CZ2017553A3 - Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy - Google Patents

Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy Download PDF

Info

Publication number
CZ2017553A3
CZ2017553A3 CZ2017-553A CZ2017553A CZ2017553A3 CZ 2017553 A3 CZ2017553 A3 CZ 2017553A3 CZ 2017553 A CZ2017553 A CZ 2017553A CZ 2017553 A3 CZ2017553 A3 CZ 2017553A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
peptide
promoter
barley
seq
sequence encoding
Prior art date
Application number
CZ2017-553A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ309487B6 (cs
Inventor
Edita Holásková
Petr Galuszka
Ivo Frébort
Jiří Mílek
Original Assignee
ĂšSOVSKO a.s.
Univerzita Palackého v Olomouci
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ÚSOVSKO a.s., Univerzita Palackého v Olomouci filed Critical ÚSOVSKO a.s.
Priority to CZ2017-553A priority Critical patent/CZ309487B6/cs
Priority to EP18782634.2A priority patent/EP3684936B1/en
Priority to PCT/CZ2018/050048 priority patent/WO2019052588A1/en
Publication of CZ2017553A3 publication Critical patent/CZ2017553A3/cs
Publication of CZ309487B6 publication Critical patent/CZ309487B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/10—Seeds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4723—Cationic antimicrobial peptides, e.g. defensins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/743—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Agrobacterium; Rhizobium; Bradyrhizobium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Způsob přípravy rostlin ječmene vhodných pro purifikaci antimikrobiálních peptidů, při němž se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci s alespoň 80% identitou k sekvenci genu kódující antimikrobiální peptid, např. lidský katelicidin, a sekvence kódující stabilizační a purifikační kotvy pod kontrolou zrnově specifického nebo konstitutivního promotoru. Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy, při němž se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické refikulum, a sekvenci kódující alespoň jeden zvířecí antimikrobiální peptid, s výhodou peptid ze skupiny katelicidinů, defensinů a magaininů. Expresní kazeta, rostlina ječmene, obilka ječmene, chimerické peptidické varianty LL-37 a způsob přípravy rekombinantních zvířecích antimikrobiálních peptidů.

Description

Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu přípravy geneticky modifikovaných rostlin ječmene, které produkují rekombinantní biologicky aktivní antimikrobiální peptidy, zejména antimikrobiální peptidy ze skupiny katelicidinů, za účelem molekulárního farmaření. Dále je popsaný způsob jejich snadné purifikace z obilek ječmene. Rekombinantní produkty mohou být po izolaci a purifikaci využity ve farmaceutickém či kosmetickém sektoru, ve veterinární medicíně nebo v ochraně rostlin.
Dosavadní stav techniky
Antimikrobiální peptidy (AMPs) představují efektorové molekuly, jež jsou esenciální součástí humorální složky vrozeného imunitního systému téměř všech živých organismů. AMPs mohou být kategorizovány na základě strukturálních motivů do 4 základních skupin, a sice na peptidy se strukturou beta skládaného listu, peptidy tvořící alfa šroubovici, dále pak na peptidy s rozvolněnou strukturou a struktury smyčky. Většina AMPs je tvořena méně než 50 aminokyselinovými zbytky a sdílí několik společných fyzikálně-chemických vlastností, jakými jsou celkový kladný náboj (výrazný obsah bazických aminokyselin argininu a lysinu) a schopnost zaujmout amfipatickou strukturu. Právě kationický charakter umožňuje peptidům selektivně rozpoznat prokaryotické buněčné membrány od eukaryotických, a to na základě rozdílů ve složení. Membrány bakterií jsou totiž za fyziologických podmínek silně elektronegativní, a to díky přítomnosti záporně nabitých molekul fosfolipidů kardiolipinu, fosfatidylglycerolu a fosfatidylserinu. Tento převážně fyzikální mechanismus působení AMPs je spojen s velice nízkým rizikem vzniku rezistentních bakteriálních kmenů v porovnání s klasickými antibiotiky. Právě díky svému širokospektrálnímu účinku a minimální cytotoxicitě vůči savčím buňkám jsou tyto peptidy považovány za velice slibná léčiva nové generace, která by mohla nahradit stávající terapeutika, a to především při léčbě onemocnění způsobených multirezistentními kmeny mikroorganismů.
V lidském organismu se vyskytují tři hlavní skupiny AMPs, a sice defensiny, histatiny a katelicidiny. Katelicidiny jsou označovány jako savčí antimikrobiální peptidy, které jsou uloženy v neutrofilových granulocytech a makrofágových buňkách, odkud jsou uvolněny po aktivaci leukocytů. Katelicidiny jsou syntetizovány v podobě inaktivních prepropeptidů skládajících se z variabilní N-terminální signální sekvence zodpovědné za subcelulámí distribuci, poměrně konzervované katelinové domény s výraznou mezidruhovou homologií a C-terminální antimikrobiální domény vyznačující se vysokou intra- i inter- druhovou variabilitou. U člověka byl popsán pouze jeden gen kódující protein ze skupiny katelicidinů, a sice tzv. CAMP gen (Cathelicidine AntiMicrobial Peptide). CAMP gen je lokalizován na chromozomu 3, má velikost přibližně 2 kb a obsahuje 4 exony. Produktem genu je antimikrobiální protein hCAP-18, přičemž proteolytickým odštěpením jeho C-terminálního konce vzniká antimikrobiální peptid LL-37 (Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J, Bergman T, Olsson B, Salcedo R. (1996), Eur J Biochem. 238:325-32). Primární struktura LL-37 je složena z 37 aminokyselinových residuí a je zodpovědná za kationický charakter peptidu se souhrnným nábojem +6, velikostí 4,5 kDa a izoelektrickým bodem 10,6. LL-37 inhibuje tvorbu bakteriálních biofilmů a zabraňuje i infekcím virálního (Currie SM, Findlay EG, McHugh BJ, Mackellar A, Man T, Macmillan D, Wang H, Fitch PM, Schwarze J, Davidson DJ. (2013), PLoS One. 8:e73659) či houbového (Ordonez SR, Amarullah IH, Wubbolts RW, Veldhuizen EJ, Haagsman HP. (2014), Antimicrob Agents Chemother. 58:2240-8) původu. Krom antimikrobiálního účinku inhibuje peptid nádorové bujení (Okumura K, Itoh A, Isogai E, Hirose K, Hosokawa Y, Abiko Y, Shibata T, Hirata M, Isogai H. (2004), Cancer Lett. 30;212:185-94), indukuje chemotaxi mastocytů (Niyonsaba F, Iwabuchi K, Someya A, Hirata M, Matsuda H, Ogawa H, Nagaoka I. (2002), Immunology. 106:20-6), buněčnou apoptózu (Barlow PG, Li Y, Wilkinson TS, Bowdish DM, Lau YE, Cosseau C, Haslett
- 1 CZ 2017 - 553 A3
C, Simpson AJ, Hancock RE, Davidson DJ. (2006), J Leukoc Biol. 80:509-20) či pozitivně ovlivňuje proces hojení poranění tím, že stimuluje angiogenesi a obnovu epitelu (Carretero M, Escámez MJ, Garcia M, Duarte B, Holguin A, Retamosa L, Jorcano JL, Rio MD, Larcher F. (2008), J Invest Dermatol. 128:223-36). Tato multifunkční molekula či její deriváty mají bezesporu významný potenciál pro praktické komerční uplatnění ve farmaceutickém, popř. i kosmetickém sektoru. LL-37 by mohl např. sloužit pro léčbu chronických polymikrobiálních infekcí, a to v podobě lokální povrchové aplikace na poraněnou oblast pokožky (Duplantier AJ, van Hoek ML. (2013), Front Immunol. 4:143). V roce 2014 byly publikovány výsledky klinické studie, v rámci které byla povrchová aplikace peptidu LL-37 vyhodnocena jako bezpečná pro léčbu pacientů s chronickými bércovými vředy (Gronberg A, Mahlapuu M, Stahle M, WhatelySmith C, Rollman O. (2014), Wound Repair Regen. 22:613-21). V současnosti peptid LL-37 prochází klinickými testy jako imunomodulátor podporující léčbu melanomů prostřednictvím lokálních intratumorálních injekcí (Mp^TcHnk^ staženo dne
14.4.2017). '
Principiální překážkou pro komerční uplatnění AMPs včetně katelicidinů je vysoká výrobní cena produktu, která se např. u LL-37 připraveného chemickou syntézou pohybuje v řádech tisíců až desetitisíců Kč za mg v závislosti na čistotě. Z cenového hlediska skýtá rekombinantní technologie s využitím prokaryotických či eukaryotických expresních systémů ohromný potenciál. Bakteriální a kvasinkové expresní systémy zpravidla poskytují vysoké výtěžky proteinových produktů a je s nimi poměrně jednoduchá manipulace. Využití těchto mikrobiálních expresních systémů pro produkci AMPs ale není vhodné právě kvůli jejich antimikrobiálním vlastnostem, které mohou vést k usmrcení hostitelské buňky. Nevýhodou hmyzích a savčích buněčných suspenzí je vysoká cena spojená s poměrně komplexními podmínkami kultivace a dále riziko kontaminace produktu priony, viry či toxiny. Naopak využití intaktních rostlin pro produkci AMPs, tzv. rostlinné molekulární farmaření, poskytuje oproti ostatním platformám řadu výhod, a sice: 1) produkce je zpravidla spojena s nižší cenou, 2) nehrozí riziko kontaminace onkogenní DNA, endotoxiny či lidskými patogeny, 3) produkci je možné převést do velkého měřítka, 4) ve většině případů lze použít poměrně jednoduchou metodu purifikace peptidu. V poslední době výrazně vzrostl zájem řady vědeckých skupin ve využití ječmene coby platformy pro produkci nejrůznějších komerčně uplatnitelných substancí, a to hned z několika důvodů. Jednak existuje účinná metoda genetické modifikace pomocí supervirulentního kmene Agrobacterium tumefaciens, oproti jiným obilovinám má ječmen jednoduchý diploidní genom zaručující stabilitu transgenní linie, rostliny jsou samosprašné a je tedy u nich eliminováno riziko úniku transgenu do volného prostředí, což ječmen řadí mezi bezpečné rostliny s certifikátem GRAS (Generally Recognized as Safe) uděleným FDA (Food and Drug Administration).
Přes všechny výše zmiňované výhody rostlinných systémů včetně ječmene zůstává exprese AMPs problematická, neboť bývá často spojena s nízkými výtěžky či ztrátou antimikrobiální aktivity v důsledku jejich náchylnosti na proteolytickou degradaci (Monda BJ, Pryke K, Rohan LC, Graebing PW. (2011), Adv Biosci Biotechnol. 2:404-408). AMPs navíc mohou působit toxicky vůči hostitelské rostlině a zapříčinit tak její abnormální, nežádoucí fenotyp včetně sterility (Nadal A, Montero M, Company N, Badosa E, Messeguer J, Montesinos L, Montesinos
E, Pla M. (2012), BMC Plant Biol. 12:159). Množství, stabilita a případná fytotoxicita peptidů produkovaných v rostlinách je tedy ovlivněna celou řadou faktorů, mezi něž patří krom výběru samotné rostlinné produkční platformy a cílového pletiva také výběr vhodných fúzních peptidických sekvencí zodpovědných za vnitrobuněčné zacílení peptidu, jeho stabilitu a biologickou aktivitu.
Na základě doposud publikovaných výsledků byl gen pro katelicidin LL-37 či jeho variantu vnesen do tří různých rostlin, a sice do čínského zelí (Brassica rapa var. chinensis) (Jung YJ, Lee SY, Moon YS, Kang KK. (2012), Plant Biotechnol Rep. 6:39-46), rajčete (Solanum lycopersicum) (Jung YJ. (2013), Biotechnol. Bioprocess Eng. 18, 615-24) a rýže (Oryza sativa L.
-2CZ 2017 - 553 A3 var. Japonica cv. Dongjinbyeo) (Lee IH, Jung YJ, Cho YG, Nou IS, Huq MA, Nogoy FM, Kang KK. (2017), PLoS One.l2:e0172936). Exprese LL-37 byla vždy řízena konstitutivním promotorem a produkt byl lokalizován v extracelulámím prostoru. Ve všech třech případech nebyl LL-37 produkován za účelem molekulárního farmaření, nýbrž za účelem bio-protekce rostlin vůči vybraným fytopatogenním mikroorganismům. Ačkoli byla exprese regulována konstitutivním promotorem, prokázali autoři vždy přítomnost peptidu pomocí molekulárně biologických metod pouze v listech a nikoli v dalších rostlinných pletivech. Koncentrace peptidu v listech navíc nebyla určena. Konstitutivní exprese se nezdá být vhodnou pro produkci a následnou izolaci AMP, protože může vést ke snížené vitalitě rostlin, relativně nízké koncentraci peptidu v pletivech a navíc z vegetativních pletiv, jakými jsou listy, jsou peptidy špatně izolovatelné kvůli vysokým koncentracím pigmentů a dalších sekundárních metabolitů, které standardně interferují s procesem extrakce a purifikace. Vegetativní pletiva navíc nejsou schopna dlouhodobě akumulovat rekombinantní protein, protože postrádají možnost přejít do stádia dormance a obsahují velké množství proteolytických enzymů zodpovědných za degradaci produktu. Z toho důvodu musí být rostlinný materiál odebrán a bezprostředně zpracován ve specifickou dobu, kdy dochází k nejvyšší akumulaci produktu.
Katelicidiny v aktivní formě jsou zatím komerčně dostupné pouze syntetické. Na trhu lze získat i katelicidiny připravené heterologní expresi v E. coli, ty jsou však vždy ve formě neaktivních prekurzorů.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na využití ječmene pro produkci antimikrobiálních peptidů, a to tak, že peptid se exprimuje a/nebo kumuluje v ječmenných zrnech. Ječmenné zrno představuje díky nízkému obsahu fenolických látek a velkému množství inhibitorů proteáz biochemicky inertní prostředí vhodné pro cílenou expresi peptidu. Díky schopnosti zrna přejít do stádia dormance je navíc tento generativní orgán vhodný pro dlouhodobé uskladnění peptidu v bioaktivní formě. Endosperm zaujímá většinu obsahu obilky a jev něm uložena většina zásobních proteinů, přičemž promotory genů pro abundantní residuální proteiny mohou být s výhodou využity pro cílenou expresi transgenu. Předkládaný vynález popisuje přípravu aktivní formy katelicidinu snadno izolovatelné z ječmenného endospermu například ve formě proteinových tělísek. Předkládaný vynález tedy představuje technologii, která je řešením výše zmiňovaných nedostatků spojených s použitím heterologních systémů pro produkci antimikrobiálních látek, a to díky zvolení klíčových parametrů majících vliv na úroveň transkripce a zároveň na množství, stabilitu, biologickou aktivitu a toxicitu vytvořeného rekombinantního produktu. Tato inovativní a pokroková technologie by mohla nalézt uplatnění v oblasti rostlinného molekulárního farmaření v podobě výroby substancí obsahující aktivní antimikrobiální peptid pro farmaceutický, kosmetický či průmyslový sektor.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy, jehož podstata spočívá v tom, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující alespoň jeden zvířecí antimikrobiální peptid, s výhodou peptid ze skupiny katelicidinů, defensinů a magaininů.
S výhodou nukleotidová sekvence dále obsahuje sekvenci kódující C-terminální sekvenci pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu (KDEL, SEQ ID NO. 7).
S výhodou nukleotidová sekvence dále obsahuje sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein; restrikční místo rozpoznávané proteázou, např. enterokinázou. S výhodou může být tato sekvence vybrána ze sekvencí kódujících maltózu vázající protein (MBP, SEQ ID NO. 8), histidinovou
-3CZ 2017 - 553 A3 kotvu (6xHis; 8xHis, SEQ ID NO. 9 a 10), SUMOstar (SEQ ID NO. 11), putativní ječmennou SUMO sekvenci (SEQ ID NO. 12), protein DAMP4 (SEQ ID NO. 13) a/nebo flexibilní spojovací sekvenci (GGGGS)2 (SEQ ID NO. 14).
S výhodou je antimikrobiálním peptidem peptid ze skupiny katelicidinů, výhodněji rekombinantní lidský katelicidin LL-37 (PDB: 2K6O_A).
S výhodou je antimikrobiálním peptidem beta-defensin 2 (HBD2) nebo pexiganan (PEX).
S výhodou je N-terminálním signálním peptidem N-terminální transientní signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (ZmCKXlsp; GenBank NM_001112121.1; SEQ ID NO. 5) nebo N- terminální signální peptid rýžové chitinasy 1 (OsChtlsp; GenBank: D16221.1,SEQ ID NO. 6).
S výhodou je vkládaná nukleotidová sekvence vybraná ze skupiny sekvencí majících alespoň 80 %, výhodněji alespoň 90 %, identitu se sekvencemi SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3., SEQ ID NO 4, výhodněji je nukleotidová sekvence vybrána ze skupiny sekvencí SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3., SEQ ID NO 4.
Zde uváděné procentuální identity jsou dosaženy náhradou nukleotidů jinými nukleotidy, zejména nukleotidy rezultujícími v kodon kódující stejnou aminokyselinu, nebo prodloužením či zkrácením sekvence. Zde uváděné procentuální identity sekvencí jsou typicky alespoň 80 %, s výhodou alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %.
S výhodou je vložená nukleotidová sekvence řízena zrnově specifickým, anebo konstitutivním promotorem. Zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je BI hordeinový promotor, ječmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor.
S výhodou se sekvence vloží pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens.
V rámci předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že pro zvýšenou akumulaci antimikrobiálního proteinu, jako například LL-37, v geneticky modifikovaných rostlinách ječmene je vhodné použít N- terminální transientní signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 (ZmCKXlsp; GenBank NM_001112121.1), který je zodpovědný za translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum. V dalším výhodném provedení lze k tomuto účelu použít N -terminální signální peptid rýžové chitinasy 1 (OsChtlsp; GenBank: Dl6221.1). Kombinace N -terminálního signálního peptidu společně s C- terminální sekvencí pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu (KDEL) má navíc stabilizující vliv na akumulaci antimikrobiálního proteinu. Dále bylo zjištěno, že lze s výhodou pro afinitní purifikaci použít maltózu vázající protein (MBP), histidinovou kotvu (6xHis; 8xHis) a flexibilní spojovací sekvenci (GGGGS)?, jež umožňuje efektivní separaci funkčních domén a zvyšuje stabilitu produktu. Pro zvýšení stability peptidu a současně i za účelem purifikace lze dále využít protein DAMP4 patřící do skupiny biosurfaktantů (povrchově aktivních látek), který vykazuje termostabilní vlastnosti (při teplotách do 90°C) a je rozpustný v prostředí o vysoké koncentraci solí. Tyto unikátní vlastnosti mohou být využity v izolačním a purifikačním procesu. Pro separaci rekombinantního produktu od ostatních nežádoucích proteinových či peptidických frakcí obsažených v extraktu lze také využít umělou sekvenci SUMOstar (small ubiquitin like modifier), která má podobnou strukturu ubikvitinu, zabraňuje však následné ubikvitinylaci a tím brání proteolýze rekombinantního peptidu v hostitelském pletivu, popř. putativní ječmennou SUMO sekvenci (HvSUMO), která byla vybrána z databáze hrubého draftu genomu ječmene na základně podobnosti se SUMOstar sekvencí (hKpTAvebbiast. ipk-gatersleben. de/barley/).
V rámci předkládaného vynálezu bylo také zjištěno, že množství antimikrobiálního peptidu, zejména LL-37, akumulovaného v obilce pod kontrolou ječmenného endospermově specifického
-4CZ 2017 - 553 A3 promotoru pro Bl hordeinový protein (GenBank: X87232.1) je vyšší než množství peptidu v obilce, jehož exprese je řízena konstitutivním kukuřičným ubikvitinovým promotorem.
Předmětem vynálezu je dále expresní kazeta, která obsahuje promotor, sekvenci genu pro antimikrobiální peptid a terminátor. Nukleotidová sekvence obsahuje kódující sekvence, jak je popsáno výše. Promotorem je zrnově specifický nebo konstitutivní promotor. Zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je B1 hordeinový promotor, ječmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor. Terminátorem je s výhodou NOS terminátor.
V jednom výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: ječmenný B1 hordeinový promotor::ZmCKXlsp_LL-37_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO.
15.
V jiném výhodném provedení expresní kazeta obsahuje:kukuřičný ubikvitinový promotor::ZmCKXlsp_LL-37_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO.
16.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: ječmenný B1 hordeinový promotor::ZmCKXlsp_(GGGGS)2_6xHis_(GGGGS)2_LL-37::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 17.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: kukuřičný ubikvitinový promotor::ZmCKXlsp_(GGGGS)2_6xHis_ (GGGGS)2_LL-37::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 18.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje:ječmenný B1 hordeinový promotor::ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-37_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 19.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: kukuřičný ubikvitinový promotor::ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-37_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 20.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: ječmenný B1 hordeinový promotor::OsChtlsp_6xHis_LL-37::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 21.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: ovesný promotor globulinu AsGLOlp::8xHis_HBD2_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 22.
V dalším výhodném provedení expresní kazeta obsahuje: ječmenný promotor inhibitoru trypsinu TIp::PEX_KDEL::Nos terminátor a má sekvenci s alespoň 80% identitou, s výhodou s alespoň 90% identitou, výhodněji s alespoň 95% identitou k sekvenci SEQ ID NO. 23.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití uvedených expresních kazet pro přípravu rostlin ječmene produkujících rekombinantní antimikrobiální peptid, s výhodou lidský katelicidin LL-37, a to pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens.
-5 CZ 2017 - 553 A3
Dále je předmětem vynálezu rostlina ječmene, obsahující v genomu nukleotidovou sekvenci popsanou výše.
A dále je předmětem vynálezu obilka ječmene obsahující rekombinantní antimikrobiální peptid, s výhodou rekombinantní lidský katelicidin LL-37. Toto zrno je připravitelné tak, že se do genomu rostliny ječmene vloží nukleotidová sekvence popsaná výše pod kontrolou promotoru řídícího expresi přednostně v obilce nebo ječmenného endospermově specifického promotoru.
Dalším předmětem vynálezu jsou chimérické peptidické varianty LL-37, které vykazují antimikrobiální účinky vůči gram-negativním (G-) bakteriím. Jedná se o polypeptidy ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO 24., SEQ ID NO 25. a SEQ ID NO 26. V rámci předkládaného vynálezu bylo totiž zjištěno, že pro zachování antimikrobiálních účinků LL-37 není třeba odštěpit vybrané fúzní sekvence pomocí finančně nákladných proteáz, čímž se výrazně snižuje cena spojená s produkcí antimikrobiálního peptidu.
Nukleotidová sekvence kódující protein ZmCKXlsp_LL-37_KDEL (59 aminokyselin, SEQ ID NO 1.)
\J\. > I.
Nukleotidová sekvence kódující protein ZmCKXlsp_(GGGGS)2_6xHis_ (GGGGS)2_LL-37 (86 aminokyselin, SEQ ID NO 2.)
1A AUvaCaACAAC A? lAÚ aAOlAAU O (> 3 CL A A a C AC A A< á 1 Ú AA A A< A A A:: - x C A AU AG( > A Ca 3 CU < A : Aú A > AI i .< A A < A
Nukleotidová sekvence kódující protein ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-37_KDEL (452 aminokyselin, SEQ ID NO 3.)
ATťřWCTTSTíXiTtTr A CT ACT': íCCTKT \ řCLCCCt ATCTšCOLCTCCC^
-6CZ 2017 - 553 A3 t:C(A'AXkA(XAA€T(ÚACCTXiATCAACAACA^ :<ÁTf<AABACA;M^ÁTÍAAXAACCTCíXÁCAA<.A*'AťATCA^^
CTCAX<ATCAAa?TCC.<i(M^
G(A$TMÁ3CčrrCAÁ(A <UAČ<Á XXŘ sAAKXX ALKXaKKKX ·Τύ
C<CŮy/ú:HÁT(XX}A(WŘÁÍAČŤÁ<r
CC<}CC;VfGA€toATTAACCKKXX<n(KKtoCTG(yrC(^
A( XŮA( X A KXřŤÍÉAC<X3 ΊΧXT A a ? LX} A ( a ? L I x AA( A aXXXW (A a AGC· ΓΧA< A0A;(X · re
TC€T(A<ÁGÁÁCMCÓ€AAOiCCXlA<X>A(AAXO
C{AX:TC<KAAACGT(AAXX’TCAA<ACC^^
GbKXXÁX A.a WTAXXXaAMáQKaTA (MMaXAaM
AlAXmXA ΑΧΑΧϊΓΤύΤΑ(ΧυΑνΑΑ:ΑθΒΪ A(AX^^ (A aíXí BCG(Xte(M<A WkXXSX<M:MK A a f
A-XC A ÁLÁ AčA A QXAXA AT AÁCAA (XXXX Aá A Wa ΑλΑ< ÁA XaA:^ :<XT<‘;TAXÁ)X-ááG3Xa;;á:;;AA;ÍA<MALíA'A
ΧΧΧΧϊ A A A A A<:‘Γ AX:'iCX a A A Αχ Χία AHA AX A A®
Nukleotidová sekvence kódující protein OsChtlsp_6xHis_LL-37 (68 aminokyselin, SEQ ID NO 4.
Nukleotidová sekvence kódující peptid ZmCKXlsp (18 aminokyselin, SEQ ID NO. 5)
Nukleotidová sekvence kódující peptid OsChtlsp (20 aminokyselin, SEQ ID NO. 6)
AAXAAAAACáAaAXjUaíAáAAHXA^^ AA^XaxLCAxK?
(AsUKm :
Nukleotidová sekvence kódující peptid KDEL (5 aminokyselin, SEQ ID NO. 7)
Nukleotidová sekvence kódující MBP (383 aminokyselin, SEQ ID NO. 8)
-7 CZ 2017 - 553 A3 :ATaAAaAXAa<A<XaXaAMXA<XGaXaX?AJX?‘aX)A ΓΧ č&btoxXRxw:^
1XaM£KMCaXW>ATAA<K :1ΧΧΜα<ΜαΧΑ(1ΧΤ<αΧ·^^^
CXKXaXaMTAa/AIXG jaa (ΚΚΚΑΧ/Α<ΑΜΑ;ΑίΚΑ?Μ:ΧΧΑΑΑΧ'’Μ
ΑΧ Ca á CaXá Á š A λ j Ά i A A A A aAá A A A A: A A A AG í (A i.: A A A A a A Ai > A1 :A' i A < A a A$ 11A A ( JA
Ί XX A AMA/aA αΠ AM Α(ΤΓ A aX. A( X aXX A (X/XM TT( X a?TA CC A A’* AT ‘ H <ΧΑΊαΧΧααΜα·(ΑΓΑΧ:ΑΑΑΑΑΑ<·ΜΑαΓΑΑΚαΧΧΜΑ(ΧαΑΚΧΑΜΑ<ΧΑ^^
AI AAXa aXaX A aXMÁ.AAáaAM AA j. A A A G L 1A.AXC
A x A i.. A.A AΑχ( A (. A > AA x x A A (: << i AAA< A: Aa a A A < .:. Av-A aaAGAA A A a αΑΑλ » Aa A aA : x x x. :A&GTAaW*ÁÁCťkXAÁM3TA£WM^^
A AáčXXaaXXXT ΑΜΧ/αΓΧΧΪ (XX ααΜα·(ΑΓαΑΊΧΜΑ(ΜλΧ·^ .<Mč(XMCXá<X(;PAX£GCaaMXQ£<ÁXa^^^
I:AAA(XXA?<XAT(;AXX/A‘r(X}FC‘<?ÁA(>AjA?{/ÁÍ/AÍ'Cft/A\^;.;X$<A('M:AAlX:C<X:(A(ArX^ AGlAXX<X(X;MXAfCAAíKXXCMX'CťfKX (ΧΚΧ·Α X X A Ú< M XaaX I A(X aXa \ A (': A A< X< AC (CTF a XX/ A AGgA a TFaCTOGAG A A AA AfX/r€CT(AACCGMÁWÓKÁ/TCXWW<GXXtMA&^^
XX XX a a j XXCAMX a A A Aá aMG( AXA M( X T (KM A3
AAT€KM(MÁ<AXAK?AAAA(XMXXjMGAT€ATS(XXlÁÁ(MTC(XXCÁAÁ^
TGTCKXAC XXOXaWKM(XXXXXX(MT1M.Aa(XXXXaMaXa^
HA:(:XMCK><XCT^AMXA€<X€(MGAWAA£T^
CÁAlA.ArAAČAAC(X
Nukleotidová sekvence kódující 6xHis (7 aminokyselin, SEQ ID NO. 9)
ATGGA£OTC&€^ .
Nukleotidová sekvence kódující 8xHis (9 aminokyselin, SEQ ID NO. 10)
Á^AťKČAÚCAHMCAÁfCÁTX
Nukleotidová sekvence kódující SUMOstar (101 aminokyselin, SEQ ID NO. 11)
t A. X X<AA A A A l A AAU.A.AX H : A ?\
Nukleotidová sekvence kódující HvSUMO (96 aminokyselin, SEQ ID NO. 12)
-8CZ 2017 - 553 A3
ATÁTCA ACC aUÁ AG* X Π A A aa )G í XX AC G Ač( AA ΑνΑ€(ΜβτΓ0 a C A 6 G OCA A (MG( A X AAWiALÁ<AAr( Ck AG A :OUIC OS A AOKXT AO
Nukleotidová sekvence kódující DAMP4 (100 aminokyselin, SEQ ID NO. 13)
A GXG AGGC G G A MT G A A (A XAG (GX J t AXXíA TT(XC X
TCCAČGCTTGAGŮáíXAXGaGČČIAGCÁKMAGC^ (G7X A( X A X A < O ÁA Γ< Π v A CG(XTTG A-G UA1X A ?TG AGC
G ACTCTGTv a / A A XG CTG GCT A G GC A G OC AUG A<KXC >yT<MAG:CAGCTTvXvXMTAGCCTTUA:(XA(:AXGGCGCG(K^
CAuaaXGaMa'GM . . '
Nukleotidová sekvence kódující (GGGGS)2 (11 aminokyselin, SEQ ID NO. 14)
AT v A. a a a A A A A A Α ΑΧΊ A AG (AX G CX A A > G G C A G CTG A
SEQ ID NO. 15:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Bl hordeinový promotor: 13 bp - 562 bp
Kozákové sekvence: 581 bp - 589 bp
ZmCKXlsp: 590 bp - 640 bp
LL-37: 641 bp-751 bp
KDEL: 752 bp - 763 bp
Nos terminátor: 791 bp - 1074 bp
-9CZ 2017 - 553 A3
TTTAAAGTCGACGTGCAGGTGTATGAGTCATTGTTATGATCTATAGGTGTCAGTTTAT CTTATCATCTGGGTGATCAATACAGGCCCAGGTTTTATAAAAACCAGTCGAGTCGAG AAGAACCGTCCACATGTAAAGCTTTAACAACCCACACATTGATTGCAACTTAGTCCT ACACAAGTTTTCCATTCTTGTTTCAGGCTAACAACCTATACAAGGTTCCAAAATCATG CAAAAGTGATGCTAGGTTGATAATGTGTGACATGTAAAGTGAATAAGGTGAGTCATG CATACCAAACCTCGGGATTTCTATACTTTGTGTATGATCATATGCACAACTAAAAGG CAACTTTGATTATCAATTGAAAAGTACCGGTTGTAGCTTGTGCAACCTAACACAATG TCCAAAAATCCATTTGCAAAAGCATCCAAACACAATTGTTAAAGCTGTTCAAACAAA CAAAGAAGAGATGAAGCCTGGCTACTATAAATAGGCAGGTAGTATAGAGATCTACA CAAGGACAAGCATCAAAACCAAGAAACACTAGTTAACACCAATCCACTGTCGACGG TACCGGATCCGCCACCATGGCCGTTGTTTACTACCTCCTCCTCGCCGGCCTCATTGCC TGCTCTCACGCCCTCCTCGGCGATTTCTTCCGCAAGTCCAAGGAGAAGATCGGCAAG GAGTTCAAGAGGATCGTCCAGAGGATCAAGGACTTCCTCCGCAACCTCGTGCCAAGG ACCGAGAGCAAGGACGAGCTTTGACTCGAGCCTTGGTCTAGAGAGCTCAGTCAAGC AGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCT TGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATG TAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACA TTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGC GCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGGCATGCAAGCTGATATGAGCTCGCATG CGCGGCCGCGATATC
SEQ ID NO. 16:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Kukuřičný ubikvitinový promotor: 1 bp - 1987 bp
Kozákové sekvence: 2056 bp - 2064 bp
ZmCKXl sp: 2065 bp - 2115 bp
LL-37: 2116 bp-2226 bp io KDEL: 2227 bp - 2238 bp
Nos terminátor: 2335 bp - 2618 bp
- 10CZ 2017 - 553 A3
GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAG TTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTAT CTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATA ATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCC TTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCA TTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATT CTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATA ATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTA AGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCT GTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCG TCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGT CGGACGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCG GCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGT AATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTA CGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCC ATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTG TTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTC TGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTC CGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGC CCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCT TTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGT AGAATTAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGT
-11CZ 2017 - 553 A3
GTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAG GATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTT CGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAG TAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTG TCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGG TATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTA TTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAAT TATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTT TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCA CCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCGCCCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGC GCCGGAACCAATTCAGTCGACCGTACGGGATCCGCCACCATGGCCGTTGTTTACTAC CTCCTCCTCGCCGGCCTCATTGCCTGCTCTCACGCCCTCCTCGGCGATTTCTTCCGCA AGTCCAAGGAGAAGATCGGCAAGGAGTTCAAGAGGATCGTCCAGAGGATCAAGGAC TTCCTCCGCAACCTCGTGCCAAGGACCGAGAGCAAGGACGAGCTTTGACTCGAGGA ATTCGCGGCCGCACTCGAGATATCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGG GGGATCCACTAGTTCTAGAATTCGATTGAGTCAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGC AATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATT TCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATG AGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCA ATTATACATTTAATACGCGATAGAAAAC AAA AT AT A GCGCGC A A ACT AGG AT A A A TT ATCGCGCGCGGTGTC ATCT A TGTT ACT A G A TCG ACCGGC A TGC A AGCTG AT A T
SEQ ID NO. 17:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Bl hordeinový promotor: 13 bp - 562 bp
Kozákové sekvence: 581 bp - 589 bp
ZmCKXlsp: 590 bp - 640 bp (GGGGS)2: 641 bp - 670 bp, 689 bp - 718 bp ίο 6xHis: 671 bp - 688 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo: 719 bp - 733 bp
LL-37: 734 bp - 844 bp
Nos terminátor: 872 bp - 1155 bp
- 12CZ 2017 - 553 A3
TTTAAAGTCGACGTGCAGGTGTATGAGTCATTGTTATGATCTATAGGTGTCAGTTTAT CTTATCATCTGGGTGATCAATACAGGCCCAGGTTTTATAAAAACCAGTCGAGTCGAG AAGAACCGTCCACATGTAAAGCTTTAACAACCCACACATTGATTGCAACTTAGTCCT ACACAAGTTTTCCATTCTTGTTTCAGGCTAACAACCTATACAAGGTTCCAAAATCATG CAAAAGTGATGCTAGGTTGATAATGTGTGACATGTAAAGTGAATAAGGTGAGTCATG CATACCAAACCTCGGGATTTCTATACTTTGTGTATGATCATATGCACAACTAAAAGG CAACTTTGATTATCAATTGAAAAGTACCGCTTGTAGCTTGTGCAACCTAACACAATG TCCAAAAATCCATTTGCAAAAGCATCCAAACACAATTGTTAAAGCTGTTCAAACAAA CAAAGAAGAGATGAAGCCTGGCTACTATAAATAGGCAGGTAGTATAGAGATCTACA CAAGCACAAGCATCAAAACCAAGAAACACTAGTTAACACCAATCCACTGTCGACGG TACCGGATCCGCCACCATGGCCGTTGTTTACTACCTCCTCCTCGCCGGCCTCATTGCC TGCTCCCACGCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGCGGGGGCAGCCACCATCACCATCAT CATGGCGGGGGCGGCAGCGGGGGGGGCGGCTCAGATGACGACGACAAGCTCCTTGG CGACTTCTTCCGCAAGTCCAAGGAGAAGATCGGCAAGGAGTTCAAGAGGATCGTCC AGAGGATCAAGGACTTCCTGAGGAACCTCGTGCCGAGGACCGAGTCTTGACTCGAG CCTTGGTCTAGAGAGCTCAGTCAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTT CTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAAT TACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGC GCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGG CATGCAAGCTGATATGAGCTCGCATGCGCGGCCGCGATATC
SEQ ID NO. 18:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Kukuřičný ubikvitinový promotor: 1 bp - 1987 bp
Kozákové sekvence: 2056 bp - 2064 bp
ZmCKXl sp: 2065 bp - 2115 bp (GGGGS)2: 2116 bp - 2145 bp, 2164 bp - 2193 bp ίο 6xHis: 2146 bp - 2163 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo: 2194 bp - 2208 bp
- 13 CZ 2017 - 553 A3
LL-37: 2209 bp-2319 bp
Nos terminátor: 2416 bp - 2699 bp
GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAG ITATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTITATCTAT CTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATA ATATCAGTGTTITAGAGAATCATATAAATGAACAGITAGACATGGTCTAAAGGACAA ITGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCC TTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCA TTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATT CTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATA ATTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTA AGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCT GTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCG TCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGT CGGACGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCG GCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGT AATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTA CGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCC ATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTG TTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTC TGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTC CGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGC CCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCT TTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGT ÁCjÁÁTTÁÁTTCTCTTTCÁÁÁCTÁCCTGCTGCÁTTTÁTTÁÁTTTTGCÁTCTOTÁTCTGT GTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAG GATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCITTTTGTT CGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCAITCGTTCTAGATCGGAG TAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTG
- 14CZ 2017 - 553 A3
TCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGG TATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTA TTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAAT TATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTT TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCA CCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCGCCCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGC GCCGGAACCAATTCAGTCGACCGTACGGGATCCGCCACCATGGCCGTTGTTTACTAC CTCCTCCTCGCCGGCCTCATTGCCTGCTCCCACGCTGGCGGCGGCGGCTCCGGCGGC GGGGGCAGCCACCATCACCATCATCATGGCGGGGGCGGCAGCGGGGGGGGCGGCTC AGATGACGACGACAAGCTCCTTGGCGACTTCTTCCGCAAGTCCAAGGAGAAGATCG GCAAGGAGTTCAAGAGGATCGTCCAGAGGATCAAGGACTTCCTGAGGAACCTCGTG CCGAGGACCGAGTCTTGACTCGAGGAATTCGCGGCCGCACTCGAGATATCTAGACCC AGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGGGGGATCCACTAGTTCTAGAATTCGATTGAGT CAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGC CGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAAT TATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTAT CGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGGCATGCAAGCTGATAT
SEQ ID NO. 19:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Bl hordeinový promotor: 13 bp - 562 bp
Kozákové sekvence: 581 bp - 592 bp
ZmCKXlsp: 593 bp - 643 bp
6xHis: 644 bp - 661 bp
MBP: 662 bp - 1807 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo: 1808 bp - 1822 bp
LL-37: 1823 bp - 1933 bp
KDEL: 1934 bp - 1945 bp
Nos terminátor: 1973 bp - 2256 bp
- 15 CZ 2017 - 553 A3
TTTAAAGTCGACGTGCAGGTGTATGAGTCATTGTTATGATCTATAGGTGTCAGTTTAT CTTATCATCTGGGTGATCAATACAGGCCCAGGTTTTATAAAAACCAGTCGAGTCGAG AAGAACCGTCCACATGTAAAGCTTTAACAACCCACACATTGATTGCAACTTAGTCCT ACACAAGTTTTCCATTCTTGTTTCAGGCTAACAACCTATACAAGGTTCCAAAATCATG CAAAAGTGATGCTAGGTTGATAATGTGTGACATGTAAAGTGAATAAGGTGAGTCATG CATACCAAACCTCGGGATTTCTATACTTTGTGTATGATCATATGCACAACTAAAAGG CAACTTTGATTATCAATTGAAAAGTACCGCTTGTAGCTTGTGCAACCTAACACAATG TCCAAAAATCCATTTGCAAAAGCATCCAAACACAATTGTTAAAGCTGTTCAAACAAA CAAAGAAGAGATGAAGCCTGGCTACTATAAATAGGCAGGTAGTATAGAGATCTACA CAAGCACAAGCATCAAAACCAAGAAACACTAGTTAACACCAATCCACTGTCGACGG TACCGGATCCGCGGCAGCGATGGCCGTGGTGTACTACCTCCTCCTCGCCGGCCTGAT CGCCTGCTCCCACGCGCACCACCACCATCACCATAAGATCGAGGAGGGCAAGCTCGT CATCTGGATCAACGGCGACAAGGGCTACAACGGCCTCGCCGAGGTGGGCAAGAAGT TCGAGAAGGACACCGGCATCAAGGTGACCGTCGAGCACCCAGATAAGCTGGAGGAG AAGTTCCCGCAGGTCGCCGCCACCGGCGACGGCCCGGATATCATCTTCTGGGCCCAC gacaggttcggcggctacgcccagtccggcctcctcgccgagatcaccccggacaag GCCTTCCAGGATAAGCTCTACCCGTTCACCTGGGACGCCGTGAGGTACAACGGCAAG CTCATTGCCTACCCGATTGCCGTCGAGGCCCTCTCCCTGATCTACAACAAGGACCTCC TCCCGAACCCGCCCAAGACCTGGGAGGAGATCCCGGCCCTCGACAAGGAGCTGAAG GCCAAGGGCAAGTCCGCCCTCATGTTCAACCTCCAGGAGCCGTACTTCACCTGGCCA CTCATTGCGGCCGACGGGGGGTACGCCTTCAAGTACGAGAACGGCAAGTACGACAT CAAGGACGTGGGCGTGGACAACGCTGGCGCCAAGGCGGGCCTCACCTTCCTCGTGG ATCTCATCAAGAACAAGCACATGAACGCCGACACCGACTACTCGATCGCCGAGGCC GCCTTCAACAAGGGCGAGACCGCCATGACCATTAACGGCCCGTGGGCCTGGTCCAAC ATCGACACCTCTAAGGTGAACTACGGCGTGACCGTGCTCCCGACCTTCAAGGGCCAG CCGTCCAAGCCGTTCGTGGGCGTGCTCTCCGCCGGCATCAACGCCGCCTCCCCGAAC AAGGAGCTGGCCAAGGAGTTCCTGGAGAACTACCTCCTCACCGACGAGGGCCTGGA GGCCGTGAACAAGGACAAGCCGCTCGGCGCCGTGGCCCTCAAGTCCTACGAGGAGG AGCTGGCGAAGGACCCGAGGATCGCCGCGACCATGGAGAACGCCCAGAAGGGCGA GATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCCTTCTGGTACGCCGTCAGGACCGCCGT GATTAACGCCGCCAGCGGCAGGCAGACCGTGGACGAGGCCCTGAAGGACGCCCAGA
- 16CZ 2017 - 553 A3
CCAACTCTTCCTCGAACAATAACAATAACAACAATAATAACAACCTCGGCGACGACG ACGACAAGCTCCTCGGCGACTTCTTCCGCAAGTCCAAGGAGAAGATCGGCAAGGAG TTCAAGAGGATCGTCCAGAGGATCAAGGACTTCCTCCGCAACCTCGTGCCAAGGACC GAGTCCAAGGATGAGCTGTGACTCGAGCCTTGGTCTAGAGAGCTCAGTCAAGCAGG ATCGTTC A A AC A TTTGGC A ATA A AGTTTCTT A AG ATTG A ATCCTGTTGCCGGTCTTGC GATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAA TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTT AATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCG GTGTCATCTATGTTACTAGATCGACCGGCATGCAAGCTGATATGAGCTCGCATGCGC GGCCGCGATATC
SEQ ID NO. 20:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Kukuřičný ubikvitinový promotor: 1 bp - 1987 bp
Kozákové sekvence: 2056 bp - 2067 bp
ZmCKXl sp: 2068 bp - 2118 bp
6xHis: 2119 bp - 2136 bp
MBP: 2137 bp - 3282 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo: 3283 bp - 3297 bp
LL-37: 3298 bp - 3408 bp
KDEL: 3409 bp - 3420 bp
Nos terminátor: 3517 bp - 3800 bp
GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAG TTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTAT CTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATA ATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAA TTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCC TTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCA TTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATT CTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATA ATTTAGATATAAAATAGA ATAA AATAAAGTGACTAAAAATTAAACA AATACCCTTTA
- 17CZ 2017 - 553 A3
AGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCT GTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCG TCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTC GAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGT CGGACGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCG GCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGT AATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCA CACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGTA CGCCGCTCGTCCTCCCCCCCCCCCCCTCTCTACCTTCTCTAGATCGGCGTTCCGGTCC ATGGTTAGGGCCCGGTAGTTCTACTTCTGTTCATGTTTGTGTTAGATCCGTGTTTGTG TTAGATCCGTGCTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGACCTGTACGTCAGACACGTTC TGATTGCTAACTTGCCAGTGTTTCTCTTTGGGGAATCCTGGGATGGCTCTAGCCGTTC CGCAGACGGGATCGATTTCATGATTTTTTTTTGTTTCGTTGCATAGGGTTTGGTTTGC CCTTTTCCTTTATTTCAATATATGCCGTGCACTTGTTTGTCGGGTCATCTTTTCATGCT TTTTTTTGTCTTGGTTGTGATGATGTGGTCTGGTTGGGCGGTCGTTCTAGATCGGAGT AGAATTAATTCTGTTTCAAACTACCTGGTGGATTTATTAATTTTGGATCTGTATGTGT GTGCCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATGGATGGAAATATCGATCTAG GATAGGTATACATGTTGATGCGGGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGCTTTTTGTT CGCTTGGTTGTGATGATGTGGTGTGGTTGGGCGGTCGTTCATTCGTTCTAGATCGGAG TAGAATACTGTTTCAAACTACCTGGTGTATTTATTAATTTTGGAACTGTATGTGTGTG TCATACATCTTCATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAATATCGATCTAGGATAGG TATACATGTTGATGTGGGTTTTACTGATGCATATACATGATGGCATATGCAGCATCTA TTCATATGCTCTAACCTTGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTTTTATAAT TATTTTGATCTTGATATACTTGGATGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGATTTTT TTAGCCCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCTTGGTACTGTTTCTTTTGTCGATGCTCA CCCTGTTGTTTGGTGTTACTTCGCCCATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGGC GCCGGAACCAATTCAGTCGACCGTACGGGATCCGCGGCAGCGATGGCCGTGGTGTA CTACCTCCTCCTCGCCGGCCTGATCGCCTGCTCCCACGCGCACCACCACCATCACCAT AAGATCGAGGAGGGCAAGCTCGTCATCTGGATCAACGGCGACAAGGGCTACAACGG CCTCGCCGAGGTGGGCAAGAAGTTCGAGAAGGACACCGGCATCAAGGTGACCGTCG AGCACCCAGATAAGCTGGAGGAGAAGTTCCCGCAGGTCGCCGCCACCGGCGACGGC
- 18 CZ 2017 - 553 A3
CCGGATATCATCTTCTGGGCCCACGACAGGTTCGGCGGCTACGCCCAGTCCGGCCTC CTCGCCGAGATCACCCCGGACAAGGCCTTCCAGGATAAGCTCTACCCGTTCACCTGG GACGCCGTGAGGTACAACGGCAAGCTCATTGCCTACCCGATTGCCGTCGAGGCCCTC TCCCTGATCTACAACAAGGACCTCCTCCCGAACCCGCCCAAGACCTGGGAGGAGATC CCGGCCCTCGACAAGGAGCTGAAGGCCAAGGGCAAGTCCGCCCTCATGTTCAACCTC CAGGAGCCGTACTTCACCTGGCCACTCATTGCGGCCGACGGGGGGTACGCCTTCAAG TACGAGAACGGCAAGTACGACATCAAGGACGTGGGCGTGGACAACGCTGGCGCCAA GGCGGGCCTCACCTTCCTCGTGGATCTCATCAAGAACAAGCACATGAACGCCGACAC CGACTACTCGATCGCCGAGGCCGCCTTCAACAAGGGCGAGACCGCCATGACCATTAA CGGCCCGTGGGCCTGGTCCAACATCGACACCTCTAAGGTGAACTACGGCGTGACCGT GCTCCCGACCTTCAAGGGCCAGCCGTCCAAGCCGTTCGTGGGCGTGCTCTCCGCCGG CATCAACGCCGCCTCCCCGAACAAGGAGCTGGCCAAGGAGTTCCTGGAGAACTACCT CCTCACCGACGAGGGCCTGGAGGCCGTGAACAAGGACAAGCCGCTCGGCGCCGTGG CCCTCAAGTCCTACGAGGAGGAGCTGGCGAAGGACCCGAGGATCGCCGCGACCATG GAGAACGCCCAGAAGGGCGAGATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCCTTCTG GTACGCCGTCAGGACCGCCGTGATTAACGCCGCCAGCGGCAGGCAGACCGTGGACG AGGCCCTGAAGGACGCCCAGACCAACTCTTCCTCGAACAATAACAATAACAACAAT AATAACAACCTCGGCGACGACGACGACAAGCTCCTCGGCGACTTCTTCCGCAAGTCC AAGGAGAAGATCGGCAAGGAGTTCAAGAGGATCGTCCAGAGGATCAAGGACTTCCT CCGCAACCTCGTGCCAAGGACCGAGTCCAAGGATGAGCTGTGACTCGAGGAATTCG CGGCCGCACTCGAGATATCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGATGGGGGAT CCACTAGTTCTAGAATTCGATTGAGTCAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAA AGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGT TGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGAT GGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAA TATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATC GACCGGCATGCAAGCTGATAT
SEQ ID NO. 21:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Bl hordeinový promotor: 13 bp - 562 bp
Kozákové sekvence: 581 bp - 589 bp
OsChtlsp: 590 bp - 646 bp
6xHis: 647 bp - 664 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikční místo: 665 bp - 679 bp
LL-37: 680 bp - 790 bp
Nos terminátor: 818 bp - 1101 bp
- 19CZ 2017 - 553 A3
TTTAAAGTCGACGTGCAGGTGTATGAGTCATTGTTATGATCTATAGGTGTCAGTTTAT CTTATCATCTGGGTGATCAATACAGGCCCAGGTTTTATAAAAACCAGTCGAGTCGAG AAGAACCGTCCACATGTAAAGCTTTAACAACCCACACATTGATTGCAACTTAGTCCT ACACAAGTTTTCCATTCTTGTTTCAGGCTAACAACCTATACAAGGTTCCAAAATCATG CAAAAGTGATGCTAGGTTGATAATGTGTGACATGTAAAGTGAATAAGGTGAGTCATG CATACCAAACCTCGGGATTTCTATACTTTGTGTATGATCATATGCACAACTAAAAGG CAACTTTGATTATCAATTGAAAAGTACCGCTTGTAGCTTGTGCAACCTAACACAATG TCCAAAAATCCATTTGCAAAAGCATCCAAACACAATTGTTAAAGCTGTTCAAACAAA CAAAGAAGAGATGAAGCCTGGCTACTATAAATAGGCAGGTAGTATAGAGATCTACA CAAGCACAAGCATCAAAACCAAGAAACACTAGTTAACACCAATCCACTGTCGACGG TACCGGATCCGCCACCATGAGGGCTCTCGCCGTGGTGGTGGTCGCCACCGCCTTCGC TGTGGTGGCCGTGAGGGGCCACCATCACCATCATCATGACGACGACGATAAGCTCCT CGGCGACTTCTTCCGCAAGTCCAAGGAGAAGATCGGCAAGGAGTTCAAGAGGATCG TCCAGAGGATCAAGGACTTCCTGAGGAACCTCGTGCCGAGGACCGAGTCTTGACTCG AGCCTTGGTCTAGAGAGCTCAGTCAAGCAGGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGT TTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGA ATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGG TTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATAT AGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGAC CGGCATGCAAGCTGATATGAGCTCGCATGCGCGGCCGCGATATC
SEQ ID NO. 22:
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Ovesný globulinový promotor: 1 bp - 960 bp
Kozákové sekvence: 989 bp - 997 bp
8xHis: 998 bp - 1021 bp
Enterokinasou rozpoznávané restrikěni místo: 1022 bp - 1036 bp eta-defensin 2: 1037 bp - 1153 bp
Nos terminátor: 1169 bp - 1418 bp
-20CZ 2017 - 553 A3
TGGAAAGTCATTTTGCCTCCTGAACTCCAGTGTTTCCTGTTTATTAAAAAAACTAAAA ACTATACTTATAAGTTTGAAAAGATCATGAAACAAAATTGTAAAAATTGCTAATGAT ATATCCCACAAACGTGCAAAATCTCAATTCGAAGTGCTTTGTATTTCGAACTACACA AAAATGACAAAGTGTGACTTTTTATGTGATTCGAAATCACTATACTACAGATCTACA ATTTTGTCATTTTTGTGAAGCTAAAAATACACATTATTTCGAATTGAGATTTTTCATG TTTGTGCTATGAATCACAGGCTACATCCTGATTTATTTTTAGAATTTTTTGGAACCCA AAATATGTTCTAGATTATTTTTTAAAAAGTGGGATCACTTATGCCCATACACACGAA ATCTCCACTCAATTCTTTTATACATTATCTTTCTATATCTACTAACGTGGATTATACAT CATAGTAAGTTTCTTACTACATGTGCTTTCTTGTGACAATGTGGACACGACTCTTCCA CTTTTGGGCTTTATGTTGTATTGATATACTCATGACATGGAATTTTGTCCACACACGT AGATCCATCCATATATATTGTTGTGCATAGAACGAAACACAAGCAAGCCATTAAAAA GGAGTCACAAGTGCCACAAACTGTTGTAGGAAGTACAACTAGTATGAGGCCTTTTAT TTGACGTCGGACAATGGCCAAGAGCTACATACAAAAGATGGTGCTAGATTTGTGAGT AAGCACCAGTTGTAGGCAGAAAACAACACATATCTTTTGAGGCAAAGTTATATCTAT TCACATTTAAAACCATGATCTGTTGAGTCACCATGAATATCTTTTTATCTATGTTAAT AATTACATGTCATCATGTTTATCCTGGACTACTTTTTATGGCTATAAAATCAAACTTA CAATTAGGAAACTAGCACCAATCCACCTTCTACAATCTCGGATCCGTCCTAAAGCCG TACGGAATTCGCCACCATGCACCACCATCATCATCACCATCACGACGACGATGACAA GGACCCGGTGACCTGCCTCAAGTCTGGCGCCATTTGCCACCCAGTGTTCTGCCCAAG GCGCTACAAGCAGATCGGCACGTGCGGCCTCCCAGGCACCAAGTGCTGCAAGAAGC CAAACTGACTCGAGCCTAGGTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATC CTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGT AATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTC CCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGA TAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCGGG
SEQ ID NO. 23:
-21 CZ 2017 - 553 A3
Pozice jednotlivých funkčních úseků:
Ječmenný trypsin inhibitorový promotor: 1 bp - 2393 bp
Kozákové sekvence: 2406 bp - 2414 bp
Pexiganan: 2415 bp - 2480 bp
KDEL: 2481 bp - 2492 bp
Nos terminátor: 2508 bp - 2757 bp
GTCGACGCATGTGTCATCTCATTCTGAAACGTGTGGTGCTGAGACGGTTGGAAATAT GCCCTAGAGGTAATGATAAATAGTTATTATTATATTTCTTGTTTCAAGATAATCATTT ATTATTCATGCTATAATTATATTGAATGAAAACATAGATACATGTGTGAATACATTG ACGAAACAATGTCCTTAGCAAGCCTCTAGTTGGCTAGCCAGTTGATCAAGGATAGTC AAGGTTTTCTGACTATGTGCAAGTGTTGTCACTTGATAACTGGATCACATCATTAGGA GAATCATGTGATGGACTAGACCCAAACTATGAATGTAGCATATTGATCGTGTCATTT TGTTGCTATTGTTTTCTGCGTGTCAAGTATTTATTCCTATGACCATGAGATCATATAA CTCACTGGTACCGGAGGAATACCTTGTGTGTATCAAACGTCGCAACGTAACTGAGTG ACTATAAAGGTGCTCTACAGGTATCTCTGAAGGTGTCCGTTGAGTTAGTATGGATCA AGACTAGGATTTGCCACTCCGTGTGACGTAGAGGTATCTCGGCCCACTCGGTAATAC AACATCACACACAAGCCTTGCAAGCAATGTGACTAAGTTTAAGTCACGGGATCTTGT ATTACCGAACGAGAAAAGAGACATGGATGCTAGTAGATTTCTTTTTGTAGAGCACCT CACAACTAGACGGGCCCTGAAACACCTATACTTATATTTAGTATACAAAATGTTTGT CCTGAAACAATACGTGAGTTGCAGAAAACGAAGCGACTTCGATAGACGCAGGAACA CACGATGGAACGACCACGGAGCCGAAGGACGGCCGCGCGATCGGTCGGTACTAGAT AATATTTTCCCAAAAGATAATGCATGGATGCTAGTAGACTTATTTTCAGAAGTACTA TACATACGATACGATACGACATATCATACCAAAATCGTATGCCAAATTATCGTATAT AGAGTAATTCCGTTTCTTTTTTGTCCCGGTGGATCTGAAATAACCACTTTCTGGAAAA TCTTGGAAATTTAGGTTTTTTCTGCCCGAATGAATTTAAAGGAACTTTGAATTTGATT TTTTTGCTGTGTGAAAATATATATAAAGACGCTAACCTACTGACTAACGTAACTCCCT CATGCTCGACTGATCGGTTGGGTACACTCTTTCGCCCGCCAGGTCATGAGATTGGAT CCTCTCGATCGGTTGCAGACATGATCTCGACTCATAAACCAAACGAGAGTTTACTTG AAGTGCTAGATTACACTACAAATAAACATGGAAGAGAATGACATGCAGATGAACTA GGGATAATTCTGTTATCTCTTTTCGTAGGGTTCTTCTTGAACCTCGACTGGCAGCATG GGATGAAGTACTCACTCGTTTGGAGGCTCGTTCAGCTGTCACATGGATGCTAGTAGA
-22CZ 2017 - 553 A3
TTTCTTTTCGTAGAGCCCCTCACAACCAGACGGGCCCCGAAACACCTATACTTATATC CAGTATAAAAAATGTCTGTCCTGAAACAATACGTGAGTTGCAGGAAAACGAAAGCG GCTTCGATAGACGCAGGAACACACGAACGAACGGCCGCGCGATTGGTCGGTACTAG ATAATATTTTCCCAAAAGATAATGCATGGATGCTACTAGATTTTTTTCAGAAGTACTC TGCATACGATACGATATGACATATCATACAAAATCGTATGCCAAATTATCGTATTTA GAGTTAATTATGTTTCTTTTTTGTTCGAGGGATCTGAAATAACCGGTTTCTGGAAAAT CTTGTAAATTCAAGGTTTTTCCGCCCGAATGAATTTAAACAAACTTTGAATTTGATTT TTTTGCAGTGTGAAAATATATATAAAGATGCTAACCTACTGACTAACGTAACTCCCT CATGCTCGACTGATCGGTTGCGTAGACCCTGTCGCCCGCCAGGTCATGAGATTGGAT CCTCTCGGCTGCAGACATGATCTCCACTCATAAAGCAAACGAGAGTTTACTTGAAGT GTTAGATTACACATTTACACTACGAATAAACATGGAAGAGAATGGCATGCAGATGA ACCAGGGATGTAGCGTAGTATGATAAGATAACTCATGCCAAGCACACTGAGAAAGG TAGGAACCGAGGAAATATGGTTATTCTTCTACTCAAACCCCAACTTTTGCATTCCCCT CCGAATATTGTTAGCACAAAGCTCCAAATTCTGTCAGCAAAAAAGGTTATCAAAGCT ACCCTTTAATCAAAATTTCCATGCAGCGGCACTCCAACAACTAACAGAAAGTCAGAA AGCACTTCGGTACTTACGATGCCAGCTGCTTGTCACTTCACATTTCACTATATATATA CATGTGATACGCCTCGCTTGCTCCAACAACATCCCTTCAATTTGATAACACGTACGG AATTCGCCACCATGGGCATCGGCAAGTTCCTCAAGAAGGCCAAGAAGTTCGGCAAG GCCTTCGTGAAGATCCTGAAGAAGAAGGACGAGCTTTGACTCGAGCCTAGGTCAAA CATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC ATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGAT AGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTA TGTTACTAGATCGGG
SEQ ID NO. 24:
SEQ ID NO. 25:
SEQ ID NO. 26:
GGGGSGGGGSHHHHHHGGGGSGGGGSDDDDKLLGDFFRKSKEK1GKEFKR1VQR1KDF
LRNLVPRTES
Dále vynález zahrnuje způsob přípravy rekombinantních zvířecích antimikrobiálních peptidů, který obsahuje následující kroky:
(a) poskytnutí rostliny ječmene obsahující v genomu nukleotidovou sekvenci obsahující sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující zvířecí antimikrobiální peptid, a popřípadě dále jednu nebo více sekvencí vybraných ze skupiny zahrnující:
-23CZ 2017 - 553 A3
- sekvenci kódující C-terminální sekvenci pro retenci peptidů na endoplasmatickém retikulu;
- sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein; restrikční místo rozpoznávané proteázou, např. enterokinázou, DAMP4 biosurfaktantní protein, SUMO nebo SUMOstar peptid;
s výhodou pod kontrolou promotoru vybraného ze skupiny zahrnující zrnově specifický nebo konstitutivní promotor, zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je Bl hordeinový promotor, ječmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor;
(b) pěstování rostliny ječmene do vytvoření obilek, případně do dozrání obilek, (c) izolace rekombinantního zvířecího antimikrobiálního peptidů nebo jeho chimérické varianty z obilek ječmene.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Schematické znázornění rostlinných expresních vektorů použitých na genetickou modifikaci ječmene. Kódující sekvence pro jednotlivé rekombinantní antimikrobiální peptidy byly vloženy mezi endospermově specifický B1-hordeinový promotor (A), kukuřičný ubikvitinový promotor (B), zrnově specifický promotor inhibitoru trypsinu (C) či ovesný globulinový promotor (D) a nopalin syntázový terminátor. Součástí finálních destinačních vektorů byl hptll gen rezistence vůči hygromycinu B, jehož exprese byla řízena 35S promotorem viru mozaiky květáku. rAMP: rekombinantní antimikrobiální peptid; B-HORp: ječmenný Bl hordeinový promotor; UBIp: kukuřičný ubikvitinový promotor; Tip: ječmenný promotor inhibitoru trypsinu; AsGLOlp: ovesný promotor globulinu; Nos-t: nopalin syntasový terminátor; ZmCKXlsp: signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1; OsChtlsp: signální peptid rýžové chititasy 1; 6xHis / 8xHis: histidinová kotva; MBP: maltózu vázající protein; E: restrikční místo rozpoznávané enterokinázou; LL-37: lidský antimikrobiální peptid katelicidin LL-37; PEX: antimikrobiální peptid pexiganan, HBD2: lidský antimikrobiální peptid betadefensin 2; KDEL: tetrapeptid zodpovědný za retenci na endoplasmatickém retikulu.
Obr. 2: PCR detekce transgenů v geneticky modifikovaných rostlinách ječmene TI generace exprimujících rekombinantní katelicidin (rAMP) pod kontrolou Bl hordeinového promotoru (BHORp). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna prostřednictvím šipek. Šedé šipky odpovídají detekci LL-37 a Bl hordeinového promotoru, černé šipky hptll genu (A). Detekce genu LL-37 a Bl hordeinového promotoru. Velikosti amplikonů pro jednotlivé použité vektory jsou:1681 bp (ZmCKXlsp _6xHis_MBP_LL-37_KDEL),592 bp (ZmCKXlsp_(GGGGS)2_6xHis_(GGGGS)2_LL-37), 499 bp (ZmCKXlsp_LL-37_KDEL) a 538 bp (OsChtlsp_6xHis_LL-37) (B). Detekce hptll genu. Velikost amplikonů pro všechny použité vektory je 649 bp (C). M: marker molekulových hmotností; PK: pozitivní kontrola (plasmidová DNA nesoucí jednotlivé transgeny); NK: negativní kontrola (gDNA kontrolních WT linií ječmene); 1, 2, 3, 4: nezávislé linie s integrovanými příslušnými transgeny.
Obr. 3: PCR detekce transgenů v geneticky modifikovaných rostlinách ječmene TI generace expimujících rekombinantní katelicidin (rAMP) pod kontrolou ubikvitinového promotoru (UBIp). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna prostřednictvím šipek. Šedé šipky odpovídají detekci LL-37 a ubikvitinového promotoru, černé šipky hptll genu (A). Detekce genu LL-37 a ubikvitinového promotoru. Velikosti amplikonů pro jednotlivé použité vektory jsou: 1379 bp (ZmCKXlsp _6xHis_MBP_LL-3 7_KDEL), 290bp (ZmCKXlsp(GGGGS)2_6xHis_(GGGGS)2LL-37), 197 bp (ZmCKXlsp_LL-37KDEL) (B). Detekce hptll genu. Velikost amplikonů pro všechny použité vektory je 649 bp (C). M: marker molekulových hmotností; PK: pozitivní kontrola (plasmidová DNA nesoucí jednotlivé transgeny); NK: negativní kontrola (gDNA kontrolních WT linií ječmene); 1, 2, 3, 4: nezávislé linie s integrovanými příslušnými transgeny.
-24CZ 2017 - 553 A3
Obr. 4: Selekce TI generace transgenních linií ječmene expimujících antimikrobiální peptid pexiganan (PEX) pod kontrolou ječmenného promotoru inhibitoru trypsinu (Tip) pomocí PCR analýzy. Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna prostřednictvím šipek. Šedé šipky odpovídají detekci PEX a trypsin inhibitorového promotoru, černé šipky hptll genu (A). Detekce genu pro PEX a trypsin inhibitorového promotoru. Velikosti amplikonů je 173 bp (B). Detekce hptll genu. Velikost amplikonů je 649 bp (C). M: marker molekulových hmotností; PK: pozitivní kontrola (plasmidová DNA nesoucí daný transgen); NK: negativní kontrola (gDNA kontrolních WT linií ječmene); 1 - 15: TI rostliny ječmene.
Obr. 5: Selekce TI generace transgenních linií ječmene expimujících derivát lidského betadefensinu 2 (HBD2) pod kontrolou ovesného globulinového promotoru (AsGLOlp). Detekovaná oblast transgenní DNA je znázorněna prostřednictvím šipek. Šedé šipky odpovídají detekci HBD2 a ovesného promotoru globulinu, černé šipky hptll genu (A). Detekce genu HBD2 a globulinového promotoru. Velikosti amplikonů je 482 bp (B). Detekce hptll genu. Velikost amplikonů je 649 bp (C). M: marker molekulových hmotností; PK: pozitivní kontrola (plasmidová DNA nesoucí daný transgen); NK: negativní kontrola (gDNA kontrolních WT linií ječmene); 1 - 15: TI rostliny ječmene.
Obr. 6: Southern blot analýza gDNA nezávislých TO transgenních linií ječmene exprimujících rekombinantní katelicidin. gDNA (40 ug) byla štěpena pomocí enzymu Xhol. K detekci hptll genu sloužila DNA próba. M: marker molekulových hmotností; PK: pozitivní kontrola (plasmidová DNA); NK: negativní kontrola (gDNA kontrolních WT linií ječmene); 1, 2, 3, 4, 5, 6: nezávislé transgenní linie ječmene s jednou (linie 1 a 2), dvěma (linie 3 a 4) či větším počtem integrací (linie 5 a 6).
Obr. 7: Srovnání fenotypu kontrolních WT rostlin ječmene (1) s fenotypem TI rostlin exprimujících rekombinantní antimikrobiální peptid pod zrnově specifickým promotorem (2) či kukuřičným ubikvitinovým promotorem (3). Fenotyp nadzemní části rostlin ječmene (A). Fenotyp kořenového systému (B). Fenotyp klasů (C). Fenotyp zralých zrn (D).
Obr. 8: Relativní kvantifikace exprese derivátu lidského antimikrobiálního peptidu betadefensinu 2 (HBD2, A), resp. antimikrobiálního peptidu pexigananu (PEX, B) v různých pletivech transgenního ječmene u rostlin transformovaných konstruktem AsGLOlp::8xHis_HBD2_KDEL::Nos (A), resp. TIp::PEX_KDEL::Nos (B) vztažená k bazální expresi detekované v listech. Exprese byla relativně kvantifikována vždy u 4 až 6 rozdílných biologických replikátů pro každou nezávislou transgenní linii a analýza byla nastavena vždy ve třech technických replikátech pro každý biologický replikát. K vyhodnocení dat metodou delta delta Ct sloužil software DataAssist™ HBD2 1 a HBD2 2: nezávislé transgenní linie ječmene T2 generace exprimující HBD2;PEX_1 a PEX 2: nezávislé transgenní linie ječmene TI generace exprimující PEX. 73, 85, 88: 3 různá vývojová stádia ječmene určená podle konsistence klasu použitá na analýzu (klasifikace dle BBCH stupnice).
Obr. 9: Western blot detekce rekombinantního katelicidinu v proteinových extraktech připravených z mléčně zralých zrn transgenních linií ječmene exprimujících znázorněné chimérické LL-37 geny (A), (B), (C), (D) pod kontrolou BI hordeinového promotoru. NK: negativní kontrola (proteinový extrakt z kontrolních WT linií ječmene); NKE: negativní kontrola štěpená pomocí enterokinasy; TL: proteinový extrakt z transgenní linie; TLE: štěpený proteinový extrakt z transgenní linie; PK: pozitivní kontrola (syntetický antimikrobiální peptid LL-37, 10 ng). Teoretická velikost rekombinantního katelicidinu pro jednotlivé chimérické varianty: 48 kDa, resp. 5 kDa pro štěpený produkt (A); 5 kDa (B); 7,2 kDa, resp. 4,5 kDa pro štěpený produkt (C); 5,9 kDa (D). Velikost syntetického katelicidinu LL-37: 4,5 kDa.
Obr. 10: Western blot detekce rekombinantního katelicidinu v proteinových extraktech připravených ze zralých zrn transgenních linií ječmene exprimujících znázorněný chimérický LL
-25 CZ 2017 - 553 A3 gen pod kontrolou Bl hordeinového promotoru. NK: negativní kontrola (proteinový extrakt z kontrolních WT linií ječmene); TL: proteinový extrakt z transgenní linie; PK: pozitivní kontrola (syntetický antimikrobiální peptid LL-37, 10 ng). Teoretická velikost rekombinantního katelicidinu pro danou chimérickou variantu: 5 kDa. Velikost syntetického katelicidinu LL-37: 4,5 kDa.
Obr. 11: Western blot detekce rekombinantního katelicidinu v proteinových extraktech připravených z různých pletiv transgenních linií ječmene exprimujících znázorněný chimérický LL-37 gen pod kontrolou kukuřičného ubikvitinového promotoru. NK: negativní kontrola (proteinový extrakt ze zrn, listů či kořenů / NKZ, NKL či NKK kontrolních WT linií ječmene); TL: proteinový extrakt ze zrn, listů či kořenů / TLZ, TLL či TLK transgenní linie; PK: pozitivní kontrola (syntetický antimikrobiální peptid LL-37, 10 ng). Teoretická velikost rekombinantního katelicidinu pro danou chimérickou variantu: 48 kDa. Velikost syntetického katelicidinu LL-37: 4,5 kDa.
Obr. 12: Imunodetekce rekombinantního katelicidinu ve zralých zrnech ječmene TI generace s využitím protilátky specifické proti LL-37. NK: negativní kontrola (zrno kontrolní WT linie).
Obr. 13: Imunodetekce rekombinantního defensinu (HBD2), resp. pexigananu (PEX) ve zralých zrnech ječmene s využitím protilátek specifických proti jednotlivým antimikrobiálním peptidům. NK: negativní kontrola (zrno kontrolní WT linie).
Obr. 14: In vitro antimikrobiální aktivita rekombinantních LL-37 produktů vůči bakterii Escherichia Coli TOP 10. Purifikované proteinové extrakty byly připraveny z mléčně zralých zrn TI linií ječmene. Testované rekombinantní LL-37 produkty pro jednotlivé linie jsou znázorněny v grafu. Růst bakteriální populace, v přítomnosti kontrolních extraktů (10 pg vyextrahovaných proteinů) ze zrn kontrolních WT linií (negativní kontrola; NK), resp. v přítomnosti extraktů (10 pg) z kontrolních linií ošetřených pomocí enterokinasy (NKE), byl považován za 100%. TL: extrakt ze zrn transgenních linií (10 pg) s integrovaným genem: ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL37KDEL (TLI), ZmCKXIsp_(GGGGS)2_6xHis_(GGGGS)2_LL-37 (TL2), OsChtlsp_6xHis_LL37 (TL3). TLE: enterokinázou ošetřený extrakt ze zrn transgenních linií (10 pg) s integrovaným genem: ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-37_KDEL (TLE1), ZmCKXlsp(GGGGS)2_6xHis_ (GGGGS)2_LL-37 (TLE2). Jako pozitivní kontrola sloužil syntetický peptid LL-37 aplikovaný k purifikovaným extraktům z kontrolních WT linií v indikovaném množství. Chybové úsečky představují střední chybu průměru (SE).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Příprava geneticky modifikovaného ječmene . Příprava expresní kazety pro vnesení cizorodé DNA do ječmene
Bylo připraveno celkem 7 expresních vektorů obsahujících různé chimérické varianty LL-37 genu pod kontrolou ječmenného zrnově specifického B1 hordeinového promotoru (Obr. 1A), resp. kukuřičného ubikvitinového promotoru (Obr. IB). Sekvence promotoru pro B1 hordeinový ječmenný protein (GenBank: X87232.1) byla společně se sekvencí Nos terminátoru na zakázku syntetizována firmou Mr. Gene GmbH (Regensburg, Německo). Mezi sekvenci pro B1 hordeinový promotor a Nos terminátor bylo umístěno multiklonovací místo s unikátními restrikčními místy rozpoznávanými specifickými endonukleasami pro vnesení příslušných chimérických variant genu LL-37 (SEQ ID NO. 1; SEQ ID NO. 2; SEQ ID NO. 3; SEQ ID NO. 4). Jednotlivé LL-37 varianty byly podrobeny optimalizaci kodónu pro ječmen a na zakázku syntetizovány firmou Thermo Fisher Scientific (Waithan, MA, USA). Součástí syntetizovaných LL-37 variant byla také iniciační Kozákové sekvence, která byla navržena s přihlédnutím na preferenci jednotlivých nukleotidů vyskytujících se kolem iniciačního kodonu u ječmene. Na
-26CZ 2017 - 553 A3 začátek a konec jednotlivých LL-37 genů byla umístěna restrikění místa pro následné vnesení příslušných sekvencí do vstupních vektorů. Další úseky DNA vnášené do ječmene byly získány zakoupením vstupního vektoru pENTR™ 2B Dual Selection Vector (Thermo Fisher Scientific), resp. pENTR™ 1A Dual Selection Vector (Thermo Fisher Scientific) a zakoupením binárního TDNA plazmidu pBRACT209, resp. pBRACT214 (John Innes Centre, Norwich, Velká Británie). Pro zrnově specifickou expresi variant LL-37 genu řízenou jeěmenným B1 hordeinovým promotorem byla nejdříve promotorová sekvence společně s Nos terminátorovou sekvencí vnesena pomocí restrikěních endonukleas Dral a EcoRV (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a T4 DNA ligasy (New England Biolabs) do vstupního vektoru pENTR™ 1A. Následně byly mezi promotor a terminátor klonovány jednotlivé chimérické LL-37 geny, a to pomocí endonukleas BamHI, Xhol a T4 DNA ligasy. Poté byly vneseny jednotlivé funkční úseky do cílového vektoru pBRACT209 pomocí Gateway klonování. K tomuto úěelu sloužil Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix (Thermo Fisher Scientific). Klonování bylo provedeno dle návodu doporučeného výrobcem. Pro expresi variant LL-37 genu řízenou kukuřičným ubikvitinovým promotorem, který byl stejně jako Nos terminátor součástí komerčního pBRACT214 vektoru, byly nejdříve jednotlivé geny vneseny pomocí restrikěních endonukleas SaH a EcoRI a T4 DNA ligasy do vstupního vektoru pENTR™ 2B Dual Selection Vector. Ten sloužil jako donorový vektor pro vnesení požadovaného úseku DNA do cílového vektoru pBRACT214 pomocí Gateway klonování s využitím Gateway™ LR Clonase™ II Enzyme mix.
Dále byl připraven 1 expresní vektor obsahující chimérickou variantu antimikrobiálního peptidu pexigananu (Obr. IC) a 1 vektor s genem kódujícím derivát lidského beta-defensinu 2 (Obr. ID). Pro zmově-specifickou expresi pexigananu byla použita sekvence promotoru jeěmenného inhibitoru trypsinu (GenBank: X65875.1), exprese HBD2 byla řízena promotorem pro zásobní protein globulin původem z ovsa. Varianty byly podrobeny optimalizaci kodónu pro ječmen a společně s Nos terminátorem syntetizovány firmou Thermo Fisher Scientific. Na začátek a konec jednotlivých sekvencí byla umístěna attl 1, resp. attl2 místa umožňující Gateway klonování, které bylo provedeno stejným způsobem jako v případě přípravy transformačních kazet s chimémími LL-37 geny. Jako cílový vektor sloužil pBRACT209.
Výsledné konstrukty byly ověřeny pomocí restrikění analýzy, PCR reakce a komerční sekvenace (SEQme, Dobříš, Česká republika) a následně vneseny společně s pomocným plasmidem pSOUP metodou elektroporace do bakterie Agrobacterium tumefaciens (kmen AGL1), která byla získána od Plant Breeding and Aclimatization Institute (Blonie, Polsko).
.Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens
Transformace ječmene prostřednictvím Agrobacteria tumefaciens probíhala dle publikovaného protokolu (Harwood, W. A. et al. in Transgenic Wheat, Barley and Oats: Production and Characterization Protocols; 137-147; Humana Press, New York, USA, 2009). Jediné modifikace spočívaly v přidání 0,3 mM acetosyringonu k agrobakteriální suspenzi před vlastní infekcí donorového materiálu, jímž byla nezralá embrya jarního ječmene kultivaru Golden Promise (semena ječmene získána z John Innes Centre, Norwich, Velká Británie). Další modifikací byl přídavek biotinu ve finální koncentraci 0,1 mgl·1 do bakteriálního MG/L kultivačního média.
.Pěstování transgenního ječmene
In vitro kultivace a regenerace rostlin probíhala podle publikovaného protokolu (Harwood, W. A. et al. in Transgenic Wheat, Barley and Oats: Production and Characterization Protocols; 137147; Humana Press, New York, USA, 2009). Po přesazení rostlin do rašelinových disků byly rostliny pěstovány ve fytotronu (16 hodin den - 15 °C, 8 hodin noc - 12 °C; relativní vlhkost 60 %; osvětlení 140 pMnús1 (na úrovni pěstební nádoby). Nakonec byly rostliny přesazeny do směsi perlitu a komerčního substrátu Gramoflor, speciální mix (Gramoflor GmbH & Co., Vechta, Německo) v poměru 10 g perlitu : 1 litr substrátu.
-27CZ 2017 - 553 A3
Jako kontrola pro potřebné analýzy byly připraveny rostliny, které prošly procesem regenerace z pletivových kultur, avšak nebyly infikovány agrobakteriální suspenzí. Součástí jednotlivých médií pro kultivaci kontrolních rostlin nebyla antibiotika.
Od každého z použitých expresních vektorů (Obr. 1) se podařilo získat minimálně 5 (maximálně 37) nezávislých TO transgenních linií. Účinnost transformace byla přibližně 10%. Jako marker pro selekci transgenních rostlin sloužil gen resistence k hygromycinu (hpt II), který byl součástí obou použitých pBRACT vektorů.
.Selekce diploidních linií
Jelikož může v důsledku regenerace rostlin z pletivových kultur docházet ke změnám ploidie, byl u transgenních linií TO generace určen počet homologních sad chromozomů pomocí průtokové cytometrie. K segmentu mladého listu (přibližně lem2) z transgenního a z kontrolního WT ječmene bylo přidáno 1,5 ml pufru (15 mmoll1 Tris, 2 mmoll1 disodná sůl EDTA, 0.5 mmoll1 spermin, 80 mmoll1 chlorid draselný, 20 mmoll1 chlorid sodný, 0,1% Triton X-100, 15 mmoll1 P-merkaptoetanol, pH 7,8), v němž byly listy rozmělněny na malé kousky pomocí žiletky. Po přefiltrování extraktu bylo k suspenzi uvolněných jader přidáno 50 pl Imgml1 ribonukleasy a 50 pl 0,1 mgml1 fluorescenční barvy DAPI. Stupeň ploidie rostlin byl určen pomocí systému CyFlow® Space (Sysmex Partec GmbH, Gorlitz, Německo). Pro následné analýzy byly vybrány pouze diploidní linie ječmene.
5.Detekce transgenu pomocí PCR analýzy a metody Southern blot
Z listů přibližně 4 měsíce starých rostlin ječmene TO, resp. TI generace byla izolována genomová DNA. Integrace transgenu byla ověřena na genomové úrovni metodou konvenční PCR s využitím vždy alespoň dvou sad genově specifických primerů. U všech linií byla ověřována přítomnost hptll genu (5'-CGAAAAGTTCGACAGCGTC-3' a 5'-GGTGTCGTCCATCACAGTTTG-3'), jenž byl součástí komerčních pBRACT vektorů (Obr. 2, Obr. 3, Obr. 4, Obr. 5). Dále byla v závislosti na charakteru použitého konstruktu detekována přítomnost B1 hordeinového promotoru (B-HORp) společně s LL-37 genem (5'-TCCATTCTTGTTTCAGGCTAAC-3' a 5’GCCGATCTTCTCCTTGGACTT-3'; Obr. 2), ubikvitinového promotoru (UBIp) společně s LL37 genem (5'-TGCTCACCCTGTTGTTTGGTGTTAC-3'a5'GCCGATCTTCTCCTTGGACTT-3'; Obr. 3), ječmenného trypsin inhibitorového promotoru a PEX genu (5’-CCAGCTGCTTGTTCACTTCACA-3'a 5'CTTCTTCAGGATCTTCACGAAGG-3'; Obr. 4), případně ovesného globulinového promotoru a HBD2 genu (5’-AGGAGTCACAAGTGCCACAAAC-3' a 5’-CACGTGCCGATCTGCTTGT-3'; Obr. 5). Jako negativní kontrola sloužila gDNA z listů kontrolních WT rostlin a jako pozitivní kontrola byla použita plasmidová DNA s jednotlivými geny.
U vybraných transgenních linií TO generace selektovaných jako pozitivní pomocí PCR analýzy byl určen počet kopií insertu metodou Southern blot s využitím DNA sondy komplementární k hpt II genu. 40 p,g genomové DNA bylo štěpeno pomocí enzymu Xhol (New England Biolab), získané fragmenty byly smíchány s nanášecím pufrem DNA Gel Loading Dye (Thermo Fisher Scientific), separovány pomocí gelové elektroforézy (0,8% agarosa) a přeneseny na nylonovou membránu BLOTTING-Nylon 66 Membranes, type b, positive for Northern/Southern blotting (Merck, Kenilworth, NJ, USA). Jako standard molekulových hmotností sloužil DNA Molecular Weight Marker Digoxigenin-labeled 0,12-23,1 (Merck). Následně byla syntetizována digoxygeninem značená DNA próba specifická pro hptll gen s využitím genově specifických primerů 5'-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC-3'a5'-ACATTGTTGGAGCCGAAATC-3'. Jako templát sloužil prázdný plasmid pBRACT207. K syntéze próby byl použit DIG Probe Synthesis Kit (Roche, Basilej, Švýcarsko). K hybridizaci imobilizovaných fragmentů sloužil komerční kit DIG-EasyHyb (Roche). Pro detekci fragmentů gDNA s navázanou próbou byla použita protilátka anti-Digoxigenin-AP Fab fragments (Roche) a následně roztok chemiluminiscenčního substrátu CSPD (3-(4-metoxyspiro {l,2-dioxetan-3,2'- (5'-chloro)tricyklo [3.3.1.13,7]dekan}-4-yl)fenyl
-28 CZ 2017 - 553 A3 fosfát sodný, Roche).
Bylo zjištěno, že většina linií obsahovala více než jednu kopii příslušné integrované T-DNA (Obr. 6). Jak konstitutivní, tak i zrnově specifická exprese antimikrobiálního peptidů neměla negativní vliv na fenotyp, rychlost vývoje či fertilitu modifikovaných linií ječmene bez ohledu na počet integrací transgenů (Obr. 7).
Pro odvození TI generace byly vybrány linie, které byly pozitivní na detekované transgeny s využitím obou sad genově specifických primerů (PCR analýza) a současně i pomocí metody Southern blot. U TI generace byla následně monitorována strukturní a funkční stabilita jednotlivých transgenů.
Příklad 2: Studium exprese trangenní DNA
1. Analýza na úrovni RNA
U GMO linií ječmene exprimujících derivát lidského beta-defensinu 2 (HBD2), resp. derivát antimikrobiálního peptidů magaininu 2 Xenopus laevis pexiganan (PEX) byl relativně kvantifikován počet transkriptu transgenů v kořenech, listech, či zrnech ve 3 různých vývojových stádiích klasifikovaných dle Makrofenologické stupnice pro obilniny BBCH jako 73, 85 a 87 (neboli stádium raně mléčné, voskové a žluté zralosti). RNA byla izolována pomocí kitu RNAqueous® (Thermo Fisher Scientific) a po ošetření Turbo DNAsou (Thermo Fisher Scientific) byla vyčištěna prostřednictvím magnetických kuliček (Agencourt RNA-CLEAN XP, Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Následoval přepis do cDNA pomocí reverzní transkriptasy RevertAid H Minus M-MULV (Thermo Fisher Scientific).
Exprese transgenů HBD2, resp. PEX byla relativně kvantifikována pomocí SYBR® Green (v případě HBD2), resp. TaqMan® (v případě PEX) chemie s využitím real-time PCR systému (ViiA 7, Thermo Fisher Scientic). Genově specifické primery byly navrženy pomocí programu Primer Express 3.0. Jako endogenní kontrola sloužily geny pro ječmenný P-aktin (Act), ječmenný cyklofilin (CYCLO) a elongaění faktor 2 (EF2). Seznam použitých primerů shrnuje Tabulka 1.
U všech analyzovaných linií byla detekována transgenní RNA v zrnech ve všech vývojových stádiích, přičemž průměrné relativní množství transkriptu transgenů v tomto pletivu bylo vždy výrazně vyšší vzhledem k množství transgenní RNA v listech či kořenech (Obr. 8). Z Obrázku 8 je dále patrné, že exprese transgenů řízena jeěmenným endogenním promotorem pro trypsin inhibitorový protein je mírně zvýšena také v kořenech, zatímco ovesný globulinový promotor se zdá být výrazně zrnově specifický a v listech byla detekována jen velmi slabá exprese na úrovni šumu.
Tabulka 1: Sekvence použitých primerů pro qRT-PCR analýzu
Název Cílový gen Sekvence forward primem (5'— 3') Sekvence reverse primem (5—J') Sekvence próby (5*—Γ) Chemie
ER elongaCni faktor 2 AAGTCCTGCCGCACTGTCAT GGGCGAGCTTCCATGTAAAG AGCAAGTCCCOCAACAAGCaTAACCG TaqMan
ACT akhn TGTTGACCTCCAAAGG AAGCT ATT GGTGCAAGACtTTGCTGTTGA TGTAGTATTCAGCTGGTTGGTGGCACAGC TaqMan
CYCLO cyklofilin TGTCT ATGG ATTTGA C ACCA CTCTTT GAAGCCTGCCCGAAGCA TG ACCTGTTTTtTTTCGC AC ACC AGCC TaqMan
HBD2 defensui AAGTCTGGCGCCATTTGC CACGTGCCGATCTGCTTGTA ACCCAGTGTTCTGCCCAAGGCG TaqMan
ER eloiigaOil faktor 2 CCGCACTGTCATGAGCA AGT GGGCGAGCTTCCATGTAAAG SYBR Green
ACT aktin TTG A < /CTCC.AA AGGAAGCT ATTCT GGTGCAAGACtTTGCTGTTGA SYBR Green
HvCYCLO cyklofilin CC< /AGTTCT At: AT A ACC AC AAT< / AA ACCtTTGCCAAAGACTACATGCT SYBR Green
PEX pexiganan AAGTTCCTC.AAGAAGGCCAAGAA (TTTCTTCAGGATCTTCACGAAGG SYBR Green
-29CZ 2017 - 553 A3
2. Analýza na proteinové úrovni
2.1 Purifikace rekombinantních LL-37 produktů
Po homogenizaci kořenů, listů či mléčně zralých zrn ječmene byl k rostlinnému materiálu přidán extrakční pufr 0,1 moll1 Tris-HCl, 0,3 moll1 chlorid sodný, 0,01 moll1 imidazol, 4% (v/v) glycerol, 0,3% (w/v) Triton X-100, EDTA free koktejl inhibitorů proteas (Roche), pH 8,0, a vzorky byly inkubovány po dobu 2 hodin při 4 °C. Po centrifugaci při 12 000 g / 30 minut / 4 °C byl odebrán supernatant a pelet byl následně re-extrahován stejným způsobem. Poté byly spojené extrakty purifikovány pomocí imobilizované metal-chelatační afinitní chromatografie (IMAC) s využitím chromatografických kolonek naplněných Co -IDA-agarosou (Qiagen, Germantown, MR, USA). Eluce navázaných proteinů byla provedena 400mM imidazolem, přičemž součástí promývacího ani elučního pufřu nebyl Triton X-100. Závěrem byly extrakty promyty v poměru 1:5 (v/v) pomocí 5mM NH4HCO3 (pH 8,0) a zahuštěny na požadovaný finální objem pomocí membránových filtrů Amicon.
2.2 Proteolytické odštěpení fúzních kotev
Součástí chimérických genů ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-37_KDEL a ZmCKXl sp_(GGGGS)2_6xHis_ (GGGGS)2_LL-37 byla sekvence kódující restrikční místo rozpoznávané enterokinázou. V případě ZmCKXl sp_6xHis _MBP_LL-37_KDEL genu se daná sekvence nacházela mezi kódující sekvencí pro MBP a LL-37 a jedním ze štěpných produktů byl tedy LL-37_KDEL (Obr. 9A), v případě ZmCKXlsp_(GGGGS)2_6xHis_ (GGGGS)2_LL-37 genu se sekvence nacházela za flexibilní spojovací sekvencí (GGGGS)? a LL-37 a jedním ze štěpných produktů byl LL-37 (Obr. 9C). K proteolytickému odštěpení fúzních kotev z rekombinantního peptidu LL-37 byla použita enterokinasa (New England Biolabs). Purifikované proteinové vzorky byly promyty v poměru 1:5 (v/v) pufřem pro enterokinasu (20 mmoll1 Tris- HC1, 50 mmoll1 chlorid sodný, 2 mmoll1 chlorid vápenatý, pH 8,0) a následně k nim byl přidán enzym v poměru 1:30 (v/v). Po proběhnutí proteolytického štěpení při 23°C po dobu 16 hodin byly vzorky promyty v poměru 1:5 (v/v) pomocí 5mM NH4HCO3 (pH 8,0) a zahuštěny na požadovaný finální objem pomocí membránových filtrů Amicon. Účinnost štěpení byla ověřena metodou Western blot na základě detekce nově vzniklých signálů pro příslušné peptidy, které nebyly přítomny v odpovídajících neštěpených frakcích a jejichž elektroforetická mobilita byla shodná s teoretickou velikostí štěpných LL-37 produktů (Obr. 9A, Obr. 9C).
2.3 Western blot detekce rekombinantního katelicidinu
Pro Western blot detekci (Obr. 9; Obr. 10; Obr. 11) byly jak štěpené, tak i neštěpené purifikované proteinové extrakty (400 ug) sráženy 85% acetonem a po rozpuštění ve směsi vody, nanášecího pufru (Thermo Fisher Scientific) a redukčního činidla (Thermo Fisher Scientific) byly zahřátý na 70°C po dobu 10 minut a následně elektroforeticky separovány pomocí komerčně dostupného SDS-PAGE gelu Bolt 4 - 12% Bis-Tris Plus (Thermo Fisher Scientific). Po transferu na PVDF membránu Immunobilion® - P Transfer Membrane (Merck) byla provedena imunoreakce s využitím komerčně dostupné polyklonální primární protilátky proti LL-37 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) a sekundární protilátky Goat anti-rabbit (Santa Cruz Biotechnology). Ředění primární protilátky bylo v poměru 1:400 a ředění sekundární protilátky v poměru 1:1000. K blokování PVDF membrány a nanášení protilátek včetně promývacích kroků byl využit poloautomatický systém iBind™ Western system (Thermo Fisher Scientific). Množství rekombinantního peptidu LL-37 bylo kvantifikováno pomocí programu Image Lab™ Software, kdy byla nejdříve sestavena pětibodová kalibrační křivka závislosti intenzity signálu na koncentraci syntetického peptidu LL-37 a následně bylo určeno množství LL-37 pro jednotlivé linie.
Metodou Western blot byla prokázána funkčnost použitých expresních vektorů. Nezávisle na
-30CZ 2017 - 553 A3 charakteru použitého konstruktu bylo možné detekovat rekombinantní LL-37 v zrnech transgenních linií (Obr. 9; Obr. 10; Obr. 11) s tím, že linie se zrnově specifikou expresí LL-37 akumulovaly větší množství antimikrobiálního peptidu v obilkách než linie, v nichž byla exprese řízena kukuřičným ubikvitinovým promotorem, který je považován za středně silný promotor pro použití v obilovinách. Z toho důvodu můžeme BI hordeinový promotor považovat za vhodný promotor pro expresi cílového genu v zrnech jednoděložných rostlin za účelem molekulárního farmaření (Tab. 2).
Tabulka 2: Přibližné množství antimikrobiálního peptidu LL-37 v mléčně zralých transgenních obilkách ječmene TI generace; Bl-HORp: exprese řízena ječmenným BI hordeinovým promotorem; UBIp: exprese řízena kukuřičným ubikvitinovým promotorem; N.D.: nebylo detekováno
chimérický LL-37 gen množství LL-37 (pmol) v 1 zrně
Bl-HORp UBIp
Zrn CKX1 spJGGGGS )2_6xHis_(GGGGS )2_LL-37 1,533 N.D.
ZmCKXlsp_LL-37_KDEL 4,000 0,100
ZmCKXlsp_6xHis_MBP_LL-3 7KDEL 0,011 0,006
OsChtlsp His LL-37 0,688 linie nebyly připraveny
Pro kvantifikaci LL-37 sloužil program Image Lab™ Software, pomocí něhož byla určena závislost intenzity signálu na koncentraci syntetického peptidu LL-37. rekombinantních variant peptidu LL-37 a samotného LL- 37.
U linií exprimujících rekombinantní katelicidin pod kontrolou konstitutivního ubikvitinového promotoru bylo možné detekovat chimérickou variantu LL-37 dále také v kořenech či listech (Obr. 11).
2.4 In situ imunodetekce rekombinantního katelicidinu ve zralých zrnech ječmene
Za účelem bližší charakterizace jednotlivých linií byla provedena imunolokalizace rekombinantního katelicidinu ve zralých zrnech TI generace dle publikovaného protokolu (Qu LQ, Tada Y, Takaiwa F. (2003) Plant Cell Rep. 22, 282-285). Modifikace spočívaly v prodlouženém blokování (4 hodiny) a použití 5% hovězího sérového albuminu (BSA) v TBS pufru (w/v), dále v inkubaci s primární protilátkou proti LL-37 (Santa Cruz Biotechnology) při použitém ředění 1:40 (v/v) v TBS pufru s obsahem 2,5% (w/v) BSA. Jako sekundární protilátka sloužila Goat anti-rabbit (Merck), která byla naředěna 1:2 500 (v/v) v TBS pufru s obsahem 2,5% (w/v) BSA. Inkubace se sekundární protilátkou probíhala 1,5 hodiny při 37°C a následně 1.5 hodiny při laboratorní teplotě. Pro kolorimetrickou detekci LL-37 sloužil NBT/BCIP (nitrotetrazoliová modř/5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfát) substrát pro alkalickou fosfatasu (Merck), se kterým byly vzorky inkubovány po dobu 30 minut. Reakce byla zastavena výměnou substrátu za sterilní vodu. Pro pořízení snímků sloužil stereomikroskop Nikon SZM800.
Pozitivní reakce na přítomnost LL-37 peptidu se projevila zbarvením endospermu všech analyzovaných linií (Obr. 12). Krom fialového zbarvení endospermu bylo možné pozorovat také zbarvení embrya jednotlivých linií, které ovšem nemůže být přičítáno specifické detekci LL-37, neboť obdobný signál poskytla také zrna kontrolních WT linií ječmene.
Přibližn
-31 CZ 2017 - 553 A3
2.6 In situ imunodetekce varianty antimikrobiálního peptidu pexigananu a derivátu lidského beta-defensinu 2 ve zralých zrnech ječmene
Metodou imunolokalizace byla dále prokázána přítomnost derivátu antimikrobiálního peptidu pexigananu (PEX) a lidského beta-defensinu 2 (HBD2) ve zralé ječmenné obilce. Z metodologického hlediska byla imunolokalizace provedena stejným způsobem, jako tomu bylo v případě detekce rekombinantních LL-37 produktů (viz. bod 5). Pro detekci PEX sloužila králičí polyklonální primární protilátka, která byla na zakázku syntetizována firmou EXBIO Praha (Vestec, Česká republika) a jako sekundární protilátka byla použita Goat anti-rabbit (Merck). V případě detekce HBD2 sloužila jako primární protilátka monoklonální protilátka proti HBD2 původem z myši (Abeam, Cambridge, Velká Británie) a jako sekundární protilátka byla použita Goat anti-mouse (Merck). Použité ředění primárních a sekundárních protilátek bylo stejné jako v případě detekce LL-37.
Pozitivní reakce na přítomnost HBD2 a PEX se projevila zbarvením endospermu všech analyzovaných linií (Obr. 13). V případě detekce pexigananu bylo možné pozorovat také nespecifické zbarvení embrya jednotlivých linií (stejně jako při detekci LL-37), zatímco při detekci HBD2 byl signál pozorovaný pouze v endospermu. Rozdíly mohou být přičítány rozdílné specifitě použitých protilátek.
Příklad 3: In vitro testování antimikrobiální aktivity rekombinantních peptidů
Antimikrobiální aktivita rekombinantních LL-37 produktů byla testována vůči bakterii E. coli kmene TOP10. Nejdříve byla čerstvě napěstována bakteriální kultura v tekutém Luria-Bertani médiu (LB) bez obsahu antibiotik. Z kultury v exponenciální fázi růstu byly za aseptických podmínek odebrány bakterie a přidány k 10 pl purifikovaných vzorků proteinů v 5mM NH4HCO3 (množství proteinů v jednotlivých vzorcích bylo přibližně 10 pg). Konečná koncentrace bakterií odpovídala hustotě 1x107 CFU/ml („colony forming unit“ na mililitr). Vzorky byly za neustálého míchání (1000 rpm) inkubovány 4 hodiny ve sterilních mikrozkumavkách při 37 °C, rovnoměrně rozetřeny na LB médium s agarem bez antibiotik a následně inkubovány po dobu 24 hodin při 37 °C. Poté byl na jednotlivých miskách určen počet kolonií a výsledek byl použit pro výpočet hodnoty CFU/ml. Testování antimikrobiální aktivity bylo provedeno minimálně ve dvou nezávislých experimentech, při kterých byly připraveny vždy čerstvé proteinové extrakty. Každý biologický vzorek byl nastaven ve 3 technických opakováních. Jako pozitivní kontrola sloužil syntetický peptid LL-37 (LifeTein LLC, Hillsborough, NJ, USA) aplikovaný v různých koncentracích k purifikovanému extraktu z kontrolních netransgenních linií.
Bylo zjištěno, že heterologně produkovaný peptid LL-37 bez přídavných sekvencí vykazuje antimikrobiální vlastnosti (Obr. 14), a to přibližně se stejnou účinností jako jeho peptidická varianta s navázanou C- koncovou KDEL sekvencí (SEQ ID NO. 24). Dále bylo zjištěno, že je antibakteriální aktivita peptidu zachována také v případě, pokud je na N- konec katelicidinu LL37 navázána histidinová kotva, a to samotná (SEQ ID NO. 25), anebo ohraničená z obou stran spojovací sekvencí GGGGS (SEQ ID NO. 26) a pro biologickou aktivitu není tedy nezbytně nutné její odštěpení pomocí finančně nákladné proteasy.

Claims (12)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy, vyznačený tím, že se do genomu ječmene vloží nukleotidová sekvence obsahující sekvenci kódující Nterminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující alespoň jeden zvířecí antimikrobiální
    -32CZ 2017 - 553 A3 peptid, s výhodou peptid ze skupiny katelicidinů, defensinů a magaininů; s výhodou se sekvence vloží pomocí bakterie Agrobacterium tumefaciens.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že nukleotidová sekvence dále obsahuje jednu nebo více sekvencí vybraných ze skupiny zahrnující: sekvenci kódující C-terminální peptid pro retenci na endoplasmatickém retikulu; sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein, restrikční místo rozpoznávané proteázou, např. enterokinázou, DAMP4 biosurfaktantní protein, SUMO nebo SUMOstar peptid.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že antimikrobiálním peptidem je peptid ze skupiny katelicidinů, s výhodou rekombinantní lidský katelicidin LL-37; neboje antimikrobiální peptid vybrán z beta-defensinu 2 a pexigananu.
  4. 4. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že N-terminálním signálním peptidem je N-terminální transientní signální peptid kukuřičné cytokinin oxidasy/dehydrogenasy 1 nebo N- terminální signální peptid rýžové chitinasy 1.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že nukleotidová sekvence je vybraná ze skupiny sekvencí majících alespoň 80%, výhodněji alespoň 90%, identitu se sekvencemi SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3., SEQ ID NO 4, výhodněji je nukleotidová sekvence vybrána ze skupiny sekvencí SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO 3., SEQ ID NO 4.
  6. 6. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že vložená nukleotidová sekvence je řízena zrnově specifickým nebo konstitutivním promotorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je B1 hordeinový promotor, jeěmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor.
  7. 7. Expresní kazeta, vyznačená tím, že obsahuje promotor, nukleotidovou sekvenci a terminátor; přičemž nukleotidová sekvence obsahuje sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující zvířecí antimikrobiální peptid, a popřípadě dále jednu nebo více sekvencí vybraných ze skupiny zahrnující: sekvenci kódující C-terminální sekvenci pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu; sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein; restrikční místo rozpoznávané proteázou, např. enterokinázou, DAMP4 biosurfaktantní protein, SUMO nebo SUMOstar peptid; a promotorem je zrnově specifický nebo konstitutivní promotor, zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je B1 hordeinový promotor, jeěmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor; a terminátorem je s výhodou NOS terminátor.
  8. 8. Expresní kazeta podle nároku 7, vyznačená tím, že má sekvenci s alespoň 80% identitou k sekvenci vybrané ze skupiny zahrnují SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 21, SEQ ID NO. 22, SEQ ID NO. 23.
  9. 9. Rostlina ječmene, vyznačená tím, že obsahuje v genomu nukleotidovou sekvenci obsahující sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující zvířecí antimikrobiální peptid, a popřípadě dále jednu nebo více sekvencí vybraných ze skupiny zahrnující: sekvenci kódující C-terminální sekvenci pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu; sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein; restrikční místo rozpoznávané proteázou, např.
    -33 CZ 2017 - 553 A3 enterokinázou, DAMP4 biosurfaktantní protein, SUMO nebo SUMOstar peptid; s výhodou pod kontrolou promotoru vybraného ze skupiny zahrnující zrnově specifický nebo konstitutivní promotor, zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je B1 hordeinový promotor, ječmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor.
  10. 10. Obilka ječmene, vyznačená tím, že obsahuje rekombinantní zvířecí antimikrobiální peptid, s výhodou rekombinantní peptid ze skupiny katelicidinů, defensinů a magaininů, výhodněji vybraný ze skupiny zahrnující rekombinantní lidský katelicidin LL-37, beta-defensin 2 a pexiganan.
  11. 11. Chimérické peptidické varianty LL-37 vykazující antimikrobiální účinky vůči gramnegativním bakteriím, vybrané ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID NO 24., SEQ ID NO 25. a SEQ ID NO 26.
  12. 12. Způsob přípravy rekombinantních zvířecích antimikrobiálních peptidů, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky: poskytnutí rostliny ječmene obsahující v genomu nukleotidovou sekvenci obsahující sekvenci kódující N-terminální signální peptid z jiné rostliny než ječmene pro translokaci peptidu skrz endoplasmatické retikulum, a sekvenci kódující zvířecí antimikrobiální peptid, a popřípadě dále jednu nebo více sekvencí vybraných ze skupiny zahrnující: sekvenci kódující C-terminální sekvenci pro retenci peptidu na endoplasmatickém retikulu; sekvenci kódující alespoň jednu stabilizační a/nebo purifikační značku, jako jsou například histidinová kotva, maltózu vázající protein; restrikční místo rozpoznávané proteázou, např. enterokinázou, DAMP4 biosurfaktantní protein, SUMO nebo SUMOstar peptid; s výhodou pod kontrolou promotoru vybraného ze skupiny zahrnující zrnově specifický nebo konstitutivní promotor, zvláště výhodnými promotory jsou ubikvitinový promotor, promotor řídící expresi přednostně v obilce jako je B1 hordeinový promotor, ječmenný promotor inhibitoru trypsinu či ovesný globulinový promotor; pěstování rostliny ječmene do vytvoření obilek, případně do dozrání obilek, izolace rekombinantního zvířecího antimikrobiálního peptidu nebo jeho chimérické varianty z obilek ječmene.
CZ2017-553A 2017-09-18 2017-09-18 Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy CZ309487B6 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017-553A CZ309487B6 (cs) 2017-09-18 2017-09-18 Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy
EP18782634.2A EP3684936B1 (en) 2017-09-18 2018-09-12 Method of production of barley plants producing antimicrobial peptides
PCT/CZ2018/050048 WO2019052588A1 (en) 2017-09-18 2018-09-12 PROCESS FOR PRODUCING BARLEY PLANTS PRODUCING ANTIMICROBIAL PEPTIDES

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2017-553A CZ309487B6 (cs) 2017-09-18 2017-09-18 Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2017553A3 true CZ2017553A3 (cs) 2019-03-27
CZ309487B6 CZ309487B6 (cs) 2023-02-22

Family

ID=63787646

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2017-553A CZ309487B6 (cs) 2017-09-18 2017-09-18 Způsob přípravy rostlin ječmene produkujících antimikrobiální peptidy

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP3684936B1 (cs)
CZ (1) CZ309487B6 (cs)
WO (1) WO2019052588A1 (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113980112B (zh) * 2021-11-25 2024-01-26 中国科学院昆明动物研究所 一种眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30的表达载体和表达产物及其构建制备方法
WO2024166076A1 (en) * 2023-02-10 2024-08-15 King Abdullah University Of Science And Technology Recombinant production of antimicrobial peptides in planta

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090156486A1 (en) * 2005-12-15 2009-06-18 Ning Huang Production of human defensins in plant cells
US20100048480A1 (en) * 2006-11-22 2010-02-25 Bettina Bommarius Production of anti-microbial peptides

Also Published As

Publication number Publication date
WO2019052588A1 (en) 2019-03-21
EP3684936A1 (en) 2020-07-29
EP3684936B1 (en) 2023-12-06
CZ309487B6 (cs) 2023-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Deo et al. Strategies for improving antimicrobial peptide production
JP6087277B2 (ja) タンパク顆粒誘導ポリペプチド配列
AU2015333924B2 (en) Copi coatomer delta subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
US6448391B1 (en) Ubiquitin-lytic peptide gene promoter
US20200224214A1 (en) Copi coatomer alpha subunit nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
KR20130130806A (ko) 딱정벌레목 해충에 대한 저항성을 부여하는 핵산 분자
AU2015255995B2 (en) Dre4 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
KR20130130805A (ko) Ｒｈｏ１ 소형 ｇｔｐ-결합 단백질을 표적화하고 딱정벌레목 해충에 대한 저항성을 부여하는 핵산 분자
US20210115467A1 (en) Ras opposite (ROP) and related nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and/or hemipteran pests
TW201625790A (zh) 賦予對鞘翅目及半翅目害蟲之抗性的ＣＯＰＩ外被體β次單元核酸分子
JPH03247220A (ja) 植物の殺虫性トキシン
KR20130130804A (ko) 공포 ａｔｐａｓｅ ｃ 서브유닛을 표적화하고 딱정벌레목 해충에 대한 저항성을 부여하는 핵산 분자
US20030056244A1 (en) Feed additive compositions and methods
CN102796187A (zh) 基于RNAi技术防治害虫的新方法
AU2014369014B2 (en) RNAPII-140 nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran pests
TW201623612A (zh) 授予對鞘翅目及半翅目害蟲之抗性的ｓｅｃ２３核酸分子
Shams et al. Production of a recombinant dermaseptin peptide in nicotiana tabacum hairy roots with enhanced antimicrobial activity
TWI664193B (zh) 植物轉錄活化交互作用之模體（ｍｏｔｉｆ）及其用途
EP3684936B1 (en) Method of production of barley plants producing antimicrobial peptides
TW201708541A (zh) 控制昆蟲害蟲之ｓｐｔ５核酸分子
Ashraf Ashfaq et al. Ricin and RCA—the enemies within castor (Ricinus communis L.): a perspective on their biogenesis, mechanism of action, detection methods and detoxification strategies
WO2023044312A1 (en) Antimicrobial cancr peptide variants
Jo et al. High-yield production of functional human lactoferrin in transgenic cell cultures of siberian ginseng (Acanthopanax senticosus)
US10344298B2 (en) WUPA nucleic acid molecules that confer resistance to coleopteran and hemipteran pests
Tanavar et al. Enhancement of recombinant human keratinocyte growth factor 1 protein production in transgenic hazelnut (Corylus avellana L.) plant cell suspension cultures under RAmy3D inducible promoter