다는 의미를 가지며 그 후로 본 발명자들에 의해서 이러한 활성을 나타내는 성분이 누에 체액으로부터 분리되었고, 그것이 단백질이라는 사실도 알게 되었다(대한민국 특허 출원 제10-2001-0010717호, Biochem. Biophys. Res. Commun., 285, 224 (2001)).

그러나, 누에 체액으로부터 분리될 수 있는 항 에이파토시스 효능이 있는 물질의 양은 소량에 불과하여 의약품, 건강 식품 및 세포배양용 배지의 첨가제로 사용하기 위하여 대량 생산하는데 문제가 있으며, 항 에이파토시스 효능의 일정성을 보장할 수 없는 문제점이 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 에이파토시스를 효율적으로 억제할 수 있는 새로운 유전자를 이용하여 대량생산이 가능하고 효능의 일정성이 보장되는 재조합 단백질 및 이를 유효성분으로 하는 의약품, 세포 배양용 배지, 건강 식품을 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 누에 체액으로부터 분리된 단백질의 유전자를 이용, 유전자 재조합 기술에 의하여 제조되는 고등세포의 항 에이파토시스 재조합 단백질 및 이를 포함하는 항 에이파토시스 의약품, 세포배양용 배지 및 건강 식품을 제공한다. 상기 누에 체액으로부터 분리된 물질은 첨부하는 서열목록 1 내지 서열목록 5로 표시되는 아미노산 서열 중 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 30K 단백질을 의미하고, 고등세포는 곤충세포, 포유동물세포 또는 인간세포를 의미한다. 또한, 상기 에이파토시스는 바이러스 뿐 아니라 화학물질에 의해 유발되는 것도 포함한다.

본 발명에 의하면, 기존의 항 에이파토시스 유전자와는 다른, 누에에서 발견된 항 에이파토시스 효능을 가진 새로운 유전자를 이용하여 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질을 합성할 수 있다. 또한 상기 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질은 동물세포 및 인간세포에 적용되어 에이파토시스를 효과적으로 억제할 수 있게 된다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 항 에이파토시스 재조합 단백질은 누에 체액으로부터 분리된 단백질의 유전자를 이용하여 유전자 재조합 기술에 의하여 합성된다. 상기 누에 체액으로부터 분리된 물질은 첨부하는 서열목록 1 내지 서열목록 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 30K 단백질이다.

구체적으로, 상기 누에 체액으로부터 분리되는 물질은 에이파토시스를 억제하는 성분을 가지고 있으며, 이러한 활성을 나타내는 성분을 본 발명자의 상기 선행 특허출원의 방법으로 누에 체액으로부터 분리하여 분석하면, 그 성분은 단백질임을 확인할 수 있다(대한민국 특허출원 제10-2001-0010717호, Biochem. Biophys. Res. Commun., 285, 224 (2001)). 상기 정제된 단백질로부터 얻어진 정보를 이용하여 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction: PCR) 프라이머(primer)를 디 자인하여 누에로부터 해당 유전자를 확보하고 그 서열을 분석한 결과, 기능이 아직 밝혀지지 않은 소위 "30K 단백질"로 통칭된 그룹(Biochimica et Biophysica Acta, 949, 224, (1988))에 속하는 단백질이며, 이에 해당하는 아미노산 서열은 첨부하는 서열목록 1 내지 서열목록 5 중의 하나의 서열목록을 가진다.

30K 단백질을 암호화하는 유전자는 현재까지 알려져 있는 bcl-2 계열의 항 세포자멸 유전자들과 전혀 상동성을 가지고 있지 않은 누에로부터의 얻어지는 새로운 항 세포자멸의 유전자이다.

본 발명에서는 이러한 누에 체액으로부터 얻어지는 물질의 유전자로부터 항 에이파토시스 효능이 있는 단백질을 제조하기 위하여, 산업적으로 유용한 재조합 단백질을 생산하기 위한 유전공학 재조합 기술에 널리 사용되어지는 E. coli 등을 숙주세포로 사용하여 유전공학 기술을 이용한다. 그러나 숙주세포가 E. coli로 한정되는 것은 아니다.

누에로부터 얻어진 30K 유전자를 E. coli 발현벡터인 pET22b(+)에 클로닝하여 E. coli BL21 (DE3)에 형질전환시킨다. 이 재조합 균주로부터 30K 단백질을 생산하였고, 고등 세포의 실험실내 배양시 일반적으로 배지 첨가물로 사용하는 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum: FBS)을 대조군으로 사용한 결과 재조합 30K 단백질을 배지에 첨가함으로써, 고등세포의 프로그램된 세포 사멸기작인 에이파토시스가 억제되는 효과를 확인할 수 있고, 이러한 효과는 원래 누에체액내의 성분에 상응한다는 것을 확인한다.

상기와 같은 과정으로 생산된 항 에이파토시스 단백질을 이용하여 의약품, 건강 식품, 또는 세포배양용 배지 첨가물을 제조할 수 있다. 예를 들면, 에이파토시스가 과잉됨에 따라서 나타나는 치매나 알츠하이머와 같은 퇴행성 질환과 후천성 면역결핍증(AIDS) 등의 치료제로 사용되어 이러한 병들을 치료·예방하거나, 각종 건강 식품에 사용하여 상기 병들을 예방하는 효과를 거둘 수 있다. 또한 생물학 제품의 생산을 위한 세포배양시 제품의 생산성을 높여주는 배지 첨가물로 사용되어질 수 있다.

이하, 실시예로 본 발명의 특징을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

[실시예]

30K 단백질 유전자(30Kc6)로 형질전환된 재조합 균주 제작

본 발명의 선행 연구(대한민국 특허출원 제10-2001-0010717호, Biochem. Biophys. Res. Commun., 285, 224 (2001))의 단백질 서열정보를 이용하여 확보한 30K 단백질 유전자 중의 하나인 C-6(Biochimica et Biophysica Acta, 949, 224, (1988))를 E. coli 발현벡터인 pET-22b(+)로 클로닝하기 위해서 프라이머로 5'-AGACA TATGACACTTGCAC CAAGAACT-3'과 5'-CAACTCGAGGTAGGGGACGATGTACCA-3'를 사용하여 PCR하였다.

PCR 조건은 초기변성을 95 ℃에서 5 분 동안 진행한 후, 각각 95 ℃에서 1 분간 변성, 55 ℃에서 1 분간 복원, 그리고 72 ℃에서 1 분 30 초간 중합반응시키는 사이클을 반복한 후, 마지막으로 충분한 중합반응을 위해서 72 ℃에서 5 분간 반응시켰다. PCR 산물과 벡터를 제한효소 NdeI 과 XhoI으로 절단한 후, 16 ℃에서 16 시간 동안 T4 라이게이즈(ligase)로 라이게이션(ligation)하였다.

라이게이션 반응물을 사용하여 염화칼슘(CaCl₂)방법으로 E. coli BL21(DE3)을 형질전환하고, 100 ㎍/mL의 앰피실린을 포함한 LB 플레이트상에서 형질전환체를 선별하였다. 이를 다시 100 ㎍/mL 앰피실린을 포함한 LB 배지에 접종하여 배양한 후, 플라스미드를 뽑아서 30K 유전자의 클로닝 여부를 확인하였다.

도 1은 발현벡터인 pET22b(+)에 클로닝된 30K 유전자로 형질전환시켜 얻어진 형질전환체로부터 플라스미드를 뽑아서 30K 유전자의 클로닝 여부를 확인한 결과이다.

도 1을 참조하면, 상기 플라스미드를 제한효소 NdeI과 XhoI로 절단하고 전기영동함으로써 30K 유전자의 크기인 732bp의 밴드가 생성됨을 확인할 수 있었다.

재조합 균주로부터 30K 단백질(서열목록 1)의 발현

상기 과정을 통하여 얻어진 재조합 균주 E. coli BL21 (DE3)를 100 ㎍/mL 앰피실린을 포함한 LB 배지에 접종하고, 37℃, 200 rpm으로 진탕 배양기에서 16 시간 동안 배양하였다. 이 종균 배양 0.5 mL을 100 mL의 같은 배지에 접종하고 마찬가지로 37 ℃, 200 rpm으로 진탕배양기에서 세포농도가 0.5 O.D가 될 때까지 배양하였다.

30K 유전자의 발현유도를 위해서 이소프로필-베타-디-티오칼락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside: IPTG)를 배지에 1 mM이 되도록 첨가하였고, 37 ℃에서 4 시간 더 배양하였다. 배 양 후 세포를 원심분리하여 수거하였고, 인산염으로 완충된 염류(phosphate buffered saline: PBS)로 2번 세척하여 배지성분을 제거한 후, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride: PMSF)가 포함되어있는 세포 파쇄용액(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 현탁시켰다.

라이소자임(lysozyme)을 최종농도가 0.5 mg/mL이 되도록 첨가하고 얼음에서 30 분간 반응시킨 후, 초음파 분쇄기로(15 초씩 4 회) 세포를 파쇄시켰다. 파쇄시킨 후 다시 원심 분리하여 상등액과 침전물을 분리하여 30K 단백질의 발현을 확인하기 위한 단백질 전기영동을 수행하였다.

도 2는 재조합 30K 단백질을 생산하도록 구축된 균주로부터 재조합 30K 단백질의 발현을 확인한 단백질 전기영동 결과이다. 여기서 레인 M은 단백질 분자량 마커이고, 레인 1과 2는 각각 세포 파쇄 후 원심분리한 수용성의 상등액과 비수용성의 침전물이다.

도 2를 참조하면, 상등액이 아닌 침전물에서 존재하는 것으로 보아 이 단백질은 내포체 형태로 발현된다는 것을 알 수 있었다.

재조합 30K 단백질의 분리 정제

내포체 형태로 발현된 단백질은 단백질의 올바른 3 차 구조가 형성되지 못하고 비수용성의 침전물이 균체에 생성된 것이므로 활성이 없는 상태로서, 이러한 내포체를 다시 재접힘시켜서 활성형으로 전환시켜야 했다. 이를 위하여 내포체를 포함하고 있는 비수용성 균체 침전물로부터 변성제인 구아니딘 하이드로 클로라이드를 이용하여 30K 단백질을 녹여내었다. 변성제로 녹여낸 30K 단백질을 니켈이 충 전된 친화성 컬럼인 하이트랩(HiTrap; Amersham pharmacia사 제조)에 로딩하고, 30K 단백질을 제외한 다른 불순물들을 제거하기 위해서 수 차례 세척하였다.

변성제의 제거는 30K 단백질이 컬럼에 붙어있는 상태로 고속 단백질 액상 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography: FPLC)를 이용하여 변성제를 6 M에서 0 M로 농도 기울기를 주어 서서히 제거하는 방법을 사용하였다. 이를 위하여 분당 0.5 mL의 속도로 30 mL의 용액을 농도 기울기 방법으로 흘려주었다. 재접힘이 완료된 30K 단백질은 500 mM의 이미다졸을 포함하고 있는 완충액을 흘려줌으로써 컬럼으로부터 회수되었다. 회수된 용액은 이미다졸을 제거하기 위해서 HiTrap 탈염 컬럼(Amersham pharmacia사 제조)에 통과시켰으며, 통과된 30K 단백질은 동결건조기를 통해 농축되었다.

도 3은 내포체 형태로 발현된 재조합 30K 단백질을 친화성 컬럼인 하이트랩상에서 재접힘을 유도하고 최종적으로 정제하여 전기 영동한 결과이며, 레인 M은 단백질 분자량 마커이다.

곤충 세포의 에이파토시스에 미치는 재조합 30K 단백질의 효과

에이파토시스의 분석을 위한 곤충 세포로는 거염벌레의 난소조직에서 유래한 스포돕테라 프루지퍼다(Spodoptera frugiperda: Sf9)를 사용하였고, 그레이스 배지를 기본배지로 하여 25 cm² 배양 플라스크 혹은 96 웰 플레이트를 사용하여 28 ℃에서 배양하였다. 미생물에 의한 오염을 방지하기 위하여 항생물질(antibiotic-antimycotic; 미국 Gibco사 제조)을 사용하였다. 재조합 30K 단백질의 에이파토시 스의 억제 활성을 확인하기 위하여 5 % 소태아혈청(FBS)이 첨가되어 있는 배지에 추가로 배지 mL당 0.2 mg의 30K 단백질을 첨가하였다.

Sf9 세포의 에이파토시스를 유도하기 위하여 배큘로바이러스로인 오토그래파 캘리포니카 뉴클리어 폴리헤드로시스 바이러스(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus: AcNPV)를 사용하였다. 배큘로바이러스는 Sf9 세포가 지수성장기 후반부에 이르렀을 때 감염시켰으며 그 방법은 다음과 같았다.

배지를 제거한 배양 플라스크에 세포 1 마리당 13개의 바이러스가 감염 가능하도록 희석한 바이러스 용액을 첨가하고, 1시간 후 상층의 바이러스용액을 제거한 뒤 감염 전에 사용했던 배지를 다시 첨가하였다. 세포의 에이파토시스의 분석은 감염시킨 시점에서부터 7 일째에 세포수와 세포 생존율을 측정하는 방법을 사용하였다. 세포수는 헤모사이토미터를 사용하여 광학현미경으로 측정하였으며, 생존율은 0.4 % 트라이판블루로 염색하여 착색된 세포를 죽은 세포로 간주하여 총 세포수에 대한 생존 세포수의 비율(생존 세포수/총 세포수)을 백분율로 나타내었다.

도 4는 상기 도 3에서 얻은 재조합 30K 단백질을 배양 배지에 첨가한 경우에 바이러스 감염 후 7일째의 숙주 세포 생존율을 도시한 그래프이다.

도 4를 참조하면, 재조합 30K 단백질을 배지에 첨가한 경우, 배큘로바이러스에 감염시킨 뒤 7 일 후 세포 생존율이 10% FBS 배지에 비해서 현저하게 높았으며, 이때의 생존율은 5% 누에체액이 첨가된 배지의 세포 생존율과 거의 유사한 결과를 볼 수 있었다. 이는 본 발명에 의해서 생산된 재조합 30K 단백질이 에이파토시스를 효과적으로 억제하는 활성 단백질임을 나타내는 결과이다.

또한 화학물질에 의해 유도되는 곤충 세포의 에이파토시스에 대한 재조합 30K 단백질의 활성을 측정하였다. 화학물질로는 단백질과 RNA의 합성을 저해함으로써 에이파토시스를 유발한다고 알려져 있는 액티노마이신D를 사용하였다. 액티노마이신D를 배지에 200ng/mL로 첨가하고 9시간이 지난 후, 에이파토시스의 유발정도를 형광 활성 세포 분리기(Fluorescence-Activated Cell Sorter: FACS)분석을 통해 비교하였다. 이를 위해서 에이파토시스가 일어난 세포를 원심분리하여 수거하였고, 세포 펠릿을 PBS로 두 번 세척하고 70% 에탄올에 현탁시켜 얼음상에 보관함으로써 세포를 고정시켰다. 고정된 세포를 다시 PBS로 세척한뒤, 리보핵산 분해효소(RNase)와 프로피디움 아이오다이드를 각각 100 및 50 ㎍/mL 농도로 첨가하여 세포의 DNA를 염색하였다. 개별 세포당 DNA의 형광성은 팩스 캘리버 플로우 사이토미터(FACSCalibur flow cytometry; Becton Dickinson사 제조)를 사용하여 측정하였다.

도 5a 내지 도 5d는 액티노마이신D로 곤충 세포의 에이파토시스를 유발시킨 뒤 각 숙주세포의 DNA 함량 분포에 미치는 영향을 보여주는 FACS 분석 크로마토그램이다. 구체적으로도 도 5a는 액티노마이신D로 처리하지 않은 Sf9 세포, 도 5b는 10% FBS 배지에서 액티노마이신D로 9 시간 처리한 세포, 도 5c는 5% FBS + 5% 누에체액 혼합액에서 액티노마이신D로 9 시간 처리한 세포, 도 5d는 5% FBS + 재조합 30K 단백질이 첨가된 배지상에서 액티노마이신D로 9 시간 처리된 세포의 FACS 분석 크로마토그램이다.

도 5a를 참조하면, 액티노마이신D를 처리하지 않은 대조군의 경우에는 에이 파토시스의 정도를 나타내는 G1-하위 피크 분포(M으로 표시된 부분)의 면적 비율이 0.61%이다. 도5b를 참조하면, 액티노마이신D 처리 후 9시간이 지났을 때, 누에 체액 미첨가 배지상의 세포는 20.60%의 G1-하위 피크 분포를 나타내는데 반해, 도 5c를 참조하면, 재조합 30K 단백질 첨가 배지상의 세포는 1.38%의 G1-하위 피크 분포를 나타낸다. 이는 도 5d에 나타낸 누에 체액 첨가 배지상의 세포의 G1-하위 피크 분포인 1.04%와 거의 같다.

이 결과 역시 재조합 30K 단백질의 에이파토시스 억제활성을 확인한 것으로서, 이러한 활성은 원래의 누에 체액의 성분에 상응하는 결과를 보여준다.

인간 세포주의 에이파토시스에서 미치는 재조합 30K 단백질의 효과

인간 세포주인 헬라(HeLa) 세포는 10% 소태아 혈청(GIBCO BRL)과 항생물질(antibiotic-antimycotic)을 포함한 DMEM 배지(GIBCO BRL)를 사용하여 5 % CO₂, 37 ℃의 배양조건에서 배양하였다. 상기 곤충 세포의 에이파토시스에 미치는 재조합 30K 단백질의 효과를 측정하기 위한 방법과 마찬가지로 재조합 30K 단백질의 에이파토시스의 억제 활성을 확인하기 위하여 5% 소태아혈청이 첨가되어 있는 배지에 추가로 첨가하였다. HeLa 세포에서의 에이파토시스의 유발은 단백질 카이네이스 억제제인 스타로스포린을 사용하였다. 스타로스포린은 다양한 세포주와 농도에 따라서 세포주기의 어레스트를 유도하는 것으로 알려져 있으며, 어레스트를 유발하는 농도보다 높은 농도에서는 에이파토시스를 유발하는 것으로 보고되어 있다.

본 발명자들의 이전 연구를 통해, HeLa 세포에서 에이파토시스를 유발한다고 이미 확인한 바 있는 농도인 600 nM로 스타로스포린을 배지에 첨가하여 에이파토시스를 유발시켰다. 세포의 에이파토시스 분석을 위하여, DNA 염색을 통한 DNA 단편화 관찰 방법을 사용하였다. 이를 위해, 스타로스포린을 처리하고 12 시간이 지난 후, 96 웰 플레이트 상에서 획스트 33258 형광 염색시약을 10 ㎍/mL 되게 배지에 첨가하여 염색시킨 후 PBS로 세척하고 염색된 세포를 B필터를 사용한 형광 현미경(TE300; Nikon사 제조)으로 관찰하였다.

도 6a 내지 도 6c는 인간 세포주 HeLa 세포를 배양하는 경우, 스타로스포린으로 에이파토시스를 유발시켰을 때의 숙주세포의 DNA 단편화에 미치는 영향을 나타내는 것으로, 처리 후 12시간 후에 세포를 획스트 33258로 염색시켜 형광 현미경(100배 확대)으로 분석한 사진이다. 구체적으로 도 6a는 스타로스포린으로 12시간 처리한, 10% FBS 배지상의 세포를, 도 6b는 5% FBS + 5% 누에체액 혼합액 첨가 배지상의 세포를, 도 6c는 5% FBS + 0.2mg/mL 재조합 30K 단백질 첨가 배지상의 세포를 관찰한 사진이다. 또한 도 7은 6a의 형광 현미경 관찰 결과로부터, 총 세포수에 대한 에이파토시스가 일어난 세포의 비율을 백분율로 나타낸 그래프이다.

도 6a 내지 도6c 및 도 7을 참조하면, 에이파토시스가 많이 유발된 세포일수록 DNA 단편화가 일어나서 작은 알갱이 형태의 밝은 형광을 보인다. 누에 체액 미첨가 배지(도 6a)와 비교했을 때, 누에 체액 첨가 배지(도 6b)와 재조합 30K 단백질 첨가 배지(도 6c)에서는 이러한 형광성이 적게 관찰되었다. 또한 도 7은 도 6a의 형광 현미경 사진에서 임의의 400개 이상의 세포중에서 DNA 단편화가 일어난 세 포를 에이파토시스가 일어난 세포로 간주하여 총 세포수에 대한 에이파토시스가 일어난 세포의 비율을 나타낸 그래프로서, 이들 결과는 재조합 30K 단백질이 누에체액과 같은 에이파토시스 억제 활성이 있음을 보여준다.

본 발명에 의하면, 기존의 항 에이파토시스 유전자와는 다른, 누에에서 발견된 항 에이파토시스 효능을 가진 새로운 유전자를 이용하여 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질을 합성할 수 있다. 또한 상기 에이파토시스를 억제하는 재조합 단백질은 동물세포 및 인간세포에 적용되어 에이파토시스를 효과적으로 억제할 수 있게 된다. 이는 앞으로 bcl-2 계열의 유전자나 단백질 등에 국한되어있었던 에이파토시스 방지기술에 사용되는 도구 유전자나 단백질의 범위를 넓힐 수 있게 되는 효과가 있다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

<110> HANSON BIOTECH CO., LTD. <120> RECOMBINANT ANTI-APOPTOTIC PROTEIN AND PHARMACEUTICALS, MEDIUM ADDITIVES, AND HEALTH FOOD INCLULDING THE SAME <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 238 <212> PRT <213> recombinant 30Kc6 protein <400> 1 Met Thr Leu Ala Pro Arg Thr Asp Asp Val Leu Ala Glu Gln Leu Tyr 1 5 10 15 Met Ser Val Val Ile Gly Glu Tyr Glu Thr Ala Ile Ala Lys Cys Ser 20 25 30 Glu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Gly Glu Val Ile Lys Glu Ala Val Lys 35 40 45 Arg Leu Ile Glu Asn Gly Lys Arg Asn Thr Met Asp Phe Ala Tyr Gln 50 55 60 Leu Trp Thr Lys Asp Gly Lys Glu Ile Val Lys Ser Tyr Phe Pro Ile 65 70 75 80 Gln Phe Arg Val Ile Phe Thr Glu Gln Thr Val Lys Leu Ile Asn Lys 85 90 95 Arg Asp His His Ala Leu Lys Leu Ile Asp Gln Gln Asn His Asn Lys 100 105 110 Ile Ala Phe Gly Asp Ser Lys Asp Lys Thr Ser Lys Lys Val Ser Trp 115 120 125 Lys Phe Thr Pro Val Leu Glu Asn Asn Arg Val Tyr Phe Lys Ile Met 130 135 140 Ser Thr Glu Asp Lys Gln Tyr Leu Lys Leu Asp Asn Thr Lys Gly Ser 145 150 155 160 Ser 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Claims

누에 체액으로부터 분리된 단백질의 유전자를 이용하여 제조되는 서열목록 1 내지 서열목록 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항 에이파토시스 30K 재조합 단백질을 포함하는, 신경-퇴행성 질환 또는 후천성 면역결핍증(AIDS)의 치료를 위한 세포사멸 억제제.
제 1항에 있어서, 상기 신경-퇴행성 질환이 치매 그리고 알츠하이머 병으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
제 1항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 곤충 세포, 포유동물 세포, 그리고 인간세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포의 단백질인 것임을 특징으로 하는 세포사멸 억제제.
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누에 체액으로부터 분리된 단백질의 유전자를 이용하여 제조되는 서열목록 1 내지 서열목록 5로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 서열목록에 의해 표시되는 아미노산 서열을 가지는 항 에이파토시스 30K 재조합 단백질을 포함하는 세포 배양용 배지 첨가물.
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