KR100583467B1 - 트레일 변이체를 포함하는 암세포 사멸용 아데노부속바이러스 유전자 전달체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 트레일 변이체를 포함하는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 전달체, 상기 바이러스 전달체를 형질도입한 세포 및 상기 바이러스 전달체를 이용하여 암세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 전달체는 트레일을 세포외로 효과적으로 분비시키고, 세포사멸 활성이 높으며, 장기간 발현시킬수 있기 때문에 암세포를 사멸시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

트레일 변이체를 포함하는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 유전자 전달체{Adeno-associated virus vector containing a trail mutant for death of cancer cell}

도 1은 본 발명에 따른 트레일 변이체(ITRAD)가 야생형 트레일(TRAIL)보다 효과적으로 세포를 사멸시킬 수 있음을 보여주는 모식도이다.

도 2는 본 발명에 따른 트레일 변이체를 제작하는 과정 및 아데노부속 바이러스 유전자 전달체를 생산하는 ITR을 발현하는 벡터에 트레일 변이체를 도입하여 pTR-ITRAD 벡터를 제조하는 과정을 보여주는 모식도이다.

도 3은 본 발명의 AAV-ITRAD 유전자 전달체를 생산하는 세포주인 293 CrmA 세포를 제조하기 위해 CrmA를 발현하는 벡터(pcDNA3FCrmA)를 제조하는 과정 및 이 벡터를 도입하여 제조된 293 CrmA 세포주가 CrmA를 발현함을 웨스턴 블랏으로 분석한 사진이다.

도 4a는 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 pTR-ITRAD 벡터 및 야생형 트레일을 발현하는 pTR-TRAIL 벡터의 유전자 구성을 나타낸 모식도이다.

도 4b는 야생형 트레일을 발현하는 pTR-TRAIL 벡터를 293 CrmA 세포에 도입시켰을 때 TRAIL 단백질이 발현되고 세포 밖으로 분비되는지 확인한 웨스턴 블랏 분석 사진이다.

도 4c는 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 pTR-ITRAD 벡터를 293 CrmA 세포에 도입시켰을 때 트레일 변이체가 발현되고 세포 밖으로 분비되는지 확인한 웨스턴 블랏 분석 사진이다.

도 4d는 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 pTR-ITRAD 벡터를 293 CrmA 세포에 도입시켰을 때 트레일 변이체가 트라이머를 형성하는지 확인한 젤 분석 사진이다.

도 5는 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 pTR-ITRAD 벡터를 293 세포주 및 293 CrmA 세포주에 형질도입하고 16시간이 지난 후에 세포사멸 효과를 확인한 현미경 사진이다.

도 6은 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 pTR-ITRAD 벡터를 293 CrmA 세포주에 형질도입시킨 후 얻은 배양액으로 각종 암세포주에 처리하였을때의 세포사멸 효과를 확인한 현미경 사진이다.

도 7은 본 발명의 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체(AAV-ITRAD)를 다양한 암세포에 감염시킨 후 세포 사멸효과를 확인한 크리스탈 바이올렛 염색 사진이다.

도 8은 본 발명의 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체(AAV-ITRAD)를 293 세포 및 골육종 세포(U20S)에 감염시킨 후 ITRAD 단백질의 발현을 웨스턴 블랏 분석한 사진이다.

도 9는 A549 폐암 세포주가 이식된 생쥐 종양괴에 본 발명의 AAV 유전자 전 달체(AAV-ITRAD)를 직접 주입한 후 시간에 따른 암의 크기를 측정한 항암 효능 분석 그래프이다.

도 5 내지 도 9에서 AAV-LacZ는 본 발명의 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체의 세포사멸 효능을 비교 검증하기 위한 대조군 발현벡터로 LacZ를 발현하는 AAV 유전자 전달체이다.

본 발명은 암세포 사멸용 바이러스 유전자 전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 트레일 변이체를 포함하는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 유전자 전달체 및 상기 유전자 전달체를 이용하여 암세포를 사멸시키는 방법에 관한 것이다.

최근 유전자 조작 기술의 발달로 인해 생체 내에 존재하는 유전자를 이용한 유전자 치료 방법(gene therapy)이 종양을 비롯한 여러 가지 난치성 질환을 치료하는데 각광을 받고 있다. 유전자 치료는 각종 질환들의 치료유전자를 유전자 전달체를 이용하여 세포내로 주입, 발현시켜 질병을 치료하는 기술이다.

치료 유전자를 생체내로 효과적으로 전달할 수 있는 유전자 전달체로서 아데노 바이러스(adeno virus), 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus: 이하 "AAV"라 약칭함) 및 레트로 바이러스(retro virus)에서 유래한 유전자 전달체와, 비 바이러스성 유전자 전달체 등이 있다. 이중에서 AAV 유전자 전달체는 비병원성 인체 바이러스에서 유래한 전달체로서 안전하며, 세포성 면역반응을 유도하지 않고, 광범위한 숙주범위를 가지며, 비 분열세포 및 분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 특히 AAV 유전자 전달체에 의해 전달된 유전자의 발현은 생체내에서 장기간 유지된다는 특징이 있다 (Conrad et al., Gene Ther., 8, 658-668, 1996; Kessler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 24, 14082-14087, 1996).

암은 다양한 원인에 의해 발생하는 유전적 질환의 일종으로 종래에는 화학요법, 방사선 요법, 면역요법, 외과적 수술을 통해 치료하였으나, 현재는 상기 방법에 의해서도 치료가 가능하지 않는 경우가 빈번하고, 종래의 항암요법이 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 주는 등의 부작용이 심각하다는 것은 주지의 사실이다. 따라서, 보다 효과적이고 부작용이 적은 새로운 암 치료기술의 개발이 절실한 상황이다.

대장암, 폐암, 유방암, 전립선암, 흑색종 및 임파암과 같은 대부분의 암세포는 트레일(trail)에 대한 세포사멸 수용체(death receptor)를 갖고 있어 세포 사멸이 유도되나(Wiley, S. R. et al., Immunity, 3, 673-682, 1995), 정상세포는 사멸 신호를 유도할 수 없는 미끼 수용체(decoy receptor)를 가지고 있어 활성을 가진 트레일과 결합하더라도 세포가 사멸되지 않는다(도 1, Walczak H et al., Nat. Med., 5, 157-163, 1999; Ashkenazi A., J. Clin. Investig., 104, 155-162, 1999).

트레일은 정상세포에는 손상을 주지 않고 다양한 종류의 암세포의 사멸을 선택적으로 유도할 수 있어 트레일 단백질을 이용하여 암을 치료하는 기술이 개발되고 있다. 그러나, 트레일 단백질의 혈장내 반감기는 1.3시간에 불과하고 5시간 내에 신체에서 소진된다. 이런 이유로 트레일 단백질을 치료제로 사용할 경우 의미있는 항암효과를 유도하기 위하여 고용량을 반복적으로 투여하여야 하는 불편함이 존재한다. 이러한 문제를 극복할 수 있는 방법은 트레일 유전자의 생체내 전달을 통하여 항암효과를 유도하는 기술을 개발하는 것이다. 이를 위하여 야생형의 트레일 유전자를 함유한 아데노바이러스 유전자 전달체가 제작되어 항암효능을 조사한 결과 생쥐 종양모델에서 효과적인 것으로 보고되었다(Armeanu S et al., Cancer Research, 63, 2369-2372, 2003; Huang X et al., Gene Ther., 9, 1379-1386, 2002). 그러나, 아데노바이러스 유전자 전달체라 하더라도 모든 종양세포에 트레일 유전자를 전달할 수 없으므로 암 세포의 일부에만 트레일 단백질이 발현되게 되고, 세포밖으로 분비되지 않기 때문에 그 효능이 제한적일 수 있다. 또한, 그 발현이 일회적이어서 반복적인 투여가 필요한데, 이 경우 아데노바이러스 유전자 전달체의 강한 체액성 면역반응에 기인하여 반복투여의 효율이 저하될 수 있다.

따라서, 야생형 트레일 유전자를 개량하여 세포 밖으로 분비되게 하고, 활성이 강한 트레일 변이체를 암의 유전자 치료에 적용하는 것이 현재 해결되어야 할 중요한 문제로 남아 있다. 이를 위하여 활성이 있는 트레일을 분비되게 하려는 시도가 있었으나, 성공적이지 않았고, 다만 리더서열(leader sequence)을 포함하는 다른 이종 단백질과 융합한 융합 단백질 형태로서 분비 가능하도록 하였다(Wu, X and Huang, H., Mol. Ther., 3, 368-374, 2001). 그러나, 상기와 같은 경우 융합단백질의 형태로 트레일 단백질이 세포 밖으로 분비되므로 그 활성이 낮다.

또한, 트레일의 C-말단 수용기 결합 도메인이 암 세포사멸에 대한 영향이 크다는 것이 밝혀졌다(Kim CH and Gupta S., Int. J. Oncol., 16, 1137-1139, 2000). 그러므로, 세포사멸의 효과를 보유하는 트레일을 만들기 위해서는 N 말단의 일부분을 제거하고, 95번부터 281번까지의 아미노산 서열을 이용하는 것이 바람직하였으며, 또 트레일의 수용체에 결합할 때 활성화 형태인 트라이머 형성을 위해서 95번 아미노산 앞 부분에 이소루이신 지퍼(isoluicine zipper)를 연결하는 것이 중요함을 보고하였다(Fanslow W et al., Semin. Immunol., 6, 267-278, 1994; Walczak H et al., Nat. Med. 5, 157-163, 1999).

이에, 효과적인 암세포 사멸 방법을 찾기 위해 노력하던 중 세포사멸 효과를 갖는 트레일 단백질을 세포외로 효과적으로 분비하고, 발현이 장기간 지속되며, 활성화 형태인 트라이머 형태로 발현되는 아데노부속 바이러스 유전자 전달체를 제조하고, 이를 암세포에 직접 전달한 결과, 우수한 암세포 사멸효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암세포 사멸 유전자 트레일의 변이체 발현용 벡터, 상기 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체 및 상기 AAV 유전자 전달체를 이용한 암세포 사멸 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 암세포 사멸 유전자 트레일의 변이체 발현용 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트레일 변이체를 함유하는 암세포 사멸용 AAV 유전자 전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 트레일 변이체를 함유하는 암세포 사멸용 AAV 유전자 전달체를 이용한 암세포 사멸 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 암세포 사멸 유전자 트레일의 변이체 발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 트레일 변이체 발현용 벡터에 포함되는 트레일의 변이체는 서열번호 13으로 기재되는 프리프로트립신 리더서열(PL, preprotrypsin leader sequence), 서열번호 8로 기재되는 이소루이신 지퍼(IZ, isoleucine zipper) 및 서열번호 5로 기재되는 트레일 활성 도메인(TRAD, trail active domain)이 연결된 염기서열(ITRAD)인 것이 바람직하다.

트레일(TRAIL)은 암세포 사멸 유전자로서, 트레일 단백질의 C 말단 수용기 결합 도메인은 암세포 사멸 기능을 하는 활성 도메인이다. 트레일 단백질이 효과적인 암세포 사멸 기능을 하기 위해서는 수용성 형태로 분비되는 것이 중요하다. 수용성 트레일을 만들기 위해서는 N 말단 일부분을 제거하여야 하며 본 발명의 트레일 변이체 제조에 사용되는 트레일 활성 도메인은 C 말단 수용기 결합 도메인인 트레일 단백질의 95번째부터 281번째 아미노산인 것이 바람직하며, 본 발명에서는 상기 트레일 활성 도메인을 코딩하는 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 사용하였다.

또한, 프리프로트립신 리더 서열은 본 발명의 트레일 단백질이 세포외로 효과적으로 분비되게 하는 신호 펩타이드이다. 기존에는 세포사멸의 효과를 보유하는 트레일을 만들기 위해 N 말단의 일부분을 제거하고, 95번부터 281번까지의 아미노산 서열을 이용하였으며, 또 트레일의 수용체에 결합할 때 활성화 형태인 트라이머 형성을 위해서 95번 아미노산 앞 부분에 이소루이신 지퍼(isoluicine zipper)를 연결하였다(Fanslow W et al., Semin. Immunol., 6, 267-278, 1994; Walczak H et al., Nat. Med. 5, 157-163, 1999). 그러나, 본 발명에서는 이에 추가로 활성형 트레일이 효과적으로 작용하게 하기 위해 세포외로 효과적으로 분비되게 하는 신호서열을 사용하였으며, 바람직하게는 프리프로트립신 리더 서열을 사용하였다. 즉, 세포외로 효과적으로 트레일 단백질을 분비되게 하는 서열번호 13으로 기재되는 프리프로트립신 리더 서열을 사용한 것이 본 발명의 큰 특징이다.

또한, 이소루이신 지퍼는 트레일이 수용체에 결합할 때 활성화 형태인 트라이머(trimer) 형성을 하게 하는 염기서열로서, 서열번호 8로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.

본 발명의 트레일의 변이체 발현용 벡터는 상기 트레일 변이체 및 아데노부 속 바이러스의 종결 반복부위(ITR)을 포함하는 것이 바람직하다. ITR은 DNA 복제 기원 및 바이러스의 패키지 신호를 제공하는 cis 요소로 기능하는 AAV 게놈의 각 말단을 의미하는 것으로 AAV-1, AAV-2, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7 및 AAV-8로 구성된 AAV 혈청형에 있는 ITR인 것이 바람직하며, 통상적으로 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 암세포 사멸 유전자 트레일 변이체를 발현하는 벡터를 제조하기 위해 신호 펩타이드인 서열번호 13으로 기재되는 프리프로트립신 리더서열, 트라이머 형성을 가능하게 하는 서열번호 8로 기재되는 이소루이신 지퍼와 서열번호 5로 기재되는 트레일 활성 도메인을 연결하여 트레일 변이체를 제조하고, 이를 포유동물세포에서 효과적으로 생산하게 하기 위해 pFLAG-CMV-1 발현벡터에 삽입하여 트레일 변이체 발현용 벡터를 제조하고 이를 "pFLAG-CMV-ITRAD"라 명명하였다. 또한, 상기 pFLAG-CMV-ITRAD 벡터로부터 트레일 변이체를 수득한 뒤 아데노부속 바이러스의 ITR을 가진 pTR-UF-2(Zolotukhin S et al., J Virol., 70, 4646-4654, 1996)에 삽입함으로써 프리프로트립신 리더서열, 이소루이신 지퍼, 트레일 활성 도메인 및 아데노부속 바이러스의 ITR을 포함하는 발현벡터를 제조하고 이를 "pTR-ITRAD""라 명명하였다.

또한, 본 발명은 상기 트레일 변이체를 발현하는 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 제조한 암세포 사멸용 AAV 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명의 AAV 유전자 전달체를 생산하기 위한 상기 숙주세포는 세포사멸을 억제하는 유전자를 발현하는 세포주인 것이 바람직하며, 강력한 캐스페이즈(caspase 8) 억제인자로 알려진 CrmA(cytokine response modifier A)를 발현하는 세포인 293 세포주인 것이 더욱 바람직하다. 그 이유는 AAV 유전자 전달체를 생산하는 통상의 293 세포주를 이용하여 트레일 혹은 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체를 생산하는 경우, 발현된 트레일 혹은 트레일 변이체에 의해 293 세포의 사멸이 일어나 트레일을 함유하고 있는 AAV 유전자 전달체의 생산수율이 급격히 저하되는 반면에 트레일에 의한 세포사멸활성을 억제하는 CrmA 유전자를 발현하는 293 CrmA 세포주를 사용하여 트레일 혹은 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체를 생산할 경우 AAV 유전자 전달체의 생산수율이 293 세포주보다 향상되기 때문이다.

본 발명에서는 상기 트레일 변이체를 발현하는 벡터(pTR-ITRAD)를 293 혹은 293 CrmA 세포주에 형질도입한 결과, 상기 293 세포주는 세포사멸이 유도되나 293 CrmA 세포주는 세포사멸이 유도되지 않는 것을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 상기 293 CrmA 세포주의 세포 배양액을 다양한 암세포에 처리한 결과, 암세포의 사멸이 유도됨 확인하였다(도 6 참조). 따라서, 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 벡터를 형질도입한 293 CrmA 세포주에서 생산되는 AAV 유전자 전달체는 세포사멸 유도 효과가 뛰어남을 확인하여 이를 "AAV-ITRAD"라 명명하였고 293 CrmA세포주는 트레일, 트레일 변이체를 함유하는 AAV 유전자 전달체 또는 세포의 독성을 유도하는 유전자(예, 암세포괴사인자 알파(tumor necrosis factor alpha), 혹은 파스 리간드(FAS ligand))를 함유하는 AAV 유전자 전달체를 생산할 때 효과적으로 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 트레일 변이체를 발현하는 AAV 유전자 전달체를 이용하여 암세포를 사멸시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 AAV 유전자 전달체를 이용하여 세포를 사멸시킬 수 있는 암세포는 폐암 세포, 자궁암, 췌장암, 골육종 및 간암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 반드시 상기 암세포에만 국한되는 것은 아니고 트레일에 의해 사멸되는 각종 암세포에 적용하여도 무방하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 트레일 변이체 발현 벡터(pTR-ITRAD)를 형질도입한 293 CrmA 세포에서 수득한 AAV 유전자 전달체(AAV-ITRAD)를 포함하는 세포 배양액을 폐암세포인 A549, 자궁암 세포인 HeLa, 췌장암 세포인 Panc-1, 골육종 세포인 U20S, 간암 세포인 HepG-2, 간암 세포인 Huh-7 및 녹색 원숭이(Green monkey) 신장 세포인 Cos-7에 처리한 결과, 폐암세포인 A549, 자궁암 세포인 HeLa, 췌장암 세포인 Panc-1, 골육종 세포인 U20S, 간암 세포인 HepG-2 세포들의 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 6 참조).

또한, 암세포를 사멸시킬 때에는 50개 내지 2000개 게노믹 타이터(genomic titer)/세포수로 본 발명의 AAV 유전자 전달체를 암세포에 주입 또는 투여하는 것이 바람직하다. 본 발명에서는 본 발명의 AAV 유전자 전달체(AAV-ITRAD)를 5 ×10⁹개/세포수로 폐암 생쥐에 주입한 결과, 시간이 지남에 따라 종양의 성장이 저해되었다(도 9 참조). 본 발명에서 사용된 게노믹 타이터(genomic titer)라는 용어는 AAV 유전체 DNA 량을 정량하여 AAV 유전자 전달체 바이러스 입자수를 정량화한 것을 의미한다. 이외에도 AAV유전자 전달체를 정량화하는 방법으로는 감염성 타이터(infectious titer), 형질도입 단위(transduction unit) 등이 사용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 트레일 변이체 발현용 벡터(pTR-ITRAD)의 제조

암세포 사멸 유전자인 트레일 유전자를 세포외로 분비하며, 세포사멸 수용기(death receptor)에 효과적으로 작용하게 하기 위하여, 신호펩타이드와 이소류신지퍼 코돈을 삽입한 트레일 변이체를 제조하고 이를 발현하는 벡터를 제조하였다. 먼저 세포 사멸 효과를 보유하는 수용성 트레일을 만들기 위해 트레일 cDNA를 주형으로 하여 95번째부터 281번째 아미노산인 트레일 활성 도메인(active domain)을 증폭하였다. 트레일 전체 cDNA는 PBL cDNA(Stratagene)로 부터 클로닝하였다(Steven R. Willey et al., Immunity, Vol 3, 673-682, 1995). 이 때 센스 프라이머로 SmaI 절단 부위를 포함하는 서열번호 1로 기재되는 hTRN(Sm) 프라이머 및 안티센스 프라이머로 HindIII 절단 부위를 포함하는 서열번호 2로 기재되는 hTRC(H) 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 증폭 반응 조건은 94℃에서 4분동안 열변성시킨 뒤, 94℃에서 1분동안 열변성 반응, 53℃에서 30초 동안 프라이머 결합반응, 72℃에서 1분동안 길이연장 반응을 25회 수행하였고, 마지막 연장 반응은 5분 동안 수행하였다. 이 때 사용한 중합효소는 NEB(New England biolab)에서 판매하는 Vent DNA 폴리머라제를 이용하였다. 이렇게 증폭된 DNA 단편을 PCR 산물 정제 킷트(Qiagen)를 이용하여 정제하고, 제한효소 SmaI 과 HindIII로 절단하여, SmaI과 HindIII로 절단된 pBluescript SK+(Stratagene) 플라스미드 단편과 결합시켜 DH5α에 트랜스포메이션하였다. 이렇게 클로닝된 플라스미드를 이용하여 트레일 활성 도메인을 증폭하기 위한 PCR 반응의 주형으로 삼았다. 트레일 활성 도메인을 증폭하기 위해 NheI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 3으로 기재되는 프라이머(TRAILAD95(Nh)) 및 EcoRI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 4로 기재되는 프라이머(TRAIL C(E))를 사용하였다. PCR 증폭 반응은 94℃에서 4분 동안 열변성시키고, 94℃에서 1분 동안 열변성 반응, 53℃에서 30초 동안 프라이머 결합 반응, 72℃에서 40초 동안 길이연장 반응을 25회 동안 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분 동안 최종 길이연장 반응을 하였다. 상기 증폭된 DNA 산물을 제한효소 NheI과 EcoRI으로 절단하여 서열번호 5로 기재되는 염기서열을 갖는 트레일 활성 도메인을 얻었다. 이렇게 얻어진 활성 도메인을 "TRAD(trail active domain)"이라 명명하였다.

또한, 트레일 단백질이 트레일의 수용체에 결합할 때 활성화 형태인 트라이머를 형성하기 위해 이소루이신 지퍼를 준비하였다. 구체적으로, HindIII 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 6으로 기재되는 센스 프라이머(I-Zipper S(H)) 및 NheI 제한효소 서열을 포함하는 서열번호 7로 기재되는 안티센스 프라이머(I- Zipper AS(Nh))를 이용하여 PCR 수행하여 DNA 절편을 얻은 뒤 이를 제한효소 HindIII와 NheI으로 절단하여 서열번호 8으로 기재되는 이소루이신 지퍼(isoleuicine zipper)를 제조하였다. 이렇게 제조된 이소루이신 지퍼는 "IZ"라 명명하였다. 상기 제조된 서열번호 5로 기재되는 트레일 활성 도메인(TRAD) 앞에 서열번호 8로 기재되는 이소루이신 지퍼(IZ)를 연결한 뒤 이를 CMV 프로모터, 서열번호 13으로 기재되는 프리프로트립신(preprotrypsin) 리더서열과 N 말단쪽에 플랙(flag) 서열을 포함하는 pFLAG-CMV-1 발현벡터(Sigma)에 삽입하고 DH5α에 형질전환시킴으로써 트레일 변이체를 포함하는 발현벡터를 제조할 수 있었으며, 이를 "pFLAG-CMV-ITRAD"라 명명하였다(도 2).

다음으로, 상기에서 제조한 트레일 변이체를 함유하며, 감염성있는 바이러스로서 복제 및 패키징이 가능하도록 하기 위해 아데노 부속바이러스 종결 반복 부위(inverted terminal repeat, 이하 "ITR"이라 약칭함)를 가진 pTR-UF-2(Zolotukhin S et al., J Virol., 70, 4646-4654, 1996) 플라스미드를 XbaI과 NotI으로 절단하였다. ITR은 DNA의 복제 기원 및 바이러스의 패키지 신호를 제공하는 cis 요소로 기능하는 AAV 게놈의 각 말단을 의미한다. 상기에서 제조한 pFLAG-CMV-ITRAD를 주형으로하여 SpeI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 9로 기재되는 프라이머(pFLAG ppl S(Sp)) 및 NotI 제한효소 부위를 포함하는 서열번호 10으로 기재되는 프라이머(pFLAG-AS-term(Not))로 PCR 반응을 수행한 뒤 증폭된 PCR 산물을 상기 XbaI과 NotI으로 절단된 pTR-UF-2 발현벡터에 삽입하였다. 이를 대장균 DH5α에 형질전환시킴으로써 최종적으로 프리프로트립신 리더 서열(PL), 플랙 표지서열(F), 이소루이신 지퍼가 연결된 트레일 활성도메인(ITRAD) 및 아데노부속 바이러스 종결 반복 부위(ITR)를 포함하는 트레일 변이체 발현 벡터를 제조하여 이를 "pTR-ITRAD"라 명명하였다(도 2).

<실시예 2> CrmA 발현 벡터 및 CrmA를 발현하는 293 세포주의 제조

트레일 변이체의 발현을 검증하고 상기 실시예 1에서 제조한 트레일 변이체(ITRAD) 유전자로부터 AAV 유전자 전달체가 효과적으로 생산되는지 확인하기 위해 세포사멸이 억제되는 세포주를 제작하였다. Bcl-2와 같은 세포사멸 방지 인자는 트레일에 의한 세포사멸을 완전하게 차단할 수 없다(Kim EJ, et al., Int J Oncol., 18, 187-94, 2001). 이에, 강력한 케스페이즈(Caspase 8) 억제인자이며 세포사멸을 억제하는 것으로 알려진 CrmA(Cytokine response modifier A)(Dbaibo GS, Hannun YA, Clinical Immunology and Immunopathology, 86, 134-140, 1998)를 항상 발현하는 293 세포주를 제조하였다. 구체적으로, CrmA가 CMV 프로모터에 의해서 발현되고 FLAG이 N-말단에 있을 수 있도록 발현벡터를 제조하였다. CrmA cDNA를 주형으로 사용하고, 제한효소 HindIII 인식 서열을 포함하는 서열번호 11로 기재되는 센스 프라이머(CrmA S(H)) 및 제한효소 XbaI 인식 서열을 포함하는 서열번호 12로 기재되는 안티센스 프라이머(CrmA AS(N))를 이용하여 PCR 증폭한 뒤 HindIII와 XbaI으로 절단하여 이를 HindIII와 XbaI으로 절단 pFLAG-CMV-2(Sigma) 벡터에 도입하였다. 이렇게 제작된 벡터를 "pFLAG-CMVCrmA"라 명명한 뒤 제한효소 SacI을 처리하고, 클레나우(Klenow) 효소로 처리하여 평활말단을 만들었다. 상기 반응 산물을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤 이를 전기영동하여 약 1080 bp의 CrmA 절편을 잘라낸뒤 아가로즈 젤 용출 킷트(agarose gel elution kit, Qiagen)를 이용하여 DNA 단편을 얻었다.

다음으로 상기에서 얻은 CrmA DNA 단편을 제한효소 EcoRV(평활말단)와 XbaI으로 절단한 세포주 구축용 플라스미드(pCDNA3, Invitrogen)에 삽입하여 CrmA 발현벡터를 제조하고, 이를 "pcDNA3FCrmA"라 명명하였다(도 3). 상기 벡터를 293 세포주(ATCC: American Type Culture Collection)에 형질도입한 뒤 G418(500 ㎍/㎖) 선별에 의하여 생존하는 콜로니를 선택하여 하나의 세포에서 유래된 클론들을 구축하였다. 상기 구축된 클론으로부터 세포 추출액을 얻은 뒤 생쥐 α-플랙 항체를 사용하여 웨스턴 블랏을 수행하여 CrmA 단백질이 발현되는 것을 확인하였다(도 3).

<실시예 3> ITRAD의 발현, 세포외 분비능, 트리머 형성능 검증

상기 실시예 1에서 제작된 pTR-ITRAD를 293 세포 또는 상기 실시예 2에서 제조한 293 CrmA 세포에 형질도입하여 목적 유전자(ITRAD)의 발현과 발현된 ITRAD가 세포 밖으로 분비되는 지를 확인하고자 하였다. 이때 대조군으로 야생형의 사람의 트레일을 함유하는 pTR-TRAIL 벡터를 이용하였다. pTR-TRAIL 벡터는 상기 실시예 1에서 수득한 TRAIL cDNA를 pTR-UF-2 벡터(Zolotukhin S et al., J Virol., 70, 4646-4654, 1996)에 도입하여 제조하였다(도 4a). 100 mm 직경의 배양접시에 293 CrmA 세포를 분할하여 키운 후 70-80%로 자랐을 때, 10% FBS(fetal bovine serum, Hyclone)을 포함하는 LDMEM 또는 IMDM 배지로 갈아 주었다. 배지를 갈아준 후 약 8시간 뒤에 칼슘포스페이트 침전법에 의한 DNA 트랜스펙션을 수행하였다. 칼슘포스페이트 침전물은 다음과 같은 방법으로 만들었다. 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 pTR-ITRAD 벡터 DNA 또는 pTR-TRAIL 벡터 DNA 10 ㎍, 연어 정자(salmon sperm) DNA(Sigma) 10 ㎍, 2 X BES 500㎕, 2 M CaCl₂ 62.5 ㎕를 넣고 멸균수를 채워 1 ㎖이 되도록 하여 잘 혼합하여 준 후 15분 동안 상온에 방치하였다. 3 내지 4회 피펫으로 섞은 후 293 CrmA 세포 위에 위치를 바꾸어가며 한 방울씩 떨어뜨렸다. 천천히 흔들어 준 다음 37℃ 인큐베이터에 4 내지 8시간 정도 두어 DNA를 함유하는 침전물이 배양접시 바닥에 침적된 것을 확인한 뒤에, 10% FBS가 첨가된 LDMEM(Gibco) 배지로 갈아주었다. 트랜스펙션 한 뒤 약 48시간 후에 배양액 및 세포 추출물을 수득하였다. 세포 배양액 및 세포 추출물을 각각 40 ㎕씩 취한 뒤 전기영동 킷트(Mighty small gel kit, Hoefer)를 이용하여 12% SDS-PAGE를 수행하거나 또는 8% 비변성 젤 전기영동을 수행하였다. 전기영동은 25 mA로 약 2시간 동안 전개하였고, 전개된 단백질은 PVDF(polyvinylidene fluoride) 멤브레인(Perkin Elmer)에 트랜스퍼(transfer)하였다. PVDF 멤브레인에 5% 탈지분유를 처리한 뒤 1 X PBST(1 X PBS, 0.05% Tween-20)로 세척한 다음, 1000:1로 희석한 생쥐의 항 FLAG 항체 또는 토끼의 항 트레일 항체로 반응시키고, 세척한 후 항-마우스 HRP 또는 항-토끼 HRP 항체를 2000:1로 희석하여 반응시킨 후에 멤브레인 상의 FLAG-ITRAD 또는 트레일 단백질들을 ECL(Amersham)로 탐지하였다.

그 결과, 트레일 변이체(ITRAD)는 세포 추출액보다는 세포 배양액에 다량 존재하였고, 야생형의 트레일은 대부분이 세포 추출액에 존재하였다(도 4b 및 도 4c). 그리고, 트레일 변이체(ITRAD)는 트라이머를 형성하는 것으로 나타났다(도 4d). 상기 결과를 통해 야생형의 트레일 단백질을 발현하는 벡터(pTR-TRAIL)를 세포에 형질도입 시켰을 때에는 세포 밖으로 트레일 단백질을 분비시키지 않는 반면에, 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 벡터(pTR-ITRAD)를 세포에 형질도입 시켰을때에는 프리프로트립신 리더서열에 기인하여 발현된 ITRAD가 세포밖으로 효과적으로 분비되고, 이소류신지퍼에 의해 트라이머를 형성함을 알 수 있었다.

<실시예 4> ITRAD의 세포사멸 기능 검증

상기 실시예 3에서 ITRAD가 세포에서 발현되고 세포 밖으로 분비되며, 트라이머를 이루는 것을 확인하였다. 이에, 발현된 ITRAD가 세포사멸효능을 나타내는지를 검증하기 위하여 pTR-ITRAD를 293 세포주 및 293 CrmA 세포주에 트랜스펙션한 후 16시간 후에 세포사멸 여부를 광학현미경을 사용하여 관찰하였다. 이 때 야생형의 트레일이 도입된 pTR-TRAIL을 대조로 하였다. 293 세포주는 아데노바이러스 E1 유전자를 발현하는 인간 태아 신장 세포(Graham FL, et al., J. Gen. Virol., 1977, 36:59-62)이다.

그 결과, 본 발명의 ITRAD 및 야생형의 트레일은 293 세포의 사멸을 유도하였다. 그러나, 293 CrmA 세포주에서는 pTR-ITRAD의 경우 세포사멸을 유도하지 않 았다(도 5). 이를 통해 293 세포에서 발현된 ITRAD는 세포사멸 기능을 갖고 있으며, 본 발명의 ITRAD가 293 CrmA 세포주에서 발현될 경우 CrmA가 ITRAD에 의한 세포사멸을 저해시킴을 알 수 있었다(도 1 참조). 이는 293 CrmA 세포주가 AAV-ITRAD 유전자 전달체를 생산하는 데에 유용하다는 것을 제시하여 준다.

다음으로, 세포 밖으로 분비된 ITRAD가 실질적으로 세포사멸 유도기능이 있는지를 알아보기 위하여 pTR-ITRAD DNA를 트랜스펙션하고 48시간 지난 후에 얻어진 세포 배양액 1 ㎖을 70-80% 정도로 자란 다양한 세포의 배양액에 첨가시켰다. 세포로는 폐암세포인 A549(KTCC, Korean Type Culture Collection), 간암 세포인 HepG2(KTCC), 골육종 세포인 U2OS(KTCC), 자궁암 세포인 HeLa(KTCC), 췌장암 세포인 PANC-1(KTCC), 간암 세포인 Huh-7(KTCC), 녹색 원숭이(Green Monkey) 신장세포인 Cos-7(KTCC), 293 세포 및 상기에서 제조한 293 CrmA 세포를 사용하였다. 세포를 16-48시간 배양 후 세포사멸이 일어나는지를 현미경하에서 관찰하고, 크리스탈 바이올렛(Sigma)으로 염색하였다. 염색 방법은 구체적으로, 세포의 배지를 제거한 뒤 1 X PBS로 세포를 1회 세척한 다음 3.7% 포름알데히드(Sigma)로 세포를 5분간 상온에서 고정한 후 1% 크리스탈 바이올렛을 첨가하여 상온에서 5분 이상 반응시킨 다음 세척하여 배양접시 상에서 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, A549, HepG2, U2OS, HeLa, PANC-1 세포의 경우 본 발명의 트레일 변이체(ITRAD)에 의해 세포사멸이 유도되었으며, Huh-7, Cos-7세포의 경우 사멸이 유도되지 않았다. ITRAD가 존재하는 배양액으로 293 세포주를 처리하였을 때 세포 의 사멸이 관찰되었으나 293 CrmA 세포주의 경우에는 세포사멸이 관찰되지 않았다(도 6). 상기 결과를 통해 세포 밖으로 분비된 ITRAD는 세포사멸 기능이 있음을 알 수 있었다.

<실시예 5> AAV-ITRAD 유전자 전달체의 세포사멸 기능 검증

본 발명의 ITRAD 유전자가 도입된 AAV-ITRAD 유전자 전달체가 세포사멸효과를 나타내는지를 조사하였다. 구체적으로, AAV-ITRAD 재조합 바이러스의 생산은 상기 칼슘포스페이트 트랜스펙션 방법을 이용하였고, 이때 AAV 유전자 전달체 바이러스 입자를 생산하기 위해서 헬퍼바이러스로 사용되고 있는 아데노바이러스의 E2, E4, VA RNA유전자들이 함유되어 있는 AAV유전자 전달체 제작용 아데노헬퍼플라스미드인 pXX6(Xiao X. et al., J. Virol., 72, 22224-2232, 1998), AAV의 복제 기원(replication origin)인 ITR(inverted terminal repeat)이 없이 AAV 복제기능을 수행하는 Rep 유전자와 AAV 입자형성(virus assembly)에 관여하는 캡시드(Capsid) 유전자를 함유하는 헬퍼플라스미드인 pIM29 및 본 발명의 pTR-PLF-ITRAD 플라스미드 DNA를 사용하였다(대한민국 특허출원 제 2002-57918호). 이때 대조군으로는 pTR-LacZ 플라스미드 DNA를 사용하였다. 상기 DNA 각각을 100 mm 배양 접시당 12 ㎍, 4 ㎍ 및 4 ㎍씩 넣어 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션의 방법은 실시예 3에서 기술한대로 수행하였고, AAV 유전자 전달체 생산 세포로는 ITRAD가 발현되었을 때 세포사멸을 억제할 수 있는 293 CrmA 세포를 사용하였다. AAV유전자 전달체를 정제하기 위하여 이오딕사놀(Iodixanol, Optiprep, Nycomed) 밀도구배 초 원심분리를 수행하였다. 초원심 분리는 베크만 초원심 분리기(Beckman ultracentrifuge)를 이용하였으며, SW41 로터에서 35,000rpm, 20시간 동안 15℃에서 수행하였다. 초원심 분리후 분획을 각 400 ㎕씩 수거하였다. AAV-ITRAD의 타이터는 통상의 유전체함량 (genomic titer)으로 결정하였다. 분리정제된 AAV-ITRAD의 세포사멸효과를 관찰하기 위해서 AAV-ITRAD 50 moi(multiplicity of infection)를 각 배양세포에 감염시켰다. 감염시킬 세포로는 A549, U20S, HeLa, HepG-2, Cos-7 및 Huh-7을 사용하였으며, 16-48시간 후에 세포사멸이 일어나는지를 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 트레일 변이체(ITRAD)에 의해 A549, HepG2, U2OS, HeLa 세포의 경우 사멸이 유도되었으며, Huh-7, Cos-7 세포의 경우 세포사멸이 유도되지 않았다. 특히, 트레일 변이체의 세포사멸효과는 A549 폐암 세포주에서 강하게 관찰되었다(도 7).

또한, rAAV-ITRAD 50 moi로 감염된 U2OS와 293세포에서 ITRAD 단백질이 발현되는지를 웨스턴블랏으로 조사한 결과, 상기 세포 모두에서 ITRAD 단백질이 발현함을 확인하였다(도 8). 상기 결과를 통해 본 발명의 pTR-ITRAD를 이용하면 293 CrmA 세포주에서 AAV-ITRAD 유전자 전달체를 생산할 수 있고, 생산된 rAAV-ITRAD유전자 전달체를 암세포에 감염시키면 ITRAD가 발현되어 암세포를 효율적으로 사멸시킬수 있음을 알 수 있었다.

<실시예 6> AAV-ITRAD 유전자 전달체의 생체내( in vivo ) 항암효능 검증

A549 폐암 세포를 이용하여 AAV-ITRAD의 항암효능을 생쥐 종양모델에서 조사하였다. 구체적으로, 누드 생쥐에 10⁶개의 A549 세포를 피하 주입하여 종양괴를 형성시켰다. 종양이 3-4 mm의 크기까지 자랐을 때 분리 정제한 5 × 10⁹개의 AAV-ITRAD 유전자 전달체 50 ㎕를 종양괴에 직접 주입하였다. 대조군으로는 AAV-LacZ를 같은 용량으로 주사하였다. 각각 사용된 누드생쥐의 개체수는 5수씩 이였고, 종양의 크기는 3일에서 일주일 간격으로 조사하였다. 암궤종의 크기는 (장축X 단축²)/2로 계산하였다.

그 결과, AAV-ITRAD를 주입하였을 때 대조군(rAAV-LacZ)에 비하여 종양의 성장이 저해됨을 알 수 있었다(도 9). 따라서, 본 발명의 트레일 변이체를 발현하는 AAV 유전자 전달체(AAV-ITRAD)는 암세포 사멸 효과가 뛰어나 암을 치료하는 유전자 치료법에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 활성을 띄는 형태로 세포 밖으로 분비되면서 트라이머를 형성하는 본 발명의 트레일 변이체를 포함하는 AAV 유전자 전달체는 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있으며 생체내에서 장기간 발현되기 때문에 유전자를 이용한 암의 치료 기술 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Adeno-associated virus vector containing a trail mutant for death of cancer cell <130> 3p-12-07 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for TRAIL cDNA(hTRN(Sm)) <400> 1 tctcccggga ccatggctat gatggagg 28 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for TRAIL cDNA(hTRC(H)) <400> 2 ccaagcttgt tagccaacta aaaaggcc 28 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for trail active domoain(TRAILAD95(Nh)) <400> 3 ttggtcagca cctctgagga aaccatttc 29 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for trail active domain(TRAIL C(E)) <400> 4 gatgcggccg cgaattctta gccaactaaa aagg 34 <210> 5 <211> 564 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> trail active domain <400> 5 acctctgagg aaaccatttc tacagttcaa gaaaagcaac aaaatatttc tcccctagtg 60 agagaaagag gtcctcagag agtagcagct cacataactg ggaccagagg aagaagcaac 120 acattgtctt ctccaaactc caagaatgaa aaggctctgg gccgcaaaat aaactcctgg 180 gaatcatcaa ggagtgggca ttcattcctg agcaacttgc acttgaggaa tggtgaactg 240 gtcatccatg aaaaagggtt ttactacatc tattcccaaa catactttcg atttcaggag 300 gaaataaaag aaaacacaaa gaacgacaaa caaatggtcc aatatattta caaatacaca 360 agttatcctg accctatatt gttgatgaaa agtgctagaa atagttgttg gtctaaagat 420 gcagaatatg gactctattc catctatcaa gggggaatat ttgagcttaa ggaaaatgac 480 agaatttttg tttctgtaac aaatgagcac ttgatagaca tggaccatga agccagtttt 540 ttcggggcct ttttagttgg ctaa 564 <210> 6 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for isoleuicine zipper <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide 'n' represent a, t, g or c <400> 6 nnnaagctta tgaagcagat cgaggacaaa attgaggaaa tcctgtccaa gatttaccac 60 atcgagaac 69 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for isoleuicine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide 'n' represent a, t, g or c <400> 7 nnngctagct tccctctcgc caatgagttt cttaatccgg gcgatctcgt tctcgatgtg 60 gtaaatct 68 <210> 8 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> isoleuicine zipper <400> 8 atgaagcaga tcgaggacaa aattgaggaa atcctgtcca agatttacca catcgagaac 60 gagatcgccc ggattaagaa actcattggc gagagggaa 99 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFLAG ppl S(Sp) primer <400> 9 aagactagtt cgtttagtga accgtcaga 29 <210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pFLAG-AS-term(Not) primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide 'n' represent a, t, g or c <400> 10 nnngcggccg cctggggagg ggtcacagg 29 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense primer for CrmA(CrmA S(H)) <400> 11 gacaagcttg atatcttcag ggaaa 25 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense primer for CrmA(CrmA AS(N)) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> nucleotide 'n' represent a, t, g or c <400> 12 nnntctagat taattagttg ttggagag 28 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> preprotrypsin leader sequence <400> 13 atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgct 45

Claims (7)

1. 서열번호 13으로 기재되는 프리프로트립신(preprotrypsin) 리더 서열(PL), 서열번호 8로 기재되는 이소루이신 지퍼(IZ, isoleucine zipper) 및 서열번호 5로 기재되는 트레일 활성 도메인(TRAD, trail active domain)이 연결된 트레일 변이체 유전자(ITRAD) 및 아데노부속 바이러스의 종결 반복부위(ITR)를 포함하며, 도 2의 개열지도를 갖는 pTR-ITRAD인 것을 특징으로 하는 아데노부속 바이러스(AAV) 발현용 벡터.
2. 삭제
3. 제 1항의 암세포 사멸 유전자 트레일의 변이체를 발현하는 벡터를 숙주세포에 형질도입하여 제조한 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스(AAV).
4. 제 3항에 있어서, 상기 숙주 세포는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스 유전자 전달체를 효과적으로 생산할 수 있는 세포주로 세포사멸을 억제하는 사이토카인 반응 변형체 A(CrmA)를 발현하는 293 CrmA 세포주인 것을 특징으로 하는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스(AAV).
5. 삭제
6. 제 3항에 있어서, 상기 암세포는 폐암, 자궁암, 골육종, 췌장암 및 간암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 암세포 사멸용 아데노부속 바이러스(AAV).
7. 삭제

Images